（发酵工程专业论文）酒花及酒花制品老化评价体系的初步研究.pdf

摘要 摘要 本论文建立了l 冲h p l c 分析颗粒酒花中仅和d 酸的3 种主要异构体的方法。样品 经预处理，色谱条件为色谱柱：e c2 5 0 4n u c l e s o i l ，1 0 0 5c 1 8 。保护柱：c c8 4n u c l e s o i l 1 0 0 5c 1 8 。梯度洗脱，流动相a ：乙腈：甲醇：t r i sb u f i e r ( 2 0r e t o o l l ) 为1 7 ：2 5 ：5 7 ( v v v ) ； 流动相b ：乙腈：甲醇： i r i sb u f f e r ( 2 0r e t o o l l ) 为5 0 ：8 ：4 2 ( v v v ) ，流速0 5 5m l m i n ，柱温 4 0 ，检测波长3 1 4n i i l 。外加标回收率9 5 7 和9 7 8 ；变异系数为1 0 3 和1 11 ： 检出限为o 2 1 和0 2 8m g l 。方法线性良好、简便、准确。 利用上述h p l c 方法考察了酒花自然和强制老化过程中仅一和d 一酸3 种主要异构体含 量的变化。加蓓草酮和蛇麻酮含量在0 【一和p 一酸总量中占的比例较少且在老化过程中变化 很小。提出了酒花老化指数( h a i ) 的概念，通过与酒花劣化度和h s i 值的比较，表明h a i 值既能弥补h s i 值不能评价香花的缺陷，也能弥补酒花劣化度测定方法重现性和准确性 差的缺点。 本文使用相同的色谱柱又建立了r p h p l c 方法测定酒花、酒花制品以及啤酒中的 4 种异构化仅酸的方法。色谱条件为流动相：甲醇：水：磷酸( 8 5 ) ：e d t a n a 2 ( 0 1t o o l l ) 为7 5 0 ：2 4 0 ：1 0 ：1 ( v v v v ) ，流速1m l m i n ，柱温3 5 ，检测波长2 7 0a m ，进样体积1 0 “l 。 方法精密度为1 0 9 1 8 6 ，4 种异构化仪酸的回收率在9 1 3 9 8 0 之间。方法线性良 好、精确、灵敏。 对不同种类的香型和苦型酒花对啤酒苦味的影响进行了研究。苦型酒花酿造啤酒中 异合0 酸和异仅酸占总酸量的8 8 以上，而香型酒花酿造啤酒中主要是异仅一酸，占5 5 左右。提出了计算苦味值( c b u ) 的概念，可以通过h p l c 测定的异0 【一酸3 种主要异构体 的含量来计算出啤酒的苦味值，此方法较传统方法更准确、重现性更高。 关键词：0 c 酸，b 酸，异构化仅一酸，酒花，高效液相色谱 a b s t r a c t a b s t r a c t am e t h o dw a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f 叶a n d1 3 - a c i di nh o pp e l l e t sb y r e v e r s e d p h a s eh i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y s e p a r a t i o na n dq u a n t i f i c a t i o nw e r e a c h i e v e db ya ne c2 5 0 4n u c l e s o i l ，10 0 - 5c l g ( 4 0 2 5 0n n l ，5r t r n ) 晰t hg u a r d c a r t r i d g ec c 8 4n u c l e s o i l10 0 - 5c18a n dag r a d i e n te l u t i o np r o g r a m ，a c e t o n i t r i l e m e t h a n o l t r i sb u f f e r ( 2 0 m m o l l ，p h7 5 埘也3 6 h c l ) a sm o b i l ep h a s ea taf l o wr a t eo fo 5 5m l m i n ，t e m p e r a t u r e 4 0 a n dd e t e c t e dw i t hu l t r a v i o l e td e t e c t o ra t314n n l t h er e c o v e r i e so fq a n d1 3 一a c i d s w e r e b e t w e e n9 5 7 a n d9 7 8 v i 疵a t i o nc o e f f i c i e n tw a s1 0 3a n d1 1 1 t h ed e t e c t i o nl i m i t s w e r eo 21a n d0 2 8m g l ，n l i si sa s i m p l e ，a c c u r a t ea n dc o n v e n i e n tm e t h o d 1 1 1 ei n f l u e n c eo ft h r e em a i ni s o m e r so fa - a n d1 3 - a c i dd u r i n ga g i n ga n df o r c ea g i n gw e r e r e s e a r c h e db yr p - h p l c n ec o n t e n to fa d h u m u l o n ea n dl u p u l o n ei sal i t t l ei n 伐一a n d1 3 - a c i d ， a n df e wr e d u c e dd u r i n ga g i n g ah o pa g ei n d e x ( h 灿) c o n c e p tw a sp u tf o r w a r d ，c o m p a r e d w i t hh o pd e t e r i o r a t i v ed e g r e ea n dh s iv a l u e ，i ts h o wt h a th a iv a l u ec a l le v a l u a t ea r o m ah o pa n d m o r ea c c u r a t ea n dr e p e a t a b i l i t yt h a nh o pd e t e r i o r a t i v ed e g r e e am e t h o d w a sd e v e l o p e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff o u rk i n d so fo fi s o m e r i z e da a c i d si nh o p h o pe 妯r a c t sa n db e e rb yt h es a m ec o l u m n t h em o b i l ep h a s ei sm e t h a n o lm e t h a n o l ：h 2 0 ：h 3 p 0 4 ( 8 5 ) ： e d t a n a 2 ( o 2t o o l l ) ( 7 5 0 ：2 4 0 ：l o ：1 ，r e s p e c t i v e l y ) w i t h1 0m l m i nf l o w i n gr a t e ，t e m p e r a t u r e3 5 a n dd e t e c t e dw i t hu l t r a v i o l e td e t e c t o ra t2 7 0n m t h ei n j e c tv o l u m ni s10 “l t h ep r e c i s i o ni s b e t w e e n1 0 9 1 8 6 t h er e c o v e r i e so ff o u rk i n d so fo fi s o m e r i z e du a c i d sw e r eb e t w e e n9 1 3 a n d9 8 0 眦si sas i m p l e ，a c c u r a t ea n dc o n v e n i e n tm e t h o d t 1 1 ei n f l u e n c eo fb e e rb i t t e r b yd i f f e r e n tk i n d so fa r o m ah o pa n db i t t e rh o pw a s r e s e a r c h e d a b o v e8 8 c o n t e n to fi s o a a c i di si s o c o h u m u l o n ea n di s o h u m u l o n ei nb e e r w h i c hw a sb r e w e db ya r o m ah o p a b o u t5 5 c o n t e n to fi s o q a c i di si s o h u m u l o n ei nb e e r w h i c hw a sb r e w e db yb i t t e rh o p ac a l c u l a t i o nb i t t e ru n i t ( c b u ) c o n c e p tw a sp u tf o r w a r d i t c o u l dc a l c u l a t eb e e rb i t t e ru n i tb yt h ec o n t e n to ft h r e em a i ni s o m e r so fi s o a - a c i du s i n gh p l c i tc a nm o r ea c c u r a t ea n dr e p e a t a b i l i t yt h a nt r a d i t i o n a lm e t h o d k e yw o r d s ：仅- a c i d ；p - a c i d ；i s o m e r i z e d0 c a c i d s ；h o p ；h p l c i l 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是苯人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：_ j 三k 导师签名： 日 期： 第一章绪论 1 1 研究背景 第一章绪论 酒花学名“蛇麻，又名“忽布 ，茎长可达1 0m ，根深入土壤1 3m ，可生存2 0 3 0 年。酒花有雌花和雄花之分，啤酒酿造通常用雌花【l j 。啤酒起源于公元前3 0 0 0 5 0 0 0 年， 9 世纪开始添加酒花为香料，1 5 世纪后才确定为啤酒的通用香料1 2 。从1 7 世纪至今，世 界上凡称啤酒的均必须以酒花为香料，过去由于酒花价格昂贵( 称软黄金) ，啤酒的优劣 以酒花用量而定【3 】。1 9 0 4 年，首次分离出0 c 酸的结晶物。在接下来的6 0 年中，人们才 对酒花化学和异构化过程有了深入的了解1 4 j 。酒花能赋予啤酒柔和优美的芳香和爽口的 微苦味，能加速麦汁中高分子蛋白质的絮凝，能提高啤酒泡沫起泡性【5 1 。另外酒花具有 重要的防腐作用，能抑制许多革兰氏阳性菌和病原菌生长；啤酒中的酒花苦昧物质( 如 反式异薇草酮) 作为一个离子载体而起到抗菌活性1 6 j 。 酒花按世界市场上供应的可以分成四类：a 类：优质香型酒花；b 类：香型酒花； c 类：没有明显特征的酒花；d 类：苦型酒花。世界酒花产量中苦型花( d 型) 占5 0 以 上，a 型占1 0 ，b 型占1 5 ，c 型占2 5 ，目前主要发展对象为a 和d 两类酒花【2 1 。 酒花的化学组成( 表1 1 ) 0 7 j 中，对啤酒酿造有特殊意义的三大成分为苦味物质、酒花 精油和多酚。其它化学组成对酿造的意义不大。 原酒花存在运输、贮存和使用的不方便，且利用率低；所以酒花制品愈来愈受到酿 造师的欢迎。在最近的4 0 年中，酒花制品的生产无论从品种上还是质量上都有了快速 的发展，这给啤酒的酿造提供了比使用整酒花更加经济、更加具有可操作性的手段。这 样就能更有效地控制啤酒的香味、苦味、泡沫、抗光性等性质，改善和稳定啤酒的风味。 随着对啤酒化学性质研究的进一步深入，近代啤酒工业越来越倾向于使用苦味度稳定、 溶解度好、光化学稳定性的酒花制品【引。 目前，市场上的酒花制品主要有普通富集酒花粉、普通富集酒花颗粒、酒花浸膏、 异构酒花浸膏( 包括二氢、四氢和六氢异构酒花浸膏) 、酒花油以及一些特殊的酒花粉 颗粒浸膏l 引。 其中颗粒酒花是目前世界上使用最广泛的酒花制品，也是国内啤酒企业应用最多的 酒花制品。颗粒酒花较全酒花的利用率提高了1 0 2 5 ，贮藏和运输体积减少达8 0 以上【l 】。酒花浸膏具有体积小、性能稳定、利用率高、没有酒花残渣和使用方便的优点， 被越来越多的使用【9 l 。而异构酒花浸膏是把仪酸先经异构化处理，再用于啤酒酿造；酒 花利用率提高9 0 以上。目前全世界约有6 的酒花被加工成异构酒花浸膏，其主要成 分是异o c 酸的钠盐、钾盐或镁盐；其一般仍和全酒花和其他酒花制品配合使用【l o 】。由于 其优良的抗“日光臭 性质，异构酒花浸膏被广泛用于白瓶啤酒的生产【l 。b 酸酒花油 是主要的酒花油制品，约含有7 0 p 酸和2 0 的酒花油( 以及一些未定性软树脂) ，仅 含少量或不含仅酸。d 酸酒花油通常用以取代部分香型酒花，能够有效改善啤酒风味， 江南大学硕士学位论文 提高啤酒的风味稳定性，为啤酒提供新鲜纯正的酒花香气【1 2 1 。 酒花主要用于啤酒酿造工业，同时亦作为药用植物被广泛使用。国外将其用于治疗 癔病、不安、失眠等；我国药典上记载酒花的乙醇浸膏可用于治疗肺结核病和麻风病等 症状【1 3 】。研究表明，酒花提取物及其复方制剂具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、镇静、雌性 激素样等多种生物活性。在临床上常用于治疗结核、神经衰弱、麻风等多种疾病 1 4 】。 表1 i 酒花的化学组成 7 1 t a b l e1 - 1t h ec h e m i s t r yc o n s t i t u e n to f h o p 1 2 酒花中的苦味物质 饮用啤酒时愉快的苦味主要由酒花产生i l5 1 。苦味物质是酒花中的重要成分，也是目 前酒花化学性质研究的重点。酒花中苦味物质含量一般为1 0 2 5 ，主要存在于啤酒 花的蛇麻腺中。酒花苦味物质是酒花树脂中的0 【酸和d 酸及一系列氧化、聚合产物f i 酬。 专门的委员会推荐使用“啤酒苦味物质 ，作为表示这种不完全定性的混合物短语。 利用此定义，酒花中大部分的酿造和苦味价值都在总软树脂中，特别是0 c 酸。啤酒中只 存在痕量的仪酸，它们在麦汁煮沸过程中转变成异仪酸，异仪酸是啤酒主要的苦味成分。 1 2 1 洳酸 0 【酸又称蓓草酮( h u m u l o n e ) ，新鲜酒花中0 c 酸的质量分数为5 11 。0 c 酸含量的高 低是衡量酒花质量的重要指标。1 9 0 4 年，l i n t n e r 和s c h n e l l t 8 】首次分离出一种结晶状的 蓰草酮。啤酒中苦味和防腐力主要来自0 c 酸的异构物。0 【酸呈另菱形结晶，浅黄色，在 0 相对稳定，熔点为6 5 6 6 5o c 【1 。7 1 。在紫外线下呈柠檬黄色的荧光。仅一酸是酒花树脂 中唯一有显著光学活性的物质【1 8 l ( i f f 己烷中【d 】智为2 3 7 0 ) 。它易溶于乙醚、石油醚、乙烷、 甲醇等有机溶剂。0 c 酸是多种结构类似物的混合物。常见结构通式见图1 1 【l 圳。 r ：。c o - c h 2 - c h ( c h 3 ) 2 亿- 酸 r ：。c o - c h ( c h 3 ) 一c 心- c h 3 加仉酸 r ：。c o - c h ( c h 3 ) 2 合仉酸 r ：。c o - c h 2 - c h s 后仉- 酸 r ：。c o c h 2 - c h 2 c h ( c h a ) 2 前也酸 r ：。c o c h ( c h 3 ) c h 2 c h 3 后前位- 酸 图1 1 酸的结构式 f i g 1 1t h es t r u c t u r eo f a a c i d 2 第一章绪论 1 2 21 3 - 酸 p 一酸又称蛇麻酮( l u p u l o n e ) 。新鲜酒花中p 一酸的质量分数为5 一1 1 ，它的苦味不及 0 【酸大( 约为1 9 ) ，防腐力也比仅一酸低( 约为1 3 ) 。3 - 酸的熔点为9 0 5 9 2 o ，在热水中 溶解度比0 c 一酸小。它更易氧化形成p - 软树脂。p 一软树脂能赋于啤酒宝贵的柔和苦味。p 一 酸也是一个混合物，r - 基团和0 l 酸相同。常见结构通式见图1 2 f 1 9 1 。 r ： r ： r ： r ： r ： r ： 。c 0 - o - 4 2 - c h ( c h 3 h3 - 酸 - c o - c h ( c h 3 ) - c 心c h 3 加p - 酸 。c o - c h ( c h 3 ) 2 台b - 酸 c o c h 2 - c h 3 后p - 酸 - c o - c h 2 c h 2 c h ( c h 3 ) 2 前d 一酸 c o - c h - ( c h 3 ) c h 2 c h 3 后前b 一酸 图1 - 2p - 酸的结构式 f i g 1 - 2t h e s t r u c t u r eo f1 3 - a c i d 1 2 3 异构化仅酸 酒花中的0 c 酸在麦汁煮沸时通过异构形成异构化o c 一酸( 异0 【酸) ，赋予啤酒爽快的苦 味。啤酒中苦味8 5 - 9 5 来源于异0 【一酸。异0 【- 酸为黄色油状。异0 【- 酸( 1 2 0m g l ) l 匕e t 酸( 3m g l ) 更易溶于麦汁【2 0 1 。在传统麦汁煮沸过程中，酒花中的0 【酸只有5 0 能被利用， 由于分离和发酵过程中酵母的作用下会进一步损失。所以，啤酒中0 c 酸的总利用率很少 超过4 0 ，有时可能只有l o 。 研究发现，异仅酸被氢化后形成的产物可以避免产生日光锈物质，具有更强的苦味， 稳定性更好，并能提高啤酒泡沫的持久性和挂壁性2 。为了能把0 c 一酸的利用率最大限度 的提高，目前开发出多种异构化酒花制品；其中4 类主要成分，主要包括异0 【酸、二氢 异0 【一酸、四氢异o c 酸和六氢异0 【酸，性质见表1 2 ，结构如图1 3 【2 羽。 表1 - 2 还原异构化0 【酸的特性【2 2 】 t a b l e1 - 2t h ec h a r a c t e r i s t i co f t h r e ek i n go f r e d u c e di s o m e r i z e d 仅- a c i d s 江南大学硕士学位论文 异* 酸 1 3 国内外研究进展 p 啊异弘酸 四氢异仉一酸六氢异也酸 图1 - 34 种异构化仪酸的结构式【2 2 】 f i g 1 - 3t h es t r u c t u r eo ff o u ri s o m e d z e dq - a c i d s 酒花苦味物质研究已经有1 0 0 多年的历史，在初期主要是电导滴定法1 2 3 j 和分光光度 法【2 4 钡0 定，但由于缺乏选择性和精确性，而且不是对所有的酒花制品和异构化的酒花制 品都适用。自7 0 年代以来，由于色谱理论的不断发展与完善，薄层色谱法【2 5 1 、毛细管 电泳【2 6 】、高效液相色谱以及近红外吸收光谱【2 7 】在酒花苦味物质的分离上取得了很大的进 展。其中，高效液相色谱法可以测定酒花和啤酒中的0 【酸和p 酸，还可从中定性和定量 地分离出苦昧酸的衍生物【2 引，分析方便快捷，操作费用相对较低，是分离测定酒花制品 和啤酒中酒花苦味物质最常用的方法。 1 9 9 9 年，陈家华等【2 9 】采用高效液相色谱法测定了酒花中的0 【酸。2 0 0 0 年，林艳等 也采用h p l c 测定了酒花及酒花制品中的仪酸和b 酸。同年，赵素华等【3 l 】又测定了 异0 c 一酸。2 0 0 2 年，陆豫等1 3 2 】采用i 冲h p l c 测定酒花浸膏中的a 酸和b 酸。同年，刘玉 梅等【3 3 】同时测定了d 酸和六氢b 酸。2 0 0 6 年，杨朝霞等【3 4 j 对啤酒中的异构化仪酸类型 进行了h p l c 鉴别。国外的研究要早于并优于国内，表1 3 综合了国外对酒花苦味物质 的测定及其发展历程。 1 9 7 0 年，美国的3 位博士在a s b c 年会上提出了酒花贮存指数( h o ps t o r a g ei n d e x ，h s i 值) 得概念。根据h s i 值可以估算出分析前酒花中的o 【酸和p 酸的损失情况。同时，日 本三得利食品公司也提出了计算酒花劣化度的经验公式【3 引。国内主要集中在对仪一酸和b 酸的研究。谷方红【3 6 】对贮存中的酒花及其制品中的仪酸和p 酸的含量进行了一定研究。 刘玉梅等【3 7 】也进行酒花储存的研究。估计上用合蓰草酮在0 c 酸的比例来衡量0 【一酸的稳定 性。a c a i l b a s 【3 8 】等对不同储存温度下颗粒酒花中化学成分的变化进行了研究。l u cd e c o o m a n 【3 9 】等研究认为酒花中合律草酮和萑草酮的顺反式比可以评价酒花老化。 l 4 = = ，一一众k 一一 啤酒因为其酒精度低，营养丰富，已经成为世界流行的大众型饮料酒。近年来，我 国的啤酒不仅产量升居世界第一，而且啤酒的质量也已有了长足的进步。我国目前以生 产淡爽型啤酒为主，其酒花的用量也越来越少。随着各种酒花制品被广泛使用，啤酒中 4 第一章绪论 苦味物质也趋于多元化。除异仅一酸以外，二氢、四氢和六氢异仅酸由于它们防“日光臭 作用，已用于高档白瓶啤酒酿造中。对于酿造师而言，精确的分析能保证酿造过程中酒 花苦味物质保持合适的含量。 表1 - 3 酒花苦味物质研究测定 t a b l e1 - 3d e v e l o p m e n to fa n a l y s i so fh o pb i t t e rc o m p o n e n t s 本研究通过对酒花苦味物质的研究，建立适用于测定酒花制品和啤酒中4 种异0 c 酸的高效液相色谱方法。综合h s i 值和酒花劣化度，从仅一酸和p 酸3 种主要异构体的变 化来评价酒花的老化；探索老化过程中异0 。酸的3 种主要异构体的变化与啤酒苦味值的 关系。 本论文在4 种异0 c 一酸测定和评价酒花老化方面探索将丰富该研究领域，为更准确的 评价酒花老化奠定基础。 1 5 课题研究思路与主要内容 为了准确测定酒花制品和啤酒中异0 【酸的含量。本课题建立了4 种异0 c 酸( 异0 c 酸、 二氢异0 一酸、四氢异a 酸和六氢异酸) 反相高效液相色谱检测方法。通过酒花h s i 值、 酒花劣化度以及o 酸和p 酸的测定，寻求其中0 【酸和p 酸3 种主要异构体的变化与酒花 老化的关系；以其来评价酒花的老化。另外，对啤酒中异0 【酸和苦味值的关系进行一定 的研究，以期建立通过异c c 。酸的含量来直接计算啤酒苦味值。 本论文主要进行了以下几个方面的探索： 1 利用r p h p l c 方法分析不同了老化过程中颗粒酒花中的仅酸和b 酸变化，结合 h s i 值和酒花劣化度，利用仅酸和d 酸中3 种主要异构体的变化来评价酒花的老化。 2 建立酒花、酒花制品及啤酒中4 种异q 酸反相高效液相色谱( i 冲h p l c ) 分析方法。 3 利用r p h p l c 方法分析啤酒中异0 c 酸的含量。建立异0 c 酸中3 种主要异构体与 啤酒苦味值的关系。能通过异0 c 酸中3 种主要异构体的含量来直接计算出只添加颗粒酒 花酿造啤酒的苦昧值。 江南大学硕士学位论文 2 1 引言 第二章颗粒酒花老化评价体系的初步研究 酒花是酿造啤酒的重要原料，其中蓰草酮( 0 c 酸) 和蛇麻酮( p 酸) 既是其主要的风味物 质，又是酒花中抑菌、防杂菌污染的主要物质1 3 3 1 。酒花中的0 【一酸在麦汁煮沸时异构化， 形成异仅酸，赋予啤酒爽快的苦味【4 9 】。伐和p 酸各有六种异构体，其中合萑草酮、蓰草 酮和加律草酮以及合蛇麻酮、蛇麻酮和加蛇麻酮分别是仅一和d 酸的3 种主要异构体，占 9 5 以上，仅和d 酸的结构见图1 1 及1 2 。 酒花中仪一和d 酸最早使用分光光度法测定。但由于测定过程中干扰因素和方法本身 稳定性的影响，有时测定结果会有误差。用高效液相色谱法( h p l c ) 分析0 c 和p 酸，在国 外最早开始于8 0 年代。2 0 0 1 年，d i e d r i c hh a r m s 掣1 9 1 采用梯度洗脱的瑚? l c 方法分离出啤 酒中的仪和b 酸的3 种主要异构体。国内陈家华等1 2 9 】采用h p l c 方法分析了酒花和酒花浸 膏中的仪酸。2 0 0 0 年，林艳等【3 0 】采用h p l c 方法分析了酒花、颗粒酒花及酒花浸膏中的 a 和b 酸。2 0 0 2 年，陆豫等【3 2 】也采用h p l c 方法分析了酒花浸膏中的仪和d 酸。但他们都 没有把仅和b 酸的3 种主要异构体完全分离。 本文建立了一种利用反相高效液相紫外检测色谱法测定颗粒酒花中仪和p 一酸的方 法，3 种主要异构体能得到较好分离，此法简便，选择性好，准确度高，能为啤酒酿造 者准确掌握颗粒酒花中0 c 和b 酸含量提供科学依据。通过与酒花贮存指数( h o ps t o r a g e i n d e x ，h s i 值) 、酒花劣化度的比较，能够利用颗粒酒花中0 【一和b 一酸3 种主要异构体的含量 来评价颗粒酒花的老化。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要试剂 0 c 酸( 合萑草酮1 4 4 5 ；n - + 副蓰草酮3 4 9 4 ) ，p 酸( 合蛇麻酮1 2 9 2 ；n 斗副蛇 麻酮1 2 0 2 ) 标样( 色谱纯) ，a s b c 提供，颗粒酒花样品，市售； 乙腈、甲醇( 色谱纯) ，t e d i a ；苯、乙醚、t r i sb u f f e r 、浓盐酸、磷酸( 8 5 ) 、氢氧 化钠( 分析纯) ，国药集团化学试剂有限公司； 碱性甲醇溶液：加o 2m l 6m o l l 的n a o h 于1 0 0m l 甲醇中，需新鲜配制； 苯稀释液：lm l 苯用1 0 0m l 碱性甲醇稀释后，在2 7 5n l n 和1e m 下，吸光度 6 0 ，而劣化度 6 0 的被认为是陈酒花。图2 4 中，其劣化度 的范围在5 0 7 0 之间，而自然老化2m 后的酒花我们分析认为已经是陈酒花，随着 老化时间的延长，酒花的新鲜度越来越低。 5 0 4 5 4 ，0 3 5 寥3 o 删2 5 抽2 0 弩1 5 1 0 0 5 0 0 老化时间t ( m ) 图2 - 2 苦型酒花自然老化中伐酸含量变化 f i g 。2 - 2t h ev a r i a t i o no fa - a c i dc o n t e n tb y b i r e rh o pa g i n g 霪 嘲 缸 筐 老化时间t ( m ) 图2 - 3 苦型酒花自然老化中p 一酸含量变化 f i g 2 - 3t h ev a r i a t i o no f1 3 一a c i dc o n t e n tb y b i t t e rh o pa g i n g 0 8 5 o 8 0 0 7 5 0 7 0 蜮絮 0 6 0 工 0 5 5 o 5 0 0 4 5 图2 4 苦型酒花自然老化h s i 值与劣化度 f i g 2 4t h e h s iv a l u ea n dd e t e r i o r a t i v ed e g r e eb yb i t t e rh o pa g i n g b 香型酒花自然老化过程中i x 和6 酸的变化 香型酒花札一的自然老化时间分别为lm ，2m ，3 m ，4m ，5m ，6m ，其中 仅酸、p 酸含量以及酒花劣化度分别见图2 5 一图2 7 。 由图2 5 可知，伐一酸含量随老化时间的增加而减少，在老化2 4m 的时间内，仪酸 含量下降速度较快，而后趋于平缓；其中獯草酮和合萑草酮占0 【酸总量的8 6 左右， 而加獯草酮的量在老化过程中的基本没有变化。图2 - 6 中，b 酸含量也随老化时间增加 1 0 4 4 3 3 2 2 1 1 0 o 第二章颗粒酒花老化评价体系的初步研究 而减少，其中加蛇麻酮和合蛇麻酮占p 酸总量的8 4 左右，蛇麻酮含量在老化过程中 也基本没有变化。 图2 7 中，香型酒花札一劣化度的范围也在5 0 7 0 之间，随着自然老化时 间的增加，其劣化度也呈减小趋势。但在自然老化3m 时，其劣化度确要高于自然老化 2m 时的劣化度；这与实际的实验情况不符。而劣化度对评价酒花的新鲜程度有较高的 准确性。这可能由于劣化度测定过程中，由于其分光光度法本身的不稳定性造成的误差。 而同样自然老化2 m 后的札一香花的劣化度 1 o 表示新鲜； 1 0 表示老化，其值越大表示新鲜程度越好。 测定1 0 种颗粒酒花的h s i 值、h a l 值和劣化度，结果见表2 5 所示。 1 4 竹弱乃加 1 1 1 0 0 0 0 0 0 第二章颗粒酒花老化评价体系的初步研究 由表2 5 可知，1 - 6 号的酒花劣化度均在合理的范围内，而7 号样品的数值偏低， 而l o 号样品数值偏高。9 号样品的h s i 值偏高超过了1 o 。而h a l 值除了1 号样品偏低 外，其它都在合理的范围之内。实验表明该值对颗粒酒花老化过程能较准确的评价，h a l 值既能弥补h s i 值不能评价香花的缺陷，也能弥补酒花劣化度测定方法重现性和准确性 差的缺点，所以具较好的应用前景。 表2 - 51 0 种不同颗粒酒花h s i 值、h a l 值和劣化度( ) t a b l e2 5d e t e r i o r a t i v ed e g r e e h s l a n dh a lv a l u e o f10p e l l e th o ps a m p l e s 12 34567891 0 酒花劣化度 7 3 98 1 17 6 37 1 i7 6 36 8 33 4 56 05 6 65 9 1 h s i 值0 4 30 5 10 5 0 - 0 7 3 1 0 2 - h a l 值 0 9 92 21 41 31 41 30 9 60 9 4 0 8 4 0 8 1 1 3 为新鲜苦花，4 - 6 为新鲜香花，7 ，8 为轻度老化苦和香花，9 ，1 0 为严重老化苦和香花 2 5 主要结论 1 建立了r p h p l c 方法测定颗粒酒花中仅和b 酸的3 种主要异构体方法。色谱柱： e c2 5 0 4n u c l e s o i l ，1 0 0 5c 1 8 。保护柱：c c8 4n u c l e s o i l1 0 0 5c 1 8 。梯度洗脱，流动相 a ：乙腈：甲醇：t r i sb u f f e r ( 2 0m m o l l ) 为1 7 ：2 5 ：5 7 ( v v ) ；流动相b ：乙腈：甲醇：t r i s b u f f e r ( 2 0m m o l l ) 为5 0 ：8 ：4 2 ( 删，使用前用0 4 5 岬有机相膜进行抽滤，并超声波除 气5m i n 。流速0 5 5m l m i n ，柱温4 0 ，检测波长3 1 4n n l ，进样体积2 0 l 。 2 对不同种类的香型和苦型酒花的自然和强制老化过程进行了研究。在苦型酒花 中，蓓草酮和合萑草酮占0 【酸总量的8 5 左右；加蛇麻酮和合蛇麻酮占b 酸总量的8 9 左右。香型酒花中，蓰草酮和合萑草酮占酸总量的8 6 左右；加蛇麻酮和合蛇麻酮 占d 酸总量的8 4 左右。加萑草酮和蛇麻酮含量在仅和p 酸总量中占的比例较少且在 老化过程中变化很小。 3 提出了酒花老化指数( h a d 的概念，公式为： 酒花老化指数( h a i ) = c 捧草酮培穗s c 加蛇麻酮+ 台蛇麻酮 通过试验发现，实验表明该值对颗粒酒花老化过程能较准确的评价，h a l 值既能弥 补h s i 值不能评价香花的缺陷，也能弥补酒花劣化度测定方法重现性和准确性差的缺 点，所以具较好的应用前景。 江南大学硕士学位论文 3 1 引言 第三章反相高效液相色谱测定酒花、酒花制品 及啤酒中异仅酸方法的建立 酒花中的0 【酸在麦汁煮沸时异构化，形成异0 【酸，赋予啤酒爽快的苦味。在传统麦 汁煮沸过程中，酒花中的仅酸只有5 0 能被利用，同时在发酵过程中由于酵母的吸附以 及啤酒的过滤会进一步损失。所以，啤酒中0 c 酸的总利用率很少超过4 0 ，有时可能只 有1 0 。为了最大限度提高仪酸利用率，目前开发出多种异构化酒花浸膏，其中4 类主 要成分主要包括异0 【酸、二氢异a 酸、四氢异o c 酸和六氢异0 【酸。 由于结构差异，4 种异0 【一酸在性质、作用和使用方法上有很大不同。其中，异0 【酸 受到光照后其侧链极易断裂，产生所谓的“日光臭味；而二氢、四氢和六氢异f t 酸因 其侧链上的双键得到不同程度的还原，从而阻止侧链断裂，具有光稳定性。此外，四氢 和六氢异仅酸能显著改善啤酒泡沫性能，而异仅酸和二氢异0 【酸无此明显功效。酿酒师 们可根据需要选用合适的异构化酒花制品来生产具有不同特性的啤酒【3 4 j 。 用高效液相色谱法( h p l c ) 分析异q 酸，在国外最早开始于8 0 年代【8 j 。1 9 8 0 年，h l g r a n t 等【4 0 】采用h p l c 分析了异构化酒花颗粒中的仅和异0 c 酸。1 9 9 9 年，j r a u m s c h u h 等【侧采用h p l c 只分析了酒花浸膏中的异0 c 酸。1 9 9 8 年，j o s e p h 等【5 0 】分析了啤酒中的 异0 【一酸和四氢异a 酸。2 0 0 1 年，d i e d r i e h 等【1 9 j 同时分析了啤酒中的异0 c 酸、二氢和四氢 异0 【酸。2 0 0 6 年，a l e x i s 等【4 8 j 使用新型的c h r o m o l i t hr p 1 8 e 色谱柱，将啤酒过滤后直 接进样分析其中的异0 【酸。2 0 0 6 年，杨朝霞等【3 4 】对啤酒中的异a 酸类型进行了h p l c 鉴别。目前国内未见对于异构颗粒酒花和酒花浸膏中异仪酸的h p l c 测定及固相萃取和 h p l c 结合应用于测定啤酒中的异0 【酸的相关报道。 本文建立一种反相高效液相紫外检测色谱法同时测定酒花、酒花制品及啤酒中4 种 异0 【酸的方法，能为啤酒酿造者准确掌握酒花、酒花浸膏及啤酒中异仅酸含量提供科学 依据。 3 2 材料与方法 3 2 1 主要试剂 异0 c 一酸( 6 4 3 ) ，二氢异0 c 一酸( 6 5 3 ) ，和六氢异0 【酸( 6 5 7 ) 的二环己基胺盐( d c h a ) 标样，四氢异0 c 酸( 9 9 4 ) 标样( 色谱纯) ，a s b c 提供；啤酒样品，市售； 甲醇( 色谱纯) ，t e d i a ；磷酸( 8 5 ) 、乙醚、e d t a n a 2 、浓硫酸( 分析纯) ，国药集团 化学试剂有限公司； 酸化甲醇：加o 5m l 磷酸( 8 5 ) 于1 0 0 0m l 甲醇( 色谱纯) ； 1 6 第三章反相高效液相色谱测定酒花、酒花浸膏及啤酒中的异a 酸方法的建立 磷酸水：0 2m l 磷酸( 8 5 ) 于1 0 0m l 超纯水； 甲醇混合物：甲醇、水和磷酸( 8 5 ) 按5 0 ：5 0 ：0 2 ( v 1 v ) 配制； 酸性甲醇：加o 1m l 磷酸( 8 5 ) 于1 0 0m l 甲醇( 色谱纯) 。 3 2 2 主要仪器和材料 s e p p a kc 1 8 柱，其它同2 2 2 。 3 2 3 主要分析方法 a 色谱条件 色谱柱：e c2 5 0 4n u c l e s o i l ，1 0 0 5c 1 8 。保护柱：c c8 4n u c l e s o i l1 0 0 5c l s 。流动 相：甲醇：水：磷酸( 8 5 ) ：e d t a n a 2 ( 0 1m o l l ) 为7 5 0 ：2 4 0 ：1 0 ：1 ( v ，v 、，、，) ，使用前用0 4 51 t m 有机相膜进行抽滤，并超声波除气5m i n 。流速1 0m l m i n ，柱温3 5 ，检测波长2 7 0n n l ， 进样体积1 0 皿。 b 标样配制 准确称取异仅酸，二氢异仅- 酸和六氢异0 c 一酸的二环己基胺盐( d c h a ) 标样2 0m g ， 四氢异0 c 酸标样1 4m g ( 精确至0 0 0 0 1g ) ，用4 0m l 酸化甲醇，溶解于1 0 0m l 的棕色容 量瓶中，振荡溶解完全，在2 0 定容，储存于2 4 的冰箱，用前稀释到一定浓度。 c 异构颗粒酒花的测定 称取异构颗粒酒花样品5 0g ，置于2 5 0m l 具塞锥形瓶中，用2 0m l 甲醇和8 0m l 乙醚萃取，于恒温2 5 摇床振荡3 0m i n ，加入0 1m o l l 的盐酸溶液3 5m l ，再振荡2 0 m i n ，静置分层。取上层乙醚层1 0m l ，用甲醇定容至1 0 0m l ，充分混匀，用0 4 5i t m 有机滤膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。 d 酒花浸膏的测定 酒花浸膏样品置于3 0 水浴中，搅匀。准确称取0 1g ，置于1 0 0m l 具塞锥形瓶 中，用3 0m l 甲醇溶解，置于超声波水浴3 0m i n ，转移至1 0 0m l 容量瓶中，用甲醇2 0 定容，充分混匀。用0 4 5p a n 有机滤膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。 e 啤酒样品的测定 啤酒除气，用8 5 磷酸调啤酒p h 至2 5 。首先1 0m l 甲醇通过s p ec l s 柱，再通过 1 0m l 超纯水，2 0m l 、p h2 5 样品通过，接着通过6m l 的酸水，接着通过1 0m l 甲醇 混合物( 5 x 2m e ) 。最后，样品被洗提用酸性甲醇( 2 x 2m l ) ，转移至5m l 容量瓶中，用 酸性甲醇2 0 定容，充分混匀。用0 4 5p m 有机滤膜过滤，存于样品瓶中，准备进样。 3 3 结果与讨论 3 3 1 异0 【酸检测色谱条件的建立 a 流动相 a 、e d t a n a 2 的选择对峰形和保留时间的影响 在流动相中，添加一定量的e d t a 二钠盐能防止痕量的金属催化氧化异0 c 酸，使峰形 1 7 江南大学硕士学位论文 更加尖锐；本研究中，e d t a n a 2 ( 0 1m o l l ) 添加量为l 。 b 、样品溶剂的选择对分离的影响 样品溶剂酸化甲醇、流动相和甲醇的p h 值分别为2 5 1 、2 3 2 和4 8 。样品在酸化甲醇 和流动相中的溶解性要优于甲醇。通过长时间放置表明，标样的酸化甲醇溶液的稳定性要 优于流动相。故本研究使用酸化甲醇作为样品溶剂。 c 、进样量的影响 分别考察了1 0 肛l 、1 5 肛l 和2 0 肛l3 个不同体积的进样量对异0 【酸分离度的影响。实 验结果表明：在进样量为1 0 此时，峰形较好；而随着进样量的增加，响应值增加的同时， 有的色谱峰明显变宽且出现平头峰。故本研究使用的进样量为1 0 皿。 d 、柱温的影响 本实验要求柱温较高，在3 5 4 0 之间。柱温在4 0 的时候，出峰时间明显提前，但 峰形出现前倾，柱压急剧升高。故本研究采用柱温为3 5 。 根据以上讨论，流动相为甲醇：超纯水：磷酸( 8 5 ) 为7 5 0 ：2 4 0 ：1 0 ( v v v ) 的溶液，并加入1 0 1m o l le d t a n a 2 混合。为了操作简便，将流动相确定为甲醇：超纯水：磷酸( 8