（发酵工程专业论文）野生产香酵母cf610的初步研究.pdf

摘要 本论文对一株从浆豆腐点浆剂一酸浆中分离出的野t 卜产香酵母一c f 6 1 0 做了较为初步的研究。 通过传统的鉴定实验，即生理生化实验，形态特征观察等对产香酵母 c f 6 1 0 进行菌种鉴定。c f 6 1 0 被鉴定为克鲁斯假丝酵母( c a n d i d a k r u s e i ) 。 通过气相色谱法、气相色谱质谱联用法对克鲁斯假丝酵母的产香成分进行 分析。通过气相色谱法确定的香味物质有：乙醛，乙酸乙酯，乙醇，正丙醇， 异丁醇，币丁醇，异戊醇，乳酸乙酯。通过气相色谱质谱联用法确定的香味物 质有：己酸，辛酸，3 羟基一b 突厥酮，3 甲硫基1 丙醇，0 一苯乙醇，对羟基苯 乙醇，p 一吲哚乙醇，己酸乙酯，乙酸苯乙酯，7 ，壬内酯，十七烷，苯酚，2 一甲 基萘。 并且对气相色谱质谱联用法谱图中峰面积最大的物质一b 一苯乙醇，作了定 量分析。通过气相色谱内标法，以2 乙基正丁酸为内标物，确定b 一苯乙醇的 含量为1 5 0 m g l 。 为了应用此株酵母，对应用中常用指标进行测定。这些指标包括：酒精发 酵力，产生c 0 2 能力，糖发酵性，凝聚力，热致死温度，以及耐酒精能力、 耐糖性、耐盐性、耐酸耐碱等生理耐性。结果表明，克鲁斯假丝酵母产生酒精 及c 0 2 的能力较面包酵母及啤酒酵母弱；能发酵葡萄糖，但不发酵麦芽糖、 蔗糖、乳糖等；其本斯值为4 4 m l ：热致死温度为6 5 。c ：最高耐糖、耐盐、耐 酒精浓度分别为4 0 ，8 ，1 0 ；适宜发酵p h 范围为4 7 ，牛长p h 范围则 在1 9 。 通过克鲁斯假丝酵母发酵苹果渣及生产馒头等方面尝试，对其应用作了初 步探讨。实验表明，克鲁斯假丝酵母发酵苹果渣可在适宜的条件下产生极佳的 香味，可考虑用来生产复合香味剂。而发酵馒头的实验表明，其不适宜单独发 酵馒头，但是与其它酵母混和发酵可以产生较好香味。 关键训：野生产香酵母；鉴定；香味成分分析；发酵特性；应用 a b s t r a c t t h i st h e s i si sm a i n l ya b o u taw i l da r o m ap r o d u c i n gy e a s tc f 6 1 0t h a ti s s e p a r a t e df r o ms u a n j i a n gw h i c hi sak i n d o fc o a g u l a n tf o rb e a n c u r d t h r o u g hp h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a le x p e r i m e n t sa n do b s e r v a t i o no fi t s c o n f i g u r a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ，t h ea r o m ap r o d u c i n gy e a s tw a sc l a s s i f i e da sc a n d i d a k r u s e i ， t h ea r o m a c o m p o n e n t st h a ta r ep r o d u c e db yt h ey e a s tw e r ea n a l y z e db yg a s c h r o m a t o g r a p h ya n dg a s m a s sc h r o m a t o g r a p h y t h es u b s t a n c e st h a tw e r ea n a l y z e d b yg a sc h r o m a t o g r a p h yw e r ea l d e h y d e ；a c e t i ca c i de t h y le s t e r ；e t h y la l c o h o l ； n - p r o p y la l c o h o l ；i s o b u t y la l c o h o l ；n - b u t y la l c o h o l ；i s o a m y la l c o h o l ；e t h y ll a c t a t e a n dt h es u b s t a n c e st h a tw e r ea n a l y z e db yg a s - m a s sc h r o m a t o g r a p h yw e r eh e x a n o i c a c i d ；o c t a n o i ca c i d ；3 - h y d r o x y - b a t a d a m a s c o n e ； 1 - p r o p a n o l ，3 一( m e t h y l t h i o - ) ； p h e n y l e t h y la l c o h o l ；b e n z e n e e t h a n o l ，4 - h y d r o c y ，1 h l n d o l e 一3 一e t h a n o l ；h e x a n o i c a c i d ，e t h y le s t e r ；a c e t i ca c i d ，2 - - p h e n y l e t h y le s t e r ；n o n l a c t o n ；h e p t a d e c a n e ；p h e n o l ； n a p h t h a l e n e ，2 - m e t h y l - 1 1 1 eq u a n t i t a t i v eo f t h es u b s t a n c ep h e n y le t h y la l c o h o l w h o s ep e a ka r e ai st h e b i g g e s ta c c o r d i n gt ot h eg a s - m a s sc h r o m a t o g r a m ，w a sa n a l y z e d t h ec o n t e n to f p h e n y l e t h y la l c o h o lw a sd e t e r m i n e da s15 0 m g lb yi n t e r n a lc a l i b r a t i o np r o c e d u r e ， a n d2 - e t h y lb u t y r a t ew a su s e da si n t e r n a ls t a n d a r d t h ef e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h ey e a s tw a ss t u d i e df o rt h eu s eo f a p p l i c a t i o n i n c l u d i n gt h ef e r m e n t i n gf o r c e ，s u g a rf e r m e n t a t i o na b i l i t y , f l o c c u l a t i o n p r o p e r t y , k i l l i n gt e m p e r a t u r e ，a n da l s ot h er e s i s t a n c ec a p a b i l i t yo fa l c o h o l 、s u g a r 、 s a l t 、a c i da n da l k a l i t h er e s u l t ss h o w e dt h a tc a n d i d ak r u s e ij sw e a k e ri n f e r m e n t i n gf o r c ec o m p a r e dw i t hb r e a dy e a s ta n db e e ry e a s t ；c a nf e r m e n ts u g a r , b u t c a l m o tf e r m e n tm a l t o s e ，s u c r o s e ，l a c t o s e ；h a sag o o df l o c c u l e n tp r o p e r t yw i t ha b u m s t e s tv a l u eo f3 6m l t h i ss t r a i n sk i l l i n gt e m p e r a t u r ew a s6 5 。c i t sr e s i s t a n c e o fs u g a r s a l t ，a l c o h o lc a r lr e a c h4 0 、8 、lo r e s p e c t i v e l y t h eo p t i m u m f e r m e n t a t i o np hw a sb e t w e e n4 7 a n dt h eg r o w t hp hc a nf l u c t u a t ef r o m1t o9 s o m ew o r ka b o u tt h ea p p l i c a t i o no ft h ey e a s tw a sd o n e ，i n c l u d i n gi t s p o s s i b i l i t yi np r o d u c i n gn l ec o m p l e xa r o m ab yf e r m e n t i n ga p p l e d r e g sa n di t s a b i l i t yi np r o d u c i n gs t e a m e db r e a d i ts h o w e dt h a tc a n d i d ak r u s e ic a np r o d u c e a m i a b l ea r o m as u b s t a n c e su n d e rp r o p e rc o n d i t i o n s ，a n dc a nb ec o n s i d e r e da san e w w a yo fp r o d u c i n gc o m p l e xa r o m a w h i l et h ee x p e r i m e n t si nf e r m e n t i n gs t e a m e d b r e a ds h o w e dt h a tc a n d i d ak r u s e ii sn o tp r o p e ri nf e r m e n t i n gs t e a m e db r e a ds i n g l y ， b u tc a r lp r o d u c ea m i a b l ea r o m aw h e nm i x e dw i t ho t h e ry e a s t s k e yw o r d s ：w i l da r o m ap r o d u c i n gy e a s t ；c l a s s i f i c a t i o n ；a r o m a c o m p o n e n t s a n a l y s i s ；f e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r i s t i c s ；a p p l i c a t i o n 附件= 三 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许可。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工业学院享有以任何方式发表、复制、公j ：阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为l l 东轻工业学院。 论文作者签名：毯世歪盘鸽鹰 r 期： 2 业! 年殳月望日 导师签名：邋虬馅嗍坠年月旦日 山东轻t 业学院坝卜学位论史 第一章绪论 1 1 课题背景 目前利用产香微生物及其特异的酶系统来生产单一香味物质或混合香 味物质成为许多研究机构研究的热点。这是因为人们越来越关注健康营养 的生活方式，天然产品成为人们的首选。然而目6 口使用的芳香化学物有近 8 0 是通过化学合成的方式生产。化学法生产的香料，通常不具定向性，或 定向性差，生产过程对环境污染较大，特别是使用重会属催化剂时污染更 大1 1 1 。而天然香料的生产主要依靠收集动物分泌的天然香料或从芳香植物中 提取。这些天然香料的生产方式受诸多条件限制【2 j 。因气候，政局的影响， 生产受损，价格高涨，品质变差而导致的天然香料供应不稳定及消费者对 天然芳香产品需求的增加，促使人们寻找生产天然芳香化合物的其它方 式一微生物发酵法、植物细胞培养法和酶法。而微生物发酵法较植物细胞 培养法周期短、高效、专性强，并具备许多其它方式所不具备的优点。 1 2 历史 其实在了解微生物以前，人们就开始利用微生物来酿酒，制作奶酪等【3 】。 这些微生物在发酵产生醇类、乳酸的同时，还产生香味物质，赋予发酵产 品以独特的香气。现在此类传统的微生物生物技术已经由原始的人工作坊 式的生产发展为大型工业化生产1 4 】。 芳香类化合物的认识和发展也起步较早。18 3 7 年l i e b i g 和w 6 h l e r 分离 鉴定出第一种芳香类物质苯甲醛1 4 1 。至1 9 世纪7 0 年代，现代香料工业就 已经丌始了，其标志是香兰素的分离、鉴定和合成【4 1 。然而第一篇关于微生 物生产香味物质的报道直到1 9 2 3 年才出现( o m e l i a n s k i1 9 2 3 ) i5 1 。这与人 们认识芳香类化合物的时间相比要晚得多。 此后，2 0 世纪5 0 年代，随着气相色谱取代传统的有机分析方法，以及 挥发性香味成分结构的明了，许多关于微生物产香的报道相继出现 ( a r m s t r o n ge ta 1 1 9 9 3 ；b e r g e r1 9 9 6 ，1 9 9 5 ：b i g e l i s1 9 9 2 ；f e r o ne tl 1 9 9 6 ； g a b e l m a n1 9 9 4 ；h a g e d o m k a p h a m m e r1 9 9 4 ；j a n s s e n se ta 1 1 9 9 2 ；k r i n g se ta l 1 9 9 5 ；w i n t e r h a l t e r , s c h r e i e r1 9 9 3 ) 6 - t5 】。早期的研究着重于菌种的筛选以及 微生物产的香味物质的成分。现阶段的研究丌始更多的利用微生物技术( 包 括基因工程) 来提高微生物生产香味物质的生物转化效率。 第章绪论 1 3 微生物生产香味物质的优越性 “天然”对于利用微生物生产香味物质有极大的意义并使得产品有极 大的利润空间。同一种化合物，天然和合成在价格上相差极大，比如说， 合成香草醛价格为1 2 美元千克，而从香草中提取的香草醛价格为4 0 0 0 美 元千克( f e r o ne ta 1 1 9 9 6 ) 1 1 0 l 。 而利用微生物生产香味物质具有许多其它生产方式无法比拟的好处。 首先生物催化剂的主要优势在于，酶或微生物进行催化反应的专一性强，、 特别是立体选择性很高，而且生产过程中反应条件温和，节能，对环境友 好。如果只有一种异构体，特别是立体异构体或对映体具有所需的生理活 性时，这种优势就特别重要。香料中这种情况是常见的，例如，l 与d 构 型页篙酮的味道相差很大，只有l 页篙酮具有留兰香；只有l 谷氨酸钠具 有鲜味；薄荷醇有3 个手性中心，因而有8 个异构体，但只有l 薄荷醇具 有所需要的薄荷昧及清凉感。而且，有的同一种物质不同的手性具有不同 的香味阈值。如园油桐( 4 r 5 s ，7 r ) ( + ) 闽值为0 6 1 0 p p m ，而( 4 s ，5 r ，7 s ) 一( 一) 闽值为4 0 0 8 0 0 p p m t “。 其次微生物生产香味物质可以摆脱从自然界动植物身l ：提取香味成分 所受的各种限制，如地域、季节、气候的影响。而且利用微生物生产香味 物质节约了自然界有限的资源，起到了资源保护作用，这对于发展中国家 尤为重要。 微生物生产香味物质具有大规模工业生产的潜力。通过微生物生物技 术的应用，对其代谢途径的控制，以及缓和的产品回收可以源源不断地生 产出大量同型异构体产品。 1 4 产香微生物及其所产香味物质 由于微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、 蛋白酶类、纤维素酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促 作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，便可使底物发生分 解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化 合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、酯类、酚 类、呋哺类、吡嗪类、吡啶类和萜烯类等。 目前对许多微生物产的香味物质已经有所研究，但是还是远远不够。 已知的微生物和其产的香味物质见表1 1 1 4 1 。 当查墅三些兰堕堡! ：堂垡鲨苎 一一 表1 1 微生物及其产的香昧物质 菌种类型 菌种名称特征性香味化合物 备注 p y c n o p o m w c i r m a b a r i n u s香草醛 f a l c o n n i e re ta l 一19 9 4 s c h n o d e r m ab e n z o i n u m 苯甲醛 f a b r e e la 1 1 9 9 6 i s c h n o d e m 口b e n z o i n u m 4 - 甲氧基苯甲醣 f a b r ee ta 1 1 9 9 6 驷删咖”? 撇 氨茼酸甲酉匕 f a l c o n e e t n i e raletl98a1199trametes s p 9 4 p a g ee ta 1 1 y 苎， 真菌类 4 篝鬈产。2 a y e ra n ds i n g e r1 9 8 0 r 酮 。 p h e l l i n u 5s p 水杨酸甲酯 p o l y p o r u st u b e r a s t e r ， p h e l l i n u ss p a s c o i d e ah y l e c o e t i p o l y p o r u ss p l e n t i n k se d o d e s l e n t i n u se d o d e s ， g r i f o l a f r o n d o s a ， p l e u r o t u s p u l m o n a r i u s m y c e n a p u r a w o t f i p o r i ac o c o s p t e u r o t u se u o s m u s 苯甲酸甲酯。 苯甲酸乙酯 2 苯乙醇 橡苔挥发性物 蘑菇香精 i 辛烯3 醇， 1 辛烯3 酮 香茅醇 沉香醇( 芳樟醇) 香娩素 a s p e r g i l l u sn i g e r ， p e n i c i l l i u ms p a u r e o b a s i d i u m甲酮 p u l l u l a n s a s p e r g i t l u ss p 吡嗪 内酯 r h i z o p u sa r r h i z u s 跃链脂肪酸酯 肋枷驴。埘妇历。6 ”。b 菜莉酮酸酯 g i b b e r e l l af u l i k u ，q o w e l s h1 9 9 4 ； m a n l e y1 9 9 4 k a w a b ea n dm o r i t a 1 9 9 3 b e r g e r1 9 9 5 a a b r a h a me la 1 19 9 4 a y a s u m o t oe ta 1 1 9 7 4 a m s t r o n ga n db r o w n 1 9 9 4 ； a s s a f e la 1 1 9 9 5 k r i n g se ta l ，1 9 9 5 k r i n g se la l1 9 9 5 b e r g e r1 9 9 5 a h a g e d o r na n d k a p h a m m e r19 9 4 ； a r m s t r o n ga n db r o w n 1 9 9 4 s e i t z1 9 9 4 a r m s t r o n ga n db r o w n 1 9 9 4 m i e r s c he la 1 1 9 9 3 ； b r o a d b e n te ta 1 1 9 6 8 m a r a s m i u sa l l i a c e u s含硫挥发性化合物 r a p i o re la 1 1 9 9 6 第一章绪论 1 。5 微生物法生产某些芳香化合物 目前仅有少数厂家利用微生物法工业化生产部分香味物质，但是其丁 艺大多处于保密状态，而大部分微生物法生产香味物质处于实验室研究阶 段。下面主要介绍两种重要的芳香化合物的微生物生产方而的实际事例或 研究成果。 1 5 。1y 癸内酯 用微生物细胞合成v 癸内酯是生物法合成水果型香料的一个很好的例 4 山东轻工业学院硕士学位论义 子。用微生物细胞或生物酶催化合成甜味、水果型香料很成功，因为这一 过程相当容易地模拟了植物内的酶催化生成相应物质的过程。化学分析表 明，苹莓的昧道和香气至少由3 5 0 种分子( 包括1 0 0 多种酯) 共同贡献而 成，一些内酯也贡献出草莓的香甜味，y 癸内酯是其中之。y 癸内酯是许 多水果香的重要成分，也是梨、杏香昧的关键成分。所以y 癸内酯对高品 味的水果香味是很重要的。传统上，y 癸内酯用化学法生产，但是消费者更 愿意接受天然产品，这为生物法生产y 癸内酯提供了机会。而且，t 一癸内酯 是手性分子，从水果中提取的y 癸内酯具有特定的立体结构，而化学法生 产的却是消旋体。因此，用生物法生产光活性的y 癸内酯的工作吸引了许 多研究人员的关注，并开展了大量的工作。 l e e 等用发酵法生产了7 癸内酯【1 6 1 。在罐式发酵器中，微生物 s p o 而o l o m y c e so 如，淞生长迅速，大约培养7 2 h 后进入静止期。在9 2 h 的培 养期内，培养介质中的p h 值和溶解氧浓度开始时下降，随后又上升，培养 1 2 0 h 的最大产率为5 4 6 m g l 。对p h 值和通气率的研究表明，介质的p h 值 分别保持在4 0 、5 0 、6 0 、7 0 时，对s o d o r u s 的生产无影响同时也不增 加y 癸内酯的产率；当通气率为2 v v m i n ( 体积气体体积液体分钟) 时， 最后的菌体量最大，但是获得最大y 一癸内酯产率时的通气率是1 0 或1 5 v v - m i n 。采用分批进料培养方式时，可得到最大v 癸内酯产率。分批进料 时间为第3 、4 、5 h ，分批加入蓖麻油水解液，培养液7 天后得到t 一癸内酯 最大产率2 0 8m g l 。 实际的工业过程【】7 - 1 9 1 ，包括蓖麻油的水解、发酵、发酵液的巴氏灭菌、 酸化、用离心或微滤除去圆形物、萃取、分离、溶剂萃取、精馏等步骤， 已投入工业使用。众多的研究工作揭示出生物法生产y 一癸内酯的许多规律。 抑制氧化磷酸化的抗生索抑制剂也抑制y 癸内酯的形成，这表明了一个完 整的p 一氧化系统的重要性。然而，蛋白质合成和细胞壁合成抑制剂却对y 癸内酯的合成没有什么影响，v 癸内酯产率与所用的蓖麻油量成反比。产品 的回收可以用疏水的大孔树脂吸附，但更常用的是溶剂萃取。通过酯转移 制得的蓖麻酸的酯是更好的原料，因为其在发酵时产t l 的泡较蓖麻油少， 当然，蓖麻油的水解液更好。 1 5 2 香兰素 香兰素( v a n i l i n ) 是香荚兰的主要成分，是一种广谱型高档香料，是目 前世界上产量最大的合成香料f 2 。】。从香荚兰中提取制备的天然香兰素产量 低，每年实际只有约2 0 5 0 t ，远远不能满足市场的需求1 2 i 】；余下的消费缺 第一章绪论 口都是通过化学合成法填补，丽化学合成法存在许多不可避免的弊端，如 产品香型单一、易掺杂质等。 生物法能够合成天然香兰素，并具有污染少、生产清洁、安全等优点【2 “。 目前，已见报道的生物法有微生物发酵法、植物细胞培养法和酶法。下面 介绍微生物生产香兰素的实验室研究情况。 1 9 7 7 年日本t a d a s a k 分离得到的棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u ms p 菌株， 能够将丁香酚转化成香兰素，开辟出生物法制备香兰素的新途径f 2 3 1 。随后 又发现许多细菌、霉菌都能将丁香酚、异丁香酚、阿魏酸、葡萄糖等化合 物转化成香兰素，即可利用多种底物进行微生物发酵法台成香兰素。 丁香酚及其同分异构体异丁香酚均可经化学反应或生物转化反应生成 香兰素。但是以异丁香酚为底物所得香兰素的收率比以丁香酚为底物时高。 以丁香酚为底物时，半知菌纲类的真菌菌株转化合成香兰素最高产量仅有 o 0 2 7 1 9 l 2 4 1 ，黏质沙雷氏菌d s m3 0 1 2 6 菌株转化所得香兰素的摩尔收率 ( 以丁香酚计) 仅为0 1 ，产量是o 0 1 8 9 l 2 5 j 。若底物为异j j 香酚黏质 沙雷氏菌d s m3 0 1 2 6 菌株转化得到的香兰素产量为3 8 9 l ，摩尔收率( 以 异丁香酚计) 为2 0 5 【2 5 l ；枯草杆菌b 2 菌株以异丁香酚为底物时产香兰素 产量为o 6 1 9 l ，摩尔收率( 以异丁香酚计) 为1 2 4 i ”】：而紫红红球菌 m t c c2 8 9 菌株在实验室最佳培养条件下，转化异丁香酚生成香兰素的摩尔 收率( 以异丁香酚计) 可高达5 8 2 “。 以阿魏酸为底物发酵生产香兰素有两种方式：一种是只需单一菌的作 用，丽男一种需要多菌株的联合作用。 以阿魏酸傲唯一碳源的凝结芽抱杆菌b k 0 7 菌株，可经4 乙烯基愈创 木酚生成香兰素。该菌株能在7 h 内代谢9 5 以上的阿魏酸，主要产物为4 - 乙烯基愈创木酚，是迄今为止报道阿魏酸的最快的代谢过程1 2 。r a b e n h o r s t j 等发明的专利方法中，利用土壤丝菌d s m9 9 9 2 菌株将阿魏酸转化成香兰 素，产量高达1 1 5 9 l ，其作用机制尚未见报道【2 ”。 l e s a g e m e e s s e nl 等提出的“两步生物转化法”是多菌株联合作用生产 香兰素的典型，该法利用黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 与朱红密孔菌 ( p y c n o p o r u sc i n n a b a r i n u s ) 联合完成整个转化过程【2 。先是由黑曲霉将阿 魏酸转化成香草酸，产量为o 9 2 9 l ，摩尔收率( 以阿魏酸计) 为8 8 ：再 用朱红密孔菌将香草酸还原为香兰素，产量为o 2 3 7 9 l ，摩尔收率( 以香 草酸汁) 为2 2 。最近他们改阿魏酸为玉米麸作为唯一骥源，创造出不需 任何纯化措施就能得到香兰素晶体的“两步生物转化法”口。 葡萄糖可由淀粉水解得到，原料充足，成本较低，但咀葡萄糖为底物 山东轻工业学院硕士学位论文 经生物转化生成香兰素的研究报道目前仅有一例1 3 ”。首先，葡萄糖在大肠 杆菌重组子( e s c h e r i c h i ac o l ik l 7 p k l 5 2 6 ao rk l 7 p k l 5 9 7 a ) 的作用下 转化成香草酸；然后，香草酸经粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s a ) 中分离得 到的芳醛脱氢酶还原并生成香兰素。要使葡萄糖为底物的生物转化法成为 天然香兰素生产用的工业化实用技术，必须解决大肠杆菌重组子的稳定表 达技术。 综上所述，从我国的原料资源以及生物技术现状来看，以异丁香酚和 阿魏酸为底物的生物转化生产香兰素的技术更具发展前景。 1 6 微生物生产单一香味物质所面临的问题 虽然微生物生产香味物质的前景广阔，并且已经有一些香昧物质的生 产是微生物及其酶系作用的结果，但是目前许多通过微生物法生产香味物 质的研究还处于实验室阶段，这是因为仍然有许多问题需要解决，如产量 还未达到工业生产的要求或者生产过程中的一些下游提取等技术需要进1 步完善。目前面临的主要问题有： 前体或产物对微生物的毒性。并不是添加合适的前体越多，所要的产 物越多。前体如丁香酚及产物香兰素、苯乙醇对菌体的毒性在超过一定量 后就显得尤为严重。选用抗性高的菌株或是及时将产物从发酵液中提取出 来是解决前体或产物的毒性的较好途径。 即时产品回收。及时将产品从发酵液中回收以维持代谢平衡和解除反 馈抑制，以使反应朝正方向进行。经济的产品生产需要简单的下游技术还 要其对细胞没有毒害。目前下游产品回收技术有液液萃墩技术，超临界c 0 2 萃取技术，溶剂固定化技术，吸附，蒸馏等技术。根据产品的性质选择有 效的可工业化的即时产品回收技术是工业化生产的关键。 合适的微生物，合适的工艺参数，以及有效的生产过程监控。合适的 菌种，最佳的工艺参数是生产香味物质的关键。而如果生产的香味物质挥 发性比较强，则可信赖的生产过程监控则显得尤为重要。 1 7 微生物生产复合香味剂方面的应用 微生物生产单一香味物质较为困难，但是相比之下利用微生物生产复 合香味剂则显得更加实用易行。下面介绍微生物在制作烟用香料的应用。 微生物产生的香味物质是否适合于烟草香气特征，取决于产香菌的种 类、培养基的组成成分和配比以及发酵条件( 温度、湿度、酸碱度、诱导 第一章绪论 物、供氧等) 。通过选择特定的菌种、培养基和发酵条件，就可定向发酵生 产出适合各种香型卷烟加香的烟用香精香料f 3 2 1 。 取配好的原料5 0 0 卫，粉碎后适当润水，于l o o 蒸煮3 0 m i n ，冷却后接 入产香菌，于3 0 6 0 温度条件下发酵5 天。然后将发酵产物于1 0 0 加热 回流3 0 m i n 灭菌，冷却后以乙醚( 也可用乙醇或f 已烷等) 为溶剂萃取发 酵产物，萃取液经氮气流挥发除去乙醚后得4 0 9 香料( 代号t m f ) ，产率为 8 。 以乙醚为萃取剂的产品色状为棕黄色树脂状物；以乙醇为萃取剂的产 品色状为深棕色粘稠状膏体。产品的香气多样，有浓郁的果香、坚果香、 焦糖香、烤香、酱香、草药香、烟草香等。此法制取的产品溶解性可完全 溶于5 0 9 5 的乙醇溶液，仅可部分水溶。 以8 5 乙醇为溶剂，按o 1 的量将t m f 加入单料烟及成品卷爆中， 平衡2 4 小时后进行评吸，结果表明t m f 与烟香谐调，能显著提高卷烟香 气质量，使烟气醇和而饱满，并能减轻杂气和刺激性，改善余味，可用于 中、高档卷烟加香【3 3 】。 此种用产香微生物发酵产生的香料系由多组分构成，香气浓郁，集果 香、坚果香、焦糖香、烤香、酱香、草药香、烟草香为体，具有独特风 格而又与烟香谐调，不仅能显著提高香气质量，使烟气醇和、细腻、饱满， 而且能产生由化工合成香料及天然植物提取香料所不能达到的效果。将其 应用于调香工艺，可有助于形成卷烟产品的独特风格，在卷烟新产品开发 加香工艺中可发挥较大作用。 而且通过调节发酵原料组成、配比、菌种及发酵条件，同时采用各种 提取、分离手段将产物分为不同的组分如酸性、中性组分，甚至某几种重 要香气成分，则可以定向改变发酵香料的香气特征，以满足各类型卷烟的 加香要求，形成定型的如清香型烤烟微生物合成香料、浓香型烤烟微生物 合成香料、混合型卷烟微生物合成香料等；也可以根据不同品牌卷烟加香 要求，开发出适合某种品牌卷烟的专用香料。 此种产香的方法所用原料易得成本低。所有富含淀粉、蛋白质、脂 质、纤维素、香味前体物的植物、作物、有机化合物等均可作为原料选择 对象。而生产反应过程又简捷，条件温和。原料按一定配方前处理并接种 后，只需通过发酵过程，便可将原料转化为化工生产需多步反应才能完成 的产品，整个过程均可在较温和的温度、压力条件下进行。 微生物生产烟用复合香味剂对微生物生产其它方面用的复合香味剂具 有极大的参考价值。 山东轻工业学院硕士学位论文 1 8 本论文的思路和框架 鉴于如上所述产香微生物在产香方面的应用及研究进展，本论文希望 通过对实验室保藏的野生产香酵母- - c f 6 1 0 的研究可以在微生物产香方面 做出一定的贡献。c f 6 1 0 系从浆豆腐点浆剂一酸浆中分离出的酵母。此株 酵母利用黄浆水( 卤水点豆腐后的沥水) 发酵产生的香气令人愉悦，具有 浓郁的果香，因此称之为产香酵母。对此株酵母的研究包括以下四个方面： 菌种的鉴定。菌种发酵产香的成分分析，菌种的发酵性能研究以及菌种应 用的初步探讨。 菌种的鉴定是研究微生物生产香味物质的基础。菌种发酵产香成分的 分析可进一步了解此菌株在产香方面的性能。发酵性能研究以确认和了解 其特性，对发酵产香具有一定的参考价值。根据对此菌株的研究，初步探 索应用此菌株的方向，希望能对今后此株酵母的应用起到敲门砖的作用。 第一章实验室保存菌种c f 6 1 0 的裕定 第二章实验室保存菌种c f 6 1 0 的鉴定 2 1 前言 传统方法酵母菌种的划分是根据是否具有有性生殖过程，即畿否形成 子囊孢子、掷孢予或冬孢予，以及有孢子酵母所生孢子的形状、特点和数 目，是否形成假菌丝和真菌丝等特点，把酵母菌分别归入真菌各个不同的 纲、目、科u 。 酵母菌的分类主要有两个系统，一个是荷兰l o d d e r 的分类系统，具体 反映在1 9 7 0 年( 第二版) 的酵母菌的分类学研究( n e y e a s t s ，a t a x o n o m i c s t u d y ) 一书中。另一个是苏联的k u d r i a v z e v 的分类系统，具体反映在1 9 5 4 年的酵母菌分类学一书中。此外，k r e g e r - v a nr 0 ( 1 9 8 4 ) 在l o d d e r ( 1 9 7 0 ) 酵母菌分类系统的基础上，适当作了调整，提出了较新的酵母菌 分类系统。 两周德庆的微生物学实验手册中主要采用了l o d d e r ( t 9 7 0 ) 的 分类系统，也适当参考k r e g e r - v a nr 0 ( 1 9 8 4 ，第三版) 酵母菌分类学 研究的分类系统。其中假丝酵母属的分种检索表和酵母属的分种检索表 对于实验室鉴定菌种有较大的意义。 随着科学技术的进步和发展，目前通过对菌种2 6 sr d n a 序列分析即 可知道菌种的来源和分类名称。但是这需要较高的技术和条件，在本章实 验中仍然采用传统的鉴定方法。 c f 6 1 0 菌株是从酸浆中分离得到的一株功能菌，已经初步鉴定为假丝 酵母属，本章拟根据周德庆的微生物学实验手册中“酵母的分属检索 表”及l o d d e r ( 1 9 7 0 ) 中“假丝酵母属分种检索表”对c f 6 1 0 的属进行确 认，并通过碳源同化等实验对其种进行鉴定。 2 2 实验仪器 f a 2 0 0 4 型上皿电子天平 y x q g 0 2 型电热式蒸汽消毒器 b c m - 1 0 0 0 a 型单人超净工作台 g n p 一9 0 8 0 型隔水式恒温培养箱 h z q q 振荡器 x s 一2 1 2 - 2 0 1 氆双筒电子显微镜 o j 二海天平仪器厂 山东新华医疗器械厂 苏州安泰技术有限公司 上海精宏实验设备有限公司 东联电子技术丌发有限公司 南京新飞达光学仪器公司 山东轻工业学院硕j j 学位论文 杜氏管等 2 3 实验材料及鉴定用培养基 2 3 1 实验材料 c f 6 1 0 ( 实验室保藏) 葡萄糖( g l u c o s e ) ( 分析纯) ；蔗糖( s u c r o s e ) ( 分析纯) ； 麦芽糖( m a l t o s e )( 分析纯) ；乳糖( 1 a c t o s e ) ( 分析纯) ： 海藻糖( t r e h a l o s e ) ( 分析纯) ；纤维二糖( c e l l o b i o s e ) ( 分析纯) ： 山梨糖( s o r b o s e )( 分析纯) ；木糖( x y l o s e ) ( 生化试剂) ； 半乳糖( g a l a c t o s e ) ( 分析纯) ：棉子糖( r a f f i n o s e ) ( 分析纯) ； 赤藓糖醇( e r y t h r i t 0 1 ) ( 生化试剂) ：山梨醇( s o r b i t 0 1 ) ( 生化试剂) ； 肌醇( i n o s i t 0 1 )( 生化试剂) ； 硝酸钾( 分析纯) ；硝酸铵( 分析纯) ； 碘液( 实验室配制) 2 3 2 分属鉴定用基础培养基 ( 1 ) 活化及菌体形态观察用培养基 黄浆水液体培养基：液体培养基是由本实验室凝固大豆蛋白后自制的 黄浆水，并添加2 的葡萄糖。 黄浆水固体培养基：黄浆水，葡萄糖2 ，琼脂2 。 ( 2 ) 生子囊孢子培养基 棉子糖一醋酸钠琼脂培养基：棉子糖0 ，0 4 ，醋酸钠0 4 ，琼脂2 。 石膏块培养基：8 份c a s 0 4 1 2h 2 0 及其3 份水混合，制成楔状斜面。 将斜面置于试管内。管底部垫有棉花，用稀释的1 5 0 b r i x 麦芽汁湿润。1 2 1 灭菌2 0 m i n 。 马铃薯块培养基：将马铃薯去皮，切成长条斜面：装入试管；1 2 1 灭 菌2 0 m i n 。 ( 3 ) 生掷孢子用培养基 麦芽汁琼脂培养基：将麦芽汁液体调节糖度到1 0 0 b r i x ，加2 琼脂， 加热溶解，分装试管；1 2 1 灭菌2 0 m i n ；搁成斜面。 ( 4 ) 观察假菌丝用培养基 马铃薯琼脂培养基：2 0 0 9 马铃薯加1 0 0 0 m l 水，煮沸3 0 m i n ，双层纱 布过滤，补水至1 0 0 0 m l ，葡萄糖2 ，琼脂2 。 第二章实验室保存葡种c f 6 1 0 的攀定 2 3 3 分神鉴定用基础培养基 ( 1 ) 糖类发酵基础培养基； 1 2 5 豆芽汁 黄豆芽1 2 5 克加水l 升，煮沸半小时，过滤后补足水至】升。】5 c 灭 菌3 0 分钟。 ( 2 ) 同化碳源基础培养基 ( n h 4 h s 0 4 0 5 ，k h 2 p 0 4 0 1 ，m g s 0 4 7 h a oo 0 5 ，酵母膏0 ，0 2 7 k 洗 琼脂2 。1 1 5 灭菌1 5 分钟。 ( 3 ) 同化氮源基础培养基 葡萄糖2 ，k h 2 p 0 40 1 , m g s 0 4 7 h 2 00 ，0 5 ，酵母膏0 0 2 ，水洗琼 脂2 。用蒸馏水配制，过滤后装大试管，每管2 0 毫升，1 1 5 。c 灭菌1 5 分 钟。 ( 4 ) 生类淀粉化合物培养基 f n l - 1 4 ) 2 9 0 4o 5 ，k h 2 p o ao 1 ，m g s 0 4 + 7 h 2 0o 0 5 ，c a c 2 + 2 h 2 0o 0 1 n a c lo 0 1 ，酵母膏0 1 ，葡萄糖3 。 2 4 实验方法与步骤 2 4 1 活化 从斜面保藏的酵母菌中挑取少量菌接入1 0 0 m l 2 5 0 m l 黄浆水液体培养 基中，2 8 摇床1 5 0 r m i n 培养1 8 - 2 0 h 至对数生长期为活化一次；后将少量 液体菌液倒入新鲜黄浆水液体培养基，培养方式不变，重复活化2 - 3 次。 2 4 2 分属鉴定 参照周德庆的微生物学实验手册【m 】第一版上海科学技术出版社， 对c f 6 1 0 做了如下四个方面的实验【3 4 】： ( 1 ) 酵母菌细胞的形态学特征：无性繁殖的方式，细胞的形状和大小。 ( 2 ) 了囊孢子的观察：予囊孢子生成培养基采用了棉子糖一醋酸钠一琼脂培 养基，石膏块培养基，马铃薯块培养基。接入棉子糖一醋酸钠一琼脂培养基 的酵母菌2 8 培养3 5 天，接入石膏块培养基和马铃薯块培养基的酵母菌 2 8 至少培养1 0 天，应持续培养至一个月方可结束实验。 榆测子囊孢子采用了石炭酸蕃红一美兰染色法。 ( 3 ) 掷孢子的观察：掷孢子生成培养基采用了麦芽汁固体斜面和平板培养 基。 ( 4 ) 假菌丝的观察：假菌丝生成培养基采用了马铃薯琼脂培养基。 2 山东轻工业学院颇j ：学位论文 2 4 3 分种鉴定 参照食品微生物学实验技术对c f 6 1 0 做了如f 血个方面的实验f 3 5 】： ( 1 ) 碳源发酵实验：测定了c f 6 1 0 对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖的发酵 能力。 ( 2 ) 碳源同化实验：测定了c f 6 1 0 对葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻 糖、纤维二糖、山梨糖、木糖、半乳糖、棉子糖、赤藓糖醇、肌醇、山梨 醇的同化能力。为排除实验干扰，在将c f 6 1 0 与无碳源基础培养基混合之 前对菌体进行了三次无菌离心洗涤。 ( 3 ) 氮源同化实