（发酵工程专业论文）酵母胞外海藻糖的合成与提取工艺的研究.pdf

天津科技大学硕士学位论文 摘要 本文对酵母胞外海藻糖的测定方法、胞外海藻糖的合成工艺和海藻糖的 提取与纯化进行了研究。 通过实验确定了用生物传感仪蒽酮比色测定胞外海藻糖的方法，该法具 有分析过程简单、所需样品少、时间短、准确等优点。 确定了高温法合成胞外海藻糖的工艺。种子刺激培养的最适条件为：3 0 振荡培养2 2 h 后，添加1 5 n a c i ；培养至2 2 h 后，升温至3 9 | 。c ；培养至 2 4 h 后，调p h 5 0 ，培养至2 5 h 后结束发酵，离心收集酵母细胞。胞外海藻糖 合成工艺为：初始糖浓度3 ，p h 6 5 7 0 ，酵母干固物接种量为4 4 9 l ，3 9 振荡培养1 h 后迅速升温至5 0 。c 反应5 h 结束，在此条件下胞外海藻糖含量 可达7 3 1 9 l 。 通过对5 l 罐胞外海藻糖合成试验发现，胞外海藻糖的合成需要适量的 溶氧( 1 0 左右) ，过高或过低的溶氧均不利于海藻糖合成；随着接种量的升 高，胞外海藻糖积累量升高。在酵母泥接种量为5 条件下，胞外海藻糖的最 终浓度为1 0 9 9 l 。 用5 0 ( v v ) 乙醇溶液提取胞内海藻糖，适宜抽提时间为6 0 m i n ，酵母 浓度为7 0 9 l ，在此条件下，海藻糖提取率可达9 8 8 1 。海藻糖提取液用离 子交换进行纯化，适宜的工艺条件为：流速3 , - - 6 m l m i n ，温度4 0 ，在此条 件下，产品纯度达9 8 以上，具有实际应用价值。对于胞外海藻糖，通过实 验确定了胞外海藻糖反应液上柱体积的计算方法。在温度4 0 ，流速 1 0 m l m i n 时，用蒸馏水洗脱进行离子交换，可实现海藻糖与葡萄糖的完全分 离，海藻糖收率可达到8 3 2 9 以上。海藻糖的适宜结晶条件为：乙醇添加量 为浓缩糖液体积的4 倍，糖液质量浓度4 0 ，结晶温度4 0 。c ，海藻糖纯度可 达9 9 ，结晶收率8 9 。本研究为酵母胞外海藻糖的生产打下了一定的理论 基础。 关键词：胞外海藻糖，面包酵母，合成，离子交换，结晶 a b s t l r ac t i nt h e p a p e a t h em e t h o do f m e n s u r a t i n ge x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s e ，t b e t e c h n o l o g yo fs y n t h e s i z i n ge x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s e ，a sw e l la st h ee x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o no f t r e h a l o s ew e r e s t u d i e d an e wm e t l l o dw i t h1 e s ss a m p l e sa n ds h o r t e rt i m ew a ss t u d l e dt od e t e r m i n e e x t r a c e l l u l a r - t r e t m l o s ea c c u r a t e l y t h em e t h o do fh i g h t e m p e r a t u r ep a s s i v a f i o nw a sd e t e r m i n e dt o s y n t h e s i z e e x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s e t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n st os t i m u l a t ey e a s t si s ：c u l t u r e y e a s t su n d e rt h et e m p e r a t u r eo f 3 9 。cf o r2 2 h a d di 5 n a c la n dc u l t u r et ot h e 2 3 一h o u r , i n c r e a s et h et e m p e r a t u r et o3 9 。c a n dc u l t u r et ot h e2 4 “h o u r ，r e g u l a t e t h ep h 5 0a n dc u l t u r et ot h e2 5 “h o u r , t h e ns t o pt h er e a c t i o n ，c e n t r i f u g a t i n ga n d c o l l e c t i n gt h ey e a s t t h es y n t h e s i z i n gt e c h n o l o g yo fe x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s ei s ：t h e i n i t i a l g l u c o s ec o n c e n t r a t i o n3 p h 6 5 7 0 ，c u l t u r ey e a s t s f o rl hu n d e rt h e t e m p e r a t u r eo f3 9 ，t h e ni n c r e a s et h et e m p e r a t u r et o5 0 ，c u l t u r ey e a s t sf o r5 h ， t h e n s t o pt h er e a c t i o n t h ef e d b a t c hr e a c t i o ni nw h i c ht h ee x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s ew a ss y n t h e s i z e d w a st e s t e di nt h e5 lb i o r e a c t o r i ti sf o u n di nt h ee x p e r i m e n t a t i o nt h a tt h es u i t a b l e o x y g e n c o n c e n t r a t i o no f1 0 i sn e e d e dt 0a c c u m u l a t ee x t r a c e u u l a r - t r e h a l o s e w i t h t h ei n c r e a s eo fs e e dv o l u m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no ft r e h a l o s ei nt h er e a c t i o nl i q u o r i n c r e a s e st o o e x t r a c t i o na n d p u r i f i c a t i o nt e c h n o l o g y o f t r e h a l o s ef r o m y e a s tw a s s t u d i e di n t h ee x p e r i m e n t t h ee x t r a c t i o nr e c o v e r yo ft r e h a t o s ei sa b o v e9 8 81 u n d e rt h e c o n d i t i o n ：t e m p e r a t u r e8 0 。c ，t h ec o n c e n t r a t i o no fy e a s t s7 0 9 l a sw e l la st h e e x t r a c t i o nt i m e6 0r a i n t h ee x t r a c t i o nl i q u o rw a sp u r i f i e db ya n i o na n dc a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y u n d e rt h ec o n d i t i o n ：f l o wr a t e3 6 m l m i n ，t e m p e r a t u r e 4 0 t h ea n i o na n dc a t i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y i su s e dt o p u n f y e x t r a c e l l u l a r t r e h a l o s e b yc a l c u l a t i n g t h ev o l u m eo fe x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s e r e a c t i o nl i q u o r , t h et r e h a l o s ew a s s e p a r a t e df r o m t h eg l u c o s ec o m p l e t e l yu n d e rt h e c o n d i t i o n ：f l o wr a t e 1 o m l m i n t e m p e r a t u r e 4 0 t h es u i t a b l e c r y s t a l i n g c o n d i t i o n sa r et h en c o h o lv o l u m e ：4t i m e so f c r y s t a l i n gl i q u o rv 0 1 a n dc r y s t a l i n g t e m p e r a t u r e4 0 。c t h ep u r i t yo ft r e h a l o s ep r o d u c e db yt h et e c h n o l o g yi s a b o u t 9 9 w i t ht h er e c o v e rr a t eo f 8 9 ， k e y w o r d s ：e x t r a c e l l u l a r - t r e h a l o s e ，s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，s y n t h e s i z i n g c o n d i t i o n s ，i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y , c r y s t a l i n g 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 海藻糖概述 1 1 1 海藻糖的理化性质 海藻糖( t r e h a l o s e ) 是由两个葡萄糖分子通过a l ，l 糖苷键连接成的 非还原性双糖，分子式为cj 2 h 2 z o i l 2 h z o ，化学名称为a - d 一毗晴葡萄糖基一 n d 吡喃葡萄糖苷。海藻糖的二水化合物是从浓缩的水溶液中结晶出的最 为稳定的结晶体。能溶于水和热醇中，不溶于乙醚，海藻糖的水溶液性质稳 定，无色无味，口感略带甜味【2 】。海藻糖不能使斐林试剂还原，在体内可被 酶水解成葡萄糖而被利用。它最初由w i g g e r s 等于1 8 8 2 年从黑麦麦角中分离 得到，后来发现它广泛存在于低等植物、藻类、细菌、真菌、酵母、昆虫及 无脊椎动物中，近年来还发现人体的肾脏内亦存在海藻糖。海藻糖有nn 、 ab 、01 3 三种光学异构体，其中na 异构体是自然界中广泛分布的一种异 构体，从酵母中提取的海藻糖为na 型，白色结晶，二水化合物晶体的熔点 为9 6 5 9 7 5 ( 无水晶体的熔点为2 0 3 ) ，比旋度 a 】0 2 0 = + 1 7 8 3 。( 2 0 ，1 水溶液) 。 海藻糖和蔗糖是同分异构体，具有类似的结构，经常在生物中同时存在。 海藻糖作为甜味剂虽然不能和处于主导地位的蔗糖相e b ，但在其他方面，它 又具有蔗糖所不可比拟的功能1 5 。海藻糖是无毒产热的双糖，且它对热、酸 非常稳定，是天然双糖中最稳定的糖，不为一般的酶所分解，只为具有特异 性的海藻糖酶水解，不能使斐林试剂还原。由于不具有还原性，即使与氨基 酸、蛋白质等混合加热也不会发生美拉德反应。具体表现为【2 ：( 1 ) p h 稳定 性：p i t 3 5 1 0 ，1 0 0 。c ，2 4 h ，9 9 残存；( 2 ) 水溶液热稳定性：1 2 0 。c ，9 0 m i n ， 不褐变：( 3 ) 含氨基酸水溶液的热稳定性：沸水中，9 0 m i n ，不褐变；( 4 ) 含 蛋白质水溶液的热稳定性：沸水中，9 0 m i n ，不褐变；( 5 ) 水溶液的长期保存 稳定性：3 7 ，1 2 个月，不分解，不褐变。 海藻糖的溶解度为蔗糖的2 3 ，甜度约为蔗糖的4 5 ，食用后口中不留后 昧，昧质爽口。含两分子水的结晶海藻糖，没有吸湿性；但无水结晶有很强 的吸湿性，是优质的天然脱水剂【6 】。天然的蔗糖只有无水结晶一种形态，它 没有吸取其他物质水分子的特性；乳糖和麦芽糖与海藻糖一样具有含水结晶 和无水结晶两种结晶态，它们的无水结晶粉末也具有吸水性，但它们吸取的 水量只有海藻糖的1 2 ，而且这两种糖具有还原性末端，对与之配合的物质的 稳定性产生很大的损害，它们不能用做脱水稳定剂。 1 前言 1 1 2 海藻糖的生物学特性 海藻糖在生物体内的作用尚未完全明了，最早只是认为海藻糖是动植物 体内的一种能量储存形式，在机体内，海藻糖的积累和外界环境压力有关， 如干燥通常会导致海藻糖的快速积累，而复水后又迅速代谢 7 】。 如面包酵母在其生长的稳定期可积累大量海藻糖，但当为其补充新的碳 源时，细胞就快速分解海藻糖并恢复其生长繁殖。海藻糖能被海藻糖酶代谢 成二分子葡萄糖，进入能量代谢，提供和其它碳水化合物相同的能量，这似 乎是碳水化合物的贮存形式。还有人把它作为糖酵解的调节物【8 】。但随后的 大量研究表明，海藻糖与某些物种对外界恶劣环境( 诸如冷冻、加热、脱水 和干燥、渗透压、接触毒性化合物等) 所表现出的抗逆耐受力有直接的关系【“】。 海藻糖是对于环境变化形成的应激状态( 或称之为紧张状态) 具有高抗性的 物质，是生物体内的一种典型的应激代谢物。可保护d n a 以防止放射线造成 的损伤。外源性的海藻糖也能对生物体和生物大分子起到良好的非特异性保 护作用，使生物在许多不利情况下维持细胞的稳定。海藻糖的这种生物保护 现象的机理亦在研究之中，一般认为海藻糖的生物保护机理在于强力的束缚 水分子，与膜脂质共同拥有结合水或海藻糖本身起到代替膜结合水的功用， 从而防止牛物体膜和膜蛋白等的变性。 目前主要有2 种假说解释海藻糖稳定生物分子的机理：水取代作用理论 和玻璃态或糖浆态理论，9 。 水取代作用理论：生物体中的蛋白质、碳水化合物、脂肪和其他大分子 物质均被一层水膜保护着。这层水膜是维持其结构和功能特性不可缺少的物 质基础。在干燥过程中，这层水膜逐渐被除去，导致这些大分子物质发生不 可逆变化，如蛋白质分子的空间结构发生改变等。当蛋白质的结构水失去时， 海藻糖可以在生物分子的失水部位以羟基和蛋白质分子形成氢键，取代了由 水形成的氢键，这使得蛋白质分子在缺水条件下仍保持其原有结构，而不丧 失活性 1 0 , 2 。 玻璃( 糖浆) 态理论：该假说认为当干燥生物活性物质时，海藻糖紧紧 地包住相临近的分子。形成一种在结构上与玻璃态的冰相似的碳水化合物玻 璃体。其扩散系数很低，分子运动变性反应非常微弱，能够使生物分子维持 一定的空间结构j 。 目前，这两种假说还不能完全解释现有实验现象，如海藻糖与葡萄糖对 限制性内切酶稳定性的显著差别是与“水替代”假说不符的；同样，玻璃态 假说也有一些不能解释的问题，如高温下海藻糖对生物制品的稳定性问题。 因此，海藻糖保护生物活性物质的机理，仍需深入研究。 天津科技大学硕士学位论文 1 1 3 海藻糖的应用 海藻糖最奇特的功能特性是其具有非特异性保护功能。大量的研究证据 表明，某些物种对外界恶劣环境所表现出的抗逆耐受力和它们体内存在的海 藻糖有直接关系【l ”。如从植物细胞的脱水过程中可以发现，海藻糖能够有效 的保护缅胞膜结构和蛋白质，明显地使植物细胞处于悬浮状态，从而可保存 其固有的风味、色泽和纹理。海藻糖对由环境变化形成的应激状态具有高抗 性。许多含有海藻糖的动植物完全干燥失水后仍维持活性，一旦遇水就立刻 复活。 研究表明外源性的海藻糖对生物体和生物大分子亦具有良好的非特异性 保护作用。如在海藻糖存在下对保存条件苛刻的基因工程酶类、各种疫苗和 抗体等进行干燥复水后的功能性研究，结果表明海藻糖的保存性能优越。由 于海藻糖具有这种奇妙的特性，使其在医药、食品、化妆品、农业等方面具 有广泛的应用价值，成为一项极有开发和应用前景的产品。 ( 1 ) 在食品方面的应用 海藻糖是一种非特异性保护剂，似乎它对所有的生物分子都具有一定的 保护功能，而且它化学性质非常稳定，与其它糖相比，不会焦糖化，甜度低， 在人体内可被酶降解为葡萄糖，因此可以作为一种新型的天然防腐剂在食品 工业上大显身手。目前已有人将其用于奶类、禽蛋及番茄酱的保存，高能干 燥食品也可用海藻糖来保存 i ”。 另外，海藻糖还是一种能改善f 燥食品质量和风味的天然食品添加剂。 当今食品工业最大的挑战就是食品防腐中的食品质量稳定性和安全性。食品 干燥防腐技术已经比较成熟，但在产品的最后质量上经常出现蛋白质或其他 成分变性的问题。现有的防腐剂大多有毒副作用，所以使用时需限量。虽然 其它糖类也具有海藻糖类似的保护功能，但其甜度大，致使产品加工处理后 其甜度难以为人接受。海藻糖恰好弥补了这些防腐剂或技术的缺陷，在干燥 前加入海藻糖可防止蛋白质或其它成分变性。如含有鸡蛋等蛋白质的食品可 以用海藻糖防止因干燥和冷却引起的变性，3 海藻糖与鲜蛋液混合后，于4 5 干燥，产生无气味黄色粉末，可置于室温保存，使用时很容易水化，水化 后产品和鲜蛋液难以区分。另外，当鲜奶用海藻糖干燥后，一旦复水也表现 出与原鲜奶同样的特性。用海藻糖干燥的食品，如肉类，水果等可延长货架 期。当这些食品在复水时，能恢复其原有的颜色、味道和质地，甚至维生素 类在脱水期间也能保留l l 6 ”j 。 海藻糖可作为口感改良剂，将其与食盐共存，能增强食品优良口味，改 善口感。而在蔗糖中加入一定量的海藻糖，其甜味优良，可广泛用于调味料、 点心、面包、口香糖、火腿、乳制品等。无水海藻糖有很强的吸湿性，是天 1 酊言 然脱水剂。通过无水海藻糖变为结晶海藻糖吸收水分，以防粉末食品粘着结 块。可广泛用于糖衣食品、各种点心、颗粒佐料、酥脆饼干等 1 5 , 1 7 】。 海藻糖具有抗干燥的作用，又具有良好的加工特性，化学性质稳定，能 阻止还原糖和蛋白质的游离氨基反应，抑制美拉德反应的发生；而且由于甜 度低，对食品的风味影响很少，在食品加工中的应用潜力主要是改进食品干 燥工艺，加工出更好的食品。加热干燥含蛋白质的食品，同时要保持其原有 质量和风昧，一般的添加剂往往很难达到这一要求，而在海藻糖存在时下燥 此类食品，则能保持其结构、色泽、风味和烹调特性。高能量的干燥食品也 可利用海藻糖保持其稳定性，同时增加其热能值。 ( 2 ) 在生物学上的应用 海藻糖的独特性能使其在生物学领域具有广阔的应用前景。海藻糖己广 泛地应用于酶制剂、农业、高抗性菌种选育和医学领域。 在分子生物学方面，随着生物技术的发展，各种工具酶【l8 1 、培养基、探 针、抗体、细胞器和生物试剂的应用愈来愈广泛，而海藻糖的良好保护性能 可使生物制品在常温下保存，使生命科学研究变得方便、简单、有效。如蛋 白质尤其是酶在干燥过程中根容易失活，例如磷酸果糖激酶是四聚体，在于 燥过程中能解离成无活性的二聚体。如果在干燥前加入一定量的海藻糖，即 使极度“f ：燥，磷酸果糖激酶性能完全稳定而且仍保持原活性。 在医药生物制品方面，减毒疫苗、单克隆抗体、激素、重组人蛋白、血 液制品、载药脂质体和活菌制剂等目前多采用真空冷冻干燥法制备和低温下 保存1 1 3 , 6 ，如用海藻糖干燥医用生物制品，就能在常温下保存，将为其保存、 运输和使用带来极大方便。据统计，由于缺乏必要的冷冻设备，第三世界约 有9 0 的疫苗失活而白白损失，即使像英国这样的发达国家，其损失率也在 4 0 左右。如果用海藻糖干燥生物制品，不仅可保护其活性，还可在常温下 存放。海藻糖还可在外科领域用来保护皮肤、血液和器官等，为器官移植和 生殖工程等提供有力的保障【2 0 1 。童桥等研究了海藻糖对载药脂质体在干燥再 水化过程中能起到保护作用。在有足够海藻糖存在时，包载抗肿瘤药物阿糖 胞苷和阿霉素的脂质体，在经干燥、再水化后，其原有的内含物8 0 以上被 保存下来，比无海藻糖存在的增加4 倍以上。所以海藻糖对脂质体在干燥和 再水化过程中具有保护作用，这将有利于脂质体在制药工业上的应用。 海藻糖在农业方面也大有用武之地。高等植物体中己证明有海藻糖代谢 的存在，但大多数维管植物中其含量相当低，所以可利用外源的海藻糖来研 究其在逆境条件下对植物的生理功能，利用o 1 的海藻糖溶液浸泡水稻种 子，经2 和6 。c 低温处理后，水稻幼苗的细胞电解质渗出率显著降低，淀粉 酶的活性及幼苗可溶性糖含量明显提高，对寒害的修复能力也提高；而且处 理温度越低，海藻糖的相对效应就越明显。海藻糖能防止叶绿素的降解，保 天津科技大学硕士学位论文 持较高的根系活力，增加高盐条件下干物质的积累和植物生长速率。另外， 把海藻糖合成酶基因导入植物中并使其在作物体内表达，可望培育出能抗旱、 抗寒、抗冻、耐盐的作物新品种，如利用转基因植物生产的水果或蔬菜还可 使其在收获加工后显得新鲜，并延长其货架寿命，且能保持其原有的风味和 质地 2 ”。 海藻糖对活菌体细胞的保护作用也比较明显 1 。海藻糖对嗜热链球菌和 植物乳杆菌菌体细胞具有保护作用，研究表明：在冷冻干燥过程中，被海藻 糖保护的细胞存活率分别达到7 5 年d3 3 ，而对照仅为1 9 和1 ；用9 0 高温 处理干燥状态和溶液状态的嗜热链球菌，海藻糖能明显提高细胞的耐热性； 用冻融法反复处理嗜热链球菌4 次和8 次，加海藻糖保护的细胞存活率显著 高于对照。在扫描电镜下观察这些冻融细胞，加海藻糖保护的菌体细胞饱满、 完整，对照则有明显的破裂、塌陷，细胞间有丝状物。海藻糖含量较高的活 性于酵母其存活率也明显高于低海藻糖含量的活性干酵母 2 2 1 。 1 2 海藻糖的合成与代谢 由于海藻糖具有独特的生理功能，引起了各国科学家的极大兴趣。8 0 年 代后，相继开展了海藻糖的生理生化和分子生物学研究。海藻糖在不同的微 生物中具有不同的生物合成途径。在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l d 和酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) t 的合成是两步反应盼2 4 1 ，如图1 - 2 。 u d p 葡萄糖1 i 6 p 葡萄糖_ m 9 2 + t p s lm 9 2 + t p s 2 t 卜6 p 一海藻糖弋卜 海藻糖 一 u d pp i 图1 2海藻糖在酵母中生物合成途径 在酿酒酵母中，海藻糖的合成酶系比较复杂，两个重要酶是6 一磷酸海藻 糖合成酶和6 磷酸海藻糖磷酸酯酶。完整的合成酶是由分子量为5 6 k d 、1 0 2 k d 和1 2 3 k d 三个多肽组成的复合物。这三个多肽分别由t p s l 、t p s 2 和t s l i 基因所编码，而且分布在酵母的第1 i 、和染色体上，其中5 6 k d 多肽具有 t p s l 基因所编码的6 磷酸海藻糖合成酶活性 25 j ；1 0 2 k d 多肽具有t p s 2 基因 所编码的6 磷酸海藻糖磷酸酯酶活性【2 6 】；被t s l l 基因所编码的1 2 3 k d 多肽 被认为具有调节功能并具有6 一磷酸海藻糖磷酸酯酶活性【2 ”。研究表明，t p s l 的插入失活引起6 一磷酸海藻糖合成酶活性的大大降低，说明t p s l 是此酶的 重要组成成分；t p s 2 的插入失活也可引起6 磷酸海藻糖磷酸酯酶活性的丧 失，在适合海藻糖积累的环境条件下引起6 磷酸海藻糖的大量积累，从而使 1 前言 海藻糖的积累大大减少 2 7 1 。中科院微生物研究所杨波等【2 研用p c r 法克隆了 1 _ 5 k b 的酿酒酵母海藻糖合成酶基因t p s l ，将该片段连接到p u c l 9 载体，通 过转化分别引入海藻糖合成酶基因缺失和缺陷的大肠杆菌( 最g c h e r i c h i a c o i l ) f f 4 1 6 9 和f f 4 0 5 0 。对转化株的质粒d n a 酶切分析表明，二者均含有 1 5 k b pp c r 克隆片段。生长曲线实验证明，带有克隆片段的转化株在含 0 5 m 0 1 l n a c l 的高渗透压基础培养基中生长良好；用高效液相色谱结合蒸发 光散射技术测定细胞内海藻糖，实验证明转化株能够合成海藻糖。陈红漫等2 9 从耐热性极强的酿酒酵母菌株a s 2 1 4 1 6 中分离纯化出总r n a 和m r n a ，以a m v 逆转录酶合成c d n a ，采用保守引物，从该c d n a 中扩增出t p s l 基因，对该基 因的全序列分析表明，该基因含有1 5 0 7 个核苷酸，与国外报道相关基因的同 源性达9 9 6 。利用b a m h i 和s a c i 切点将t p s l 基因插入植物表达载体p b i n 4 3 8 多克隆位点上，得到t p s l 基因植物表达载体重组质粒。此外，b e i l 和d e v i r g i l i o 等人的工作表明，由t p s l 和t p s 2 基因编码的5 6 k d 和1 0 2 k d 两条 肽链可被热休克诱导合成。在编码合成酶复合物的基因中发现，含有典型的 g a a n n t t c 热休克因子和最新鉴定的c c c c t 序列。这些结果为从理论上解释海 藻糖能保护细胞抵御高温胁迫提供了遗传学证据【2 5 2 6 1 。另外，这三个基因的 表达均受葡萄糖的阻遏。研究发现，6 磷酸果糖在3 5 以下是t r e 6 p 合成酶 的激活剂：m g ”可使t r e 6 p 合成酶活性增加，但高浓度会抑制其活性；而无 机p 却非竞争地抑制了合成酶的活性，但激活t r e 6 p 磷酸酯酶的活性 3 0 , 3 1 , 3 2 】。 海藻糖的分解代谢是在海藻糖酶( t r e h a l a s e ) 的作用下进行的。海藻糖酶 有两种【3 ”，一种为存在于液泡中的酸性海藻糖酶( a t i t l ) ，它的最适p h 为4 5 ， 具有较高的热抗性。因为它不能被蛋白磷酸化作用所调节，所以此酶又称为 非调节型海藻糖酶；另一种为存在于胞质中的中性海藻糖酶( n t h l ) 3 z ，它 的最适p h 为7 0 ，具有较低的热抗性，活性由需要c a m p 的蛋白激酶的磷酸化 作用来调节，非磷酸化形式是没有活性的，所以又称为调节型海藻糖酶 2 4 ，1 。 中性海藻糖酶的基因( n t h l ) 已被克隆【3 3 1 ，在肽链的n 端区存在两个可能的磷 酸结合位点，a r g l 7 a r g l y s s e r 2 0( s e r 2 0 被磷酸化)和 a r 9 8 0 a r g g l y s e r 8 3 ( s e r 8 3 被磷酸化) ，其磷酸化参与调节细胞海藻糖浓度，以 对不同环境做出响应。另外，中性海藻糖酶和酸性海藻糖酶相比具有较高的 砌值，酸性海藻糖酶的k m 值为0 5 至3 n l f n o l l 之间，而中性海藻糖酶的k m 值据报道为4 5 m m o l l 、1 0 m m o l l 和5 5 m m 0 1 l 1 3 。 关于二种海藻糖分解酶在酵母细胞内的协同分解机制，现在还不十分清 楚。j o h nk i m ( 1 9 9 6 ) 解释为在胞液中n t h 仅在生长周期的对数期有活性，当 细胞生长在可发酵糖丰富的培养基中时，海藻糖可被n t h 快速分解。但海藻 糖的分解不能单单被n t h 的磷酸化和脱磷酸化所调节，可能的原因是n t h 较 a t h 稳定性差，而分解时需要a t h 参与 3 5 o 因为细胞从对数期至稳定期c n p 6 天津科技大学硕士学位论文 和可发酵性糖水平降低，导致了n 丁h 的脱磷酸化，造成其活性丧失；同时， a t i q 被合成，而又由于a i h 存在于胞囊中，与存在于胞液中的底物海藻糖分离， 因此，海藻糖便开始积累p ”j 。在稳定后期营养开始缺乏，此时海藻塘便可 作为能源被分解利用。研究表明在胞囊膜上存在一种海藻糖运输器，可将海 藻糖从胞液运输至胞囊中和a t h 接触而被分解利用l ”3 8 , 3 9 1 。另外，研究报道 海藻糖酶缺失菌株在同种条件下可积累较多海藻糖【4 叫“。 1 3 海藻糖的生产方法 迄今为止，正在研究和开发的海藻糖生产方法有酵母提取法【2 0 43 1 、发酵 法p 9 、酶合成法 4 4 5 7 1 。 1 3 1 酵母提取法 酵母提取法是采用特殊培养工艺使酵母细胞内积累较高的海藻糖，然后 用酒精抽提法提取。由于海藻糖属酵母胞内产物，且合成受外界环境条件的 影响较大，因而用此法生产海藻糖的产量较低，成本较高。本世纪四十年代， 欧美从面包酵母中提取海藻糖取得成功，并建立了一套用酒精从面包酵母中 提取分离海藻糖的方法，至今仍被用来生产海藻糖1 2 0 】。 采用特殊的培养工艺，通过调节多种限速生长的因素，如营养饥饿、温 度休克、干燥或冷冻等造成海藻糖的积累，导致其含量增加，这样可使酵母 细胞内海藻糖的含量达其干基的1 5 2 0 。酵母中海藻糖的含量由合成与分 解的平衡调节。在海藻糖合成期间，必须使6 一p 海藻糖合成酶处于活性状态， 而中性海藻糖酶处于非激活态，这样才能使海藻糖的合成大于分解，有利于 积累。从酵母中提取海藻糖，首先要保证细胞含有较高的海藻糖，并保持不 被酶所分解，这要通过多因素调控来实现。由于海藻糖积累是在碳源有限时 才能出现，所以一般不存在其它单糖和双糖的干扰，在除去蛋白等大分子物 质和细胞碎片以后，用乙醇抽提可以得到含二分子结晶水的海藻糖晶体。 1 3 。2 发酵法i ”1 发酵法是在一定的基质上培养微生物，通过微生物发酵产生海藻糖，再 由培养液中提取精制而成。例如以正烷烃为碳源培养节杆菌属o r t h r o b a c t e r ) 的发酵生产，以砂糖和葡萄糖为基质培养短茎细菌属( b r e v i b a c t e r i u m ) 、棒杆 菌属( c o r y n e b a c t e r i u m ) 等的发酵生产，还有利用诺卡氏菌属( n o c a r d i a ) 、丝核 菌属( r h i z o c t o n i a ) 、微球菌属( m i c r o c o c c a c e a e ) 等微生物的培养液来制造的。但 该法由于转化率不高，副产物多，因此未见工业化大生产报道。 目前，国内外利用酵母合成胞外海藻糖尚无报道，日本的堀津浩章等【5 耻 ( 1 9 9 7 ) 将处于稳定初期的酵母细胞培养液加热至4 5 ，保温4 1 9 h ，观 察到胞内海藻糖有释放到胞外的现象，这可能是由于加热使细胞壁破坏，渗 透性增加的缘故。但此法生成海藻糖的发酵水平也较低，仅为0 2 。 前言 采用基因工程的手段利用微生物和植物积累海藻糖是最近研究的一种方 法”“”1 。美国加洲的c a l g e n e 公司和英国剑桥q u a d r a n t 公司联手，研究利用 大肠杆菌基因工程菌，通过发酵，进行胞外海藻糖的商业化生产；另外目前 还有人进行能够合成海藻糖的重组植物和微生物的研究工作，在植物中的研 究主要是将编码葡萄糖转化成海藻糖的酶的基因引进产糖的作物中，使其能 在植物体内生成海藻糖。例如，英美科学家利用基因工程手段，已使番茄积 累海藻糖，并正在研究把基因引入其他水果：荷兰摩根公司也开始研究用植 物生产海藻糖。有人将一种革兰氏阴性的埃希氏菌的基因转入马铃薯使其在 此转基因植物中表达，马铃薯叶子内部即产生海藻糖，海藻糖达其湿重的 0 0 1 2 。此种方法的研究刚刚起步，目前还在进一步研究、摸索之中。 1 3 3 酶合成法 所谓酶法生产是利用酶制剂所具有的转糖基作用，在离体条件下作用于 底物，生成海藻糖。酶转化法制取海藻糖的途径有多种，按其作用的底物， 主要分为以葡萄糖、麦芽糖、淀粉为底物的三种方法。 1 3 3 1 以葡萄糖为底物 人们在研究酵母的生物合成途径时，发现酵母利用体内的6 - p 一海藻糖合 成酶和6 - p 一海藻糖磷酸酯酶，经两步作用将两个葡萄糖分子转化为海藻糖。 据此，h j d c k ik i z a w a 等人在小球菌变异株菌体内提取出合成酶，转化葡萄糖 为海藻糖。但这一过程需要消耗高能物质u d p 或g d p ，且酶活很不稳定，因此 用该方法很难实现大规模的工业化生产【5 “。 1 3 3 - 2 以麦芽糖为底物 以麦芽糖为底物的酶转化法目前发现有两种。 1 3 3 2 1 利用某些磷酸化酶由麦芽糖二步转化为海藻糖 s a w a om u r a o 等详细研究了由麦芽糖生物合成海藻糖的途径5 7 】： 麦芽糖磷酸化酶 麦芽糖+ p i 葡萄糖+ b 海藻糖磷酸化酶 卜磷酸一葡萄糖卜海藻糖+ 磷酸 第一步反应：麦芽糖在海藻糖磷酸化酶的作用下生成葡萄糖和b 一卜 磷酸一葡萄糖。第二步反应是葡萄糖和b 一卜磷酸一葡萄糖在海藻糖磷酸化酶作 用下生成海藻糖和磷酸h ”j 。日本专利曾介绍用麦芽糖磷酸化酶和海藻糖磷 酸化酶处理麦芽糖就可以生产海藻糖。酶反应完成后，从反应液中除去沉淀 物，含有海藻糖的液体进一步用阴离子交换树脂纯化，然后，再用一种硼酸 型阴离子交换树脂吸附海藻糖，采用硼酸钾分级洗脱和收集。含有海藻糖部 分经阳离子交换树脂处理和浓缩，然后加入少量乙醇蒸馏除去硼酸，最后的 浓缩液用乙醇进行重结晶，可得到二水海藻糖晶体。研究表明，此法生产海 藻糖转化率较低，提取丽难，且酶不易制备，不适宜于工业化生产口。1 。 天津科技大学硕士学位论文 1 3 - 3 2 2 利用海藻糖合酶将麦芽糖一步转化为海藻糖 许多细菌中都有海藻糖合酶，如脂肪杆菌( p i m e l o b a c t e rs p ) 【4 4 ，48 1 、恶 臭假单胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) 、水生嗜热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 等。 这种酶是分子内转糖基酶，能将麦芽糖的n 一1 ，4 糖苷键转化成一l ，1 糖苷 键，但不作用于葡萄糖，麦芽三、四、五糖，麦芽寡糖、曲二糖、黑曲霉二 糖、异麦芽糖、海藻寡糖、蔗糖、松二糖、异麦芽寡糖和乳糖。这种酶在催 化麦芽糖转化为海藻糖的过程中不消耗高能物质，不需要磷酸，且转化率高 达7 0 8 0 ，海藻糖产率和麦芽糖的浓度( 2 5 一4 0 ) 无关。这为海藻糖的大 规模生产提供了有利条件。 1 3 3 _ 3 以淀粉或淀粉水解物为底物 它是由新型葡糖基转移酶和新型a 一淀粉酶联合作用而形成的f 4 5 ，4 6 1 。1 9 9 3 年日本林原生化研究所首次发现两种新的酶低聚麦芽糖苷基海藻糖生成 酶( m t s a s e ) 和低聚麦芽糖苷基海藻糖水解酶( m t h a s e ) ，利用这两种酶的协 同作用，将一定链长的直链淀粉转化为海藻糖，在世界上最先开发出直接从 直链淀粉以极高得率生产海藻糖的技术【4 7 ，5 ”，为海藻糖的工业化生产开辟了 新途径，以直链淀粉为底物生产海藻糖的机理如下： m l s a s em l h a s e ( c 6 h 1 0 0 6 ) m ( c 6 h 1 0 0 6 ) n - 2 t r e h a l o s e ( c 6 h 1 0 0 6 ) + t r e h a l o s e 此反应分两步完成，第一步，m t s a s e 从麦芽低聚糖( 淀粉液化液) 的还 原性末端开始，通过分子内转苷作用，将q 一1 ，4 键转变成n l ，1 键，使原 麦芽低聚糖转变为带有一个海藻糖结构的麦芽低聚糖。此酶是一种分子内转 糖基酶，称为麦芽寡糖基海藻糖合酶；第二步，m t h a s e 专一地作用与a 1 ，1 键相邻的a l ，4 键，从而使原麦芽低聚糖变为少两个葡萄糖苷的低聚糖和游 离的海藻糖，称为麦芽寡糖海藻糖基水解酶。如果n 一2 1 3 ，则上述反应继续 进行。所以如果反应完全，其最终产物主要为海藻糖及一部分葡萄糖和麦芽 糖。 另外在帕拉金糖( p a r a r i n o s e ) 的生产中，采用固定化葡萄糖基转移酶， 使底物蔗糖的1 ，2 一糖苷键结合转变为1 ，6 一结合键，生成一种新的双糖。这种 反应的副产物也有海藻糖。在帕拉金糖结晶和分离后，母液中含有的海藻糖 经过复杂的离子交换树脂处理纯化，可以得到二水海藻糖结晶。 酶合成法虽然具有特异性高和快速温和等特点，但所用的酶需要精制， 制酶的费用很高，且由于酶法生产海藻糖所用底物一般为麦芽糖、低聚糖和 淀粉，中间产物较多，其产物分离过程复杂，这样就增加了分离的费用。 9 1 前言 1 4 海藻糖的提取与分离 ( 1 ) 胞内海藻糖的提取与分离 用于提取海藻糖的酵母中同时存在海藻糖酶，在条件适宜时，海藻糖会 被迅速水解，为抑制酶的水解以及防止蛋白质及多糖的溶出，可以选用乙醇、 三氯乙酸等有机溶剂提取。 l i l l i e 6 0 】等报道过三氯乙酸法提取海藻糖，但三氯乙酸是一种较强的蛋白 质变性剂，不适于工业化生产。还有报道采用纯水提取法，但对酵母悬浮粘 度过大等问题仍难于解决。目前，酵母海藻糖的提取主要有乙醇提取法1 4 3 ，6 0 , “ ，微波提取法1 6 2 - - 6 3 】等。 胞内海藻糖的纯化比较容易。由于提取液是由海藻糖、少量的杂质蛋白 和金属离子组成。蛋白质与糖的分离可以通过变性沉淀，微滤或超滤等手段 除去，而通过离子交换可以很容易除去金属离子。 ( 2 ) 胞外海藻糖的分离 在生物体内的三大物质一蛋白质、多聚核苷酸和糖中，蛋白质( 包括多 肽、氨基酸) 以及核苷酸均具有两性电离的特性，可以通过外部条件( 如p h 值) 变化使其所带正负电荷发生改变，而后进行离子交换以达到分离的目的。 也可以通过变性沉淀，微滤或超滤等手段除去。一般糖类的分子式为( c h 2 0 ) 。， 不会产生两性电离，另外糖类的异构体( 旋光异构或立体异构) 种类繁多。 目前人们还没有发现哪种单独的方法可以完全适合整个碳水化合物，包括单 糖、二糖、寡糖、糖醇、糖胺、淀粉和纤维素的分离f 6 ”。 一个容易想到的分离方法是改变糖类的物质属性，例如将葡萄糖氧化成 为葡萄糖酸，而后通过离子交换色谱法将葡萄糖除去。这样的氧化方法很多， 所用试剂如溴水、t o l l e n 试剂、稀硝酸等。张海平1 6 5 j 在对该方法的研究过程 中认为溴水氧化最高可以将9 6 的葡萄糖转化为葡萄糖酸，但是外加溴水 方面认为引入大量杂质，另一方面产生些反应中间体，如葡萄糖酸内脂等， 并且溴水浓度过大也会引起海藻糖的降解，这种分离葡萄糖和海藻糖的方法 很不理想。 葡萄糖一个重要的特性是它具有的弱酸性，这是因为葡萄糖具有c l 位的 醛基。同其它醛类一样，可以在碱性条件下发生解离，释放出一个h + 离子从 而使葡萄糖带负电荷，所以葡萄糖容易被阴离子交换树脂吸附。在此点上海 藻糖则与葡萄糖有很大的不同，海藻糖的两个葡萄糖基单体在各自的c 。位连 接形成化学键，从而使海藻糖分子的羟基发生解离比葡萄糖的c ，位的盯离 子解离要困难。为此，荣绍丰【6 6 】采用n a o h 调节混合液p h 碱性，用7 1 7 强 碱性阴离子交换树脂进行静态吸附交换分离海藻糖和葡萄糖。但是，该法采 用7 1 7 树脂一次吸附处理，葡萄糖去除率只有6 5 ，分离效果不好。采取二 次吸附处理后，海藻糖总收率只有4 9 8 。 天津科技大学硕士学位论文 1 s 本课题的立题依据及研究内容 1 5 1 本课题的立题依据 由于海藻糖所具有的独特功能，使得海藻糖在稳定生物大分子和生物膜 以及食物保鲜等方面有着广阔的应用前景。例如将海藻糖用于食品的保存， 可以防腐并保持食物原有的色泽：将海藻糖用于酶抗体、生物膜等的干燥过 程，可以将其在常温下运输和保存。目前，世界上海藻糖最大的生产商是有 一百多年麦芽寡糖生产历史的目本林原公司。实际上，海藻糖仍未被广泛大 量使用的主要原因在于其市场价格较高。由此可见，进一步探讨新的海藻糖 生产方法，降低生产成本，对海藻糖推广应用具有重大意义。 目前生产海藻糖的方法主要是酵母提取法、发酵法和酶合成法。酵母提 取法由于受到胞壁的限制，胞内积累的海藻糖会对代谢系统产生抑制作用， 胞内海藻糖的积累量有限。而酶法合成海藻糖，则需要先培养用于生产海藻 糖合成酶的微生物菌体，再将分离出的酶液进行海藻糖生产，其中酶的提取 和分离增加了生产成本，还存在着酶损失和酶活降低等问题。对于用细菌合 成胞外海藻糖，则由于转化率低，并且发酵液中杂质多丽无法工业化生产。 本论文采用的胞外海藻糖合成的方法，是种间于发酵法和酶法之间的 新的合成方法。此法通过积累胞内海藻糖，激活海藻糖合成酶系，然后采用 物理或化学的方法适度破壁，使过量的海藻糖溶出细胞，由于胞内的海藻糖 浓度降低，产物对合成酶的抑制解除，海藻糖合成酶可以利用反应液中的葡 萄糖继续合成海藻糖，因而可以大量积累海藻糖，实现