（发酵工程专业论文）构建fks1缺陷型啤酒酵母基因工程菌改良自溶性能.pdf

摘要 摘要 酵母自溶是啤酒生产中一个无法避免的现象，如果发生自溶的酵母细胞数超过细胞 总数的5 啤酒质量将发生严重恶化。酵母死亡自溶使胞内物质发生水解，由渗透作用 运向胞外，造成双乙酰反弹，醛类物质增加提高啤酒老化几率，同时由于大量胞内物质 的泄露造成啤酒浑浊，非生物稳定性下降严重影响啤酒的外观质量和口感。 以前文献报道酵母自溶只与细胞膜和胞内有关，细胞壁不发生作用。近年来国内外 学者一直对酵母自溶进行研究，通过一系列的实验发现酵母细胞壁的代谢作用与酵母自 溶有密切的联系。酵母自溶时细胞壁多聚糖也发生明显的水解作用，水解产物与胞内物 质协同影响啤酒质量，这些多聚糖主要是p 葡聚糖和甘露糖。 他基因为酵母细胞壁的b 葡聚糖合成酶基因，控制着细胞壁葡聚糖合成。经研究 发现加缺陷的酵母会启动一种补偿机制诱导同功能基因加2 表达，缺陷株细胞壁葡聚 糖量与伽，缺失量有直接的相关性。 根据同源重组的原理，将来源于啤酒酵母工业菌株g 0 3 的铜离子抗性基因( c u p l ) 取代质粒p t k 中的肛基因构建重组质粒p k c 。限制性酶切重组质粒p k c ，得到以触j 为整合位点包括c u p l 的基因片段触j ：c u p l 。用此片段转化啤酒酵母g 0 3 ，通过硫酸铜 抗性实验得到一株基因工程菌g 0 3 c ，遗传性能良好。碱法提取工程菌和原茵细胞壁的 b 葡聚糖，工程菌细胞壁的b 葡聚糖含量为3 7 7 3m g g 比原菌下降3 9 。 对实验室内保存的几株酵母菌和啤酒厂的酵母进行自溶实验，测定酵母自溶过程中 与氮关联的指标。实验发现不同菌株自溶产物中的含氮物质量不尽相同，但是非a 氨基氮a a 氨基氮的值都在7 9 1 2 2 4 的范围内波动。随着自溶时间延长，非a 氨基 氮0 【一氨基氮的值皆逐渐减小。对工程菌和出发菌进行自溶实验，结果现实工程菌的自 溶性能得到改善，比出发菌下降1 3 7 1 。 对工程菌进行生理性能测试和实验室规模的酿造实验，工程菌的生理性能发生变 化，常规发酵指标无较严重变化。主酵结束后工程菌的t b a 下降7 2 8 ，s i 系数提高 2 6 4 。成品啤酒中工程菌的t b a 降低6 5 6 ，s i 系数提高1 9 2 7 ，风味保鲜预测值 r s v 提高2 6 6 。 关键词：。啤酒酵母、自溶、工程菌、风味稳定性 a b s t r a c t a b s t r a c t i ft h en u m b e ro fa u t o l y t i cb r e w i n gy e a s tw a sm o r et h a n5 o ft h et o t a lc e l ln u m b e r , a s a nu n a v o i d a b l ep h e n o m e n o ni nt h eb r e w i n gp r o c e s s ，t h eq u a l i t yo fb e e rw o u l ds e r i o u s l y w o r s e n i n t r a c e l l u l a rs u b s t a n c e sh y d r o l y z e di n t os m a l l e rm a t t e r sa n de x c r e t e do u t s i d eb y p e n e t r a t i o nw h e nb r e w i n gy e a s td i e da n da u t o l y z e d ，w h i c hw o u l dm a k ec o n c e n t r a t i o no f d i a c e t y la n da l d e h y d ei n c r e a s e da c c e l e r a t i n gt h er a t eo fb e e ra g i n g ，w h i l eb e e rh a z e da n d a b i o l o g i c a ls t a b i l i t yd e s c e n d e d t h a ti n f l u e n c e db e e ra p p e a r a n c ea n dt a s t eq u a l i t yb e c a u s eo f al o to fi n t r a c e l l u l a rs u b s t a n c e se x c r e t e d p r e v i o u sr e p o r t st h a ty e a s ta u t o l y s i sw a so n l yr e l a t e dt oc e l l u l a rm e m b r a n ea n d i n t r a c e l l u l a rs u b s t a n c e sw i t h o u te e l lw a l le f f o r t r e c e n t l yr e s e a r c h e sa b o u ty e a s ta u t o l y s i s d i s c o v e r e dt h a te e l lw a l lm e t a b o l i s ma f r o c t e da u t o l y t i ca c t i v i t i e so fy e a s t p o l y s a c c h a r i d eo f c e l lw a l l ，m a i n l y1 3 - g l u c a na n dm a n n o s eo b v i o u s l yh y d r o l y z e dw h e na u t o l y t i ca c t i v i t i e so f y e a s th a p p e n e d ，w h i c hi n f l u e n c e db e e rt o g e t h e r g e n e r a li s1 ，3 - 1 3 一d - g l u c a ns y n t h a s eg e n ei ns a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，w h i c hi n d u c e s ac o m p e n s a t o r ym e c h a n i s ml e a d i n gt oj k s 2e x p r e s s i o n t h ec o n t e n to fg l u c a nw a sd e p e n d e n t o nq u a n t i t yo f f l c s ll a c k e d o nt h eb a s i so fh o m o l o g o u sr e c o m b i n a t i o n ，r e c o m b i n a n tp l a s m i dp k cw a sc o n s t r u c t e d b yr e p l a c i n gt h ei n t e r n a lf r a g m e n to f f l c s lo fp t kw i t hac o p yo fc o p p e rr e s i s t a n c eg e n e ( c u p l ) f r o mt h ei n d u s t r i a lb r e w i n gy e a s ts t r a i ng - 0 3 t h e nr e c o m b i n a n tp l a s m i dp k cw a sc u tb y r e s t r i c te n z y m er e a c t i o nt of r a g m e n t f k s l ：c u p li n t e g r a t e dt ot h ec h r o m o s o m a ld n a o fg - 0 3 s t r a i n ，ar e c o m b i n a n ts t r a i n g - 0 3 cw a so b t a i n e do nb l u e s t o n ey p dp l a t e sw i t hg o o d g e n e t i cs t a b i l i t y t h e1 ，3 - 1 3 - d g l u c a nw a se x t r a c t e df r o mt h ec e l lw a l lo fr e c o m b i n a n ta n d o r i g i n a ls t r a i nb ya l k a l im e t h o d ，c o n t e n to f1 ，3 - 1 3 - d - g l u c a nf r o mt h ec e l lw a l lo fr e c o m b i n a n t s t r a i nw a s3 7 7 3m g ga n dw a sr e d u c e db y3 9 c o m p a r e dw i t ho r i g i n a ls t r a i n e x p e r i m e n t sf o rs e v e r a ly e a s ts t r a i n sk e p ti nt h el a b o r a t o r ya n dc e r t a i ny e a s ts t r a i n a v a i l a b l ef r o mb r e w h o u s ew e r em a d et o s t u d yy e a s ta u t o l y s i s ，a n dn i t r o g e nm a t t e r sw e r e d e t e r m i n e di nt h ey e a s ta u t o l y s i sp r o c e s s r e s u l t sd o m e n s t r a t e dt h a tc o n t e n to fn i t r o g e n m a t t e r si nt h ea u t o l y s a t ed i f f e r e dw i t hy e a s ts t r a i n s w h i l et h er a t eo f n o n q a m i n on i t r o g e n a n d q a m i n on i t r o g e nw a si nt h er a n g e7 91 - 2 2 4 w i t ht i m e sp r o l o n g i n g t h ev a l u ew a s d e s c e n d e d t h ea u t o l y t i ca b i l i t yw a sd e t e r m i n e db e t w e e nr e m b i n a n ts t r a i na n do r i g i n a ls t r a i n b yt h ea b o v em e t h o d a n da u t o l y t i ca b i l i t yo f r e c o m b i n a n ts t r a i nr e d u c e db y1 3 7 1 i tw a ss h o w nt h a tt h ep h y s i o l o g yc h a r a c t e ro fr e c o m b i n a n ts t r a i nc h a n g e d ，w h i l er o u t i n e f e r m e n t a t i o np a r a m e t e r sw e r en oo b v i o u sd i f f e r e n tw h i c hw a sp r o d u c e db yt h er e c o m b i n a n t s t r a i ng 一0 3 ca n do r i g i n a ls t r a i ng - 0 3 a f t e rm a i nf e r m e n t a t i o nt h ea g i n gi n d e xt b ao f g 一0 3 cw a sr e d u c e dt o7 2 8 a n dt h ea n t i s t a l i n gs iw a si n c r e a s e db y2 6 4 c o m p a r e dw i t h g - 0 3 t b ao ff i n a lb e e rw a sr e d u c e dt o6 5 6 ，s ia n dr s vv a l u ew e r ei n c r e a s e db y19 2 7 ， 2 6 6 r e s p e c t i v e l y k e y w o r d s ：s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ，a u t o l y s i s ，g e n e t i c a l l ym o d i f i e ds t r a i n s ，f l a v o r s t a b i l i t y u 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名： 圭熟 e l 期： 塑2 ：51 纠 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 立觳 导师签名： = 竺! 【= 一 日 期： 第一章引言 第一章引言 1 1 酵母自溶 啤酒酵母作为啤酒生产中的灵魂，在啤酒酿造过程中占有举足轻重的作用。年轻强 壮的酵母能够酿造出清新爽口的优质啤酒，而衰老的细胞在酿造过程中死亡破裂将胞内 物质释放到酒体中如一些对风味有负面影响的物质，从而降低生产出的啤酒质量。我们 将这种酵母细胞破裂而将胞内物质释放到外界的现象称之为自溶【l l 。 1 1 1 酵母自溶概念及原理 1 9 8 5 年b a b a y a n 和b e z r u k o v 将自溶定义为细胞死亡，胞内生物聚合体在水解酶作 用下形成低分子量产物的一种水解反应【2 3 】。在特定条件下触发了细胞消化自身结构的自 溶酶的分解作用引起细胞自溶【4 1 。酵母细胞自溶主要作用的是蛋白酶，还包括核酸酶和 葡聚糖水解酶。a r n o l d 等研究发现在活性酵母细胞中自溶酶类位于细胞质膜的内侧，在 特定条件卞酶原被激活与相应的底物作用，使细胞内的生物大分子降解并在细胞内积 累，当生物大分子被水解成能通过细胞壁的小分子时，水解产物则通过扩散作用进入细 胞外介质。随着自溶作用的进行水解酶类亦发生自身消化，水解活性随之下降最后趋于 零，此时自溶作用也随之结束。 1 1 2 酵母自溶对啤酒质量的影响 1 产生酵母味 酵母发生自溶后，酵母细胞内物质溶于啤酒中，从而使酒液大量积累癸酸乙酯而产 生酵母味【m 】。啤酒中的癸酸乙酯阈值为1 5m g l ，而一般啤酒的癸酸乙酯含量为o 0 7 1 1 m g l ，无明显的酵母味；而酵母发生自溶后，啤酒中的癸酸乙酯将显著增高超出1 5 m g l ，使啤酒带上浓重的酵母味。且酵母自溶通常伴随杂菌污染，啤酒在酵母味的基础 上再增加臭味。 2 造成双乙酰反弹 酵母自溶时，细胞内的双乙酰及其前驱物a 乙酰乳酸会释放到啤酒中，使啤酒中双 乙酰出现反弹。如果发酵后期倒罐出现溶氧控制不严格，已休眠沉降的酵母被重新活化， 开始有氧代谢和增殖反应合成氨基酸，就可能增加细胞内的0 【乙酰乳酸含量。而此时酒 液能为酵母提供的营养物质已很少，酵母在缺乏营养的情况下容易死亡并发生自溶，将 细胞内的a 乙酰乳酸全部释放出来l 卜6 】。 3 促进啤酒老化几率 啤酒风味物质氧化风味发生缓慢而明显的恶化，称为啤酒的老化【5 - 7 】。酵母自溶后 啤酒中氨基酸等物质含量增加，氨基酸通过s t r e c k 降解形成醛类，使啤酒中醛类物质浓 度提高，而醛类物质的存在是啤酒产生老化味的基础。 4 增加啤酒浊度及产生沉淀 酵母自溶后细胞内容物进入啤酒中，因有些物质采取过滤的方法难以去除，啤酒硅 藻土过滤后这些微细成分仍悬浮于啤酒中增加啤酒的浊度。同时大量的蛋白质进入酒 江南大学硕士学位论文 液，碱溶性蛋白质在酸性和高温条件下产生沉淀，如果加上变性凝结，并与啤酒中其他 大分子接合，沉淀颗粒迅速增大形成明显的可见沉淀物【5 - 7 】。 5 啤酒苦涩味加重 酵母自溶后释放出的氨基酸，有许多是呈味物质，进入啤酒将导致啤酒苦味加重， 俗称“酵母苦，涩味也加重，减轻了啤酒爽口感。 6 对啤酒酸度的影响 酵母自溶后溶液中的核酸类物质增加啤酒中总酸量；另一方面是蛋白质类物质在酸 碱滴定过程中与n a o h 反应而变性，导致n a o h 滴定时消耗量增加，计算结果总酸量偏 高。 7 对啤酒生物稳定性的影响 酵母自溶后，导致啤酒的p h 提高，自溶产物为细菌提供氮源、碳源和维生素等营 养物质，有利于细菌的生长，从而影响啤酒的生物稳定性。 1 1 3 防治酵母自溶的措施 影响酵母自溶的因素有酵母菌种、发酵条件及微生物污染【8 ，9 】。其中酵母菌种的影响 最大，如果酵母性能不良，表现衰老、变异，酵母活性低，那么在工艺条件发生变化时 极易发生死亡自溶。目前国内外对防止啤酒酵母自溶都只能采取从生产工艺或酵母管理 上着手，比如：使用强壮酵母；优化糖化工艺，按时完成发酵，不延长主发酵和高 温发酵时间；合理控制酵母添加量及使用代数；制定合理的发酵工艺；合理的酵 母回收工艺及强化质量管理；正确使用添加剂；淘汰产生自溶的酵母。 1 2 酵母自溶国内外研究进展 1 2 1 酵母自溶与细胞壁代谢关系 为了提高啤酒质量，酵母自溶研究很多。但由于技术与条件的限制，使过去对酵母 自溶的认识还不是很透彻。过去对啤酒生产过程中酵母自溶的研究一直认为在酵母自溶 时，胞内各种酶相互作用共同水解细胞膜，使细胞膜发生破损，从而在细胞膜破损后胞 内物质通过渗透作用渗出细胞壁进而溶入啤酒中，直接影响啤酒的质量，但细胞壁几乎 不发生水解作用。其中一段时间内大家对酵母自溶时细胞壁不发生作用都持相同观点。 但随着对酵母自溶作用和细胞壁研究的深入，这一理论在各方面得到补充和完善。 m a s a h i r o l l 0 1 等最早发现了酵母自溶现象与细胞壁代谢之间的关系。他与其实验人员 在酵母细胞壁制备液中检测出自溶现象。相对于稳定期来说对数期细胞壁制备液的酵母 细胞壁葡聚糖水解情况较为明显，而在稳定期的碎片浸出液中葡聚糖酶活性比对数期的 高。细胞壁葡聚糖酶作用细胞壁葡聚糖，生成物溶出。酵母细胞壁糖蛋白以及贯穿酵母 生长过程的甘露糖也表现出较强水解作用。其研究还表明在p h5 0 时酵母细胞壁多聚糖 表现出较强的水解作用并且在对数期水解生成的糖类含量比稳定期糖类生成量大。所以 说酵母自溶时细胞壁也发生水解作用，且细胞壁水解作用还提高了胞内物质向啤酒渗透 的速度。一旦在啤酒生产过程中自溶酵母超出一定比例，细胞壁的水解物质和渗出的胞 2 第一章引言 内物质将共同作用影响啤酒质量，加速啤酒质量恶化。p o l o 等采用n o m a r s k y 光学显微 镜和低温扫描电镜( 1 0 wt e m p e r a t u r es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ，l t s e m ) 观察到葡萄酒 和起泡酒老化1 2 个月后酵母自溶现象【2 , 1 1 , 1 2 】。自溶反应发生2 4 h 后，由于胞内物质渗透 到酒液中，细胞内外渗透压差变大，使自溶酵母细胞小于处在生长阶段的细胞。利用低 温扫描电镜还观察到酵母细胞表面有很多褶皱，这些细胞实际上都是自溶后的空细胞。 老化1 2 个月葡萄酒中的酵母细胞比那些诱导自溶1 2 h 的酵母发生更多的形态变化，包 括结构和超结构变化两种。诱导自溶后的酵母细胞体积变小而液泡变大几乎占据整个细 胞质。正常酵母细胞壁厚实并且光滑，而诱导自溶1 2 h 后酵母细胞壁上出现类似酵母出 芽的芽痕和因质壁分离产生的褶皱，这些褶皱几乎都成纵向发展。因此可以看出酵母在 自溶时也影响到细胞壁的结构，改变细胞外形。当酿酒酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 出 现自溶时p a l o m e r o 等【l3 j 利用h p l c r i ( r e f r a c t i v ei n d e x ) 在老化9 个月的酒糟中检测出细 胞壁多聚糖。对酵母自溶与细胞壁代谢之间的联系进行了更深刻的验证。酵母自溶时胞 内的水解酶水解细胞膜后，部分胞内酶进一步作用细胞壁，使细胞壁发生一定程度水解。 b u r a t t i n i 等4 】称酵母自溶后传输光谱中1 3 - 1 ，3 葡聚糖对应的1 3 7 0c m 。1 吸收带的强度增 加，这一现象可能与酵母自溶产物中b 1 ，3 葡聚糖含量相对增加其他胞内物质相对减少 有关。同时使用a t r 光谱发现酵母自溶后1 2 0 0c m 。1 处碳水化合物条带强度也增加，与 报道的酵母自溶时自溶产物中细胞壁多聚糖含量增加相符合。经a t rw 5 光谱区域分析 发现酵母自溶产物中甘露聚糖含量增加，说明细胞壁的甘露糖蛋白发生降解。 1 2 2 酵母自溶的应用 国外对酵母自溶的研究主要集中在从自然界中筛选或采用基因手段获得酵母自溶 突变株来生产红酒或气泡酒14 1 。我国为啤酒生产第一大国，每年有多达1 0 万吨的废 弃酵母排放量，对酵母自溶的研究主用集中在利用酵母自溶抽提酵母提取物来生产功能 性食品添加剂【”。1 引。 1 3 立题背景与立题意义 1 3 1 立题背景 我国是世界啤酒生产大国，产量稳居世界第一。啤酒质量近年来有了较大提高，生 物稳定性与非生物稳定性已不再是制约我国啤酒工业发展的难题。但是啤酒的整体质量 与国际先进水平相比，仍有一定的差距，主要表现在啤酒的风味稳定性差、风味易老化、 抗老化能力弱等方面。国内在解决延长风味保鲜期的问题上，主要采取一些挽救性措施， 并未从根本上解决老化与抗老化的问题。 啤酒酵母是啤酒生产的灵魂和命脉，它的质量直接影响麦汁发酵和啤酒的质量，啤 酒酿造过程中如有5 的酵母发生自溶将对啤酒质量造成难以挽回的影响，因此使用优 良的酵母在工艺中解决风味稳定性等问题是啤酒生产的一大技术突破。 啤酒酵母工业应用历史悠久，但其选育工作仍多采用传统经典遗传学方法( 诱变、 杂交、原生质体融合等) ，通过发酵和菌株的生理性状筛选u 】。工业啤酒酵母细胞多为多 江南大学硕士学位论文 倍体，通过诱变很难获得遗传标记，而且标记很不稳定，使得传统方法工作繁琐，盲目 性较大，还常常伴随其它情况的出现。而采用基因技术可以精确定位修饰菌株的某个性 能，只改变单一性状，保持酵母的发酵特性、保证啤酒独特的风味特征，是改良菌株较 为理想的方法。近些年，随着酵母基因组全序列的测定( 1 9 9 6 ) ，酿酒酵母基因组数据库 ( s g d ) 、酵母蛋白质组数据库( y p d ) 等的建立【2 ，酵母作为基因表达载体和受体系统的 不断完善，基因育种得到了实质性的开展。已构建的基因工程酵母有缩短熟化期、低热 能高发酵度、低高级醇、产p 葡聚糖酶、高产酯、高絮凝性、抗微生物污染、耐高渗透 压以及生产无醇啤酒的酵母菌株。 1 3 2 立题意义 我国是啤酒生产大国，但是整体品质在国际上难以与国际品牌竞争。影响啤酒质 量的因素很多，但最主要的因素在于啤酒生产的灵魂啤酒酵母。优良酵母生产出的 啤酒清新爽口，风味稳定性好且保鲜期长；而衰老的酵母在啤酒生产过程中容易死亡、 自溶，一旦酵母发生自溶细胞内的水解酶将作用于细胞内部将胞内物质水解成小分子物 质通过渗透作用扩散到细胞外部释放至酒体中，对啤酒质量造成严重的影响。如双乙酰 及其前体物质0 t 乙酰乳酸增多造成反弹，含氮物质量增加经降解后生成老化物质醛类， 加速啤酒老化速率和风味恶化缩短货架期。 通过酵母菌种改良生产高品质的啤酒是当前企业和科研机构研究的热点内容，在生 产工艺日趋成熟的基础上，优良的菌株是生产优质产品的关键所在。现代基因工程手段 可以精确定位修饰特定基因片段，最大程度保证酵母的优良品质。运用现代分子生物学 手段构建细胞壁触，缺陷型，研究触j 缺失的酵母基因工程菌自溶性能变化情况，对解 决啤酒酵母自溶具有深远意义；是将现代基因工程手段运用到传统酿造行业中的一次有 益的探索，丰富了酵母自溶与细胞壁联系的研究，为酵母自溶改良的进一步深入提供理 论支持与参考。 1 4 研究思路与研究内容 本研究通过中断d 葡聚糖合成酶基因( 细，) 的表达，达到改变酵母细胞壁组成的目 的，研究中断# s l 基因对酵母自溶性能的影响及工程菌生理性能及酿造啤酒能力。通过 发酵实验考察其发酵特性、抗老化能力以及对啤酒风味的影响。主要研究内容包括： 1 根据同源重组原理，将来源于啤酒酵母工业菌株g 0 3 的d 葡聚糖合成酶基因( 肛) 和筛选标记c u p l ，得到以s k s l 为整合位点包含c u p l 的基因片段t k s l ：c u p l 。用此片 段转化啤酒酵母工业菌株g 0 3 得到# s l 基因缺陷型的啤酒酵母工程菌，对得到的 工程菌进行细胞壁b 葡聚糖分析及电镜形态分析； 2 对几株不同的酵母菌进行自溶实验，检测自溶产物中的含氮物质量变化并初步建立 酵母自溶判定指标，对工程菌与出发菌的自溶性能进行比较； 3 对工程菌进行生理性能试验和实验室规模的酿造实验，考察其发酵特性、对啤酒风 味的影响、抗老化的能力以及在酿造条件下的稳定性。 4 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 材料 2 1 1 主要材料 a 菌种与质粒 研究所用的菌株和质粒如表2 1 所示。 表2 1 菌株和质粒 t a b l e2 1s t r a i n sa n dp l a s m i d s b 培养基、工具酶和试剂 a 培养基【2 1 2 2 】 ( 1 ) l b 培养基( l ) ：胰蛋白胨1 0 ，酵母提取物5 ，氯化钠1 ，p h7 0 。需要时使用前加 入氨苄青霉素至1 0 0 t g m l ，固体培养基添加2 0 9 琼脂，用于大肠杆菌培养。 ( 2 ) y p d 培养基( l ) ：胰蛋白胨2 0 ，酵母提取物1 0 ，葡萄糖2 0 。制备平板时添加2 0g 琼脂，用于酵母培养。 b 工具酶 限制性内切酶s a li 、b g li i 、t 4d n a 连接酶：宝生物工程( 大连) 有限公司( t a k a r a ) ； 碱性磷酸酶c i a p ( c a l f i n t e s t i n ep h o s p h a t a s e ) 、质粒抽提试剂盒：上海生工生物工程有限 公司；p c rp u r i f i c a t i o nm i n ik i t 、g e le x t r a c t i o nm i n ik i t ：上海华舜生物工程有限公司； 蜗牛酶( 生化试剂) ：上海国药集团化学试剂有限公司。 c 试剂 ( 1 ) 抗生素的配制：5 0m g m l 的氨苄青霉素溶液保存在2 0 下，含药平板保存在4 可 保存1 5d 。 ( 2 ) 质粒提取溶液组成：见表2 2 所示。 ( 3 ) s c e 溶液：0 7m o l lk c l ，10r n r n o l lm g c l 2 ，10m m o l lp h 8 0t r i s h c i 。 ( 4 ) 化学试剂：酵母提取物和胰蛋白胨为o x o i d 公司产品；n a 2 s 0 4 、n a c i 、n a 2 c 0 3 、 江南大学硕士学位论文 k 2 s 0 4 、c u s 0 4 、n a o h 、浓h 2 8 0 4 、盐酸、甘氨酸、苯砩戊三酮( 茚三酮) 、无水乙醇、 碘酸钾、三氯乙酸、氯化钡、氢氧化钡、c h 2 c 1 2 、甲醛为分析纯购自上海国药集团化学 试剂有限公司；十七碳酸、辛酸、癸酸均为进口色谱纯标样；c h 3 0 h 为h p l c 级。麦 芽购自江苏宝应麦芽厂。二苯代苦味酰肼自由基( d p p h 纯度9 0 ) 为东京工业株式会社 产品i2 硫代巴比妥酸b r 级，购自国药集团化学试剂有限公司 表2 - 2 质粒提取试剂 t a b l e2 - 2b u f f e r sf o rp l a s m i dp r e p a r a t i o n 2 1 2 主要仪器 凝胶成像系统( 法国v i l b e rl o u r m a t 公司) 水平电泳系统( d y y - 8c ) ( 北京六一仪器厂) 基因扩增仪( p t c 1 0 0 ) ( 美国m jr e s e a r c h 公司) 台式冷冻离心机( 5 8 0 4r ) ，台式高速离心机( 5 4 15d ) ( 德国e p p e n d o r f 公司) 电热恒温水浴锅( 上海医用恒温设备厂) 冰浴锅( t e 8 a ) ( 美国t e c h o n e 公司) h y g a 全文摇瓶柜( 太仓市实验设备厂) 隔水式电热恒温培养箱( 上海博迅实业有限公司) 生化培养箱( s p x 2 5 0 ) ( 上海跃进医疗器械厂) 恒温恒湿培养箱( h p x 1 8 0 b s i i ) ( 上海新苗医疗器械制造有限公司) 超净工作台( 苏净集团安泰公司) 超纯水生成系统( 美国l a b c o n c o ) 梅特勒p h 计( 梅特勒托利多仪器上海有限公司) 灭菌锅( 日本h i r a y a m a h v e 5 0 ) 显微镜( 日本o l y m p u s 公司) u n i c ou v - 2 0 0 0 紫外分光光度计( 美国u n i c o 公司) s h i m a d z ug c 2 0 1 0 气相色谱仪( 日本岛津) 真空旋转蒸发仪( 无锡旭野科技有限公司) 液相色谱仪( 美国沃特斯公司) 凯式自动定氮仪( f o s s t e c a t o r ) 6 第二章材料与方法 2 2 实验方法 2 2 1 啤酒酵母染色体d n a 的提取 啤酒酵母染色体d n a 的提取参考经典的方法并改进如下【2 3 j ： ( 1 ) 取一环酵母细胞接种于2m l y p d 液体培养基中，2 8 培养过夜。 ( 2 ) 以2 的接种量接种于5m ly p d 液体培养基中2 8 培养1 2 1 6h 至对数期。 ( 3 ) 1 2 0 0 x g 离心5m i n 收集菌体，用2m l t e 洗涤一次。 ( 4 ) 重悬菌体于2m ld 疏基乙醇t e 溶液中。室温下振荡2 0 3 0r a i n ，离心收集菌体。 ( 5 ) 用s c e 溶液洗涤一次，重悬于含有l 蜗牛酶的2m l s c e 溶液中，3 7 振荡2h ， 8 0 0 x g 离心1 0r a i n 收集原生质体，用s c e 溶液洗涤二次，在悬于2m lt e 溶液中。 ( 6 ) 加入1 0 s d s0 2m l 使其终浓度为1 ，l o 此2 0m g m l 蛋白酶k 使其终浓度 为1 0 0i ，t g m l ，5 6 温育2 3h ； ( 7 ) 冷至室温，用等体积的酚，充分颠倒混匀1 0r a i n ，2 3 0 0 x g 离心5m i n 后取上清； 用等体积的酚氯仿、氯仿重复抽提，取上清。 ( 8 ) 2 h 入2 倍的无水乙醇沉淀染色体d n a ，经7 0 乙醇洗涤后于超净台上自然干燥； 沉淀溶于t e 溶液中，加入r n a s ea 溶液，3 7 水浴中保温3 0m i n ，贮存于2 0 。 2 2 2 啤酒酵母p - 1 ，3 葡聚糖合成酶f l , s ：和铜抗基因c u p l 的扩增 a 啤酒酵母p 1 ，3 一葡聚糖合成酶f l , s l 的扩增 根据g e n b a n k 公布的酿酒酵母s c e r e v i s i a e j k s l 序列，设计引物，通过p c r 技术从 啤酒酵母g 0 3 基因组d n a 中扩增出船j 序列。引物由上海生工生物工程公司合成。 以g 一0 3 的染色体d n a 为模板，进行p c r 扩增。在0 5m l 薄壁p c r 管中逐一添加以 下成分： 1o s u p e re f ud n a p o l y m e r a s eb u f f e r5 “l d n t pm i x ( 1 0m m o l l ) o 8p l m g c l 2 ( 2 5m m o l l ) 5 肛l p r d n a 01 ( 5 0l i m o l l ) 1 “l p r d n a 0 2 ( 5 0i x m o l l )l “l g 0 3 基因组d n a 模板l 此 10 x s u p e re f ud n a p o l y m e r a s e ( 5u l t l ) o 8 “l 加d d h 2 0 至总体系为5 0 此 将p c r 管中的组分混匀，在p c r 仪上进行p c r 扩增，反应参数如下：9 4 5m i n ；9 4 4 0s ，5 6 1r a i n3 0s ，7 2 2m i n3 0s ，重复3 0 个循环；7 2 1 5m i n 使产物延伸 完全。 b 铜抗性基因c u p l 的扩增 根据g e n b a n k 公布的酿酒酵母s c e r e v i s i a ec u p l 基因，设计引物，通过p c r 技术从 啤酒酵母g 0 3 基因组d n a 中扩增出c u p l 序列。引物由上海生工生物工程公司合成。 以g 0 3 的染色体d n a 为模板，进行p c r 扩增。p c r 反应参数为：9 4 5m i n ；9 4 7 江南大学硕士学位论文 4 0s ，5 6 1m i n3 0s ，7 2 2m i n ，重复3 0 个循环后7 2 1 5m i n 使产物延伸。 2 2 3t k s l 与p m d 一1 8 一tv e c t o r 载体连接 触j 的p c r 产物与p m d l 8 t v e c t o r 载体进行连接，连接体系组成如下： p m d l 8 - t v e c t o r o 3 “l ( 约5 0n g ) p c r 产物 4 7p l ( 约3 0 0n g ) s o l u t i o ni 5 此 将连接液混合均匀，放置于1 6 恒温水浴中，连接1 2 1 6h 。 2 2 4 大肠杆菌e c o i lj m1 0 9 感受态的制备及转化程序 ( 1 ) 从3 7 培养1 6 2 0h 的新鲜平板中挑选一个单菌落( 直径2 3m m ) 转到一个含有 1 0m ll b 培养基的烧瓶中。于3 7 剧烈振荡培养约8h ( 旋转摇床，转速2 0 0r m i n ) 。为 得到有效转化，活细胞数不应超过1 0 8 个m l ，可每隔2 0 3 0m i n 测量o d 6 0 0 值来监测培 养物的生长状况。一般o d 6 0 0 值约为o 4 时收获细胞。 ( 2 ) 在无菌条件下，将细菌转移至一无菌、一次性使用的、用冰预冷的1 5m l 的聚 丙烯离心管中，在冰上放置2 0m i n ，使培养物冷却至0 。 ( 3 ) 4 、4 0 0 0 x g 离心1 0m i n ，回收细胞。 ( 4 ) 倒出培养液，将离心管倒置lm i n ，以使残留的痕量培养液流尽。 ( 5 ) 用生理盐水洗涤菌体一次。 ( 6 ) 以1m l 用冰预冷的o 1m o l lc a c l 2 重悬沉淀，冰上放置1 5m i n 。 ( 7 ) 4 、5 0 0 0 x g 离心1 0m i n ，回收细胞。 ( 8 ) 倒出培养液，将离心管倒置1m i n ，以使残留的痕量培养液流尽。 ( 9 ) 1 0 0r t l 用冰预冷的o 1m o l lc a c l 2 重悬沉淀，4 放置5 1 2h 后转化。 0 0 ) 每管感受态细胞加入连接产物约1 0g l ( d n a ir t g ) 轻轻旋转、混匀，在冰上静置 3 0m i n 。管放在预加温至4 2 的循环水浴中，恰恰放置9 0s ，不要摇动。 o d 快速将离心管转移至冰浴中，使细胞冷却5m i n 。 ( 1 乃每管加5 0 0p ll b 培养基，用水浴将培养物加热至3 7 ，温育4 5m i n ，使细菌 复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。 ( 1 3 ) 将适当体积的已转化的感受态细胞涂布在含有相应抗生素和i p t g 的l b 平板上。 ( 1 4 ) 将平板置于室温直至液体被全部吸收。倒置平板，3 7 培养1 2 1 6h ，可见相应 菌落【2 2 1 。 2 2 5 大肠杆菌重组质粒的抽提 ( 1 ) 取过夜培养物2m l1 2 0 0 0 x g 离心1m i n ，弃去上清液。 ( 2 ) 用1 0 0g l 溶液i 重悬沉淀，可用振荡器短暂振荡使沉淀完全悬起。 ( 3 ) 向重悬液中加入2 0 0 此溶液i i ，轻轻倒转离心管4 6 次放置于冰上不超过4 m i n 。 ( 4 ) 加入15 0g l 溶液i i i 立即轻轻倒转离心管4 6 次放于冰上静止( 约5m i n ) 直至有白 色沉淀为止。 8 第二章材料与方法 ( 5 ) 室温1 2 0 0 0 g 离心1 0m i n 回收上清。加等体积异丙醇，混匀。 ( 6 ) 4 、1 2 0 0 0 x g 离心2 5m i n ，小心弃去上清，每管加入约6 0 0g l 的7 5 的乙醇 清洗沉淀。 ( 7 ) 4 、1 2 0 0 0 x g 离心2 5r a i n ，小心弃取上清，无菌操作台上自然干燥。 ( 8 ) 将干燥的沉淀溶于5 0 斗l 无菌超纯水中，可进行进一步酶切或纯似2 2 j 。 2 2 6 重组质粒鉴定 将转化后的菌液涂布到含2 41 t g m li p t g ( i s o p r o p y l d d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ，异丙 基d d 一硫代半乳糖苷) 、4 0p , g m lx - g a l ( b r o m o 4 c h l o r o 一3 - i n d o l y l - p d g a l a c t o s i d e ，5 一溴- 4 - 氯3 - 吲哚1 3d 半乳糖苷) 、1 0 0i t g m l 氨苄青霉素( a m p ) 的l b 琼脂平板上，于3 7 恒 温培养箱培养过夜。利用蓝白斑筛选，从平板上挑取白色菌落，提取质粒后利用限制性 内切酶进行酶切后，琼脂糖凝胶电泳验证。 2 2 7 啤酒酵母感受态的制备及转化程序 ( 1 ) 接种酵母于2 0m l 液体y p d 培养基中，3 0 下振荡培养过夜。 ( 2 ) 以5 x 1 0 6 c e l l m l 的细胞密度接种至2 0m l y p d 培养基中，置于3 0 恒温摇床2 0 0 r m i n 振荡培养至细胞密度至2 1 07 c e l l m l ，大约3 5h 。 ( 3 ) 用4 支7m l 无菌离心管，每管5m l ，以3 0 0 0 x g 离心5m i n ，收集细胞。 ( 4 ) 弃上清，把细胞悬浮于2 5m l 无菌水中，同上离心。 ( 5 ) 弃上清，将细胞悬浮于1m l 的1 0 0m m o l ll i a c 中，转到无菌1 5m l 离心管中。 ( 6 ) 高速离心5s 沉淀细胞，吸出l i a e 。 ( 7 ) 再用5 0g ll i a c 悬浮细胞，取1 0 “l 菌体的量，离心5s ，吸出l i a c 。 ( 8 ) 小心按顺序加入：2 4 0g lp e g3 3 5 0 ( 5 0 w v ) ，3 6l a l1 0m o l ll i a c ，5 0g l 单 链载体d n a ( 2 0m g m l ) ，5 0g l 水和线性化的d n a ( 0 1 - 1 0p g ) 。 ( 9 ) j 冒l j 烈振荡1m i n ，直到反应管中的细胞完全混匀。3 0 保温3 0m i n 。 0 0 ) 置4 2 水浴热激2 0m i n 。3 3 0 0 5 9 0 0 g 离心1 5s ，除去转化混合液。 o d i n0 2m l 的y p d3 0 后培养2h 。用枪轻轻吹吸混匀，悬浮沉淀，涂布9m m o l l c u