（发酵工程专业论文）纯生啤酒泡沫稳定性研究.pdf

。- - - - - - - 天津科技大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集 体已经发表或撰写的成果内容。对本文研究做出重要贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天 津科技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名： 日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借 阅。本人授权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打t 寸，) ，在年解密后适用本授权 书。 本学位论文属于 不保密囱( 请在方框内打“妒，) 。 作者签名：抑饮 日期：年月日 导师签名： 日期：年月 日 摘要 本文主要对纯生啤酒发酵过程中产生的酸性蛋白酶的酶活测定方法进行了优化， 对影响纯生啤酒泡沫稳定性的因素作了初步研究，主要内容如下： ( 1 ) 确定了福林法测定酸性蛋白酶酶活的最适条件：反应温度3 7 、缓冲液 p h 5 5 、底物用量l m l 、终止液用量2 m l 、静置时间1 0 m i n ，5 0 0 0 r r a i n 离心1 5 r a i n ， 反应后立即显色。在此条件下，福林法测定酸性蛋白酶活力的准确性得到了提高，线 性相关系数( r 2 ) 从0 9 4 9 1 提高到0 9 9 9 9 。 ( 2 ) 探讨了发酵温度、培养基p h 、酵母接种量、酵母代数和c 0 2 含量等发酵条 件对酸性蛋白酶分泌的影响，在8 0 、p h 6 4 、合适的接种量和酵母代数、适当压力的 条件下，酸性蛋白酶分泌量少，酶活低，啤酒泡沫稳定性好。 ( 3 ) 初始a 氨基氮含量是影响酸性蛋白酶分泌的因素之一，当a 氨基氮含量为 1 9 0 m g l 时酸性蛋白酶分泌量较低，酶活为8 4 9 4 u m l ，是未调节a 氨基氮水平的 6 2 ，此条件下的啤酒风味较好。 ( 4 ) 生物素及铁、锌、镁、磷四种无机盐的含量一定程度上影响着酸性蛋白酶 的分泌。当生物素含量为7 5 1 工g 1 5 0 m l ，或者各种无机盐在最适添加量下，即f e 2 ( s 0 4 ) 3 0 3 m g l ，k h 2 p 0 4 0 5 9 l ，z n s 0 4 0 2 9 l ，m g s 0 4 0 4 9 l ，酸性蛋白酶的酶活较低，分 别是未调节生物素或无机盐含量的3 0 和5 3 。 ( 5 ) 通过发酵初期添加蛋白质起始浓度为2 0 m g m l 的灵芝抑制剂，酸性蛋白酶 分泌量明显降低，酶活为5 2 4 1 u m l ，是不添加抑制剂的5 1 。 关键词：纯生啤酒；酸性蛋白酶；福林法；发酵条件；洳氨基氮；无机盐；蛋白酶抑 制剂 a bs t r a c t t h i sp a p e rf o c u so nt h em o d i f i c a t i o no fa c i d i cp r o t e i n a s em e t h o dd u r i n gp u r ed r a f t b e e rf e r m e n t a t i o na n df a c t o r sa f f e c t e do nf o a ms t a b i l i t y , t h ep r i m a r yc o v e r a g ei sa sf o l l o w s ： 1 s t u d yo nt h ea c i d i cp r o t e i n a s ea c t i v i t yb yf o l i nm e t h o dw a sc a r r i e do u t o p t i m a l c o n d i t i o n sw e r ea tr e a c t i o nt e m p e r a t u r e3 7 ，b u f f e rp h5 5 ，s u b s t r a t ev o l u m elm l ， t e r m i n a t o rv o l u m e2 m l ，t i m elo m i n , c e n t r i f u g es p e e d5 0 0 0r r a i ni n15 m i na n di m m e d i a t e c o l o r i r n e t e ra r e r w a r d s a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o n , t h ea c c u r a c yo ff o l i nm e t h o dw a s i m p r o v e d ，r e l a t e dc o e f f i c i e n to fs t a n d a r dc u r v e 掣) w a si n c r e a s e df r o m0 9 4 91t o0 9 9 8 9 2 t h ee f f e c to fv a r i o u sf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ，s u c ha st e m p e r a t u r e ，p hv a l u eo f m a l t ，y e a s ti n o c u l u m ，y e a s tg e n e r a t i o na n dc o n t e n to fc 0 2 ，o na c i d i cp r o t e i n a s ep r o d u c t i o n w e r es t u d i e d mc o m b i n a t i o no f8 ，p h 6 4 ，o p t i m a ly e a s ti n o c u l u ma n dy e a s t g e n e r a t i o n s ，a n da p p r o p r i a t ec o n t e n to fc 0 2w e r eb e n e f i c i a lt of o a ms t a b i l i t y 3 t h ei n i t i a lc o n t e n to fa - a m i n o n i t r o g e nw a so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf a c t o r st h a t a f f e c t e da c i d i c p r o t e i n a s ep r o d u c t i o n i n p u r e d r a f tb e e rf e r m e n t a t i o n w h e n a - a m i n o n i t r o g e nw a s 19 0 m g l ，t h ea c i d i cp r o t e i n a s ea c t i v i t yw a sd e c r e a s e du pt o 8 4 9 4 u m l ，o n l y6 2 o f b l a n k s a tt h i sc o n d i t i o n , d r a f tb e e rh a sb e t t e rs e n s o r yq u a l i t y 4 a c i d i cp r o t e i n a s ep r o d u c t i o nw a sa f f e c t e db yb i o t i na n df o u ri n o r g a n i cs a l t s ，l i k e f e r r i c ，z i n c ，m a g n e s i u ma n dp h o s p h a t e w i t h7 5 p g 15 0 m lb i o t i no ri n o r g a n i cs a l t sa t o p t i m a lc o m b i n e dc o n c e n t r a t i o n s ，n a m e l y0 3m g lf e 2 ( 8 0 4 ) 3 ，0 5 9 ll m 2 p 0 4 ，0 2 9 l z n s 0 4o r0 4 9 lm g s 0 4 ，l e s sa c i d i cp r o t e i r m s ec o u l db ed e t e c t e dw i t ht h ea c t i v i t yo f3 0 a n d5 3 o fb l a n k s ，r e s p e c t i v e l y 5 b ya d d i n g2 0 m g m l ( o r i g i n a lc o n c e n t r a t i o n ) p r o t e a s ei n h i b i t o rf r o mg a n o d e r m a l u c i d u me x t r a c ta tt h ei n i t i a lo ff e r m e n t a t i o n ，t h ea c t i v i t yo fa c i d i cp r o t e i n a s ew a sd e c r e a s e d t oa b o u t5 2 4 1u m l ，o n l y5 1 o f b l a n k s k e yw o r d s ：p u r ed r a f tb e e r ，a c i d i cp r o t e i n a s e ，f o l i nm e t h o d ， a - a m i n o n i t r o g e n ，i n o r g a n i cs a l t s ，p r o t e a s ei n h i b i t o r 目录 1 1 j f 言1 1 1 纯生啤酒发展概况1 1 2 啤酒泡沫概述2 1 2 1 泡沫化学组成：。2 1 2 2 啤酒泡沫特性3 1 3 酸性蛋白酶对纯生啤酒泡沫稳定性的研究进展3 1 3 1 蛋白酶来源及分泌途径_ - _ 4 1 3 2 蛋白酶a 结构和特性_ 5 1 3 3 酵母蛋白酶a 活性的测定方法6 1 3 4 低分泌蛋白酶a 菌种的选育7 1 3 5 存放时间、温度对纯生啤酒泡沫稳定性的影响。7 10 4 本课题的立题依据及研究内容7 2 材料与方法9 2 1 材料与仪器：o o o o o ooooo o o o ：9 2 1 1 菌种：9 2 1 2 主要试剂9 2 1 3 主要实验仪器。1 0 2 1 4 。主要溶液1 0 2 1 5 主要培养基1 3 2 2 分析方法13 2 2 1 酸性蛋白酶酶活的测定方法福林法1 3 2 2 2c 0 2 失重实验“1 4 2 2 3 发酵速度测定1 4 2 2 4 双乙酰的测定：j 1 4 2 2 5 快速氧化法测定酒精含量：l5 2 2 6 发酵度的测定。：1 6 2 2 7 凝聚性的测定1 6 2 2 8a 氨基氮含量的测定茚三酮法1 6 2 3 试验方法：2 0 2 3 1 啤酒酵母的扩大培养2 0 2 3 2 酵母泥的制备2 0 2 3 3 啤酒发酵试验2 0 3 结果与讨论 2 l 3 1 出发菌株的选择。2 l 3 1 1 蛋白酶a 分泌量的比较。2 l 3 1 2 三菌株发酵特性的比较2 l 3 1 3 小结。2 4 3 2 纯生啤酒中酸性蛋白酶测定方法的优化2 5 3 2 1 反应温度与缓冲体系对酸性蛋白酶测定的影响2 5 3 2 2 底物用量对酸性蛋白酶测定的影响o 2 6 3 2 3 终止液三氯乙酸用量对酸性蛋白酶测定的影响2 6 3 2 4 静置时间对酸性蛋白酶测定的影响2 6 3 2 5 提取上清液方法对酸性蛋白酶测定的影响2 6 3 2 6 终止反应后的存放时间对酸性蛋白酶活力测定的影响：2 7 3 2 7 优化后福林法酸性蛋白酶标准曲线的绘制一2 7 3 3 发酵条件对酸性蛋白酶分泌的影响2 8 3 3 1 发酵温度对酸性蛋白酶分泌的影响：2 5 3 3 2 培养基p h 对酸性蛋白酶分泌的影响2 9 3 3 3 酵母接种量对酸性蛋白酶分泌的影响。2 9 3 3 4 酵母代数对酸性蛋白酶分泌的影响一3 0 3 3 5c 0 2 含量对酸性蛋白酶分泌的影响3 0 3 4a 氨基氮对酸性蛋白酶分泌的影响。3 1 3 4 1a 氨基氮含量对酸性蛋白酶分泌的影响3 l 3 4 2a 氨基氮含量对杂醇油生成量的影响3 2 3 4 3 洳氨基氮含量的确定及此条件下的发酵特性：3 3 3 5 生物素和无机盐对酸性蛋白酶分泌的影响。3 4 3 5 1 生物素对酸性蛋白酶分泌的影响3 4 3 5 2 无机盐对酸性蛋白酶分泌量的影响。3 4 3 6 抑制剂对酸性蛋白酶分泌的影响3 7 3 6 1 正交实验确定抑制剂的提取条件：_ 3 7 3 6 2 乙醇沉淀3 9 3 6 3 抑制实验4 0 3 6 4 添加灵芝抑制剂后纯生啤酒的发酵特性4 2 3 7 优化前后蛋白酶的分泌情况一4 2 4 结论 5 展望 6 参考文献 7 攻读硕士学位期间发表论文情况 8 致谢 4 4 4 5 4 6 5 l s 2 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 纯生啤酒发展概况 啤酒是世界公认的营养食品，是长盛不衰的国际性饮料，被誉为“液体面包”。近 年来，国内外啤酒的生产量及消费量均出现增长趋势。欧洲依然是世界最大的啤酒市 场，人均消费量也最多。亚洲国家在金融危机之后，啤酒业也进入快速的发展。随着 我国经济建设的蓬勃发展，人民生活的不断改善，啤酒越来越受到消费者的喜爱。在 中国，啤酒业已成为食品饮料行业中发展最好的产业之一。从市场角度和经济环境看， 在可以预见的将来，啤酒行业将有很大的发展空间和诱人的发展前景。 纯生啤酒是指不经过巴氏杀菌而通过微孔膜过滤除菌以达到保质要求的啤酒。自 日本朝日啤酒株式会社首先推出纯生啤酒以来，其新鲜、清爽的口感立即引起世界各 国消费者的好感与青睐，发展势头极为迅猛，已成为最受消费者欢迎的啤酒品种。在 我国，广东珠江啤酒集团于1 9 9 7 年建成了国内第一条纯生啤酒生产线，而后国内众 多实力啤酒企业纷纷进军“纯生市场”，到2 0 0 7 年全国纯生啤酒的产量已达到7 0 多万 吨。与普通啤酒相比，纯生啤酒的生产建立在酿造、过滤、包装全过程对污染微生物 严格控制的基础上，其特点体现在“纯”和“生这两个字上，生产工艺流程见图1 1 。 “纯l 一啤酒是麦汁接入酵母发酵而来，一般的啤酒生产往往容易污染杂菌，影 响啤酒品质。纯生啤酒通过严格的过程控制，实现了无菌酿造，杜绝了杂菌污染，保 证了酵母的纯种发酵，使啤酒拥有最纯正的口感和风味。 “生- 发酵终了经过过滤的啤酒仍含有部分酵母，普通啤酒为避免灌装后酒液 发酵变质，对灌装后的啤酒进行巴氏杀菌处理。但啤酒在有氧的条件下进行热处理会 损失部分营养物质，并对新鲜口感造成损害，破坏原有的啤酒香味，产生不愉快的老 化味。纯生啤酒生产不经高温杀菌，采用无菌膜过滤技术滤除酵母菌，避免了啤酒中 营养物质的热损伤，保持了原有的新鲜口味。最后一道工序进行严格的无菌灌装，避 免了二次污染。 大麦一麦芽、大米_ 粉碎一糊化_ 糖化_ 过滤一麦汁煮沸_ 酒花分离一冷却_ 前发酵_ 后发酵一粗滤_ 精滤( 膜除菌) _ 装酒_ 贴标_ 成品 图卜1纯生啤酒的生产工艺流程图 f g 1 1p r o d u c t i o np r o c e s so fp u r ed r a f tb e e r 在国内，消费者对纯生啤酒的消费已成为新的时尚，这不仅标志着中国啤酒酿造 技术划时代的进步，拉近了我国与国外啤酒行业的距离，同时也标志着中国啤酒业正 走向风味稳定性竞争的新阶段。然而，由于纯生啤酒在包装前未经过巴氏灭菌，由酵 母分泌的少量酸性蛋白酶存留下来，在啤酒储存及货架寿命中对泡持性蛋白进行降 l 前言 解，最终使纯生啤酒的泡持性随时间增加越来越差。因此，提高纯生啤酒泡沫的稳定 性，成为当今世界改善纯生啤酒质量的一个难题。 1 2 啤酒泡沫概述 泡沫俗称啤酒之花，是啤酒区别于其它酒类的主要特征之一，国标g b 4 9 2 7 9 1 将啤酒泡沫作为一项重要感官指标加以考核【1 1 。啤酒泡沫是消费者在接受啤酒时首先 考虑的一个因素【2 】，外观表现为大量处于过饱和状态的二氧化碳气体逸出，气体含量 越多、释放速度越慢，对泡沫的形成就越有利。优质啤酒的泡沫应细腻、洁白、挂杯 持久，且酒液饮完之后仍有大量泡沫在杯壁上【3 , 4 】，通常把这些感官指标作为评判啤 酒质量优劣的重要标准。 。 1 2 。l 泡沫化学组成 啤酒泡沫主要是由二氧化碳、泡沫活性糖蛋白( 由7 0 的蛋白质和3 0 的低糖物 质组成) 、酒花树脂、金属离子及类黑素等组成的复合体1 5 一。啤酒泡沫活性蛋白 ( f o a m - p o s i t i v ep r o t e i n ) ，又称啤酒发泡蛋白( f o a m i n gp r o t e i n ) ，是指存在于啤酒泡沫 中且对啤酒泡沫具有较明显的积极作用的蛋白质群体，具有较强的疏水特性，是麦芽 生产和啤酒酿造时蛋白质分解的含氮物质。在组成泡沫的物质中，二氧化碳、起 泡蛋白和酒花树脂是构成啤酒泡沫的三大基本要素；起泡蛋白、酒花树脂等表面活性 物质有降低啤酒表面张力的作用，可形成较多的泡沫；酒花树脂中的异a 酸表面粘度 高，有利于泡沫的持久和挂杯：亲水性的多糖能提高泡沫膜的牢固性；金属离子则起 到保护泡沫持久性作用。 1 2 1 1 蛋白质 蛋白质是影响啤酒泡沫生成和稳定性的关键物质，国内外学者对啤酒泡沫蛋白做 了较多研究。a s a n o 和h a s h i m o t o 从啤酒中提纯出由三种组分组成的泡沫蛋白。第一 种是来源于大麦醇溶蛋白、分子量为1 5 , - 一3 0 k d 的富含脯氨酸的多肽，这部分与啤酒 的混浊有关；第二种是类脂转移蛋白l t p l ( 分子量为9 7 如) ，与泡沫的稳定性有关： 第三是蛋白质z ( 分子量为4 0 k d ) 没有直接的功能，但它是泡沫稳定物质的一种组 成成分【厶1 4 1 。研究表明，对啤酒泡沫稳定性起重要作用的是蛋白质z 【1 5 1 ，且蛋白质z 与l 1 t l 多以糖蛋白的形式存在i i6 1 7 】。发酵过程中部分发泡蛋白的流失会引起啤酒泡 沫质量降低【t s a 9 1 ，适当添加发泡蛋白有可能改善啤酒泡沫的质量，但添加发泡蛋白给 啤酒非生物稳定性带来的负面影响，也是值得考虑和关注的问题【2 0 ，2 1 1 。 1 2 1 2 糖蛋白 糖蛋白是一种复合蛋白质，主要由两部分构成，一部分是多肽，另一部分是多糖， 两部分通过共价键结合在一起 2 2 1 。糖蛋白的蛋自质部分一般分布在泡沫液体的界面 上，多糖部分则分布在液体内部。在泡沫产生过程中，蛋白质向泡沫中带来了大量的 液体，泡沫一旦形成，其中的液体也就开始逸出，从而引起泡沫的破灭，多糖的作用 是增大液体的粘性，延缓了后一过程的发生，从而对泡沫起到稳定性的作用。 天津科技大学硕士学位论文 1 2 1 3 酒花树脂 啤酒泡沫中含有大量的苦味物质经分析证明是酒花树脂，尤其是异a 酸，具有增 加泡沫稳定性的作用。酒花的作用充分体现在泡沫的附着性上，它与带正电荷的蛋白 质分子基团相互作用形成沉淀而增强泡沫的附着性。苦味较强的啤酒，泡沫的附着性 一般都较高，当其浓度达到2 0 p p m 时，附着性达到最大值【2 3 1 。 1 2 1 4 金属离子 金属离子可以增强泡沫的稳定性和附着性，但在没有酒花存在时，这种作用变得 十分微弱，原因可能是它能和异a 酸形成沉淀，并沉集在酒杯上。金属离子不宜过量 加入，如n i z + 毒性较大，f e ”能催化啤酒发生不利的化学变化而引起啤酒风味变质。 1 2 1 5 类黑素 麦芽中的类黑素是糖和蛋白质及其分解物在一定温度下相互作用形成的一类棕 褐色化合物，有香味和着色力，具有胶体特性，常用作食品色素添加剂，是啤酒风味 成分之一，有利于啤酒的起泡性和泡特性瞰】。深色麦芽所含类黑素要较浅色麦芽高得 多，因此一般深色啤酒的胶体稳定性和泡沫性能都较浅色啤酒好【2 5 】。 1 2 1 6 脂肪类物质 脂肪类物质，包括脂肪酸、甘油脂和磷脂等，也是表面活性物质，由啤酒酵母的 自溶产生【2 们，它们的存在必然和表面活性蛋白质争夺空间，降低泡沫弹性，引起泡沫 的崩溃，最终起到破坏啤酒泡沫的作用【2 7 1 。 1 2 2 啤酒泡沫特性 啤酒泡沫的特性包括起泡性、泡持性、泡沫附着力( 挂杯) 、泡沫外观等，其中 主要特性为起泡性和泡持性，并以起泡性为前提【2 8 ，2 们。起泡能力指形成泡沫的能力和 泡沫高度：泡持性指泡沫形成后至泡沫消失的时间；泡沫挂杯是指泡沫滞留于杯壁的 能力；泡沫外观是指泡沫的色泽和细洁的程度。泡沫性能的四个方面彼此是相互关联 的，起泡能力差，啤酒的其他各项性能都会差一些。泡沫性能好是指啤酒的起泡能力。 优良，形成的泡沫细腻，泡沫色泽洁白，泡沫高度可达酒液量的三分之一甚至二分之 一，泡沫消失慢，持久时间长，挂杯的泡沫较多，因此，泡沫性能可以完整地反映啤 酒泡沫质量的好坏【捌。 1 3 酸性蛋白酶对纯生啤酒泡沫稳定性的研究进展 以前的观点认为，在麦芽汁煮沸的过程中所有的蛋白酶都失活，即在啤酒的发酵 和储酒期间不会出现蛋白水解作用【3 1 1 。但m o m s 和h o u g h t 3 2 】注意到酵母分泌的蛋白 酶能使明胶降解。随后，m a d d o x t 3 3 】，a c h s e t e r 和w o l f 3 4 】等又逐渐发现了啤酒酵母中 的酸性蛋白酶在发酵液中有活性。1 9 8 3 年，c a l s b e r g 实验室的d r e y e r ”】首先报道了从 未杀菌的啤酒中分离出了酸性蛋白酶，并证实此蛋白酶是造成啤酒泡沫稳定性迅速下 降的原因。之后生化、免疫学及分子生物学研究证实，主要是蛋白酶a ( p r o t e i n a s e a ， 简称p r a ，e c 3 4 2 3 8 ) 导致了泡沫的稳定性变差，特别是在储存期间，泡沫降低很 l 前言 快 3 6 , 3 7 。由此可知，纯生啤酒泡持衰减主要是酒液中存在的蛋白酶a 造成的1 3 8 ，它 通过水解泡沫蛋白使啤酒泡沫稳定性下降【3 3 1 ，且泡持的衰减幅度与酒体中存在的活 性蛋白酶a 的量成正比。 蛋白酶a 是一种由p e p 4 基因编码的酸性蛋白酶，位于啤酒酵母液泡中【铒州，其 特性与胃蛋白酶、组织蛋白酶d 、e 以及人的血管紧张肽原酶相似。蛋白酶a 的氨基 酸组成以天门冬氨酸为多，蛋氨酸最少，由于这些酶的氨基酸数目约在3 2 7 左右，并 且序列同源性都大于4 0 ，活性中心保守序列a s p 3 3 t h r - g l y s e r 及a s p l 8 t h r - g l y - s e r 中，天冬氨酸侧链参与了催化作用，所以有人将它归为天门冬氨酸蛋白酶【4 刀。许多微 生物学家和生化学家如s l a u g h t e r 、k n o p 、h a z e l 4 8 5 0 】等对酿酒酵母m c c | l 口，d 明，c 船 c e r e v i s i a e ) 液泡的生物合成和功能进行了细致而深入的研究，得出酿酒酵母的液泡有 类似于高等生物的溶酶体的功能，尤其是蛋白的水解作用。 1 3 1 蛋白酶来源及分泌途径 1 3 1 1 蛋白酶来源 一般来说，啤酒酿造过程中蛋白酶主要有三个来源【5 1 1 。一是来源于麦芽。大麦发 芽时会产生自然蛋白酶，它可以降解蛋白质产生的有泡沫稳定性的多肽【5 2 5 3 1 ，但此酶 在经过麦汁煮沸后就被除去，不会有所残留；第二是来源人为添加的蛋白酶，如木瓜 蛋白酶就是啤酒中应用最广的蛋白水解酶【5 4 1 ，它主要是用于控制啤酒中的高分子量的 蛋白质，提高啤酒的非生物稳定性。据报道，木瓜蛋白酶耐热性很强，在7 0 处理 2 h 后仍存有4 5 的酶活力【5 5 l ，因而在生啤和熟啤中都有残留，但它的存在会对啤酒 泡沫产生不利影响，故许多啤酒厂已经不添加或少添加此类蛋白酶；第三是来自于酵 母，到目前为止，已报道的酵母蛋白酶约为4 0 种【剐。酵母中含有的蛋白酶主要有三 类，即蛋白酶a 、蛋白酶b 和羧肽酶y 。研究证实，主要是蛋白酶a 降解了泡沫蛋 白质，影响了纯生啤酒的泡持性。因而，为了解决纯生啤酒的泡沫问题，国内外许多 “学者和研究机构都对蛋白酶a 进行了大量的研究。 1 3 1 2 蛋白酶分泌途径 细胞内酵母蛋白酶a 的形成途径是：蛋白酶a 酶原的前驱物( p r c p r o p r a ) 一进入 内质网切后除掉2 2 个氨基酸_ 蛋白酶a 酶原( p r o p r a ) 形成适宜运输的构型_ 进入高 尔基体_ 进入液泡时n 端5 4 个氨基酸的肽段自动水解形成成熟的蛋白酶a ，其结构 见图1 2 。 图i - 2p e p 4 基因编码蛋白酶a 的示范性结构 f i g 1 - 2t h e s c h e m a t i co r g a n i z a t i o no f p e p 4 - c n c o d o dp r a l 前言 1 3 2 2 酵母蛋白酶a 的特性 ( 1 ) 稳定性 在不同条件下对酵母蛋白酶a 进行保温然后测定其酶活性发现，p h 5 5 条件下 4 5 c 保温2 h 后蛋白酶a 仍很稳定；在2 5 c 条件下p h 5 - 6 时保温4 8 h 后也很稳定。蛋 白酶a 对热比较稳定这一特性可能是造成纯生啤酒存放过程中泡沫衰减的一个主要 原因。 ( 2 ) 底物特异性 酵母蛋白酶a 底物特异性较小，可采用蛋白质如酪蛋白，偶氮酪蛋白，酸变性血 红蛋白，非折叠肌红蛋白、胰岛素a 链及b 链、核糖核酸酶等作为底物，也可以采 用生色肽及荧光肽进行测定 6 0 1 。在纯生啤酒存放过程中，酵母蛋白酶a 的存在会对 啤酒泡沫活性蛋白有水解作用，从而引起泡沫的衰减。 1 3 3 酵母蛋白酶a 活性的测定方法 1 3 3 1 福林法 如何测定发酵液和啤酒中极微量的蛋白酶a 活性一直是研究者所关注的问题。最 初，人们采用天然蛋白质为底物，用分光光度计来检测，但此方法检测灵敏性偏低。 m a d d o x 和h o u g h s q 使用f o l i n 法来测量上清液的多肽含量，将酶与过量的蛋白质底 物酪蛋白作用释放出各种大小的多肽，蛋白水解的程度用溶解在三氯乙酸中的蛋白质 的u v 吸光值来评价，然后计算出蛋白酶的活性。 福林法长期用于检测啤酒发酵过程中产生的蛋白酶，该法检测时间短、成本低， 但反应系统不稳定，影响因素较多。故使用福林法测定发酵过程中分泌的酸性蛋白酶， 需对反应系统和条件进行优化，以提高其测定的准确性。 1 3 3 2 荧光底物法 由于蛋白酶a 在啤酒中的浓度很低，因此要测量啤酒中痕量的蛋白酶a ，需先解 决两个问题：一是底物的特异性，二是检测仪器或方法的高灵敏度。荧光底物法【6 2 l 测定的基本原理是采用荧光底物( m o c a c a l a - p r o 砧a - l y s p h e p h e a r g l e u - ( d n p ) - n h 2 ) 与蛋白酶a 特异性结合，专一测定蛋白酶a 活性。该底物有一个荧光物 质m o c a c 连接在多肽的氨基端，而底物的另一端是该荧光物的熄灭物( d r i p ) l y s ， 加在羧基端。在蛋白酶水解前，即环境中没有蛋白酶a 时，该底物没有荧光性，荧光 素m o c a c 被d n p 所抑制；当发酵液中含有蛋白酶a ，底物就与蛋白酶a 特异性结 合，随后蛋白酶a 切开p h e _ _ p h e 键，解除d n p 对m o c a c 的荧光熄灭，导致荧光物 质m o c a c 发射荧光。释放出的荧光素在荧光分光光度计上可检测出来，通过荧光强 度值判定蛋白酶a 酶活的强弱。 此方法检测灵敏度高，整个检测时间也被控制在l h 内，但由于合成特异性的荧光 底物成本较高，对仪器设备要求也高，限制了其广泛应用，其原理图见图l - 4 。 天津科技大学硕士学位论文 蛋白酶a 不象在正常代谢过程中那样被准确地从高尔基体运输到液泡而可能是通 过错误途径( d e f a u l tp a t h w a y ) 被运输出活细胞。被排放的大多数蛋白酶a 是非活性的 前驱物( 分子量为5 4 k d ) ，其中一部分前驱物会通过自降解作用而转化成活性蛋白酶 a ( 分子量为4 2 k d ) 5 7 1 。活性态的蛋白酶a 将啤酒中的泡沫活性蛋白降解，从而影响 啤酒泡沫稳定性。蛋白酶能从活细胞中泄漏的观点现在已经被普遍接受，许多研究也 表明这种现象是由于发酵液中营养缺乏造成的，但是，4 2 k d 的蛋白酶a 从细胞壁泄漏 的途径到目前为止并不完全清楚，其释放机理示意图见图1 3 。 细胞膜 降解严物 t 泡持蛋白质 t 蛋白水解 活性蛋白酶a t 自溶 匪受巫圃 图1 3p r a 的释放机理示意图【5 8 5 9 】 f i g 1 3t h es c h e m a t i cm e c h a n i s mo fp r ar e l e a s e 1 3 2 蛋白酶a 结构和特性 1 3 2 1 酵母蛋白酶a 的结构 一级结构：成熟的酵母蛋白酶a 由3 2 9 个氨基酸及7 5 的中性糖( 甘露糖) 和 l 的葡萄糖胺、半乳糖胺组成。3 2 9 个氨基酸残基中有两个二硫桥，位于4 6 - - - 5 1 、2 5 2 2 8 5 位( 即前蛋白酶原1 2 2 - 1 2 7 、3 2 8 - 3 6 1 位) 半胱氨酸残基之间。糖基化位点在a s h - 6 8 和a s n - 2 6 9 ( 即前蛋白酶a 原a s n - 1 4 4 、a s n - 3 4 2 ) ，连接方式为n 连接。 二级结构：酵母蛋白酶a 与其它天冬氨酸蛋白酶空间结构相似，二级结构形式主 要为b 折叠，另外还有1 0 个小的右手洳螺旋以及发夹结构。 三级结构：酵母蛋白酶a 的3 2 9 个氨基酸残基折叠形成两个拓扑学相似的叶片状 结构( 结构域) ，两个结构域拥有同一个中心轴，穿过含有天冬氨酸残基的活性位点 平面。这一结构特点与其它天冬氨酸蛋白酶如胃蛋白酶、肾素、组织蛋白酶d 相似， 即都具有两个结构域。 酵母蛋白酶a 由一条多肽链组成，因此无四级结构。 酵母蛋白酶a 是影响纯生啤酒泡沫稳定性的关键因素，要想从根本上解决纯生啤 酒泡沫稳定性的问题，需设法抑制蛋白酶a 活性，而构建蛋白酶a 缺陷型的酵母菌 株是一种有效的方法。鉴于该酶的基因结构已经研究的比较清楚，因此，通过现代分 子生物学手段可以从根本上敲除酵母中编码蛋白酶a 的相关基因。国外许多科研工作 者通过多年研究采用基因工程法构建了酵母蛋白酶a 缺失菌株。重新构建的菌株不仅 合成蛋白酶a 的功能消失，而且对蛋白酶a 有依赖作用的基因的相对功能和活性也 受到影响i o 蛐引。 1 3 5 存放时间、温度对纯生啤酒泡沫稳定性的影响 发酵过程中分泌的蛋白酶a 酶活随储存时间的延长和储存温度的增加而增加。因 此为了尽可能降低后发酵过程中蛋白酶a 的分泌量，酵母回收时间与储存条件应该尽 可能优化i 的 6 7 j 。 1 4 本课题的立题依据及研究内容 从纯生啤酒泡沫稳定性的研究进展可以看出，对于如何提高纯生啤酒泡沫稳定 性，以及如何更好的检测蛋白酶a 的问题，国内研究者已经做了很多的努力。目前关 于提高纯生啤酒泡沫稳定性的问题，主要有三种研究方向：( 1 ) 利用基因工程的手段 改良酵母，筛选出合适的菌株；( 2 ) 选择合适的发酵工艺；( 3 ) 添加蛋白酶a 的抑制 剂等。利用基因工程的方法改良酵母，即构建酵母蛋白酶a 的缺失株国外研究的较多， 但由于他们的研究目的多集中在功能研究方面，因此所用菌株一般是营养缺陷型菌株 i 前言 而非工业用的酵母菌株；其次，蛋白酶a 完全缺失株在营养缺乏条件下很容易死亡， 一旦营养条件控制不良将导致啤酒酵母大规模死亡，日常生产将会受到很大影响：再 次，人们对基因工程食品仍然存在置疑和戒心，而啤酒作为一种日常生活中消耗量较 大的饮品，应当尽量避免使用基因工程手段对啤酒酵母进行育种。然而，酸性蛋白酶 的分泌量与原料、酵母菌株、发酵工艺等方面也有很大关系，而相关报道在国内外文 献中尚未见到，同时添加蛋白酶的抑制剂来降低蛋白酶分泌量的研究也有待发展。本 课题正是基于优化发酵工艺和添加蛋白酶抑制剂等方面考察酸性蛋白酶对纯生啤酒 泡沫稳定性的影响。 对于微量蛋白酶a 的检测。荧光底物法有其优势。但总的来说成本太高，对仪器 精密度的要求也很高，并不利于普遍推广。而福林法测定酸性蛋白酶虽然误差相对较 大一些，但成本低、检测时间短，如果能加以改造、优化，将会是实用性很强的一种 方法。所以本课题将从优化福林法测定酸性蛋白酶的条件入手，提出自己的研究方案， 希望可以在该热点问题上做出贡献。 论文拟从以下几个方面展开研究： ( 1 ) 出发菌株的选择 ( 2 ) 纯生啤酒中酸性蛋白酶测定方法的优化 ( 3 ) 发酵条件对酸性蛋白酶分泌的影响 ( 4 ) a 氨基氮对酸性蛋白酶分泌的影响 ( 5 ) 生物素和无机盐对酸性蛋白酶分泌的影响 ( 6 ) 抑制剂对酸性蛋白酶分泌的影响 8 盐酸 酸性蛋白酶 硫代硫酸钠 重铬酸钾 碘化钾 可溶性淀粉 浓硫酸 硫酸钙 醋酸钠 冰醋酸 邻苯二胺 磷酸氢二钠 磷酸二氢钾 茚三酮 果糖 对二甲氨基苯甲醛 乙醇 异戊醇 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯，- ，- 分析纯7 一 分析纯w- ， 分析纯w， 分1 析纯wov ， 分析纯g， 分l 析i i 纯g ， 分析纯，jv ，u 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯 分析纯，j v l ：y l 天津市北方天医化学试剂厂+ 诺维信( 中国) 生物技术有限公司 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津四通化工厂 张家口市化学试剂厂 北京化工厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市科密欧化学试剂开发中心 天津市北方天医化学试剂厂 天津市四通化工厂 上海试剂三厂 ， 上海蓝季科技李展有限公司 天津市光复精细化工研究所 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 2 材料与方法 异丁酸分析纯 甘氨酸生化试剂 硫酸锂分析纯 溴水分析纯 二甲基胺硼烷分析纯 碘酸钾分析纯 生物素分析纯 牛血清蛋白分析纯 考马斯亮蓝g 2 5 0 染料分析纯 硫酸铁分析纯 硫酸锌分析纯 硫酸镁分析纯 磷酸二氢钾分析纯 荧光底物 。 大麦芽 蛋白酶a 2 1 3 主要实验仪器 荧光分光光度计r f 5 3 0 1 p c 。 7 2 2 型光栅分光光度计 恒温水浴锅 l d 5 2 a 离心机 分析天平 电子天平 生化培养箱 天津市北方天医化学试剂厂 北京化工厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 北京嘉康源科技发展有限公司 天津科秘欧化学试剂开发中心 天津科秘欧化学试剂开发中心 天津市北方天医化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 天津市化学试剂厂 天津市北方天医化学试剂厂 上海生工生物技术有限公司 天津华润啤酒有限公司 s i g m a 岛津s h i m a d z u 上海分析仪器总厂 天津市中环实验电炉有限公司 北京医用离心机厂 上海精科仪器有限公司 梅特勒托利多常州衡器有限公司 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 2 1 4 主要溶液 2 1 4 1 福林试剂 于2 0 0 0 m l 磨口回流装置中加入钨酸钠1 0 0 9 ，钼酸钠2 5 9 ，水7 0 0 m l ，5 磷酸 5 0 m l ，浓盐酸1 0 0 m l ，小火沸腾回流1 0 h 后取下回流冷却器，在通风橱中加硫酸锂 5 0 9 ，水5 0 m l 及数滴溴水( 9 9 0 6 ) ，再微沸1 5 m i n 以除去多余的溴( 冷后仍有绿色需 再加溴水，再煮沸除去过量的溴) ，冷却，加水定容至1 0 0 0 m l 。混匀，过滤。制得的 1 0 天津科技大学硕士学位论文 试剂应里金黄色，贮存于棕色瓶中。使用时，加水1 ：2 稀释，摇匀使用。有效期： 三个月。 2 1 4 2p h 3 0 乳酸乳酸钠缓冲液 甲液：称取8 0 9 0 乳酸1 0 6 9 ，加蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 乙液：称取7 0 乳酸钠1 6 0 9 ，加蒸馏水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 吸取一定量的甲、乙液，混匀，最终用p h 计校正为3 o 。配好后用双层滤纸过滤 后使用。冰箱内4 储存，有效期：三个月。 2 1 4 3p h 5 5 磷酸氢二钠柠檬酸缓冲液 称取7 1 6 1 9n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 0 溶解于蒸馏水中，配成1 0 0 0 m l0 2 m o l l 的溶液( a 液) 。称取2 1 0 1 9c 6 h 8 0 7 h 2 0 溶解于蒸馏水中，配成1 0 0 0 m l o 1 m o l l 的溶液( b 液) 。 吸取一定量的a 、b 液( a b 体积比约为5 2 ) ，混匀，最终用p h 计校正为5 5 。配好 后用双层滤纸过滤后使用。冰箱内4 储存，有效期：三个月。 2 1 4 41 0 9 l 酪素溶液 准确称取酪素1 0 0 0 9 ( 精确至0 0 0 1 9 ) ，若测定酸性蛋白酶，先于酪素中滴入2 3 滴浓乳酸，再加缓冲液约8 0 m l ，置于沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却 后，转入1 0 0 m l 容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。冰箱内存放，有效期三天。 2 1 4 50 4 m o l l 三氯乙酸 称取三氯乙酸6 5 4 9 ，用水溶解并定容至1 0 0 0 m l 。 2 1 4 60 4 m o l l 碳酸钠溶