（发酵工程专业论文）表面接枝高分子量季铵盐的纳米siox的抗菌机理研究.pdf

2 0 0 7 届硕j ：研究生学位论文 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究在做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确 方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：必 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权贵州大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：盐导师签名：五拿熬期：蚴 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 摘要 本论文研究了一种新型纳米抗菌材料的合成及其抗菌机理。以纳米s i o 。为 载体，先用活化剂对其进行处理，然后将高分子聚乙烯亚胺( p e i ) 与带活性功 能基团的s i o 。在有机溶剂中反应，使p e i 接枝在纳米s i o x 上，然后用卤代烷进 行烷基化修饰，使其形成高分子季铵盐。对这种高分子季铵盐进行了抗菌检测， 结果表明，其对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、酵母菌和霉菌都有较强的致死 作用，并且将抗菌纳米s i o x 长时间放置，在不同时期检测抗菌纳米s i o 。的抗菌 性能，结果表明其仍具备良好的抗菌效果，说明其具备较好的抗菌长效性和稳 定性。 对抗菌s i o 。粉体的抗菌机理进行了研究，其对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性 菌和酵母菌在呼吸代谢过程中产生的脱氢酶有较强的抑制作用，当抗菌粉体的 添加量达到l m g m l 时，其脱氢酶的活性完全被抑制，代谢过程被终止。通过测 定添加抗菌粉体的菌悬液中的d n a 、r n a 及b 一半乳糖苷酶的浓度发现细菌 的d n a 、r n a 及1 3 一半乳糖苷酶不断的泄露至溶液中，说明抗菌s i o x 粉体对 细胞膜有裂解作用。对添加了抗菌纳米s i o 。粉体的细菌和酵母菌进行荧光染色， 结果发现添加了抗菌粉体的细胞几乎全部被红染，这说明微生物的细胞膜被破 坏，因为荧光染料碘化丙锭只能进入细胞膜被破坏的细胞内部，将细胞核染成 红色。而对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及细菌芽孢的透射电镜观察发现，抗 菌纳米s i o 。粉体与微生物之间的作用分为吸附和分解两个过程。带有正电荷的 抗菌纳米s i o 。粉体与表面带有负电荷的细菌之间有极强的静电吸附作用，当其 互相吸附后，抗菌纳米s i o 。粉体将细胞膜破坏，接着细菌内容物质泄露，细胞 逐渐被抗菌粉体分解掉。 关键词：纳米s i o x ；季铵盐；抗菌剂；抗菌材料：抗菌机理； 2 0 0 7 届碗e 研究生学位论文 a b s t r a c t t h ep r e p a r i n go fan o v e ll l a n o - s i c xa n t i m i c r o b i a lm a t e r i a la n di t sm e c h a n i s m w e r es t u d i e di nt h i sp a p e r f i r s t ，n a n o s i c xw a st r e a t e db ya c t i v a t i o ns u b s t a n c e s ，t h e n r e a c t e dw i t hh i g h - m o l e c u l a r - w e i g h tp o l y e t h y l e n i m i n e ( p e i ) i no r g a n i cs o l v e n t , , s o p e iw a sg r a f t e dc o v a l e n t l yo nt h es u r f a c eo fn a n o s i c x ，f i n a l l y , m o d i f i e di tb yt h e h a l i d es u c ha sb r o m o h e x a n ea n di o d o m e t h a n e ，t h e n h i g h m o l e c u l a r - w e i g h t q u a t e m a r ya n a m o n i u m s a l t sw a sp r e p a r e d t h eb a c t e r i c i d a la c t i v i t yo ft h e a n t i m i c r o b i a ll l a n o s i c xw a se v a l u a t e d ，t h er e s u l t ss h o w e d ，g r a m - p o s i t i v eb a c t e r i a , g r a m - n e g a t i v eb a c t e r i a ，y e a s ta n dm o l dw e r e k i l l e d d r a m a t i c a l l y , t h e nt h e b a c t e r i c i d a lc a p a b i l i t yw a sa n a l y s i s e da td i f f e r e n tp e r i o dd u r i n go n ey e a r a tl a s t ，w e f o u n dt h ea n t i m i c r o b i a lc a p a b i l i t yo fn a n o s i o xh a dl i t t l er e d u c t i o n ，i td e m o n s t r a t e d t h a tt h el l a n o s i o xh a dap r o l o n g e da c t i o na n db a c t e r i c i d a ls t a b i l i t y t h es t e r i l i z a t i o nm e c h a n i s mo fn a n o s i o xw a ss t u d i e d d e h 3 7 d r o g e t m s ec r e a t e d d u r i n gr e s p i r a t o r ym e t a b o l i s mo fg r a m p o s i t i v e ，g r a m n e g a t i v eb a c t e r i aa n dy e a s t w e r ei n h i b i t e dc o m p l e t e l yw h e nt h e nc o n c e n t r a t i o no fn a n o - s i c xr e a c h e dl m g m l ， m e t a b o l i s mp r o c e s sw a st e r m i n a t e d t h ec o n c e n t r a t i o nd e t e r m i n eo f d n a ，r n aa n d 1 3 - g a l a c t o s i d a s ei n d i c a t e dt h a ti n n e rs u b s t a n c eo fb a c t e d ac e i l sl e a k e do u ti n t o s o l u t i o n ，t h i sa l s od e m o n s t r a t e dt h a tn a n o s i c xh a dd e g t a d a t i o na g a i n s tt h ec e l lw a l l a n dm e m b r a n e f l u o r e s c e n ts t a i n i n go fb a c t e r i aa n dy e a s tw a sd e t e c t e d ，t h ec e l l s r e a c t e db yn a n o s i c xw e l em o s t l ys t a i n e d , w h i c hi n d i c a t e dt h a tt h ec e l lm e m b r a n e w a sd e s t r o y e d ，f o rp r o p i d i u mi o d i d ec a no n l ye n t e rt h ei n c o m p l e t ec e l l s ，s t a i n e dt h e c e l l u l a rn u c l e u s s h a p ev a r i e t yo fb a c t e r i aa n da n t i m i c r o b i a lp r o c e s sc o u l db e o b s e r v e dt h r o u g ht e m t h ea c t i o nw a sc o m p o s e do f t w os t e p s ，f i r s ta d s o r p t i o n ，t h e n c e l l - l y s i s t h e r ew a ss t r o n g l ye l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o nb c t 、v e e l ln a n o s i o xa n dc e l l s a f i e ra d s o r p t i o n , c e l lm e m b r a n ed e s t r o y e d t h e ni n t r a c e l l u l a rc o m p o n e n t s1 6 a k e do u t , f i n a l l yd e c o m p o s e d k e yw o r d s ：n a n o s i o x ；q u a t e r n a r ya m m o n i u ms a t t s ；a n t i m i e r o b i a lm a t e r i a l ； a n t i m i c r o b i a la g e n t ；a n t i m i e r o b i a lm e c h a n i s m ； 4 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 1 1 引言 第一章绪论 “抗菌”的含义n 1 实际上是指抗各种微生物的功能，包括抗细菌、霉菌、立 克次氏体、真菌甚至病毒等多种微生物，是一种广义的抗菌概念，比较准确的说 应该叫“抗微生物”功能。包括灭菌、杀菌、消毒、抑菌、防腐等。灭菌( s t e r i l i z e a t i o n ) 是指将待处理体系中的所有微生物包括微生物的孢子等生态形式都完全除去或 使之丧失活性的过程。杀菌( m i c r o b i o c i d e ) 是指将待处理体系中的微生物营养体 和繁殖体杀死的过程。消毒( d i s i n f e c t i o n ) 是指破坏待处理体系中微生物的过程。 一般需要将体系中的致病和条件致病的微生物除去或使之丧失活性。抑菌 ( b a c t e r i o s t a s i s ) 是指抑制微生物生长繁殖的作用，抑制待处理体系中微生物的活 性，使之繁殖能力降低或停滞繁殖的过程。防腐( a n t i s e p s i s ) 是指采取一定措施防 止物品性能因微生物的破坏而下降的过程和技术。 “抗菌剂”【lj 指一些微生物高度敏感、少量添加到材料中即可赋予材料抗 微生物性能的化学物质；“抗菌材料”的制备通常是在材料中直接添加抗菌剂， 或者以其他方式将抗菌基团引入到材料中，使其获得抗菌性能。抗菌剂对微生 物的作用主要表现在两方面，抑菌和杀菌。抗菌方法可分为物理方法和化学方 法两大类。物理方法是通过改变温度、压力以及使用环境的电磁波、电子射线 等物理手段杀菌：化学方法则是通过调节p h 值、进行气体交换、失水、隔离营 养源等手段灭菌。而目前在材料领域使用的方法主要是通过添加抗菌剂的办法 来达到抗菌的效果，这种方法均有适用面广、效率高、有效期长的特点。 1 2 抗菌剂的分类 抗菌材料研制和生产的核心是抗菌剂的研制和生产。抗菌剂按照其性能可 分为无机抗菌剂、有机抗菌剂、天然抗菌剂和高分子抗菌剂四类。 1 2 1 无机抗菌剂 无机抗菌剂是2 0 世纪8 0 年代中期发展起来的一类抗菌材料【1 1 ，是利用银、 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 铜、锌、钛等会属及其离子的杀菌或抑菌能力制得的一类抗菌剂，具有耐热性、 持久性、连续性、安全性等优点，但也存在一些成本高、易变色等缺点。无机 系抗菌剂主要可分为重金属类、光催化类两大类。 重金属类抗菌剂为a u ，a g h g ，c u ，z n ，b a ，b i ，t a 等金属及其化合物。人们研 究了一般金属离子对菌类的作用强度嘲，实验结果表明以银的灭菌效力最为显 著，一般用量为1 0 6 m o l l 即可灭菌。重金属类抗菌剂在实际应用中，通常利用 吸附或离子交换等方法，将重金属离子固定在沸石、硅胶等载体上制成抗菌剂。 重金属类抗菌剂，尤其是银系抗菌剂已经得到了广泛应用，近年来已扩展到建 筑塑料、陶瓷制品及纤维、塑料、涂料等诸多领域。 最近几年，一种具有光催化作用的无机型抗菌剂成为研究的一个热点。研 究表明具有光催化功能的材料主要为n 型半导体材料，如t i 0 2 、z n o 、w 0 3 等，其中日d 2 是目前最常见的光催化型抗菌剂。 1 2 2 有机抗菌剂 有机抗菌剂品种很多，根据有机抗菌剂的化学分子结构可以将其分成2 0 余 大类，常见的有卤化物、有机锡、异噻唑、毗啶金属盐、眯唑酮、醛类化合物、 季铵盐等许多种，它们绝大部分是有机小分子物质。有机抗菌剂的用量相对较 少【3 】，一般在1 0 击( t o o l l ) 级甚至1 0 - 9 ( t o o l l ) 级就有明显的抗菌效果。 与无机抗菌剂比较，有机抗菌剂具有杀菌力强、即效好、种类多，缺点是 毒性大、耐热性较差、易迁移、可能产生微生物耐药性等，因此它们的应用受 到很大的限制。 1 2 3 天然抗菌剂 天然抗菌剂主要有壳聚糖、鱼精蛋白、桂皮油和罗汉柏油等，大都是从动 植物中提炼精制的，具有耐候性优良、毒性低、使用安全等优点，其主要缺点 是耐热性较差，药效持续时间短。 目前最常用的天然抗菌剂是壳聚糖，它是由甲壳素脱乙酰基化反应而来的， 而甲壳素广泛存在于自然界虾、蟹等节肢动物的外壳中。是产量仅次于纤维素 的自然界第二大天然高分子。壳聚糖是一种抗菌性能较强的天然抗菌剂，体系 中含o 1 时就具有十分明显的抗菌作用【l 】。其它天然抗菌剂主要有山梨酸、黄 6 2 0 0 7 届硕i ：研究生学位论文 姜根醇、孟宗竹提取物和日柏醇等。 劂吲戌黼卿甜。 n h _ k 十b 七 7 2 0 7 届硕士研究生学位论文 病毒及藻类。u s4 8 2 6 9 2 4 1 6 1 报道了以氯甲基苯乙烯的均聚物或它与苯- - 7 , 烯的 共聚物为载体制备的水不溶性聚季铵盐抗菌剂。该类聚合物对细菌、真菌有长 效、高效的抗菌性，在2 5 m i n 内几乎全部杀灭所试条件下典型的革兰氏阳性 菌和革兰氏阴性菌，可用于水处理、建材及农业等领域。u s5 1 0 4 6 4 9 1 6 j 报道了 通过聚乙烯或聚氯乙烯在紫外光下与二氧化硫和氯气作用制得的磺酰氯为载 体，该载体再与适当结构的二胺反应与季铵化作用制得又一类水不溶性聚合物 抗菌剂。 聚阳离子型抗菌剂对于多种革兰氏阳性、阴性菌以及真菌都有很好的抗菌 活性。随着烷基链的增长，抗菌活性升高。因此认为化合物憎水性的提高有利 于抗菌性的提高，并且高分子抗菌剂比相同结构的单体小分子抗菌剂活性高。 1 2 4 2 高分子季膦盐类抗菌剂 a k i h i k ok a n a z a w a 等【7 】研制了以季膦盐为抗菌基团的高分子抗菌剂。他们 发现这种高分子抗菌剂的抗菌活性不仅比相应的小分子高，而且要比相同结构 的季铵盐型高分子抗菌剂高出两个数量级，如图1 2 所示。对季膦盐上不同的 取代基抗菌活性的研究表明，含有较长链( 辛基) 的化合物有特别高的抗菌活 性，可能是疏水性的提高有利于提高对细菌的杀灭力。 。卡h 。一? h 七c h s i h z。卡h z f h 七。卡h z 一早h t 峪r p i r e 钆忪轴矗茹队i - i i 畅r r 时 r r rr 图1 2 聚季膦盐抗菌剂与小分子季膦盐抗菌剂，以及与聚季铵盐抗菌剂的抗菌活性比较 1 2 4 3 高分子有机锡类抗菌剂 人们很早就发现带烷基链的有机锡基团具有抗菌活性，并利用d s n 和 n - s n 键将其键合到单体和聚合物上。n a y e f 等【即合成了两种含有机锡的单体。 并将它们和苯乙烯进行共聚。如图1 3 所示。 8 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 h 2 c 2 9 h h c 一- - - c h c = o 归良掣声一。 犬 鼬一s 6 n 。吨“。渤b 。b n c o o s n b u 3 图1 3 两种含有烷基锡单体 研究表明，含有机锡基团的抗菌剂对与革兰氏阳性细菌，尤其对金黄色葡 萄球菌有着很好的杀灭率。对革兰氏阴性细菌的杀灭率相对较低。单体共聚后， 由于抗菌基团浓度下降，抗菌活性也随着下降。 1 2 4 4 高分子卤代胺类抗菌剂 s u n 等9 3 通过高分子化学反应合成了聚( 1 ，3 ，5 一三氯6 一甲基( 4 一 乙烯基苯基) 一l ，3 ，5 三嗪2 ，4 二酮) 。由于这种抗菌剂不溶于水。而 且在水中氯溶解量小于1 m g ，l ，所以可以用于净化饮用水。他们用5 ，5 一二甲基 乙内酰脲( d m h ) 和7 ，8 一苯并一1 ，3 一二氮杂螺环( 4 ，5 ) 2 ，4 一癸二酮( b d d d ) 分别与3 一溴丙烯反应制备了3 一丙烯基一5 ，5 一二甲基乙内酰脲和7 ，8 一苯并一 3 一丙烯基一l 3 一二氮杂螺环( 4 ，5 ) 2 4 一癸二酮( a d m h ) ，再把a d m h 和 b a d d d 以一定的比例分别与丙烯腈、醋酸乙烯酯、甲基丙烯酸甲酯单体共聚， 产物经卤化处理后形成了带n 一卤化胺结构的抗菌剂。 1 2 4 5 高分子胍盐类抗菌剂 人们发现胍及其衍生物具有很好的抗菌性能，并应用与药物、农作物防护、 工业产品及食品的消毒等方面。它能有效地控制农作物和动物的致病菌和发癣 菌，可用于控制苹果的黑斑病和樱桃花瓣的斑点发生，同时它也是有效的海藻类 生物的生长抑制剂。胍基聚合物抗菌剂添加到涂料中可以提高涂料的防霉耐久 性。z h a n g 等【1 0 1 通过熔融缩聚的方法合成出了胍基聚合物，对这种胍基聚合物 进行抗菌检测后，发现它对一般常见的细菌有显著的抗菌效果，最小抑菌浓度仅 为z g m j ，而且这种抗菌剂具有良好的溶解性，可以用作抗菌纤维整理剂。 1 1 2 4 6 壳聚糖及其衍生物类抗菌剂 早在1 9 7 9 年，a l l a n 等i l l l 就提出壳聚糖具有广谱抗菌性。由于壳聚糖在碱 性条件下溶解性较差，因此限制了它的应用。k i m 等【1 习在壳聚糖的胺基上接上 了不同长度的烷基，制备了一系列的壳聚糖季铵盐衍生物。s h i n 等【”】用可溶性 9 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 的壳聚糖衍生物对纤维进行了预处理，得到具有抗菌活性的纤维制品。由于壳 聚糖具有微细的, j q l 结构，有毛细管作用，可以迅速散发吸收的汗液，使细菌 不易附着并滋生，从而增强了抗菌功效。而且壳聚糖对皮肤没有刺激，安全性 高。 综上所述，高分子抗菌剂比小分子抗菌剂有更好的抗菌活性，而且使用安 全，易加工，稳定性好。比起其它类型的抗菌剂，高分子抗菌剂有许多优点， 微生物与它的作用方式基本上是通过表面触杀完成的，抗菌成分与载体大部分 是通过共价键键合在一起的，抗菌安全性和长效性都比较高，可以广泛应用于 医疗卫生、食品保健、建筑装饰等各个行业。 1 3 抗菌剂的抗菌机理 由于不同的抗菌剂对同种病原菌的抗菌作用机理和有效性的不同，以及同 种抗菌剂对于不同的病原菌的抗菌作用机制和抑制范围也不同，因此，要研究 出既长效又广谱、既高效又安全的抗菌剂，对抗菌机理的研究十分重要。无机 抗菌剂属于溶出接触型抗菌剂，其抗菌作用机理分为接触反应机理和活性氧 机理。有机抗菌剂的作用机理是通过和微生物细胞膜表面阴离子结合逐渐进 入细胞，或与细胞表面的巯基等基团反应，破坏蛋白质和细胞膜的合成系统， 抑制微生物的繁殖。天然抗菌剂的作用机理4 1 分为以下两种，一种认为其破 坏细胞壁的合成与溶解平衡，溶解细胞壁，另一种认为其渗透进入细胞内，吸 附细胞体内带有阴离子的物质，扰乱细胞正常的生理活动，从而杀灭细菌。 对于小分子季铵盐类抗菌剂的抗菌机理人们已经有了较多的研究，目前国 内报道的对高分子抗菌剂抗菌机理的研究较少，k a w a b a m 等“”认为阳离子杀 菌剂的杀菌过程如下：杀菌剂依靠库仑力吸附到带负电荷的细菌表面，通过细 胞壁扩散，与细胞质膜结合使其玻裂，细菌因内容物释放死亡。高分子化后的 季铵盐型接触抗菌剂的灭菌机理目前尚不十分清楚，王蕊欣【1 6 】等曾报道过高分 子吡啶季铵盐抗菌剂的抗菌机理为：带正电荷的高分子吡啶季铵盐抗菌剂吸附 到菌体表面，穿透细胞壁与细胞膜的类脂层和蛋白质层结合，阴碍细菌对外界 的正常离子交换和物质交换，并破坏控制细胞渗透性的原生质膜使细胞内物质 外渗，致使细菌死亡。飚ml c 谢s ”】等研究了季铵盐聚阳离子的抗菌机理，并且 1 0 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 通过碘化丙锭染色法证明季铵盐的目标主要是细胞膜，此实验说明了破坏细胞 膜是表面接触杀菌聚合物的杀菌机理，聚合物长链可以穿过微生物细胞的外层 细胞壁将活性部分伸入到细胞膜杀死细胞。 1 3 1 无机抗菌剂的抗菌机理 关于无机抗菌剂的抗菌机理，目前有多种解释。重金属类抗菌剂抗菌机理 一般认为是：在抗菌剂的作用过程中，逐渐溶出的金属离子与生物体内的蛋白 质、核酸中存在的巯基( 一s h ) 、氨基( 一n h 2 ) 等含硫氮的官能团发生反应， 使一些必要的酶丧失活性，从而达到杀菌的目的。 对于银系抗菌剂有银离子接触反应杀菌机理【1 8 1 ：抗菌材料中的银一般以 a r 的形式参与杀菌，当微量的a 矿接触微生物细胞壁时，因后者带负电，依靠 库仑引力，使二者牢固吸附，a g + 穿透细胞膜进入细胞内，破坏细胞合成酶的 活性，细胞丧失分裂繁殖能力而死亡。a g + 也能破坏微生物电子传递系统、呼 吸系统、物质传递系统。 无机抗菌剂中的氧化钛系光触媒抗菌剂的抗菌作用机理【l s 】：氧化钛光触媒 剂是一种半导体，充满电子的价电子带，由能传导电子的传导带和不能存在电 子的禁带构成，当含有紫外线的光照射到抗菌剂时，产生电子( e 一) 和空穴 ( h + ) ，产生的电子和空气中的组成成分反应，生成过氧化氢( 氧化反应) 。空 穴和抗菌剂表面的微量水分反应生成氢氧团( 原反应) ，过氧化氢和氢氧团具有 杀菌作用。 1 3 2 有机抗菌剂的抗菌机理 有机抗菌剂的主要作用机理【l 】是通过和微生物细胞膜表面阴离子结合逐渐 进入细胞，或与细胞表面的巯基等基团反应，破坏蛋白质和细胞膜的合成系统， 抑制微生物的繁殖。有机抗菌剂品种繁多，各种微生物的菌体间也各不一样， 其作用机理也随相互种类而异。一般可通过如下途径： ( 1 ) 降低或消除微生物细胞内各种代谢酶的活性，阻碍微生物的呼吸作用。 ( 2 ) 抑制孢子发芽时孢予的膨润，阻碍核糖核酸的合成，破坏孢子的发芽。 ( 3 ) 加速磷酸氧化体系，破坏细胞的正常生理功能。 “) 阻碍微生物的生物合成，干扰微生物生长和维持生命所需物质的产生过程。 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 ( 5 ) 破坏细胞壁的合成。 ( 6 ) 阻碍类酯的合成。 1 3 3 天然抗菌剂的抗菌机理 壳聚糖的抗菌作用，认为有以下2 种机理【1 9 】：一种是壳聚糖分子中的 一n h 3 + 带正电性，吸附在细胞表面，一方面可能形成一层高分子膜，阻止营养 物质向细胞内运输，另一方面使细胞壁和细胞膜上的负电荷分布不均，破坏细 胞壁的合成与溶解平衡，溶解细胞壁，从而起到抑菌杀菌作用；另一种是通过 渗透进入细胞内，吸附细胞体内带有阴离子的物质，扰乱细胞正常的生理活动， 从而杀灭细菌。 1 3 4 高分子抗菌剂的抗菌机理 1 3 4 1 高分子季铵盐抗菌剂的抗菌机理 对于小分子季铵盐抗菌剂的机理有了较多的研究2 0 1 ，其抗菌作用过程可以 分为6 步，即吸附到细菌表面，穿透细胞壁。与细胞膜结合，扰乱细胞膜组成， 导致胞内物质泄漏，最后细菌死亡。高分子化后的季铵盐型接触抗菌剂的灭菌 机理目前尚不十分清楚，但一般认为其作用过程也服从上述步骤，季铵盐分子 带正电，经高分子化后，相对分子量增大，电荷密度提高，由于微生物细胞表 面带负电，而且细胞膜内含有的磷脂及一些膜蛋白水解也带负电，因此，抗菌 剂分子量增大有助于吸附菌体及与细胞膜结合，但同时由于分子量增大，分子 变大，在扩散穿透细胞壁时的阻力增大，但就综合效果而言，高分子化后的消 毒剂比相同结构的小分子单体的抗菌性和稳定性均有大幅度提高。根据目前抗 菌机理的研究现状，普遍认为季铵盐类高分子抗菌剂的作用位点是细胞膜。 k a w a b a t a 等”1 认为阳离子杀菌剂的杀菌过程如下：杀菌剂依靠库仑力吸附 到带电荷的细菌表面，通过细胞壁扩散，与细菌质膜结合使其破裂，细菌因内 容物释放而死亡。t e c l o e t e l 2 1 1 曾报道抗菌剂的作用是先吸附到细菌细胞的表 面，然后穿过0 + 的细胞壁或g - 的细胞膜，到达它的作用位点，如细胞膜，呼吸 系统，酶和遗传物质等。抗菌剂在低浓度时只起到抑制细菌繁殖的作用，只有 在高浓度时才起到杀菌的作用。有效的抗菌剂必须在作用位点处有足够高的浓 度以发挥它们的杀菌作用。 2 0 0 7 属坝i ：研究生学位论文 v i k t o r 等【2 2 1 研究了1 6 种消毒剂对大肠杆菌属的抗菌机理，其中包括1 1 种 季铵盐和5 种结合了其它成分的季铵盐，并研究了其对生物合成过程和呼吸系 统的影响。研究表明，季铵盐属于外膜活性化合物，结合到细胞膜上来影响细 胞的新陈代谢，干扰了核酸和蛋白质的合成，影响了细胞的能量代谢。对季铵 盐的活性研究表明是细胞膜的酶先受到影响，然后消毒剂渗入细胞作用于细胞 质酶。m a j t a n o v a 等通过研究发现长链的有机铵盐对呼吸系统的影响比短链的化 合物要强，而抑制细菌生长的抗茵剂是通过干扰新陈代谢中的产能和耗能过程 来实现的。k i ml e w i s 1 7 1 等研究了季铵盐聚阳离子的抗菌机理，并且研究了不同 分子量的季铵盐聚合物的抗菌活性的不同。结果表明，为了达到较好的杀菌效 果，固定化的聚阳离子必须要有足够长的链。并且通过碘化丙锭染色法证明季 铵盐的目标主要是细胞膜，因为这种红色的荧光染料只能进入到细胞膜损失的 细胞，此实验说明了破坏细胞膜是表面接触杀菌聚合物的杀菌机理，聚合物长 链可以穿过微生物细胞的外层细胞壁将活性部分伸入到细胞膜杀死细胞。 1 3 4 2 其它高分子抗菌剂的作用机理 k a n a z a w a 等对季膦盐型抗菌聚合物的性能作了研究 2 3 - 2 3 1 ，实验表明聚合物 的抗菌活性比相同小分子化合物高得多，随着分子量的增加，抗菌活性也相应 提高，这是因为随着分子量的增加，聚合物中阳离子含量也随着增加，更有利 于被细菌吸附，吸附的阳离子和细胞膜相互作用造成了细胞膜破坏，杀灭细菌， 但是分子量增大的同时也引起聚合物线团尺寸的增加，使其向细胞壁扩散变得 困难，但当分子量在9 4 0 0 0 以下时，抗菌活性随分子量的增加而增大。 k a n a z a w a 等针对季膦盐类高分子抗菌剂。2 5 】，考察了膦盐的种类、膦盐基 团在主链或者侧链的位置以及膦盐单体的侧链烷基种类等因素对其抗菌能力的 影响，并将此类材料的抗菌能力归因于表面活性剂形成胶团从而干扰细菌细胞 膜组成。 双胍类杀菌剂常用的有氯己啶，其浓度低时破坏菌细胞膜，使胞质内容物 漏出；浓度高时使菌体蛋白质凝固。 图1 4 2 1 l 总结了目前常见抗菌剂的抗菌作用机制，描述了不同抗菌剂对微生 物的作用部位。 1 3 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 图1 4 生物杀菌剂对微生物的灭活机理 ( 其中0 a c s 代表季铵化合物) 1 4 立题背景及研究内容 1 4 1 立题背景 自然界的有害细菌、真菌和病毒等微生物是使人类遭受传染、诱发疾病的主 要原因。在公元1 4 世纪中期引起欧洲三分之一人口死亡的黑死病和2 0 世纪初致使 全世界2 0 0 0 多万人死亡的流感：在日本国范围内的病原性大肠杆菌“o - 1 5 7 ”、英 国的“疯牛病”，“口蹄疫”、美国的“炭疽病”和2 0 0 3 年春夏出现的严重急性呼 吸道感染综合症( s a r s ) ，这些传染病都与病原微生物有直接的关系【14 1 。病原微 生物不但极大威胁人类的健康和社会的公共安全，而且还严重破坏各种工业原 料，对社会财富造成相当大的损失i l 2 6 】。许多研究发现抗菌功能材料可以杀死或 抑制病原微生物，能有效地控制病原微生物的传播【2 7 一舯，因而有着广泛的应用 前景。目前，抗菌材料研究在我国正面临着重大的机遇和挑战。1 9 9 6 年日本病原 性大肠杆菌感染事件，引起日本全国范围内对抗菌材料研制开发的极大重视，也 1 4 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 是目静r 本在这一领域处于领先地位的重要原因。随着生活水平的提高，人们对 生存环境的要求也越来越高。由此，抗菌材料的生产已成为一个新兴的产业，世 界各国对抗菌剂的研究更加重视。 现代抗菌材料的大规模应用始于第二次世界大战时期，德军穿用经抗菌整理 加工的军服，减少了伤员的细菌感染和伤病减员。日本无机抗菌剂的开发和应用 在国际上居领先地位，欧美地区的抗菌材料主要采用有机抗菌剂，我国科学家1 0 多年前就开始跟踪研究抗菌剂和抗菌防霉材料，1 9 9 8 年的成立海尔科化工程塑料 国家工程研究中心有限公司，经过5 年多对抗菌剂、抗菌塑料和抗菌家电的系统 研究后，终于在海尔集团得到了成功应用，“抗菌系列家电及抗菌塑料研制应用” 荣获2 0 0 0 年度国家科技进步二等奖，标志着我国抗菌材料研制和应用技术已跨入 了国际先进行列【2 9 】。与此同时，一批高等院校、科研院所和科技型企业密切联合， 在无机抗菌剂、有机抗菌剂、光触媒抗菌剂等领域形成全方位开发应用的势头。 我国在抗菌材料方面的研究还很薄弱，很多重要的专利已被日本抢注，因此迅速 研制和开发抗菌产品对我国的塑料、建材工业以及食品、日用品等轻工业的发展 有着重要的意义。 1 4 2 研究内容 1 4 2 1 论文的主要内容 本文介绍的高分子季铵盐是在纳米载体上以共价方式接枝具有抗菌功能的 有机高分子季铵盐。 合成新型不溶性高分子季铵盐抗菌剂( 材料) 以纳米s i o x 为载体，先用活化剂对其进行处理，使纳米s i o x 表面带上活性官 能基团，然后将活化后的纳米s i o x 与高分子聚乙烯亚胺( p e i ) 在有机溶液中反 应，最后用卤代烷对其修饰，最终制成携带高分子季铵盐抗菌剂的不溶性抗菌纳 米s i o x 。对具有抗菌功能的纳米s i o x 进行抗菌检测，为抗菌纳米s i o x 的应用提 供理论依据和工艺参数。 抗菌纳米s i o x 的抗菌机理研究 考察了表面接枝高分子季铵盐纳米s i o x 粉体的抗菌过程及抗菌机理。采用测 定细菌的脱氢酶和b 一半乳糖苷酶的活性来说明其对细菌新陈代谢过程的影响及 其杀菌性能，通过测定溶液中的d n a 和r n a 的含量来判断细胞膜的破坏程度， 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 用荧光显微镜观察细菌是否被染色以说明其抗菌作用机理，通过透射电镜观察细 菌的形态随时间变化，动态反映细菌的死亡过程和抗菌作用位点，并测定了其抗 菌动力学。 1 4 2 2 论文创新之处 在本论文中，我们首次在纳米s i o x 粉体表面上通过共价键合的方式接枝长链 聚乙烯亚胺( p e i ) ，随后用卤代烷对其进行烷基化修饰，使接枝的p e i 生成高分 子季铵盐，制备出具有抗菌功能的s i o x 粉体。抗菌高分子与纳米颗粒之间是共价 的连接，不易脱落，抗菌分子不必经过缓慢释放到材料表面产生抗菌功能，而是 通过接触方式杀菌。我们还系统考察了抗菌s i o x 粉体对细菌和真菌的抗菌性能。 本论文研究了上述抗菌s i o x 粉体的抗菌机理，测定了微生物脱氢酶和b 半乳 糖苷酶的活性，并通过荧光染色确定了其作用位点，最后在电镜下观察抗菌s i o 。 粉体对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抗菌行为，而且首次在透射电镜下发现了细菌 芽孢的死亡过程，证实整个抗菌过程不是抑菌而是杀菌。 1 6 2 0 0 7 属硕士研究生学位论文 第二章表面接枝高分子量季铵盐抗菌剂的合成工艺 2 1引言 为了改善抗菌剂的性能，降低它对环境、人畜的刺激和毒害，研制具有缓释、 长效、高效、低毒安全的抗菌剂，人们正设法通过抗菌剂单体化合物的聚合或将 抗菌剂分子固定在高分子载体上制成聚合物抗菌剂，尤其是水不溶性聚合物抗菌 剂。在聚合物抗菌剂中，一般包括高分子载体、抗菌活性官能团( 一般为含氮或 磷阳离子及卤亚胺的结构) 以及连结二者的结合部位1 6 】。制备聚合物抗菌剂的聚合 方式常见的有两类：一类是多卤代烷与多叔胺的季铵化反应，常用来制备水溶性 聚合物抗菌剂；另一类是碳碳双键的加成聚合，常用来制备水不溶性聚合物抗菌 剂。 季铵盐类抗菌剂是研究较多的一类有机抗菌剂 3 0 - 3 2 1 ，高分子季铵盐由于其 优良的抗菌性能、较好的稳定性和较高的安全性已成为当今抗菌剂研究和开发的 一个热点1 3 3 - 3 5 。有人7 3 5 ) 报道了在玻璃、棉花、羊毛、尼龙上共价接枝季铵盐 型高分子抗菌剂。本章介绍的高分子季铵盐是在纳米载体上以共价方式接枝具有 抗菌功能的有机高分子季铵盐。以纳米材料为载体，先用活化剂对其进行处理， 使纳米材料表面带上活性官能基团，然后将活化后的纳米材料与高分子胺类聚合 物在有机溶剂里反应，最后用其它有机化合物进行修饰，最终制成携带高分子季 铵盐抗菌剂的抗菌纳米材料，由于抗菌功能的高分子与纳米颗粒之间是共价的连 接，不易脱落，抗菌分子不必经过缓慢释放到材料表面产生抗菌功能，而是通过 接触杀菌，抗菌功能一直存在于纳米颗粒表面，从而有利于纳米抗菌材料的应用， 其应用前景十分广阔。 2 2 材料与设备 2 2 1 主要试剂、原料及来源 纳米s i o x 粉体 聚乙烯亚胺( p e i ) 4 - - - 溴丁酰氯 贵州省纳米材料工程中心 含量 9 5 武汉强龙化工新材料公司 含量 9 5 江苏盐城利达化工厂 1 7 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 y 一氯丙基三甲氧基硅烷 贵州省纳米材料工程中心 l 一溴己烷 9 8 江苏宜兴芳桥东方化工厂 碘甲烷 分析纯江苏太仓市长江轻工助剂厂 叔戊醇 9 9 重庆化工试剂公司 异丁醇分析纯天津市科密化学试剂厂 其它一些常用的试剂均为市售分析纯试剂。 2 2 2 、仪器与设备 漩涡混合器 电热恒温培养箱 洁净工作台 电热鼓风干燥箱 立式压力蒸汽灭菌器 离心沉淀机 分光光度计 恒温磁力搅拌器 电子精密天平 2 3 实验方法 舢型 h h b 11 - - 4 2 0 型 s w - c j i f d 型 d b 2 0 6 s c 型 y x q - l s 一5 0 s i 型 l x j 型 7 2 1 1 0 0 型 8 1 2 型 a r 5 2 0 型 2 3 1 抗菌纳米s i 0 。粉体的制备 2 3 1 1 抗菌纳米s i o x 粉体的制备工艺 1 8 江苏省姜堰市康健医疗器具有限公司 上海跃进医疗器械厂 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 成都天字试验设备有限责任公司 上海博迅实业有限公司医疗设备厂 上海医用分析仪器厂 上海第三分析仪器厂 上海司乐仪器有限公司 奥豪斯仪器公司 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 s t e p l o 十c h z c z v 七 兰蒜卜埔一一 兮# 副 l q 。 c h 2 - c h 2 - 忙 9 0 - o 邓峨一5 啦 r = c h s ( c h 2 ) 6 & o h 3 图2 1 抗菌纳米s i o , 粉体的制备过程 2 3 1 2 抗菌纳米s i o x 粉体的制备步骤 抗菌纳米s i o x 粉体的制备反应过程如图2 1 所示，整个反应分四步完成，具 体如下： 纳米s i o x 粉体的活化 根据资料【3 6 】显示，暴露于硅表面的硅原子倾向于与氧原子的四面体配位， 通常以结合单价羟基，即形成表面硅羟基来完成这种配位。理论上，一个表面 硅原子可以带l 3 个羟基，因此纳米s i o 。的表面含有大量的o h 。在本步反 1 9 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 应中，选用四溴丁酰氯和y 一氯丙基三甲氧基硅烷作活化剂，对纳米s i o 。进行 处理，则四溴丁酰氯会和y 一氯丙基三甲氧基硅烷与纳米s i o 。表面的- - o h 发 生反应，使纳米s i o x 带上活性官能团，为下一步的烷基化反应做好铺垫。反应 过程如图2 1 中s t e p l 所示。 纳米s i o 。粉体的烷基化 本步反应的目的是在纳米s i o 。表面接枝上高分子含胺化合物，为下一步将 高分子含胺化合物修饰成高分子季铵盐做好铺垫。在本实验中我们选用了比较 容易被接上的高分子聚乙烯亚胺( p e i ) 作为高分子含胺化合物。反应过程如图 2 1 中s t e p 2 所示。反应中p e i 的亚胺基可以和纳米s i o x 表面上的活性官能团 发生亲核取代反应，则纳米粉体就与p e i 连接起来。 纳米s i o x 粉体的进一步烷基化 为使p e i 转化成具有抗菌功能的季铵盐，须将接枝有p e i 的纳米粉体进一步烷 基化，所用的烷基化试剂是溴己烷。文献报道【3 5 l 烷基化试剂的碳链长短和抗菌效 果直接相关。根据季铵盐抗菌机理的推测，季铵盐首先利用正电荷与微生物发生 静电吸附，吸附后利用一定的疏水作用，穿透细胞壁和细胞膜，使细胞内容物渗 漏而导致细胞死亡。碳链过短，则疏水性不够，季铵盐无法穿透细胞膜，影响抗 菌效果：碳链过长，导致分子过大，空间位阻也增大，使其无法穿透细胞膜。研 究表明【3 5 】烷基化试剂碳链长度为6 时的抗菌效果最好。因此，本实验选用了6 个碳 的溴己烷。 纳米s i o x 粉体的充分烷基化 碘甲烷是一种典型的烷基化试剂，本步操作是为了使p e i 上的胺基充分烷 基化，增加季铵盐所带的正电荷数。根据季铵盐的机理推测，正电荷是抗菌所 必需。 。 2 3 2 抗菌纳米s i 0 。粉体的抗菌性能测试 2 3 2 1 抗菌纳米s i o x 粉体的抗细菌性能测试 ( 1 ) 菌浓度吸光度标准曲线的绘制啪 细菌的菌浓度与o d 值之间存在线性关系，标准曲线的绘制采用平板菌落 计数方法而得。 具体操作如下： 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 稀释：将菌悬液稀释到1 0 、l o 、l o 一、l o 、l o 一、1 0 一、l o 一： 测o d 值：在5 6 0 n m 下测以上不同稀释度菌悬液的o d 值； 计数：分别取o 1 m l 稀释好的菌悬液涂布在事先倒好的琼脂平板上，培养4 8 h r 后，计算同一稀释度三个平板上的菌落平均数，并按下列公式进行计算： 每毫升中菌落形成单位( c f u ) = 同一稀释度三次重复的平均菌落数x 稀 释倍数1 0 ： 作标准曲线：以o d 值为横坐标，c f u 为纵坐标，得到如图2 2 所示标准曲线。 0 20 30 40 5 a b s o r b e n c y 图2 2 吸光度一菌浓度标准曲线 ( 2 ) 细菌菌悬液的制备f 3 s 】 细菌菌悬液制备的程序如下： 取冻干菌种管，在无菌操作下打开，以毛细吸管加入适当的营养肉汤( 附录a 1 ) ，轻柔吹吸数次，使菌种融化分散。取含5 0 m l 至1 0 0 m l 营养肉汤培养基 试管，滴入少许菌种悬液，置于3 7 ( 2 培养l g h 2 4 h 。用接种环取第l 代培养的 菌悬液，划线接种于营养琼脂培养基( 附录a 一2 ) 平板上，于3 7 ( 3 培养1 8 h 2 4 h 。挑取上述第二代培养物中典型的菌落，接种于营养琼脂斜面，于3 7 培 养l g h 2 4 h ，即为第三代培养物。 取菌种第3 代第1 4 代的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物( 1 8 h 2 4 h ) ，用 2 l 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 一一e、ril3一一再ijml。西d j o co；巴芑mocoo一6i 2 0 0 7 届硕士研究生学位论文 5 0 m l 吸管吸取3 0 m l 5 0 m l 稀释液( 附录a 一3 ) 加入斜面试管内，反复吹洗， 洗下菌苔。随后，用5 0 m l 吸管将洗液移至另一无菌试管中，用电动混合器混 合( 振荡) 2 0 s ，或在手掌上振敲荡8 0 次，以使细菌悬浮均匀。 初步制成的菌悬液，先测定其吸光度，根据图2 2 的菌浓度一吸光度标准曲 线，粗测其含菌浓度，然后稀释至所需的浓度。 (