（发酵工程专业论文）红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究.pdf

摘要 1 1 3 8 0 0 9 红曲霉的应用在我国有着悠久的历史。如今，红曲产品广泛地应用在酿酒、食品 色素及保健药品等领域。其中，对红曲霉在医药保健方面的应用的研究近年来已成为 国内外学者的研究热点。但在1 9 9 5 年，红曲霉中的一种有害代谢产物桔霉素的 发现引起了国内外学者的广泛关注。在欧美各国，桔霉素是食品或饲料中严加控制的 毒素之一。 为敲除红曲桔霉素合成酶编码基因，构建不产桔霉素的红曲霉种打下基础，本课 题对红曲霉原生质体的制备方法及红曲霉9 9 0 3 a 的r e m i 原生质体转化方法进行了 较为详细的研究。重点考察了各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂等对红曲霉原生质体 形成和再生的影响。将红曲霉分生孢子在铺有玻璃纸的平板上3 2 培养5 0 - - 6 0 h 收 获的菌丝体最有利于原生质体的形成和释放。红曲霉菌丝体形成和释放原生质体最适 裂解酶和酶解时间分别为：0 4 l y s i n ge n z y m e 、0 8 c e f l u l a s e 和o 6 s n a h a s e 的酶 组合，3 l 作用l5 h ；最适渗透压稳定剂是：l m o l l 山梨醇。最适合原生质体再生 的培养基为含0 6 m o f l 蔗糖的r m 2 培养基。通过原生质体制备方法的研究，可显著 提高原生质体的再生率。 本文利用p c r 方法从红曲霉9 9 0 3 a 菌株染色体扩增出包括i t s l 、i t s 2 的部分序 列和5 8 sr d n a 完整序列的保守系列，通过序列测定及比对分析确认该菌种为紫色红 曲霉。用质粒p b c - h y g r o 进行原生质体转化。转化试验表明，所建立的转化方法可 达到将外源基因转化到红曲霉中去的目的。经多次转化在潮霉素b 抗性平板上共获 得5 9 8 株转化子，从中挑选色价与原菌株相当和提高的6 株转化子进行固态发酵和稳 定性的研究。经初筛和复筛，最终获得了色价显著提高的转化子z m 0 3 0 3 。 在进行上述原生质体制备和转化试验的同时，本课题以提高红曲产品色价和降低 桔霉素含量为目标，对红曲霉的培养基和发酵条件的优化进行了大量探索性研究。通 过单因素试验和正交试验确定了红曲霉固态发酵的培养基组成。还发现在培养基中添 加适量硫酸镁、辛酸可以提高发酵液的色价并同时降低桔霉素的含量。在固态发酵工 艺方面还研究了培养温度，发现在一定温度范围内( 3 0 3 6 ) 红曲米的色价随着温 度的上升而增加，温度偏低( 3 0 ) 时，红曲米桔霉素含量显著减少。培养过程中较 低的加水量有利于红曲霉产色素。最优的固态发酵条件是种子发酵液r 3 及p i - d 5 ， 大米6 0 9 ，接种量为4 5 ，大米中添加z n s 0 40 2 、辛酸0 0 5 ，固态米中加入水 p h 4 0 。在优化条件及初始条件下对转化菌株z m 0 3 0 3 进行固态发酵，在整个发酵过 程中，z m 0 3 0 3 的色价稳定提高2 4 6 3 ，色价与桔霉素含量比值提高了3 4 8 1 2 。 关键词：红曲霉；基因克隆；原生质体制备；遗传转化系统；固态发酵；色素； 桔霉素 s t u d i e so ng e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e m ，c o l o rv a l u ea n d c i t r i n i no f m o n a s c u sp u r p u r e u s a b s t r a o t t h ea p p l i c a t i o no fm o n a s c u sh a sal o n gh i s t o r yi nc h i n a p r e s e n t l y , t h em o n a s c u s p r o d u c t sa r ew i d e l yu s e d i nr i c ew i n ef e r m e n t a t i o n , f o o da d d i t i v e s ，h e a t hc a r ea n d m e d i c i n e s i nr e c e n ty e a r s ，r e s e a r c h e so nt h el a t t e r m o s to n eh a v eb e c o m et h eh o t s p n t , b o t h i nc h i n aa n da b r o a d b u tt h ei d e n t i f i c a t i o no fc i t r i n i ni nt h em e t a b o i r e so f m o n a s c u si n 1 9 9 5 ，h o w e v e r , h a sa r o s ec l o s ea t t e n t i o na m o n gt h er e s e a r c h e r sa r o u n dt h ew o r l d t h i s m y c o t o x i ni st i g h t l yc o n t r o l l e di nt h ef o o da n df e e di nw e s t e r nc o u n t r i e s h lo r d e rt od i s r u p tp k sg e n ea n dm a k en o n - c r r i n i np r o d u c i n gs t r a i r mo fm o n a s c u s p u r p u r e u s w es t u d i e dt h em e t h o do fp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e m it r a n s f o r m a t i o n t o e s t a b l i s hp r o t o p l a s t - m e d i a t e dg e n e t i ct r a n s f o r m a t i o ns y s t e mo f m o n a s c u s p u r p u r e u 一9 9 0 3 八 c o n d i t i o n sf o rt h ep r o t o p l a s ti s o l a t i o na n dr e g e n e r a t i o no ft h em y c e l i ao fv a r i o u se n z y m e s a n do s m o t i cs t a b i l i z e r sw e r ee x a m i n e d t oi n v e s t i g a t es u i t a b l ec e l la g ef o rt h ep r o t o p l a s t p r e p a r a t i o no fm y c e l i ao fm p u r p u r e u s t h em y c e l i aw e r ec u l t u r e di nd i f f e r e n tw a y sa t3 2 m y c e l i ao b t a i n e dt h r o u g hc e l l o p h a n e m e d i a t e dc u l t u r ef o r5 0 6 0hw e r ea d e q u a t et o f o rp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o n w h e nl y s i n ge f l z y m e ，c e l h l a s ea n ds n a i l a s ew e r ea d d e dt ot h e m y c e l i ai nc o m b i n a t i o no ra l o n e ，c o m b i n a t i o no fl y s i n ge n z y m e , c e l l u l a s ea n ds n a i l a s ea t t h ec o n c e n t r a t i o no f0 4 l y s i n ge n z y m e 、o 8 c e l l u l o s ea n d0 6 s n a l l a s er e s p e c t i v e l y w a sm o s tb e n e f i tf o rp r o t o p h s ty i e l d w h e l lw ea p p l i e dv a r i o u so s m o t i c , 2 t a b i l i z e r sa t d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no nt h ep r o t o p l a s t sp r e p a r a t i o n , lm o f ls o r b i t o lw a sm o s te f f e c t i v e f o rt h ep r o t o p l a s tr e l e a s e t h es u i t a b l ei n c u b a t i o nt i m ew i t he n z y m ef o rt h em a x i m u m r e l e a s eo fp r o t o p l a s t sw a s1 5 一h w h e nw ei n v e s t i g a t ev a r i o u so s m o t i cs t a b i l i z e r sf o rt h e r e g e n e r a t i o n o ft h ep r o t o p l a s t so fm y c e l i ao f 脱p u r p u r e u s , t h ec o m p l e t em e d i u m c o n t a i n i n g0 6m o l ls l l e r o s oi n d u c e dh i g h e s th y p h a lg r o w t h a c c o r d i n gt ot h es t u d yo f p r o t o p l a s t sp r e p a r a t i o n , w ec a l la d c a n c et h ee f f i c i e n c yo f p r o t o p l a s t sr e g e n e r a t i o n f r i s t l y , t h ec o n s e r v e ds e q u e n c ei n c l u d i n gp a r t i a li t s l ，i t s 2a n de n t i r e5 8 sr d n a w a sa m p l i f i e df r o mt h ec h r o m o s o m a ld n ao f9 9 0 3 aa n ds e q u e n c e d t h es t r a i nw a s c o n f e r m e da 8m o n a s c u sp u r p u r e u sb yt h eb l a s t a n a l y s i so fn e t w o r ks e r v i c e t h er e s u k s h o w e dt h a tt h em e t h o do ft r a n s f o r m a t i o nw a sa b l et ow a n s f o r mo t h e rg e n ei n t o 膨 p u r p u r e u s f i v eh u n d r e da n dn i t ye i g h tt r a n s f o r m a n t sw e r eo b t a i n e do nt h es e l e c t i v ep l a t e s c o n t a i n i n gh y g r o m y c i nb s i xo ft h et r a n s f o r m a n t sw e r es u b j e c t e d t oc h a r a c t e r i z e e x t e n s i v e l yt h ep i g m e n tp r o d u c t i o ni ns o l i ds t a t ef e r m e n t a t i o n s a r e rs e v e r a lt i m e so f s c r e e n i n g ，t r a n s f o r m a mz m 0 3 0 3w a ss e l e c t e d a tt h es a m et i m e ，a i m i n gt oi n c r e a s et h ey i e l do fm o n a s c u sp i g m e n t sa n dt od e c r e a s e t h ec i t r i n i nc o n t e n t , w es t u d i e dt h ec u l t u r em e d i u ma n dt h ef e r m e m a t i o nc o n d i t i o n so fs o l i d f e r m e n t a t i o no f m o n a s c u sp u r p u r e u s9 9 0 3 a a no p t i m u mm e d i u mw a so b t a i n e dt h r o u g h s i n g l ef a c t o rt e s t sa n do p t i m i z a t i o nt e s t s d u r i n gt h er e s e a r c h ，w ef o u n d t h a tt h ea d d i t i o no f o c t a n o i ca c i do rm g s 0 4 7 i - 1 2 0c o u l di m p r o v et h ec o l o rv a l u ew h i l ed e c r e a s et h ec i t r i n i n c o n t e n t t h es t u d i e so nt h ep r o c e s sc o n d i t i o n so fs o l i df e r m e n t a f i o na l s of o c u s e do nt h e e f f e c t so ft e m p e r a t u r e w h e nt h et e m p e r a t u r ei n c r e a s e sw i t h i nt h er a n go f3 0 - 3 6 c ，t h e c o l o rc a l u eo fr e dr i c ew a sf u n dt oi m p r o v e ，t o o h o w e v e r , o n l ya tl o w e rt e m p e r a t u r e ( 3 0 c ) c o u l dar e m a r k a b l yl o w e r c i t r i n i nc o n t e n tb eo b t a i n e d k e yw o r d s ：m o n a s c u s l m r l m r e u s ；g e n ec l o n i n g ；p r o t o p l a s p r e p a r a t i o n ；g e n e t i c t r a n s f o r m a t w ns y s t e m ；s o l i d f e r m e n t m i o n ；p l g m e n cc i t r m m o ir e c t e db y ：p r o f d u 州k a i h o n g 。 p r o f x ug a n r o n g ( p h d ) a p p ii c a n tf o rm a s t e rd e g r e e ：z h a n gy u a n g u o ( m a s t e z 0 f f m 劬0 n e n g l n e e n n g ) ( c o l l e g e o f b l o e a g m e e r m g ，i n n e r m o n g o h a a g r i c u l t u r a l u m v e r m y , h u h h o t0 1 0 0 1 8 ，c l a n a ) p c r e d t a h p l c r e m i c t a b p e g s d s t r i s p d a i p t g l b 缩略语表 ( p 0 1 y 皿e r ec h a i nr e a c t i o n ) ( e t h l e n e d i a m i n et e r a a c e t i ca c i d ) ( h i g hp e r f o r m a n c eo i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ) ( r e s t r i c t i o ne n z y m em e d i a t e di n t e g r a t i o n ) ( c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) ( p o l y e t h y l e n eg l y e 0 1 ) ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) ( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) 一m e t h a n a m i nc a s7 7 - 8 6 1 ) ( p o t a t od e x t r o s ea g a r ) ( i s o p r o p y l - l - t h i o - 3 - i n d o y l b d - g a l a c t o s i d e ) ( l r i a - b e r t a n i ) 聚合酶链反应 二乙胺四乙酸 高效液相色谱法 限制性酶介导整合 十六烷基三甲基溴化铵 聚乙二醇 十二烷基硫酸钠 三羟甲基胺基甲烷 土豆葡萄糖琼脂培养基 内蒙古农业大学 研究生学位论文独创声明 本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果据我所知，除了文中特别加以标注和致谢阿 地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包 含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一 同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任 论文作者签名： 内蒙古农业大学研究生学位论文版权使用授权书 本人完全了解内蒙古农业大学有关保护知识产权的规定，即：研 究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属内蒙古农业大学本 人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为内蒙 古农业大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为内蒙古农业 大学学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子文档，允许论文被查阅和借阅学校可以公布学位论文的全部或部 分内容( 保密内容除外) ，采用影印、缩印或其他手段保存论文 论文作者签名：豸整益垄乐f 指导教师签名：翟筵丑垒三 日 期：型乙丝：塑 内蒙古农业大学硕士学位论文 1 1 引言 1 1 红曲霉概述 1 1 1 红曲简史 红曲霉以其能产生大量代谢产物而得名，是我国先人的伟大发现。红曲，泛称 红曲霉的发酵产品( 有时也指红曲霉) ，在中国古代也称为“丹曲”、“赤曲”、“红米” 等，是红曲霉在蒸煮过的米饭上生长并发酵的产品。目前红曲的定义有所外延，泛 指以红曲霉为菌种，发酵( 包括固体发酵和液体发酵) 而制成的各类产品的总称。 红曲的故乡在中国，在浩瀚的中国历史典籍中，我们祖先大量记录了红曲在酿酒、 发酵食品、食用色素、中药等方面的广泛应用。大约在唐代，我国劳动人民就掌握 了将曲霉科真菌紫红色曲霉接种在粳米上制造红曲的技术，开创了我国和世界用微 生物发酵法制造食用色素的先河。在后来的古籍文献如宋初的清异录、元代的日 用本草、明代的天工开物本草纲目和清代的本草约编中都有红曲制作 和应用的相关记载m 。 1 1 2 红曲霉的分类 红曲霉属于真菌门( e u m y c o p h y t a ) ，子囊菌亚门( a s c o m y c o t i n g ) ，子囊菌纲 ( a s c o m y c e t e s ) ，不整子囊菌目( p l e c t o m y c e t e a ) ，红曲霉科( m o n a s c a c e a e ) ，本科 仅有一属红曲霉属( m o n a s c u s ) m 。主要种类有：红曲霉( 膨硎枷、烟色红曲霉 ( a z f u l i g i n o s u s ) 、紫红曲霉( m p u r p u r e u s ) 和红色红曲霉( m r u b b e r ) 等“2 0 世纪3 0 年代 初，日本的佐藤喜吉从中国的红曲中分离并鉴定了紫红红曲霉( m o n a s c u s p u r p u r e u s ) ，安卡红曲霉( m o s s e sa n k a ) 。国内介绍过的红曲霉有1 7 种，中科院 微生物菌种保藏管理委员会正式收藏的有8 种4 8 个菌株，e t 本有4 0 多菌种w 。 1 1 3 红曲霉的特征 红曲霉在麦芽汁琼脂培养基上生长良好，菌落最初为白色，长熟后，变为淡红 色，紫红色或灰黑色，因种而异。菌落结构有的呈绒毡状，有的呈皮膜状，呈皮膜 状的菌落稍有褶皱或有辐射纹。试验室保藏的红曲霉m o n 删ss p 9 9 0 1 在麦芽汁琼 脂培养基的菌落特征见图1 。 红曲霉m 是腐生菌，最适p h 3 5 5 ，耐酸，特别是乳酸；红曲霉最低生长温度 为2 6 ，最高为4 2 ；红曲霉有无性世代和有性世代；可利用多种碳源和氮源，能 合成多种酶类、色素及其它生理活性物质。 2 红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究 图1o n a s g u 8 印9 1 在麦芽汁琼脂培养基的形态 f i g1 t h ec o n 如盯n a t l 叫o f m o n a s c u s s p 9 9 0 1c u l t u r e d o n w o r t a g a r i n e ( t l u l n 1 1 4 红曲霉生理活性物质 莫呐可琳类( m o n a c o l i n s ) 物质。1 9 7 6 年，日本远藤章从p e n i c i l l i u mc i t r i n u m ( 黄 青霉) 中发现了具有胆固醇合成抑制作用的m l 一2 3 6 a ，m l 2 3 6 b 和m l 2 3 6 c ，其 中活性最强的化合物是m l 2 3 6 b t , ，。同年，b r o w n 等筛选到一种抗真菌物质 c o m p a c t i i l ”。1 9 7 9 年远藤章一又从红曲霉属m o n a s c u st u b e r 的培养液中获得莫那可 林k 。1 9 8 0 年美国的a l b e r t s 等人m 发现了相似的h m g - c o a 抑制物质，起名为 m e v i n o l i n 。其后，远藤章又从m o n a s c u st u b e r 培养物中分离到了莫那可林j 和莫那 可林l c w ，1 9 8 6 年，又从m o n a s c u s t u b e r 的培养液中分离得到了新的莫那可林m o ”， 这些物质统成为m o n a c o l i n s t m ，其中抑制胆固醇合成最有效的物质是莫那可林k 。 含有莫呐可琳类物质的红曲己被开发成降血脂和治疗心血管等疾病的新药，例如我 国北大维信生产的血脂康，是国内第一个以富含莫呐可琳的红曲为主要原料的调血 脂药物。 酶类物质。红曲霉在生长过程中能产生多种酶类，如淀粉酶( a m y l a s e ) 、蛋白酶 ( p r o t e a s e ) 、糖化酶( g h c o a m y l a s e ) 、麦芽糖酶( m a l t a s e ) 、果胶酶( p e c t a s e ) 等“。 其他功能性成分。如y 氨基丁酸( g a b a ) ，具有降血压的作用n 一；葡萄糖胺具 有治疗关节炎的作用；麦角固醇，是维生素d 的前体物n 一。国内其他学者还对红曲 霉产生的d p p h 自由基捕捉物质进行了研究n ”；红曲中具有效杀菌防腐的物质可能 是色素及其中所含的一些生理活性质n m 。 1 2 红曲色素概述 1 2 。1 红曲色素的种类及结构 目前已知结构的红曲色素有6 种，呈现橙色，黄色，红色三种颜色。其中橙色 的是红曲玉红素( m o n a s c o r u b r i n e ) 和红斑红曲素( g u b r o p u n c t a t i n e ) ：黄色的是安 卡红曲黄素( a n k a f l a v i n e ) 和红曲素( m o n a s c i n e ) ；红色的是红斑玉红胺 ( m o n a s c o m b r a m i n e ) 和红斑红曲胺( k u b r o p u n c t a m i n e ) 。该六种色素的其结构、分 子式和分子量分别见图2 ，图3 ，图4 。 内蒙古农业大学硕士学位论文 3 h 3 r = c ? h 1 5 ：红曲玉红素( k o n a s c o r u b r i n e ) c 2 3 h 2 6 0 51 1 = 3 8 2 r = c 5 h 1 1 ：红斑红曲素( r u b r o p u n c t a t i n e ) c 2 1 h 2 2 0 5m = 3 5 4 圈2橙色素结构和分子量 f 培2 m o l e c u l m s t m c t i 】：mo f o r a n g ep t g m e = l t h 3 r = c 7 h 1 5 ：安卡红曲黄素( a k a f l a v i n e ) c 2 3 h 3 0 0 51 1 仁3 8 6 ( y e l l o w ) r = c s h i i ：红曲素( m o n a s c i n e )c 2 1 h 2 6 0 51 1 = 3 5 8 ( y e l l o w ) 图3黄色素结构和分子量 f l g3m o l e c u l a r s t r t w e o f y e l l o w p t g m e n t s h 3 r = c 7 h 1 5 ：红斑玉红胺( m o n a s c o r u b r a m i n e ) c 2 3 h 2 7 n 0 5m = 3 9 7 k - - c b 评l l l ：红斑红曲胺( r u b r o p u n c t a m i n e ) c 2 1 h 2 3 n 0 4m = 3 5 3 圈4红色素结构和分子量 砘4 m o l e c u l a rs t n w h o f p u r p l ep t g n u m t s 4 红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究 以上六种色素是非水溶性的，但可以溶于有机溶剂。此外，法国学者b l a n c 等 于1 9 9 4 年分离出了两种复合色素，呈现红色，是单一色素和培养基中的谷氨酸复合 而成的，这两种色素是水溶性的，命名为g l u t a r y l o m a s c o r u b r i n e 和 g l u t a r y l r u b r o p u n c t a t i n e t ，其结构和名称见图1 - 4 。b y o n g s m i t h 等从m o n a s c u s 叩k b i o 菌种的代谢产物中分离纯化出了两种黄色素w 其结构见图5 。 r = c 7 1 - 1 1 5 ：g l u t a r y l o m a s c o r u b r i n 1 1 = 5 1 1 r = c s l t l l ：g l u t a r y l r u b r o p u n c t a t i n e m = 4 8 3 圈5 两种复合色素的结构和分子 f 坞5m o l e c u l a rm a l c t t l l ec o m p o u n do f t h et w om u l n p l ep i g m e n t s h o0 左为黄色素i ：c 2 1 h 2 6 0 5 _ 1 = 3 5 8 右为黄色素i i ：c 2 2 h 2 8 0 5 1 1 = 3 8 2 图6 两种黄色素的结构和分子量 f 瑶6 l l e c u l a rs t u c t u r e m p c m do f t w oy e l l o w p l g m e n t s 若用薄层层析分离红曲的萃取物，可发现复合色素的种类非常多。这是因为氨 基酸有2 0 钟，都有可能与色素形成复合色素。 1 2 2 红曲色素生产状况 红曲色素主要在东南亚国家中进行生产和应用，其中中国和日本生产量最大， 我国2 0 0 4 年产量在7 0 0 0 吨左右。红曲色素的生产有两种方式m ，固态发酵( 产品 堕蔓查壅些查堂里主兰焦堡塞! 为红曲米) 和液态深层发酵( 产品为红曲红) ，其中前者为传统的生产方式，并且目 前国内大多数红曲厂家仍然采用固态发酵的方式。红曲色素的生产由固态转向液态 深层发酵在中国是近l o 多年兴起的，采用这种生产方式有助于实现生产自动化，提 高产品质量的稳定性，扩大生产规模。在国内采用液态深层发酵的企业中，居国内 先进水平的企业，年产量可达8 0 吨( 粉状红曲红) ，发酵液中的色价最高可达 4 5 0 u m l 矧。 1 2 3 红曲色素应用 红曲色素作为着色剂的应用。在国内红曲色素已广泛用做果味水、果味粉、果 子酱、汽水、配制酒、糖果、糕点、熟肉制品、腐乳等食品的着色剂，美食家、烹 饪高手常用其与甜酒糟、花椒、盐配合用来腌制糟鱼、糟肉等，色红耀眼、糟香浓 郁、昧醇至极一。日本对红曲色素应用也比较多，其市场对红曲色素的消耗从1 9 8 1 年的1 0 0 吨上升到1 9 9 2 年的6 0 0 吨，产值1 5 ，0 0 0 ，0 0 0 美元，产品有红色日本清酒， 红色糖浆，含蛋白质的红色酱菜等m ，。 红曲色素的其他应用。红曲所产生的单胺氧化酶阻遏物早就用于对帕金森氏综 合症及其相关的精神病治疗w 。近年也有报道，宫慧梅及l m a r t i n k o v a “1 都提到橙 色素具有一定的抑菌性，能够抑制革兰氏阳性菌以及大肠杆菌。 1 3 红曲桔霉素概述 1 3 1 红曲桔霉素的发现及毒性研究 随着人们对红曲研究程度的日渐深入，1 9 7 7 年，x i n g c h u nw o n g 等人通过菌种 诱变而从红曲霉的发酵产物中分离出一种黄色的抑菌物质，并将其命名为 m o n a s c i d i na 。随后证实m o n a s c i d i na 即是桔霉素，其分子式为c 1 3 h 1 4 0 5 ，分子 量2 6 0 ，结构式如图7 所示。 c h h o 圈7 桔霉素的两种结构式 f t g7 m o l e c u l a rd r m n mo f c l l m m c h 3 桔霉素是一种真菌毒素，可由青霉和部分曲霉菌产生，是由脂类代谢产生的一 6 红曲霉退传转化方法研究及色素、桔霉素的研究 种真菌毒素。桔霉素对细菌尤其是革兰氏阳性菌有抑菌活性。桔霉素作用的靶器官 是肾脏，因此在动物试验中发现桔霉素对肾脏有毒害作用，过量还可使动物致死w 。 桔霉素还被认为有致畸作用m 。研究还发现，桔霉素损害肝脏代谢。体内试验发现， 桔霉素可与血清蛋白结合，有致癌性和诱发突变作用w 。最新研究结果表明，桔霉 素甚至还对基因有毒性效应w 。 1 3 2 国内外红曲桔霉素的研究状况 综合近年来的研究，国外在红曲桔霉素的研究工作大致有以下几个方面：红曲 桔霉素的认定m ，；红曲霉产桔霉素的性能的普查m ，；桔霉素毒理学的研究m - 删；红曲 桔霉素生物合成及降解代谢过程的研究m w 及提高色价控制桔霉素的发酵工艺条件 的研究”- q ；红曲霉代谢产物调控基因的研究。j y h 1 y e w a n g “l 等人对膨p u r p u r e u s n t u 6 0 1 进行诱变，最后得到两株变异菌。mp u r p u r e u s3 0 1 ，其桔霉素为02 3 士0 0 1 m g l ，比亲株减少了5 0 ；m o n a c o l i n k 为4 8 1 2 9 士7 9 8m g l ，产量是亲株的9 1 ：mp u r p u r e u s3l o ，桔霉素为02 7 士0 0 1m g l ，比亲株少4 l ；m o n a c o l i n k 为 5 2 6 2 9 = i = 5 5 4r a g l ，与亲株相比无明显变化。2 0 0 3 年，v a r g aj w 等人对紫色红曲霉 中聚酮体合成酶多样性进行了分析研究。2 0 0 5 年，s h i m i z ut t i 等人对聚酮体合成酶 进行研究，证明桔霉素的形成与聚酮体合成酶有关。 我国在红曲桔霉素方面的研究始于1 9 9 8 年前后。许赣荣等在1 9 9 8 年后发表了 有关红曲桔霉素的研究论文m w ，从红曲霉种、生产工艺、分析方法等方面开展了研 究。目前，控制红曲霉产生桔霉素的方法主要是改良红曲霉的发酵工艺以及红曲霉 种的筛选。在发酵工艺方面，可以选择不同的碳源、氮源和添加剂，在对培养基优 化的同时对发酵过程参数的控制尤为重要。许赣荣w 等人筛选出一株红曲霉j i o l i s c u s s p 9 9 0 1 ，该菌固态发酵红曲米中m o n a c o l i n k 的含量最高可达1 1 0 0 0m g k g 。该 菌在酵母提取物一蔗糖培养基及谷氨酸钠一葡萄糖培养基中均未测出桔霉素，液态 及固态发酵红曲产品也未测出桔霉素。 1 4 红曲霉遗传转化方法研究进展 1 4 1 聚酮体合成酶种类 聚酮体合成酶( p k s s ) w 是合成聚酮体化合物的关键酶，按照合成机理可分为 三类：( 1 ) i 型p k s s ( m o d u l a r t y p e ip k s s ) ，它是大型的具有多个蛋白域的多酶体系， 用于合成大环内酯类物质，其活性中心是线性的模块化排列方式，类似与一个装配 线。( 2 ) i i 型p k s s ( a r o m a t i cp k s s ) ，用于合成芳香型多聚酮体，相对于i 型p k s s ， 它是由许多可解离的单功能酶组成的复合酶，其结构的多样性较少。( 3 ) i i i 型p k s s ， 用于合成小分子芳香代谢产物，如淡黄霉素，它是由游离的硫酯c o a 直接合成，而 不用通过酰基载体蛋白( a c p ) 。在一个p k s 基因系列中，同种类型的活性位点不 内蒙古农业大学硕士学位论文 7 重复，所以这些活性位点在聚酮体的生物合成中可能重复使用“”。 真菌聚酮体代谢物展现了广泛的结构多样性，具有一些在细菌聚酮体代谢中未 发现的特殊特性。这些特性表现了真菌p k s s 的酶学多样性。细菌的p k s 酶是多酶复 合物，每个多肽上只携带一个酶结构域。与此相反，真菌p k s s 是由单个基因编码得 到的多功能巨大蛋白，具有8 种类型的功能结构域w ：酮体合成酶( k s ) ，酰基转 移酶( a t ) ，甲基转移脱水酶( d h ) ，酶( m e t ) ，烯脂酰还原酶( e r ) ，酮体 还原酶( k i t ) ，酰基运载蛋白( a c p ) 和硫酯酶( t h t ) ( 见图8 ) 。 l n k s l d k s 图8 真菌p k s 中各结构域的排列顺序 f t $ 8 r l mo d e ro f d o m a m smf u n g ip k s 合成途径的多样化、广泛的底物和可控制的碳链延伸使真菌产生的聚酮体化合 物结构和种类繁多，这就暗示真菌p k s s 的结构和功能也同样具有相当的多样性。 红曲色素及桔霉素都是聚酮体化合物，都由聚酮体合成酶( p k s s ) 指导其合成， 桔霉素的聚酮体合成酶基因蔟是较大的d n a 片段( 7 8 3 8 b p ，含k s _ a t a c p 州t ) 。从 理论上说，桔霉素聚酮体合成酶和色素的聚酮体合成酶有各自的独立性，也有一定 的相似性。尤其是由于聚酮体合成酶的某些蛋白域活性中心对底物的专一性不强， 可能存在两种聚酮体合成酶相互补充，当桔霉素这一支路的生物合成受阻时，某些 指导色素合成的酶有可能用于桔霉素的生物合成。 1 4 2 经典的菌种诱变选育技术筛选低产或不产桔霉素的红曲菌种( 株) 经典的诱变育种技术较为成熟。如吴祖芳w 等人经过复合诱交处理得到的不产 桔霉素的红曲色素变异株。江南大学许赣荣从1 9 9 8 年以来在低产或不产桔霉素菌种 筛选方面做了多年的研究工作。已获得多株不产桔霉素的紫色红曲菌株。其中一株 的生产工艺在2 0 0 5 年被授予国家发明专利，并成功地应用于工厂进行功能性红曲的 生产；另外一株不产桔霉素的的紫色红曲菌种，用于固态发酵法生产红曲色素，色 素含量达到工业化生产水平m 一。 8 红曲霉遗传转化方法研究及色素、桔霉素的研究 1 4 3 通过发酵工艺条件控制桔霉素的产生 日本y a e g a k i 公司是世界上最早宣称已解决红曲桔霉素问题的企业。据了解， 生产色素的菌种并不是基因重组菌，有可能是通过发酵工艺控制及提取精制技术控 制产品中桔霉素的含量。日本食品添加剂协会从2 0 0 0 年食品添加剂公定书第6 版起，将红曲色素中桔霉素的限量指标定为：0 2 m g k g ( 色价基准为5 0 0 u g ) 。据 本课题组分析，其红曲色素中桔霉素含量确实低于此限量值。 江南大学和广东东莞市天益生物工程有限公司合作，进行了发酵工艺条件控制 桔霉素的试验，所生产的红曲色素中的桔霉素含量已低于日本食品添加剂公定书中 的限量值( 项目于2 0 0 5 年底开始进行，预计2 0 0 7 年6 月将鉴定) 。 1 4 4 利用基因工程技术，构建不产桔霉素的红曲菌种( 株) 利用基因工程技术定向改造红曲菌，敲除桔霉素合成酶编码基因，在国内外都 是新颖的课题。近年来取得了一些有价值的成果。具体表现为： ( 1 ) 用于转化红曲菌重组载体的构建 通常是将抗性基因( 常用潮霉素抗性基因) 插入各种不同类型的载体中，得到 的重组载体转化红曲菌，使红曲菌表达潮霉素抗性。国内外不少研究者( 包括本课 题组) 都成功地得到具有潮霉素抗性的红曲转化子。如k a m o l n a nl a k r o dc w 等人将带 有潮霉素b 抗性基因的考斯质粒导入红曲霉菌体内，得到的抗性转化菌能在含潮霉 素bl m g m l 的培养基上生长。江南大学通过对各种细胞壁裂解酶和渗透压稳定剂 的考察，建立了原生质体介导的红曲菌遗传转化系统。有效地提高原生质体的再生 率及转化率m 一。可使潮霉素抗性基因在红曲菌细胞内大量表达。这项研究的意义说 明在红曲菌中表达外源基因是可行的。 ( 2 ) 红曲菌转化方法的建立 已报道的方法有：p e g 介导原生质体转化法、电击转化法、农杆菌介导的转 化( a t m t ) 方法和限制性酶介导整合( r e m i ) 转化等方法m ，。如韩国研究者建立 了红曲菌的基因转化系统。能允许多种外源基因在红曲菌中过量表达w 。f l o r p e f e z 【 “ 等人优化了色素高产菌原生质体形成和再生的条件，在此基础上利用农杆菌介导 d n a 研究红曲霉种属间的转化，提高了转化系统的稳定性，华中农业大学丁月娣m 等以农杆菌介导法建立了红色红曲霉t - d n a 转化库，采用抑菌圈法从大量转化子 筛选到2 0 0 株桔霉素产量和色素产量各异的突变子。江南大学周礼红m 等考察了四 种不同的红曲菌转化方法，选定了转化率最高的r e m i 转化方法，获得每微克 d n a 2 5 0 0 个转化子的高转化率。 ( 3 ) 分离和克隆红曲桔霉素合成酶编码基因 日本y a e g a k i 公司和大阪大学合作，已成功克隆紫色红曲菌的桔霉素合成酶 基因，并测得其序列。2 0 0 4 年g e n b a n k 公布了紫色红曲霉桔霉素聚酮体编码基因 内蒙古农业大学硕士学位论文 9 序列( 登陆号：a b l 6 7 4 6 5 ) ；南昌大学赖卫华w 等用一株高产桔霉素的红曲菌株( m a g r a n t i a c u 8 ，即a s 34 3 8 4 ) 构建了红曲霉e d n a 文库。并应用抑制性消减杂交法 筛选与红曲菌产桔霉素相关的基因。江南大学从红色红曲菌( 膨r u b e r ) c i c c 5 0 0 6 克隆到编码桔霉素合成酶基因p k s c t l 序列，通过基因敲除，基本确定p k s c t l 是红 曲