（法医学专业论文）肌红蛋白降解及肌原纤维小片化指数与人体死亡时间的相关性研究.pdf

论文独创性声明 率论文是我个人在弹帮指导下避行的研究工作及敬稽蕊研究成臻。论文中除了 特别加以标注和致谢的地方外，f i 包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究 成采。其他同志对本研究静启发和所傲黪贡献均已充论文中作了爨硫静声萌并表示 了琳意。 侔者签名： 力。叁t l 。! 一l 论文使用授权声明 是翅： 妒奠。 本人宠全了鼹复旦大学有荚保整、使用学位论文的规定，弹：学校真权傈馨送交 沦文的复印件，允许论文破歪阅和借阕；学校可以公布论文的全部或部分内容，可以 果蠲誓印、缩印或其它复斜手段保存论交：慑密的埝文在嬲密后遵勺= 此规定。 作者签名：丑当一导师签名 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 摘要 目的：探索肌红蛋白降解及肌原纤维小片化指数与人体死亡时间的相关性，摸索 其中的规律及其用于实践的可行性，为法医学推断死亡时间提供新方法。 方法；利用免疫组织化学方法、蛋白免疫印迹法( w e s t e r n b l o t t i n g ) 观测人体骨 骼肌中肌红蛋白( m y o g l o b i n ，m b ) 的降解与死亡时间的相关性；利用肌原纤维 小片化指数( m y o f i b r i lf r a g m e n t a t i o ni n d e x ，m f 0 ，观测蛋白质降解同死亡时间的 相关性。 遵循知情同意原则，取6 例人体骨骼肌组织，置于室温2 5 - 3 = 1 ；分别在死 后o h 、4 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 、7 2 h 取上述肌组织各o 5 9 。 实验一：运用免疫组织化学的方法，观测人体死后，骨骼肌中肌红蛋白降解 情况。将上述骨骼肌按常规制作石蜡切片，后用小鼠抗人m b 单克隆抗体作为一 抗，用h r p 标记的羊抗小鼠l g g 抗体作为二抗，采用免疫组织化学染色，利用 图像分析技术测定平均光密度值，探讨其与死亡时间的相关性，并作统计分析和 计算回归方程。 实验- - ：运用w e s t e r nb l o t t i n g 技术研究人体死后，骨骼肌中肌红蛋白降解 情况。将上述骨骼肌组织经匀浆、梯度离心、蛋白定量等步骤，制作蛋白样品液， 随后用w e s t e r nb l o t t i n g 方法检测肌红蛋白，用发光法显示，以f l - a c t i n 做为内标 参照，并用图像分析系统拍摄并测量其灰度值，计算两者之间的比值，探讨其与 死亡时间的相关性，并作统计分析和计算回归方程。 实验三：运用肌原纤维小片化指数推断人体死亡时间。将上述肌组织经匀浆、 梯度离心、蛋白定量等步骤，制作蛋白样品液，分光光度计在5 4 0 n m 处测其吸 光度，以吸光度值x 2 0 0 作为肌原纤维小片化指数，探讨其与死亡时间的相关性， 并作统计分析和计算回归方程。 结果：l 、死后1 2 小时内，骨骼肌细胞内m b 的染色颗粒整体变淡，数量在减少； 死后2 4 小时，m b 的染色颗粒分布不均；死后4 8 小时，出现大面积的脱色区。 2 、随着死亡时间的延长蛋白电泳条带m y o 四o b i n p a c t i n 的灰度值比值逐渐 降低，以死后1 2 小时内下降较明显，同免疫组织化学的结果相一致。 3 、肌原纤维小片化指数随死亡时问的延长而逐渐上升，死亡1 2 小时内变化 较明显，而后趋于平缓，呈一定的线性相关。 结论；机体死亡后，体内蛋白质逐渐降解，肌原纤维不断断裂分解，其改变随死 亡时间的推移，呈现一定的规律性。肌原纤维小片化指数随着死亡时间的延长而 逐步上升，且在死亡1 2 小时内变化较明显，该方法操作简单易行、取材方便广 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 泛，有望成为一种早期快速推断死亡时间的好方法。免疫组织化学方法和w e s t e r n b l o t t i n g 方法结果均显示肌红蛋白随着死亡时间的推移而逐步降解，并在死后1 2 小时内变化较显著，运用图像分析软件能达到半定量的效果。肌红蛋白有望为推 断死亡时间提供新的检测指标。 关键词：死亡时间推断肌红蛋白肌原纤维小片化指数 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 a b s t r a c t o b j e c t i v e ：t os t u d yt h ed e g r a d a t i o no ft h em y o g l o b i n 似b ) a n dt h em y o f i b r i l f r a g m e n t a t i o ni n d e x ( m f i ) ，a n dt oi n v e s t i g a t et h er u l eb e t 3 v e e nt h e ma n dt h et i m e a l k rd e a t h a n dt oh o p ef i n d i n gan e wm e t h o dt oe s t i m a t et h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l m e t h o d ：u s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya n dw e s t e r nb l o t t i n gt oo b s e r v et h er e l a t i o n s h i pb e “w 玲n t h ed e g r a d a t i o no fm ba n dt h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l u s i l l gm f it oo b s e r v et h er e l a t i o m h i p b e t w e e nt h ed e g r a d a t i o no f m u s c l ef i b r i la n dt h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l t h es k e l e t a lm u s c l ew a st a k e nf r o ms i xh u m a na td i f f e r e n tp o s t m o r t e mi n t e r v a l ( m4 ，8 ，1 2 ，2 4 ，3 6 ， 4 8 。6 0 7 2 h ) o i lt h et o m p e l a a n2 5 4 - 1 t h es t u d yi n c l u d e s3p a r t s f i r s t , u s i n g i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym e t h o dt oo b s e r v et h ed e g r a d a t i o no fm b t h em u s c l ea b o v ew a sm a d et o p a r a f f i ns e c t i o nb yn o r m a lw a y , t h e na d df i r s ta n t i b o d ya n ds e c o n da n y b o d y ，a n dd i g i t i z e dt h e g r a ys c a l eo f e a c hp o s o n o r t o mi n t e r v a lb yi m a g ea n a l y s i ss y s t e m s e c o n d , u s i n gw e s t e r nb l o t t i n g t oo b s e r v et h ed e g r a d a t i o no f m b t a k i n gt h e0 - a c t i n 鸽t h ei n t e r n a ls t a n d a r d , w ec a p t u r e d t h ei m a g ea n dd i g i t i z ee a c hb a n db yt h eg e li m a g i n gs y s t e m t h i r d , u s i n gu l t r a v i o l e t s p e c t r o p h o m e t r yt om e a s u r et h em y o f i b r i lf r a g m e n t a t i o ni n d e xo fe a c hp o s t m o r t e m i n t e r v a l ，s t a t i s t i c a la n a l y z et h er e l a t i o n s h i pb e c w e 圮= nt h ei n d e xa n dt h ep m i r e s u l t ：1 t h eg r a ys c a l ew e r et h i n n i n gf o l l o w i n gt h ee x t e n s i o no ft h ep o s t m o r t e mi n t e r v a li n 1 2 h r s ，s t a i n i n gd e f i c i e n c y z o n ew e 砧a p 仟粕蜘i n4 8 h r s 2 t h ed a t ao ft h eg r a yb a n db y m y o g l o b i n 3 a c t i nd i m i n i s h e df o l l o w i n gt h ee x t e n s i o no ft h ep o s t m o r t e mi n t e r v a l t h er e s u l ti ss i m i l a rt ot h ep a r to n e 3 m f ir i s ea c c o r d i n gt ot h et i m ea f t e rd e a t h , a n d s h o wo b v i o u si nt h ef i r s t1 2 h r s c o n c l u s i o n ：m f ia n dt h ed e g r a d a t i o no fm bc a nb eu s e dt oe s t i m a t et h ep o s t m o r t e m i n t e r v a li ne a r l yt i m e s k e l e t a lm u s c l ec a l lb et a k e nv e r yc o n v e n i e n t , s ot h e s em e t h o d s h a v es t r o n ga d v a n t a g eo f u s i n gi np r a c t i c e k e yw o r d s ：e = s t i m a f i o no f p m i ；m y o g l o b i n ；m f i 4 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 前言 死亡时间( p o s t m o r t e mi n t e r v a l ，p m i ) 是指机体死亡发生时距尸体检查时所 经过的时间。死亡时间的推断，一直以来都是法医学的研究重点，也是法医工作 的重中之重，因为准确的推断死亡时间，在刑事案件的侦破工作中，有着无与伦 比的重要性，对于确定案件的性质、犯罪嫌疑人的作案时间、案件侦查的范围都 有着重大的意义；同时在一些民事纠纷案和保险理赔案中也发挥着重要的作用。 在刑事案件的侦查中，询问时间证人是最常用也是最有效的手段，但多数情 况是很难找到时间证人，此时运用实验室手段推断死亡时间成为一种可行且可靠 的方法。早期人们通过观察尸体现象的变化规律推断死亡时间f l l ，因为那是肉眼 可以直接观测到的。后来人们通过胃内容的消化情况、直肠内部的温度】、特 定昆虫的幼虫生长发育规律 4 1 、组织中酶活力的改变旧、血液及玻璃体液中某些 离子浓度的改变 6 1 来推断死亡时间。但是这些方法都受到诸多内在或外在因素的 影响，如尸体本身的胖瘦和衣着，尸体的完整性，尸体保存的环境条件，地域之 间的差异，死亡原因等等。因此人们一直试图找寻一种快速简便、准确可靠、适 用性强的实验方法，用于推断死亡时间。后随着科学技术的不断发展，尤其是分 子生物学领域的技术的高速发展，许多新技术、新方法被运用于死亡时间的推断， 研究方向也从大体到细胞最终转向分子水平。人们开始借助诸如流式细胞仪、单 细胞凝胶电泳、t u n e l 法等方法观测机体死亡后d n a 的降解同死亡时间之间 的规律p 即j ，以此推断死亡时间。后又有不少学者将目光转移至蛋白质降解同死 亡时间的规律性研究。图像分析软件也越来越被大家所熟识并运用。 本课题结合了国内外学者的研究思路，并继承了本实验室前辈的研究内容， 将肌原纤维小片化指数运用于人体组织，验证其推断死亡时间的可行性，同时试 图寻找人体骨骼肌中肌红蛋白的降解规律同死亡时间之间的关系，为推断死亡时 间找寻一种新的检测目标，并期望该方法能用于实践中。 肌红蛋白( m y o g l o b i n ，m b ) 是由1 5 3 个氨基酸构成的单一肽链，分子量 1 7 8 0 0 ，其主链的7 5 折叠成a 螺旋构象，共有8 段主要的螺旋，以a 、b 、c 、 h 命名。肌红蛋白的功能是把氧从肌细胞附近毛细血管的血液通过细胞膜运到肌 细胞中，以m b 0 2 形式暂时贮氧，并可携带氧在肌肉中的运动，在肌肉急剧运动 时把氧释放出来，以保障肌肉强烈代谢对氧的需要。目前国内外有很多文献研究 主要集中在利用肌红蛋白检测心急梗塞的情况1 1 0 , 1 1 , 1 2 l ，在急性心肌梗塞( a m i ) 时，心肌细胞坏死，m b 释放入血液中。在症状出现约2 3 小时后，血中m b 可超出正常上限，9 1 2 小时达到峰值，2 4 3 6 小时后恢复正常。而在法医学领 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 域，有用于青壮年猝死综合症的研究、早期心梗的研究【1 4 1 、挤压综合症的研究 旧及电击死的研究i ”1 等，但还未见利用它推断死亡时间的相关研究。因其研究的 广泛性，检测技术相对成熟，抗体价格便宜效果好，而肌肉组织取材广泛方便， 因此本实验选择其作为检测目标。 肌原纤维小片化指数是食品科学领域用于检验肉类嫩度的指标【1 7 ，代表肌 原纤维蛋白的水解程度，主要用来衡量牲畜经屠宰并保存一段时间后的嫩度。这 一过程中，作用最大的蛋白酶系是钙激活中性蛋白酶，它的作用是分解肌间线蛋 白，降解肌球蛋白和肌动蛋白，使肌原纤维的结构松驰、碎裂，肌原纤维降解成 数个肌节组成的串联体或片断。利用c u l l e r 等的方法1 2 0 l ，将o 5 m m l 蛋白浓 度的骨骼肌样品在5 4 0 n t o 处测吸光度值2 0 0 即为肌原纤维小片化指数，可望用 于推断死亡时间。该方法取材广泛、操作简便、成本低廉，本实验室前面的研究 已用兔肌肉组织验证了其可行性【2 l i ，但尚未在人体组织中进行试验，故本实验沿 用其方法，欲在人体组织中验证其可行性。 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 实验一人体死后骨骼肌中肌红蛋白降解与死亡时间 相关性研究( 免疫组化法) 引言 肌红蛋白广泛存在于人体心肌和骨骼肌组织中，人体死后，随着死亡时间的 延长，在各种酶的作用下，肌红蛋白逐渐降解，找寻其中的规律，有望给死亡时 间的推断带来新的方法。本实验采用人体骨骼肌作为样品，在人体死后不同时间 段取骨骼肌组织，用免疫组织化学技术在原位检测肌红蛋白的降解情况。 1 主要材料、试剂与仪器 1 1 主要材料 1 1 1 人体组织( 骨骼肌) 1 1 2 防脱玻片 1 2 主要试剂 1 2 1 分析纯乙醇 1 2 2 分析纯二甲苯 1 2 3 中性甲醛固定液 1 2 4 p b s 溶液 1 2 5 柠檬酸缓冲液 1 2 6 小鼠抗人m b 单克隆抗体 1 2 7 辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体 1 2 8 d a b k i t 1 2 9 苏木素衬染液 1 2 1 0 1 盐酸酒精 1 3 主要仪器 1 3 1 石蜡切片机 1 3 2 显微摄影系统 1 3 3 显微图像分析系统 复旦大学上海医学院病理系 武汉博士德公司 上海振兴化工厂 国药集团化学试剂有限公司 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 武汉博士德公司 武汉博士德公司 武汉博士德公司 本实验室配制 本实验室配制 r e i e h e r th i s t o s t a t , 美国 n i k o nf 5 0 0 a n i k o n 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 2 方法 2 1 实验分组及取材 2 1 1 分别取6 例已知死亡时间的人体骨骼肌组织，置于室温2 5 - j ：1 ； 2 1 2 分别在死后o h 、4 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 、7 2 h 取上述肌组 织，置入4 中性甲醛固定液中固定。 2 2 石蜡切片制作僻】 2 2 1 固定：组织块经4 8 h 固定后，以肌束的纵轴方向常规取材，并再次固定 1 2 h 2 2 2 脱水：按以下时间顺序将上述组织块置入不同浓度酒精中脱水：7 0 酒 精2 h 、8 0 酒精2 h 、9 0 酒精2 h 、9 5 酒精i2 h 、9 5 酒精i i1 2 h 、无水酒精i3 h 、 无水酒精i i3 h ； 2 2 3 透明：经过脱水后的组织块，依次按以下时间放入室温下的二甲苯中透 明：二甲苯i5 m i n 、二甲苯1 5 r a i n 、二甲苯i l l 2 0 m i n ： 2 ，2 4 包埋：经过透明的组织块，依次按以下时间放入6 5 ( 2 环境下的石蜡中： 石蜡i1 5 r a i n 、石蜡i i3 0 m i n 、石蜡1 1 1 6 0 m i n ，最后包埋； 2 2 5 包埋后的蜡块经过- 2 0 c 冷冻3 0 m i n 后用切片机制作成5 1 t m 厚的切片， 每块蜡块各制作5 张切片备用，用防脱玻片捞取： 2 2 6 新制成的石蜡切片在7 0 环境下均匀烤片3 0 m i n ，后放入3 0 温箱中 保存。 2 3 免疫组织化学染色 2 3 1 取上述石蜡切片依次按以下时间放入不同的溶液中脱蜡至水：二甲苯 i1 0 m i n 、二甲苯1 1 1 0 m i n 、无水酒精i1 0 m i n 、无水酒精1 1 1 0 r a i n 、9 5 酒精 i1 0 m i n 、9 5 酒精i i1 0 r a i n 、8 0 酒精1 0 m i n 、7 0 酒精1 0 m i n ； 2 3 2 自来水冲洗1 0 r a i n 、蒸馏水冲洗5 m i n ，再用p b s ( p h = 7 4 ) 冲洗三次， 每次5 m i m 2 3 3 加1 滴过氧化物酶阻断液，室温下孵育1 0 m i n ，以阻断内源性过氧化物 酶的活性； 2 3 4p b s ( p h = 7 4 ) 冲洗三次，每次5 m i n ； 2 3 5 利用微波修复抗原1 0 m i n ，室温下冷却1 0 r a i n 后p b s ( p h = 7 4 ) 冲洗三 次，每次5 m i m 2 3 6 每张切片加5 0 山正常动物非免疫血清，室温下孵育5 m i n ，后p b s 冲洗 5 r a i n ： 2 3 7 再加5 0 山小鼠抗m b 单克隆抗体( 1 ：2 0 0 稀释) ，3 t c 下孵育6 0 r a i n ， 后p b s ( p h = 7 4 ) 冲洗三次，每次5 m i n ； 2 3 8 再加5 0 山辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠抗体，3 7 c 下孵育1 0 m i n ，后 2 0 0 7 年复旦大学上海医学靛磷：研究生毕业论文 p b s ( p h = 7 。4 ) 冲洗三次，每次5 m i n ； 2 3 9 每张切片加新鲜配制d a b 工作液1 0 0 1 ，显微镜下观察最色1 0 m i n ： 2 3 1 0 将切片放入苏术索染色液中浸染5 m i n 。自来水冲洗5 r a i n ，1 盐酸酒 精分化3 s e c ，自来水冲洗l h ； 2 。3 。l l 按鼓下嚣瘸蹶黟黢衣透臻：9 5 溅鞲ll m i n 、9 5 瀵耱i il m i n 、无承 港耪ll m i n 、无承滔赣l il m i n 、二甲苯苯酚混合液2 m i n 、二学笨ll m i n 、二甲 蓉i il m i n ： 2 3 1 2 中性树胶封片； 2 3 1 3 以p b s 液代替一抗作为空白对照，另以正常人体乳腺缀织作为阴性对 照。 2 。4 霭像分辑 2 4 1 显微镜下随机抽取6 个视野作图像分析，并显微照相 3 。缎果 3 。l 久傣瑟瑟不霞辩阉 瑟夤赘魏串貌经蛋囊免疫缠缓纯学d a b 程色结象 死后8 小时内，横缀肌结构未见明显改变，舰浆内m b 着色逐步变淡；死君 2 4 小时，横纹肌出现部分断裂，m b 着色进一步浅淡，并出现局部的缺染区：死 后4 8 小时，横纹肌结构部分破坏，缺染区增多；死后7 2 小时，肌浆内出现大面 积的缺染区。( 见图l 1 1 ) 蓬h 空囱对照( 4 0 0 x )圈2 ：鞠瞧对照( 4 0 0 x ) 2 0 0 7 年羹羹大学上辩蔌学院颈士研究生筝监论文 图3 ：死后o h ( 4 0 0 x ) 翻5 # 死后8 1 1 ( 4 0 0 x ) 图7 死后2 4 h ( 4 0 0 x ) 星4 ：死磊4 h ( 4 0 0 x 囤6 ：死后1 2 h ( 4 0 0 x ) 图8 ：死后3 6 1 1 ( 4 0 0 x ) - l o - 2 0 0 7 颦复曼大学上海医学院嫒士碰究生毕业论文 图9 ：死厩4 8 h ( 4 0 0 x )图1 0 ：死麟6 0 h ( 4 0 0 x ) 鹜1 1 ：毙黯7 2 1 1 ( 4 0 0 x ) 3 2 图像分析系统结架及统计分析 3 2 1 人体死后不同时间段各骨骼肌样本m b 染色所测光密度假 人体死后随着死亡时间延长，所测光密度值逐渐降低。( 见袭1 ) 表1 ：死詹誉羼时闻备嚣骼腿样本所潮光密度值及平均馕 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 3 2 2 光密度值与死亡时间的关系 利用分析软件，以死亡时间为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制散点图，并 在回归分析，得到回归方程：y = 一o 0 0 2 9 x + 0 2 6 7 2 ( x 为死亡时间，y 为光密度 值) ，相关系数r = o 9 0 9 6 。( 见图1 2 ) 光密度值与死亡时间关系 0 4 0 j 四o 3 0 餐o 2 0 果 o 1 0 o 0 0 01 22 43 64 8 6 07 2 死亡时间( h ) 图1 2 ：平均光密度值与死亡时间的关系 4 讨论 肌红蛋白是人体肌肉组织中主要的输氧载体，当机体剧烈运动，需要大量耗 氧时，肌红蛋白就会将血液中的氧输送至肌细胞中，它主要分布于人体的心肌和 骨骼肌中。目前国内外在临床上对于m b 的研究主要集中于对其血浆水平的检 测，以诊断早期的心肌梗塞1 1 0 , 1 1 , 1 2 1 。在心梗早期，梗死心肌细胞膜通透性改变， 胞浆内的m b 释放入血液，致使血浆中b i b 的水平显著升高，对于早期诊断心肌 梗塞具有重要意义。但是目前还无法区分心肌来源的m b 与骨骼肌来源的m b ， 所以若以该项检测诊断心肌梗塞时，必须在排除骨骼肌疾病的基础上才能进行。 而在法医学领域，有学者将其用于挤压综合症的鉴定，发现大部分的挤压综合症 在肾脏中出现肌红蛋白管型 2 7 1 。有学者将其用于鉴定电击死的鉴定，发现电击致 死者的心肌纤维中出现m b 的缺染区，证实心肌缺血、缺氧性改变，可以作为电 击死的辅助鉴定手段。也有用于心肌梗死致死者和青壮年猝死综合症者的心肌 梗死改变的鉴定。目前尚无利用m b 推断死亡时间的相关报道。本实验首次应用 检测骨骼肌细胞中的m b 的降解情况来推断人体死亡时间。通过对m b 在人体死 后的降解情况的检测，探讨其与死亡时间的规律性，为法医学推断死亡时间提供 新的途径。 2 0 盯年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 在进行免疫组织化学实验之前，对于时间段的划分进行了预试验，采用了 w e s t e r nb l o t t i n g 方法，结果发现，在死亡5 天之后，m b 无法被检测出来，死后 3 天尚可检测到，因此实验时间分段定在了死亡后7 2 h ( 3 天) 内。从中我们也 可以知道，如果肌肉组织中无法检测到m b ，说明死亡时间己在5 天以上；如果 检测到m b ，则说明死亡时间在3 天以内。 m b 广泛存在于骨骼肌细胞胞浆中，占肌蛋白总量的0 1 o 2 。从最终 的免疫组织化学染色结果看，组织染色程度随着时间的延长逐渐变浅，并出现分 布不均的情况，说明m b 随着死亡时问逐步降解，因此着色区越来越少，根据不 同的着色情况，可以初步判断死亡时间。死后8 小时内，横纹肌结构未见明显改 变，肌浆内m b 着色逐步变淡；死后2 4 小时，横纹肌出现部分断裂，m b 着色进 一步浅淡，并出现局部的缺染区；死后4 8 小时，横纹肌结构部分破坏，缺染区 增多；死后7 2 小时，肌浆内出现大面积的缺染区。随后采用图像分析软件，随 机选取数个视野并测定其平均光密度值，并以死亡时间为横坐标，光密度值为纵 座标作图，可以更直观的反应m b 降解情况同死亡时间之问的规律。可以发现， 死亡1 2 小时内，m b 降解趋势较明显，此后降解曲线较平缓。进一步可以求出 回归方程( 见图1 2 ) ，其相关系数为o 9 0 9 6 ，相关性高，可见人体死后肌红蛋白 的降解有望用于推断死亡时间。 本实验室曾做过大量实验，运用流式细胞仪技术结合图像分析法、d n a 末 端转移法等技术手段研究d n a 降解规律与死亡时间的相关性| s 9 1 ，发现d n a 降 解速度非常快，心、肝、肾组织细胞核d n a 在死后6 小时已非常低，脾脏因含 有大量淋巴细胞，d n a 含量丰富，因此可以延长至1 2 小时，但1 2 小时后d n a 含量也下降至极低水平。可见利用d n a 降解规律推断死亡时间只能运用于极早 期，而且相比骨骼肌，心、肝、脾、肾等组织取材需要做系统解剖，而在实际工 作中，在许多特殊案件如碎尸案，常无内脏器官。因此，运用骨骼肌内肌红蛋白 的降解规律推断死亡时间具有取材方便、时间跨度较大、相关性高等优点。 免疫组织化学方法发展至今已是一项非常成熟的技术。可以在组织原位观察 到目标蛋白的表达，定位准确，直观易观察。显微图像分析技术是- - f - j 随着计算 机技术的发展而新兴的技术，可以对染色组织进行半定量的分析，通过计算机将 各时间段染色程度转换成数值，进而对这些数据进行统计分析并绘图，可以更直 观的反映m b 降解情况同死亡时间之间的相关变化情况。 总之，利用免疫组织化学方法能够在细胞水平原位观测到m b 的降解情况， 同时结合图像分析技术，能够较直观的反映其与死亡时间之间的相关性，骨骼肌 中m b 随死亡时间延长降解的规律可以作为推断早期死亡时间新的科学依据之 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 实验二人体死后骨骼肌中肌红蛋白降解与死亡时间 相关性研究( w e s t e mb l o t t i n g 法) 引言 实验一已证实肌红蛋白随着死亡时间的延长而逐渐降解，尤以死后1 2 小时 内降解较明显，为了进一步验证上述结论，同时对肌红蛋白降解的情况进行半定 量的分析，本实验采用w e s t e r nb l o t t i n g 技术检测骨骼肌中肌红蛋白的降解情况， 并利用图像分析软件进行分析。实验中以p a c t i n 作为内参，以减少实验操作及 加样量的影响。 1 主要材料、试剂与仪器 1 1 主要材料 1 1 1 人体组织( 骨骼肌) 1 1 2b i o t r a e ep v d f 转印膜 1 1 3 转膜滤纸 1 1 4 感光胶片 1 2 主要试剂 1 2 13 0 * 4 丙烯酰胺 1 2 24 i r i s c f s d s 溶液( p h = 8 8 ) 1 2 34 i r i s c l s d s 溶液( p h = 6 8 ) 1 2 4 1 0 过硫酸铵 1 2 5 t e m e d 1 2 6 裂解液 1 2 7 小鼠抗人m b 单克隆抗体 1 2 8 小鼠抗人 a e t i n 单克隆抗体 1 2 9 h r p 标记羊抗小鼠l g g 抗体 1 2 1 0 p b s t 溶液 1 2 1 l 考马斯亮蓝染色液 1 2 1 2 脱色液 1 2 1 3 发光试剂 复旦大学上海医学院病理系 p a l l 公司 a m e r s h a m 公司 柯达公司 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 国药集团化学试剂有限公司 本实验室配制 武汉博士德公司 武汉博士德公司 武汉博士德公司 本实验室配制 本实验配制 本实验室配制 复旦悦达公司 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 1 2 1 4 显影剂、定影剂 1 2 1 5 双缩脲试剂 1 2 1 6 电泳缓冲液 1 2 1 7 加样缓冲液 1 2 1 8 转膜缓冲液 1 2 1 95 脱脂奶 1 3 主要仪器 1 3 1 分析天平 1 3 2 微量注射器 i 3 3 匀浆机 1 3 4 低温离心机 1 3 52 0 目铜制筛网 1 3 6 紫外分光光度计 i 3 7 电泳仪 1 3 8 凝胶成像分析系统 复旦悦达公司 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 本实验室配制 上海天平仪器厂，f a l 0 0 4 型 上海医用激光仪器厂 宁波新芝科器研究所，d y 8 9 - i 型 上海安亭科学仪器厂，t g l - 1 6 g 型 上海实生细胞生物技术有限公司 上海棱光技术有限公司，7 5 2 s 型 a m e r s h a m 公司，e p s 3 0 1 型 复日公司，f r - 2 0 0 a 型 2 方法 2 1 实验分组及取材 2 1 1 分别取6 例已知死亡时间的人体骨骼肌组织，置于室温2 5 4 - i ： 2 1 2 分别在死后o h 、4 h 、8 h 、1 2 h 、2 4 h 、3 6 h 、4 8 h 、6 0 h 、7 2 h 取上述肌组 织各o 5 9 。 2 2 蛋白质提取 2 2 1 将上述肌组织投入匀浆机，加入5 m l 预冷的裂解液( 1 0 0 m m 氯化钾， 2 0 m m 磷酸钾，i m me d t a ，i m m 氯化镁，i m m 叠氮纳，p h 7 o ) 匀浆2 m i n ， 后以离心半径4 c m ，1 5 0 0 r p m 离心3 m i n ； 2 2 2 取上清液，4 3 2 低温离心机3 0 0 0 9 下离心2 5 m i n ，弃上清； 2 2 3 加入2 m l 裂解液，混匀备用。 2 3 蛋白定量：蛋白浓度的测定利用双缩脲法1 2 3 1 2 3 1 制定标准曲线 2 3 1 1 利用标准牛血清白蛋白配置成不同浓度的蛋白溶液，分别为0 ，2 ， 4 ，6 ，8 ，1 0 m g r n l ： 2 3 1 2 取上述配好的不同浓度牛血清白蛋白溶液i m l ，加入4 r n l 双缩脲试 剂，充分混匀，常温下暗室中静置3 0 m i n ； 2 3 1 3 反应后应用紫外分光光度计测其在5 4 0 r i m 处的吸光值，以吸光值为 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 纵坐标，蛋白浓度为横坐标绘制标准曲线。 2 3 2 样品的浓度测定和稀释 2 3 2 1 待测的样品蛋白液各取0 2 5 m l 加o 7 5 m 1 裂解缓冲液稀释； 2 3 2 2 双缩脲法测定，从标准曲线查得各样品蛋白浓度； 2 3 2 3 依照所测的蛋白浓度将各份样品液稀释成o 5 m g m l 。 2 4s d s - - p a g e l u j 2 4 1 按照电泳槽说明书中的使用方法安装电泳槽玻璃板； 2 4 2 配制1 5 分离胶( 3 0 丙稀酰胺3 4 m l ，4 x t d s c i s d s ( p h 8 8 ) 1 7 m l ， 双蒸水1 7 m l ，1 0 过硫酸氨6 8 p l ，t e m e d l 5 山) ，混匀后往玻璃板中灌胶，饱 和正丁醇封盖； 2 4 3 分离胶凝固后倾去正丁醇，双蒸水清洗3 次； 2 4 4 配置4 浓缩胶( 3 0 丙稀酰胺o 3 m l ，4 x t f i s c i s d s ( p h 6 s ) o 5 m l ，双 蒸水1 2 n i l ，1 0 过硫酸氨2 0 m ，t e m e d 2 山) ，混匀后在分离胶上灌胶，并缓慢 插入梳子； 2 4 5 浓缩胶凝固后拔去梳子，电泳槽中加入适量电泳缓冲液； 2 4 6 各取上述稀释成o 5 m g m l 的样品液2 0 u l ，以l ：l 比例加入2 0 t d 加样 缓冲液，水浴中煮沸3 分钟，冷却后于两块胶中各加样3 0 山，并加入蛋白m a r k e r ； 2 4 7 接通电源，先以1 0 m a 电泳3 0 m i n ，在以2 0 m a 电泳9 0 m i n ，以溴酚蓝 到达凝胶底部为宜； 2 4 8 电泳结束后用考马斯亮兰染色液染色2 个小时；后用脱色液i 脱色3 0 分钟，再以脱色液i i 脱色至凝胶背景透明； 2 4 9 将脱色后的凝胶置于凝胶成像分析系统中以2 4 x 曝光并拍照； 2 4 1 0 根据m a r k e r 的分子量确定目的蛋白的位置； 2 ，4 1 1 以加样缓冲液代替蛋白样品作为空白对照。 2 5w e s t e r nb l o t t i n g 2 5 1 按上述方法制胶，对照m a r k e r 分别在1 0 2 0 k d 和4 0 6 0 k d 之间割胶， 并按照凝胶大小裁定p v d f 膜，膜各边长应比凝胶长l m m ，将膜在甲醇中活化 数秒后和凝胶一同置入转膜缓冲液中平衡3 0 m i n ； 2 5 2 剪取同胶一样大小的滤纸6 张，置转膜缓冲液中饱和； 2 5 3 在转膜槽中按照从负极到正极方向依次安装海绵滤纸凝 胶p v d f 膜滤纸海绵； 2 5 4 倒入转膜缓冲液，接通电源，2 5 v 、2 5 0 m a 条件下转膜9 0 m i n ； 2 5 5 取出转好的p v d f 膜，5 脱脂牛奶室温下封闭3 0 m i n ，以p b s t 洗涤 1 5 m i n 3 次： 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 2 5 6 以1 ：2 0 0 比例稀释小鼠抗人m b 抗体及 a c t i n 单克隆抗体，与膜在室 温下孵育4 5 r a i n 后，以p b s t 洗涤1 5 m i n 3 次以p b s t 洗膜； 2 5 7 加二抗( 玎冲标记羊抗鼠抗体) 孵育4 5 m i n 后，以p b s t 洗涤1 5 m i n x 3 次，p b s 洗涤1 0 m i n x 3 次； 2 5 8 将发光试剂与p v d f 膜反应l m i n ，于暗室中感光，然后显影、定影， 照相固定。 3 结果 3 1 各样本的蛋白免疫印迹结果 实验结果显示随着死亡时间的推移，在死亡7 2 小时内，弘a c t i n 未见明显降 解，而m b 的条带随着死亡时间的延长，越来越淡，表明m b 随着死亡时间的推 移在逐步降解，含量越来越少，此变化尤以死亡1 2 小时内明显。( 见图1 3 1 8 ) 图1 3 ：样品l 免疫印迹图图1 4 ：样品2 免疫印迹图 图1 5 ：样品3 免疫印迹图图l6 样品4 免疫印迹图 图1 7 ：样品5 免疫印迹图图1 8 ：样品6 免疫印迹图 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 3 2 生物电泳图像分析软件测得各样品i b - a c t i n 和m y o g l o b i n 的灰度值比值 3 2 1 死后不同时间各样品所测m y o g l o b i n 灰度值与b - 血灰度值之间的比 值随着死亡时间的延长而越来越小，以1 2 小时内下降明显。( 见表2 ) 表2 ：死后不同时间各样品所测m y o g l o b i n 灰度值与肛a e t i n 灰度值之间的比值 3 2 2 以死亡时间为横坐标，灰度比值为纵坐标，绘制散点图，并作回归分析， 得到回归方程：y = 一0 0 0 8 9 x + 0 7 1 0 1 ( x 为死亡时间，y 为灰度比值) ，相关系 数r = o 9 5 3 3 。( 见图1 9 ) 1 4 0 1 2 0 1 o o o 8 0 o 6 0 0 4 0 0 2 0 0 o o 灰度比值与死亡时间关系 01 22 4 3 64 86 07 2 死亡时间 图1 9 ：灰度值与死亡时间的关系 趔丑越拭 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 4 讨论 通过实验一我们发现m b 随着死亡时间的延长逐步降解，并与死亡时间呈现 一定的规律性。为了进一步了解这种规律，我们采用w e s t e r nb l o t t i n g 技术，检 测m b 的降解情况。以期更快捷、更灵敏、更准确地反映这种规律。 免疫印迹法也称为免疫转印技术，1 9 7 5 年s o u t h e r n 首先采用该方法来分析 d n a ，称为s o u t h e r nb l o t t i n g 。1 9 7 9 年a 1 w i n e 将此法用于r n a 分析，称为n o r t h e r n b l o t t i n g 。同年，t o w b i n 等将该方法运用于蛋白质分析领域，称为w e s t e r n b l o t t i n g 。 因此w e s t e r nb l o t t i n g 技术已相当成熟，其主要原理是根据各种抗原分子量的不 同，所以在电泳中行走速度不同，最终在醋酸纤维膜上所处的位置也不同，经过 和特异性抗体的反应并用特定的显色法显现，就可以鉴定特定的蛋白。结合后期 的图像分析技术，通过分析显色后蛋白条带的不同灰度值，可以对蛋白进行半定 量的分析。w e s t e r nb l o t t i n g 实验操作相对简便，需时较短，重复性强，实验结果 稳定可靠。因此我们选用该方法对人体死后骨骼肌中肌红蛋白的降解情况进行检 测。 肌动蛋白是一条由多肽链构成的分子量为4 2 k d 的球形分子，它在进化上 很保守，与肌球蛋白结合构成微丝后有多种生物学功能：构成细胞骨架，维持 细胞形状。参与许多细胞活动，如细胞运动、分泌、细胞质流动、吞噬细胞溶 解和胞质分裂等过程。参与细胞内信号的传递。参与蛋白质的合成。肌动蛋 白有6 种不同的异构体，根据不同的等电点分别称为日t - a c t i n 、p a c t i n 、1 , - a c t i n 。 其中争a c 曲为胞质肌动蛋白，是细胞骨架的组成部分，同时也参与细胞信息的 传递、细胞移动和黏附阴。它在所有组织细胞中衡量表达，且表达量基本不随年 龄而改变。同时有研究1 2 6 】表明肌动蛋白在死后8 天仍可检测到，且其降解极其缓 慢。因此我们选取p - a c t i n 作为内标，以排除样品蛋白浓度、实验操作等各方面 对实验结果的影响。 最后结果我们以m b 测得的灰度值与p - a c t i n 测得的灰度值的比值作为观测 目标，以便更准确真实地反映死后m b 的降解情况，研究其与死亡时间的规律。 从结果看，上述灰度比值随着死亡时间的延长而逐步降低，而且在死亡1 2 小时内变化趋势较明显，随后趋于平缓，表明m b 的降解与死亡时间密切相关( 相 关系数r = 0 9 5 3 3 ) ，并且在死亡后1 2 小时内降解明显。死后7 2 小时内可持续检 测到m b ，而死后5 天则无法检测到，该实验结果同实验一的结果相一致，且相 关性更高。因此m b 有望成为早期死亡时间推断的一项可靠检测指标。 曾有学者研究报道1 2 6 1 ，利用检测肝脏肌动蛋白、微管蛋白的降解情况推断腐 败尸体的死亡时间，主要集中在死亡8 日以后，而肌红蛋白降解情况的检测结果 表明其适用于推断早期死亡时间，正好填补了此类研究的空白。 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 本课题研究样本取材来自肌肉，来源广泛，取材方便，利于应用，在实际检 案中，尤其是在一些特殊案件中如碎尸案等具有相当大的优势，该类案件中，尸 体通常都不完整，有时候只有躯体的某一部分，这种情况下，肌肉组织是最容易 获取的检材，通过w e s t c mb l o t t i n g 方法半定量研究肌肉中m b 随死亡时间的降 解规律，有望成为实际检案工作早期死亡时间推断的科学依据之一。 2 0 0 7 年复旦大学上海医学院硕士研究生毕业论文 实验三肌原纤维小片化指数与人体死亡时间相关性 研究 引言 肌原纤维小