（发酵工程专业论文）重组大肠杆菌高密度发酵研究.pdf

摘要 摘要 本文对重组大肠杆菌( p r l + p e t 2 8 一p f a ) 高密度发酵培养基及发酵工艺进行了系统 的研究。确定出最佳培养基组成为( g l ) ：葡萄糖1 0 0 ，酵母膏1 1 5 ，蛋白胨( 鱼粉) 1 9 5 ，( n i - h ) 2 s 0 44 0 ，k 2 h p 0 4 3 1 - 1 2 01 8 0 ，k h 2 p 0 43 0 ，m g s 0 41 2 ，微量元素母液1 0m l 。 对重组大肠杆菌诱导条件进行了优化，得到最佳的诱导时机为菌体对数生长中后期( 6 0 0 达到7 o 左右) ，乳糖浓度为lg l ，诱导时间为8h 。对摇瓶中培养条件的优化采用单因 子实验法，研究了温度、培养基初始p h 、装液量、种龄和接种量等对工程菌生长和产 酶的影响，确定了最佳培养条件为：温度3 7 、培养基装液量3 5r o l l 2 5 0m l 、培养基 初始p h 7 1 、种子培养时间8h 、接种量1 。采用优化后的培养基及培养条件，发酵1 8 h ，菌体密度a 6 0 0 达到1 2 8 ，茵体干重为4 7g ( d c w ) l ，酶活力达到2 1 0u m l 发酵液， 分别为初始条件下的3 1 和1 4 9 倍。 采用分批补料的方法发酵重组大肠杆菌( p r i l + p e t 2 8 p f a ) ，对发酵工艺及高密度 发酵的方法进行了探索。在发酵罐实验中，比较几种不同的补料策略：恒速流加法、 p h s t a t 流加法、指数流加法和变指数恒p h 值混合流加法。结果表明：变指数恒p h 值混合流加法更能有效地避免发酵过程中低分子有机酸的积累，菌体浓度彳6 0 0 最终达到 1 6 5 ，菌体干重为6 2 7g ( d c w ) l ，酶活力达到7 0 0u m l 。 探索了大肠杆菌主要厌氧代谢途径可能对高密度重组大肠杆菌发酵的影响。分别敲 除了大肠杆菌主要厌氧代谢途径的丙酮酸甲酸裂解酶编码基因p f l a b 、p f l c d 以及 p f l e f ，获得了p f l a b 。、p f l c d 。、p f l e f 。突变株。发酵实验表明：突变株表达重组蛋白 的能力有了一定程度的提高。突变株与原始菌相比，乙酸产量有了一定的降低，尤其 p f l a b 。仅为原始菌的3 0 ；但同时也发现，乳酸的产量都有了不同程度的增加。 关键词：重组大肠杆菌，发酵条件优化，高密度培养，厌氧代谢 ， a b s t r a c t a b s t r a c t i n p r e s e n tp a p e r , t h ef e r m e n t a t i o nc u l t u r em e d i u ma n dc o n d i t i o nf o rr e c o m b i n a n t e s c h e r i c h i ac o l i ( p r i l + p e t 2 8 - p f a ) h a v eb e e n o p t i m i z e d 1 1 1 eo p t i m u mm e d i u mw a s c o m p o s e da sf o l l o w s ( i ng l ) ：g l u c o s e10 0 ，t r y p t o n e l9 5 ，y e a s te x t r a c t 11 5 ，n a c l0 5 ， ( n h 4 ) 2 s 0 44 0 ，k 2 h p 0 4 。3 h 2 0l8 o ，k h 2 p 0 43 0 ，m g s 0 41 2 ，t r a c ee l e m e n ts o l u t i o n1 0 m l n eo p t i m i z e do p e r a t i o n a lc o n d i t i o n sw e r et e m p e r a t u r e3 7 ( 2 ，w o r k i n gv o l u m e3 5 m li na 2 5 0 m lf l a s k ，i n i t i a lp h 7 1 ，i n o c u l a t i n ga g e8 ha n di n o c u l u m sq u a n t i t y 诵t i l1 o w h e nt h e a b s o r p t a n c ea 6 0 0o fb r o t hg i v e nb yt h er e c o m b i n a n ts t a i nu pt o7 0 ，l a c t o s ew a sa d d e ds oa s t ot h ef i n a lc o n c e n t r a t i o nt olg l ，a n di n d u c t i o nw a sc o n d u c t e df o r8 ha t3 7 。c ，t h ea - a m y l a s e a c t i v i t yr e a c h e dt h em a x i m u mt o2 10 i7 m i ，a n dt h ec e l ld e n s i t y ( a t a 6 0 0 ) d i d1 2 8 ，w h i c hi s a l m o s t3 1t i m e sa n d14 9t i m e so ft h o s eu n d e rt h ei n i t i a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n s ， r e s p e c t i v e l y f e d b a t c hp r o c e s sf o rec o t i ( p r r l + p e t 2 8 - p f a ) w a sc a r r i e do u ti na15 la u t o m a t i c f e r m e n t o r s e v e r a lf e e d i n gs t r a t e g i e s ，i e ，p h - s t a tf e e d i n g ，e x p o n e n t i a lf e e d i n ga n dt h e c o m b i n a t i o n , w e r ec o m p a r a t i v e l yi n v e s t i g a t e d ，n l er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ec o m b i n e d s t r a t e g yw a sa d o p t a b l e n eh i g h e rc e l ld e n s i t ya n de n z y m ea c t i v i t yw e r eo b t a i n e d 、析t l l 6 2 7 9 l ( b yd r yc e l lw e i g h t ，d c w ) a n d7 0 0u m l0 l - a m y l a s e n ep o t e n t i a le f f e c to fa n a e r o b i cm e t a b o l i s mp a t h w a yn a t u r a l l ya p p e a r e di nec o l io n 1 1 i g hc e l l d e n s i t yc u l t i v a t i o nw a si n v e s t i g a t e d t h r e eg e n ec l u s t e r s ( p f l a b ，p f l c d ，p i l e f ) e n c o d i n gp y r u v a t e - f o r m a t el y a s ew e r ed i s r u p t e da n dr e l a t i v em u t a n t s ( p f l a m 一，p f l c d a n d p i l e f - ) w e r ed e v e l o p e d b yu s i n gt h e s em u t a n t sa sah o s tc e l l ，t h er e c o m b i n a n te n z y m e a c t i v i t yw a ss i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e d o nt h eo t h e rh a n d ，c o m p a r i s o nt ot h ep a r e n t ，m u t a n t s f o r m e dl e s sa c e t a t ea n dp f l a m m u t a n td i do n l y3 0 h o w e v e r , a tt h es a m et i m e ，l a c t a t ew a s a c c u m u l a t e dw i t he l e v a t e d1 e v e l k e yw o r d ：r e c o m b i n a n te s c h e r i c h i ac o l i ，f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n , h i g hc e l l d e n s i t yc u l t i v a t i o n ，a n a e r o b i cm e t a b o l i s m 玎 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签名：丁兰宝 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 、 签名：- j 兰宝导师签名： 日 期： 1 州。 2o o 9 6 j 第一章绪论 第一章绪论 1 1 重组大肠杆菌的高密度发酵 1 1 1 高细胞密度发酵技术概述 基因工程技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能 够大量生产：由于大肠杆菌( e s c h e h c h i ac o l o 结构简单、遗传学背景清晰、生长周期短、 生长条件清楚，成为最为常用的宿主菌，已被广泛应用于重组蛋白，以及非蛋白的生物 分子，如氨基酸等的生产i l j 。 高细胞密度发酵咖g hc e l ld e n s i t yc u l t i v a t i o n ，h c d c ) 是指在一定条件和培养体系下， 获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装 置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率 ( 单位体积单位时间内产物的产量) 【列。实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下 游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。 通常认为菌体密度超过5 0g ( d c w ) l 即为高密度发酵。根据硒e s e n b e r e 【3 j 计算，理 论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为4 0 0g ( d c w l ) ，考虑到实际情况中的种 种条件限制，m a r k e l 等1 4 认为最高的菌体密度为2 0 0g ( d c w l ) ，此时发酵液的2 5 充 满了长3l x r n ，宽1i x r n 的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。迄今为止，大 肠杆菌发酵菌体密度最高的两例为：非重组ec o l iw 3 1 1 0 达1 7 4g ( d c w l ) 4 ，生产聚3 羟基丁酸的重组菌达17 5 4g ( d c w l ) 5 1 。表1 1 为近年来重组大肠杆菌高密度发酵的一 些实例。 表1 - 1重组大肠杆菌的高密度发酵【6 , 7 1 t a b 1 1p r a u c t i o no f r e c o m b i n a n tp r o t e i n sb yh i g hc e l ld e n s i t yc u l t u r eo f ec o l i 产物产品 宿主菌株 菌体密度 产物产量 人干扰素弘l t g l9 5 59 0 ) c w ) l2 8 5 x1 0 0u m l 牛促生长激素 w 3 11 0 a c , o o = 1 0 0 2 9e e l 青霉素酰化酶h b l 0 1 1 4 5g ( d c w ) l6 0m g u 胰蛋白酶x90 9 2g ( d c w ) l5 6m g l 蛋白a p 半乳糖苷酶t g i 9 5 5g ( d c w ) l2 8 5 x 1 0 0u l 大肠杆菌氨酸合成酶l f 0 3 3 0 1 1 0 2g ( d c w ) l1 6 x1 0 o g 碱性磷酸酶h b l 0 1 a 6 0 0 = 1 5 0 5 2g l 1 2 2 影响大肠杆菌高密度发酵的环境条件 利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其构建的基因工程菌的表达产物，大肠杆菌 的生物量、蛋白表达量、代谢产物在菌体内和发酵液中的浓度都比较低，难以获得理想 的生产效率。重组大肠杆菌进行高密度发酵可获得较高的生物量，但对发酵条件有非常 高的要求。影响高密度发酵的因素非常多，如细胞生长所需要的营养物质、发酵过程中 生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、诱导方式、发酵液的p h 值、补料方式及发 江南大学硕士学位论文 酵液流变学特性等。 1 2 2 1 培养基 培养基按组成成分可分为合成培养基、半合成培养基、复合培养基。其组成元素包 括：c 、h 、o 、n 、s 、p 、f e 、m g 、k 等。根据在基本培养基中的菌体生长量推倒出 每种元素获得1g l 的大肠杆菌所需的无机盐( l 以) 为：o 7 7gn h 4 c 1 ，o 1 2 5gk h 2 p 0 4 ， l7 5m gm g s 0 4 。7 h 2 0 ，7 5m gk 2 s 0 4 ，0 6 4m gf e s 0 4 7 h 2 0 ，0 4m gc a c l 2 l 引。大肠杆菌 高密度发酵所使用的培养基一般为半合成培养基，它是在合成培养基的基础上添加能促 进细胞生长、及代谢产物形成的不同物质，如适量的无机盐、氨基酸、维生素等。常用 的碳源有糖类、油脂、有机酸和低碳醇。葡萄糖是碳源中最易利用的糖，常被用作培养 基的主要成分。常用的氮源可分为有机氮源和无机氮源。微生物对无机氮源的吸收一般 比有机氮源快，但在含有有机氮源的培养基中常表现出生长旺盛，菌体浓度增长迅速的 特点。培养基各组分的浓度和比例要适当，尤其是碳源和氮源的比例。如果碳源、氮源 浓度过高，虽然比例合适，发酵起始会导致菌体的大量繁殖，但发酵后期菌体生长缓慢， 代谢废物过多，增大发酵粘度，影响溶解氧浓度，容易引起菌体的代谢异常，影响产物 合成。所以单纯增加营养物质用量的方法并不能实现高密度发酵。一般而言，大肠杆菌 培养时营养的抑制浓度为：葡萄糖( 5 0g l ) ，铵( 3g l ) ，f e 2 + ( 1 1 5g l ) ，m 9 2 + ( 8 7g l ) ， p 0 4 3 ( 1 0g l ) ，z n 2 + ( o 0 3 8g l ) j 。因此设计一种平衡的培养基更有利于产物的表达。工 程菌高密度培养基设计原理【9 】如下：( 1 ) 使用最稀培养基以便精确设计营养成分之间的定 量关系，同时避免任何不利于细菌生长的营养限制性因素；( 2 ) 利用碳源限制的方法直接 阻断细菌对数生长期间抑制性代谢产物的合成；( 3 ) 依据细菌细胞的元素组成确定培养基 各成分的精确配比。 1 2 2 2p h 值 稳定的p h 值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的p h 值变化会通 过弱酸或弱碱的变化而改变菌体细胞内的p h 值，从而影响细菌的代谢反应，因此发酵 过程中p h 值的改变会影响细胞的生物量和基因产物的表达。另一方面，微生物的生长 可引起培养液p h 值的变化。在基本培养基中培养微生物，通常p h 值会发生较大的变 化。铵盐中氨的消耗，或者微生物利用碳源产生的代谢产物即有机酸的积累，都会造成 p h 值的下降，而有机酸的消耗，以及硝酸盐为氮源时硝酸根的消耗，则造成p h 值上升。 在复合培养基中培养，当消耗碳源时，培养基中的氨基酸被用于异化代谢时，因氨的释 放，会造成p h 值升高。发酵过程中跟踪p h 值的变化，可以为了解微生物代谢的变化 提供十分重要的信息i l0 1 。此外，在高密度发酵条件下，基质中葡萄糖浓度较高，菌体密 度很高，细胞产生大量的乙酸等低分子有机酸，会显著地降低p h 值。在基质中加入不 同浓度的葡萄糖可使p h 值下降到5 4 甚至更低。为了减轻p h 值下降对菌体生长和外源 蛋白表达的不利影响，在发酵工艺控制中，必须及时使用低浓度的碱和氨水调节p h 值 使之处于适宜的p h 值范围内，避免p h 值剧烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。 1 2 2 - 3 温度 培养温度是影响茵体生长和调控细胞代谢的重要因素。s c h m i d t 等就培养温度对基 2 第一章绪论 因工程菌生长密度和人胰岛素表达的影响进行了研究，结果表明诱导前培养温度为3 0 、诱导后为4 2 可提高胰岛素的表达量i l 。柴家前等认为较高的温度有利于细菌的 高密度发酵，低温培养能提高重组产物的表达量，而且在不同培养阶段采用不同的培养 温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量，并可缩短培养周期。此外，一些 研究表明，培养温度升高，基因工程菌的质粒稳定性变差。如质粒p t g 2 0 1 带有熙启 动子调控的恶臭假单胞菌x y l e 基因，大肠杆菌b ( p t g 2 0 1 ) 在3 1 连续培养时比较稳定， 经过8 3 代连续培养，有超过8 2 的细胞带有p t g 2 0 1 。当在3 7 连续培养时，经过8 7 代带有重组质粒的细胞仅占4 0 ；而在4 2 培养6 7 代，带有质粒的细胞仅为3 5 t 1 2 】。 1 2 2 4 溶解氧 溶解氧浓度是好氧微生物高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一，而且它 往往会成为发酵的控制因素。这主要是由于氧在水中溶解度很小所致。在细胞的对数生 长期若停止供氧，则发酵液中的溶解氧会在几分钟内耗尽。在发酵后期，反应器中生物 量很大，而且发酵液粘度增大，此时受反应器供氧能力的限制，发酵液中的溶解氧浓度 会低于临界氧浓度。这样，氧的溶解和传递便成了该细胞反应的限制步骤。h o p k i n s 等 【1 3 】研究了大肠杆菌a b l l 5 7 ( p k n 4 0 1 ) 在分批培养中供氧的影响。在复合培养基中，无论 培养基是否加入氨苄青霉素，基因工程茵都比较稳定，但当发酵时中断通气使溶氧降到 5 ，则造成基因工程菌比例迅速下降。在发酵o 5h 停止通气后，经1 6h 溶氧缓慢降 到5 ，然后恢复通气，此后丢失p k n 4 0 1 的宿主细胞比例大大增加，表明低溶氧会引 起该菌株的质粒不稳定。然而，在培养过程中并不是维持溶氧越高越好，即使是专性好 氧菌，过高的溶氧对生长也可能不利。氧的有害作用是通过形成新生氧o ，超氧化物基 0 2 和过氧化物基0 2 ，或羟基自由基o h 。，破坏许多细胞组分来实现的。 1 2 2 5 诱导条件 基因工程菌的构建通常考虑采用可诱导的强启动子，这样在进行发酵时可分成两个 阶段，即生长阶段和生产阶段，生长阶段以获得较大量的茵体为目标，而在生产阶段则 以获得大量重组蛋白为目标。这是由于采用强启动子表达外源基因时，外源基因的高表 达会对宿主细胞的代谢带来很大的负担，从而严重影响生长和质粒稳定性。 l a c 启动子是一种常用的由乳糖或其类似物异丙基一b d 硫代半乳糖苷( i p t g ) 诱导表 达的启动子，诱导剂量可影响其调控的基因表达水平。如s r i u b o l m a s 等【1 4 j 采用大肠杆菌 d h 5 a ( p q e a l l ) 生产青霉素酰化酶，质粒p q e a l l 中青霉素酰化酶基因受l a c 启动子调控。 他们采用不同浓度i p t g 诱导青霉素酰化酶表达，当i p t g 浓度在0 0 2 5 0 1m m o l l 时， 增加i p t g 浓度可提高重组青霉素酰化酶活性，而i p t g 浓度在o 2m m o l l 和o 5m m o l l 时，酶的活性下降。这是由于在高i p t g 浓度下，大肠杆菌内生成更多包含体。此外， 诱导剂i p t g 在不同的生长时期进行诱导，对r b l f n 的表达具有显著性差异。在对数生 长初期和中期进行诱导时，r b l f - n 最终的表达量却不高。这是由于r b l f - n 的表达造成 重组大肠杆菌代谢负担【l5 1 。因此，在初期和中期进行诱导时，由于细胞生长受制于代谢 压力，重组大肠杆菌的生物量不高。在对数生长中后期进行诱导时，能提高r b l f n 的 表达量。 江南大学硕士学位论文 1 2 2 6 比生长速率( ) 发酵过程中，p 是一个重要的参数，它能影响质粒的拷贝数，与重组蛋白的表达量、 乙酸等生长抑制性产物的形成也有很大的关系，最近研究发现p 与r n a 聚合酶的a 5 的 严格控制有关f 1 6 1 。一般通过限制重要营养物质的供应来维持p 在一个临界值之下。“大 约控制在o 1 0 3h 1 之间比较合适，为戕的一半左右，但具体情况视菌株和培养基而 定。在合适的范围内，采用波动的肛较恒定的p 取得的效果要好。在菌体量达到1 0 0g l 干重的条件下，k h a l i z a d e h 等得到了目前大肠杆菌高密度培养重组人p 干扰素最高的单 位蛋白产率【1 7 1 。一般在培养过程中，菌体分生长和表达两个阶段，生长期限制养分的供 给，控制p 在较低水平，防止乙酸的积累，使菌体量达到一定的高度；表达时采用增大 营养物质浓度，提高“，从而提高蛋白表达水平。然而p 太低也会延长分批发酵期，影 响单位时间体积产率的提高。发酵时养分的供给应根据肛的变化而改变，将肛应控制 在一定的范围之内，超出这个范围不但导致乙酸的积累，对产物的活性也会有影响，这 可能与蛋白折叠有关但机制不明l l 引。 1 2 3 影响大肠杆菌高密度发酵的补料策略 。 大肠杆菌的高密度培养大多采用分批补料技术，分批补料技术( f e d b a t c hc u l t u r e ) 是 指在微生物分批发酵中连续补加一定物料的技术。 1 2 3 1 非反馈补料法 恒速流加补料法：在发酵过程中，以恒定的速率流加补料液，在培养前期，菌体生 长迅速，随着菌量的增加和代谢产物的积累，比生长速率逐渐下降，但菌体总量在发酵 过程中还是线性增加的。陈坚等【1 9 1 利用恒速流加法高密度培养大肠杆菌生产谷胱甘肽， 培养4 1 5h 获得7 7 5g ( d c w ) l 。 变速流加补料法：针对增长的菌体加入更多的营养物质，对菌体的密度增加、产物 的积累是有利的。李民等1 2 0 在高密度培养温度诱导型大肠杆菌时，利用三阶段式葡萄糖 流加法获得彳6 为5 3 的菌体密度。 指数流加法：是对变速流加法的改进，根据菌体在指数生长期内菌体数目的指数增 加，通过微机控制，指数流加营养物质，使基质浓度保持在较低水平，有效地抑制副产 物的积累，提高外源蛋白的表达效率。y e e 【2 l j 认为现在最成功的方法就是指数流加法。 r i e s e n b e r g 2 2 等控制比生长速率为o 1 1h ，获得了1 1 0g ( d c w ) l 。在没有反馈控制的系 统中料液的添加程序是预先设定的。当随着时间变化，微生物的生长方式与预想不一致 时，这种非反馈补料法就不能对其进行有效的调节。因此，非反馈补料法对环境的适应 性和可调节性不强，不能根据发酵环境的变化和菌体生长的具体情况作出反馈调节，所 以在菌体的诱导阶段，引起乙酸的严重积累，造成菌体高密度条件下的蛋白低表达。 1 2 3 2 反馈补料法 残糖浓度反馈法：利用葡萄糖浓度的离线或在线分析的数据，维持培养基中较低的 残糖浓度。但化学法、酶法分析葡萄糖耗时过长，葡萄糖电极技术也尚未成熟，对流加 的控制较为滞后，菌体密度不够理想。 p h s t a t 流加法：培养过程中葡萄糖耗尽时，细胞产生的铵离子浓度会增加，导致培 4 第一章绪论 养基的p h 值升高。这样，p h 值的变化就可以成为需要补料的标志。因此在p h 值回升 时反馈流加一定量葡萄糖，利用葡萄糖代谢产生的有机酸代替通常用于调节p h 值的酸 液使培养基p h 值保持恒定。该方法缺点是p h 值变化并不完全是葡萄糖代谢的结果， 容易造成补料体系的错误。 恒溶氧流加法：培养过程中葡萄糖浓度降低到一定程度时，茵体代谢强度下降，消 耗氧气能力降低，反映为培养基中溶解氧的上升，因此可在溶氧回升时反馈流加葡萄糖， 使溶氧保持在某一水平【2 引。 用于反馈控制的附属设备比较昂贵。此外，反馈式调节有一定的滞后性，未能避免 糖浓度的波动和代谢副产物的积累。 因此，寻找一种补料方式，既能避免反馈式补料法带有的一定的滞后性，又能克服 非反馈式补料对环境的适应性和可调节性不强，不能根据发酵环境的变化和菌体生长的 具体情况作出反馈调节的缺点，具有十分重要的现实意义。 1 2 大肠杆菌代谢途径的改造对高密度发酵的贡献 1 2 1 大肠杆菌厌氧代谢途径 在工程菌的高密度发酵中，外源基因高表达条件下的高密度发酵对于提高生产效 率、降低生产成本都具有非常重要的意义。然而在大肠杆菌的高密度发酵中遇到了许多 困难【2 4 1 ，其中主要的一方面为有机酸类代谢副产物累积，往往抑制细菌自身生长，妨碍 重组蛋白的表达。 g l u c o s e l ， 飞l 一 k 篇 警l a d p p 一 u r 1。卜atp一7l气dhp l a c t a t e y r u v a l ：e 7 1 一 姒d h n a d + 一f 专o r ma t e a c 薹e t y l - c o a 慧詈p t a - - 埘a 簪c e t y l - p 等 c 一伊嚣乏批阴埘譬等 h 2 f 2 n a d + ， 大肠杆菌对糖类的摄取是通过所谓基团转移的方式进行的，大肠杆菌对糖类的转运 江南大学硕士学位论文 能力很强，而且在糖进入细胞的同时，糖酵解作用就已经开始了，使得大量的碳代谢流 涌入细胞。由于大肠杆菌的氧化磷酸化和三羧酸循环的能力有限，造成碳代谢流在糖酵 解途径中过量【2 5 1 。大肠杆菌主要通过分泌部分氧化的副产物时碳代谢流得到平衡，主要 的代谢副产物的代谢途径如图1 1 。 乙酸是大肠杆菌发酵过程中的主要代谢副产物。高浓度的乙酸( 大于5g l ) 会明 显减缓生长速率，降低菌体密度，重组蛋白的生产严重受到影响。c 0 2 对菌体生长的影 响也不容忽视，一般培养液中溶解7 的c 0 2 就可抑制菌体的生长；高于4 ，生长下 降1 2 6 1 。发酵液中c 0 2 的溶解度应控制在1 3 之间。在大型发酵罐中，c 0 2 的影响更加 突出，因为罐中c 0 2 的分压是液体深度的函数，罐底部的c 0 2 分压通常比上端的c 0 2 分压高许多。 1 2 2 大肠杆菌代谢途径的改造对高密度发酵的影响 应用代谢工程技术对工程菌进行改良，切断细胞代谢网络上产生代谢副产物的途 径，是降低代谢副产物的产量的最直接的方法。 大肠杆菌产成乙酸的代谢途径有多种，包括在丙酮酸氧化酶作用下，氧化丙酮酸为 乙酸；在乙酸激酶( a c k ) 和磷酸转乙酰基酶( p t a ) 的作用下将乙酰c o a 转化为乙 酸。许多作者尝试过筛选p t a 或a c k 突变株的策略。b a u e r 等1 2 7 利用乙酸突变株对氟 乙酸钠的抗性由大肠杆菌m m 2 9 4 筛到了一株p t a 突变株m d 0 5 0 ，用摇瓶和1 4 l 发酵 罐进行的发酵实验表明，p t a 缺陷株的生长速率并未减缓，但乙酸的分泌水平有了显著 降低。在诱导表达- i l 2 的阶段，该菌保持继续生长的能力强于亲株，i l 2 基因的表达也 有所加强。但d i a z r i c c i 等【2 8 】的实验结果却有所不同。他们从野生型大肠杆菌k 1 2 菌株 m g l 6 5 5 得到p t a 和a c k 双基因缺失的t a 3 4 7 菌株，研究表明，p t a 和a c k 的突变 无论是在好氧还是厌氧方面，均对大肠杆菌的代谢产生不利影响。现在的认知逐步统一 到a c k 和p t a 主要参与乙酸的分解代谢。 大肠杆菌产生甲酸的反应如图1 2 ，它是在厌氧条件下由丙酮酸甲酸裂解酶( p y r u v a t e f o r m a t e l y a s e ，p f l ) 催化丙酮酸和辅酶a 反应产生。z h u 等【2 9 】报道，在微好氧条件下， p f l c d 缺陷株的发酵状况与原始菌相似，而p f l a b 。缺陷株几乎测定不到甲酸的存在，而 且乙酸产量大大降低，只有0 3 l 。 i q a c o 0 0 。+ c o a p f l 邺人s a 。，、， 0 + 人 ho 。 图1 - 2 丙酮酸甲酸裂解酶的反应式 f i g 1 2e n z y m a t i cr e a c t i o no fp y r u v a t ef o r m a t e l y a s e 1 3 本论文的立题依据和研究内容 大肠杆菌一直因为具有容易培养、生长速度快、遗传学资料丰富等特点，作为重组 6 第一章绪论 蛋白的表达系统而被广泛使用。高密度培养技术的出现，大幅度提高了重组蛋白的产量 和产率，降低了发酵成本，为重组大肠杆菌的应用提供了更多的空间。然而，外源基因 的高水平表达，不仅涉及宿主、载体和克隆基因三者之间的相互关系，而且与其所处的 环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺进行生产是远远不够的，需要对影响外源 基因表达的因素进行分析，探索出一套适于外源基因高效表达的发酵工艺。 本课题是在本实验室已成功的构建出产高温酸性a 一淀粉酶基因工程菌的基础上，主 要研究以下几方面的内容，以探索重组大肠杆菌高密度、高表达极端微生物来源的基因 高表达的可行性及其可以出现的相关技术问题。 ( 1 ) 优化出适合重组大肠杆菌高密度发酵的培养基、培养条件以及诱导条件； ( 2 ) 优化出一种补料方式，实现重组大肠杆菌在】5l 发酵罐上的高密度发酵； ( 3 ) 改造大肠杆菌的代谢途径，敲除大肠杆菌的矽基因，探索其在重组大肠杆菌高密 度、高表达外源蛋白中的可行性。 江南大学硕士学位论文 第二章摇瓶发酵培养基及发酵条件的优化 2 1 材料与方法 2 1 1 菌种 重组大肠杆菌( p t l i l + p e t 2 8 - p f a ) 由本实验室先期构建并保存【3 0 1 。 2 1 2 主要仪器 恒温金属浴( 杭州博日科技有限公司，型号h b 1 0 0 ) 全温摇床柜( 太仓市实验设备厂，型号h y g a ) 隔水式恒温培养箱( 上海精密实验设备有限公司，型号g n p 9 0 8 0 ) 超净工作台( 苏净集团安泰公司) 生物传感分析仪( 山东省科学院微生物研究所，型号s b a 4 0 c ) 电子分析天平( 瑞士梅特勒托利多公司产品，型号a l l 0 4 ) 紫外分光光度计( u n i c o 公司产品，型号u v - 2 1 0 0 ) 台式高速离心机( 美国s i g m a 公司产品，型号1 1 5 ) 台式高速冷冻离心机( 美国s i g m a 公司产品，型号4 k 1 5 ) 2 1 3 培养基 种子培养基为l b 培养基( g l ) ：酵母粉5 ，胰蛋白胨1 0 ，n a c l1 0 ，p h7 0 ，添加1 5 琼脂即为l b 固体培养基。补加终浓度为3 5 肛g m l 的硫酸卡那霉素或终浓度为3 6 5l a g m l 的氯霉素。 发酵初始培养基( g l ) ：酵母提取物5 ，蛋白胨( 鱼粉) 2 0 ，n a c l0 5 ，柠檬酸2 ，k 2 h p 0 4 1 4 ，k h 2 p 0 45 ，p h 7 0 ，灭菌后补加5m l 已灭菌的2m o l lm g s 0 4 及3 5p g m l 硫酸卡那霉 素。 优化培养基( g l ) ：葡萄糖1 0 0 ，酵母提取物1 1 5 ，蛋白胨1 9 5 ，( n h , h s 0 44 0 ， k 2 h p 0 4 3 h 2 018 0 ，k h 2 p 0 43 0 ，m g s 0 41 2 ( 单独灭菌) ，微量元素液1m l 。 微量元素溶液( l ) ：f e s 0 4 7 h 2 02 8 ，m n c l 2 4 h 2 02 ，c o s 0 4 7 h 2 02 8 ，c a c l 2 2 h 2 0 1 5 ，c u c l 2 2 h 2 00 2 ，z n s 0 4 7 h 2 0o 3 ，溶于1m o l lh c i 中 4 1 1 。 2 1 4 培养方法 灭菌方法：发酵培养基( 除微量元素溶液和葡萄糖外) 在位灭菌，1 2 1 灭菌1 5m i n 。 葡萄糖单独灭菌，1 1 5 灭菌1 5m i n 。采用超滤膜过滤灭菌微量元素溶液。 菌株活化方法：取7 0 保存菌株甘油管，二次摇瓶活化( 3 7 、2 0 0r m i n 、1 0h ) 后，接种于平板中，4 保存，可用4 周。 种子制备方法：取4 c 保存平板转接入另一平板中，3 7 培养1 6h ，然后挑单菌落 于5 0m l 摇瓶培养基中，3 7 、2 0 0r m i n 过夜培养。 摇瓶培养：按照1 接种量接入装有5 0m l 发酵培养基的2 5 0m l - - - 角瓶中，3 7 、 第二章摇瓶发酵培养基及发酵条件的优化 2 0 0r m i n 振荡培养，待茵体浓觑6 0 0 达到适当值时加入诱导剂( 乳糖) ，继续诱导培养， 取样测翩6 0 0 和( i t 淀粉酶酶活力。 2 1 5 分析方法 ( 1 ) 菌体量的测定：实验中菌体密度采用浊度法问接测量，发酵液适当稀释后， 使用可见分光光度计在6 0 0n n l 下测定发酵液光密度( a 6 0 0 ) ，然后根据菌体干重与a 6 0 0 的标 准曲线计算菌体密度。从图2 2 中可以得到菌体千重c x ) 和a 6 0 0 的关系： x = 0 3 8 2 x a 6 0 0 uz468l u 细胞密度, 46 0 0 图2 1 茵体干重与细胞密度( 彳6 0 0 ) 关系的标准曲线 f i g 2 - 1t h es t a n d a r dc u r v eb e t w e e nd r yc e l lw e i g h ta n do p t i c a ld e n s i t ya t6 0 0 n m ( 2 ) 酶活测定方法：将粗酶液先在9 5 加热1 0m i n ，然后在9 5 下测定酶活力，具体 参照国家行业标准q b t 2 3 0 6 9 7 【3 l 】。 ( 3 ) 葡萄糖浓度的测定：使用s b a 4 0 c 生物传感器测定葡萄糖浓度。 ( 4 ) 乙酸浓度的测定：采用高压液相色谱法测定。 2 2 结果与讨论 2 2 1 种子生长过程曲线及种龄的确定 摇瓶发酵前对种子进行预培养是为了获得数量多、活力强盛的对数生长期细胞以缩 短发酵延滞期，从而提高生产强度，并且可确立生产菌的生长优势以减少染菌的可能性。 种子的分批培养过程要经过一个细胞活力最强、比生长速率最大的对数生长期；随后细 胞的活力开始减弱、其细胞数目开始减慢甚至停止。适宜的种龄应是菌体处于对数生长 的中后期。将对数生长中后期的种子培养液接入发酵培养基可以保持很高的细胞活力， 缩短发酵时间，并减少染菌的可能性。 重组菌在种子培养基上的生长情况如图2 2 所示。3 至1 0h 为菌体的对数生长期， 而培养8 1 0h ，菌体的比生长速率开始下降，因而采用培养时间8h 左右的种子接入发 酵培养基为好。 9 4 3 2 l o 1嚣)悯巾留恳 江南大学硕士学位论文 o z46 81 0l z1 4 培养时间l l 图2 - 2 摇瓶种子生长过程曲线 f i g 2 2t h eg r o w t hc u i v eo f t h es e e di nf l a s k 2 2 2 发酵培养基及诱导条件的优化 2 2 2 1 葡萄糖浓度的优化 对本实验的重组大肠杆菌来说，葡萄糖是满足重组菌生长所需的碳源，添加一定量 可以提高菌体的代谢活性，增加目的蛋白的表达量。另一方面，葡萄糖添加过量时容易 导致葡萄糖效应，其代谢中间产物有可能抑$ 1 j l a cm r n a 的合成，从而降低重组酶的表 达量。本文以2 1 3 所示的发酵初始培养基为基础，采用不同葡萄糖浓度进行发酵( 接种 后8h 加入乳糖至终浓度5g l 继续诱导培养6h ) ，结果如图2 3 所示。 晷 醚 望 暴 口bl u1 5z dz 53 0 葡萄糖浓度( 吕l l l ) 爿鲫；口酶活力 图2 3 葡萄糖浓度对菌体生长及酶活力的影响 f i g 2 - 3e f f e c t so fd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fg l u c o s eo nc e l l sg r o w t ha n de x p r e s s i o no fa - a m y l a s e 从结果可以看出，重组大肠杆菌在含浓度为1 0g l 葡萄糖的培养基中生长迅速，培 养1 0h 后，菌体密度达到最大值，a 6 0 0 达到11 1 ，重组酶的酶活也达到最高值9 0u m l 。 2 2 2 2 诱导时机的优化 将重组菌分别培养至不同生长阶段，加入乳糖至终浓度为5g l 进行诱导，3 7 持 续诱导6h ，取样测定茵体浓度和酶活力。实验结果表明( 图2 4 ) ，在菌体生长的不同 阶段加入乳糖，最终均可诱导重组酶表达。随着加入诱导剂时菌体密度的增大，酶活呈 上升趋势，这是因为菌体以乳糖为碳源，菌体量不断增加，因此单位体积发酵液中菌体 l o 5 4 3 2 i o o。口谜釉碧器 4 2 0 8 6 4 2 0 1 l i 第二章摇瓶发酵培养基及发酵条件的优化 所表达的目标蛋白增加，表现出酶活升高的趋势。菌体密脚6 0 0 达到7 0 ( 菌体培养9h ) 左右时进行诱导，有利于目标蛋白的表达。诱导时a 6 0 0 进一步增大，酶活力仍能维持较 局。 誊 弋 越 街 爱 恳 。 甚 e r 烬 溢 02468l o 诱导起始细胞密度ae o o a a 6 0 0 ；口酶活力 图2 4 诱导时机对茵体生长及酶活力的影响 f i g 2 - 4e f f e c t so f d i f f e r e n ti n i t i a li n d u c t i o no nc e l l sg r o w t ha n de x p r e s s i o no fa - a m y l a s e 2 2 2 3 乳糖浓度的优化 在重组菌生长至彳6 0 0 值为7 o 左右时加入不同浓度的乳糖，使菌体在不同乳糖浓度的 条件下进行诱导培养，3 7 诱导6h ，取样测定菌体浓度和酶活力。结果表明( 图2 5 ) ， 当加入乳糖终浓度为0 0 5g l 时就能诱导重组酶的表达；当乳糖终浓度为1g l 时，酶活 力最高，此后随着乳糖浓度的增大，重组酶的产量不再增加，说明乳糖浓度过高将抑制 目的蛋白的表达。另外，随着乳糖终浓度的增加，菌体终浓度呈上升趋势，最高可以达 到彳6 0 0 超过1 3 ，说明部分乳糖被用作碳源消耗于细胞代谢。 暑 噬 塑 导 3 重 = 楚 锰 0l2 了4 56 乳糖浓度，( g l ) a a 6 0 0 ；口酶活力 图2 - 5 乳糖浓度对菌体生长及酶活力的影响 f i g 2 - 5e f f e c t so f d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no fl a c t o s eo nc e l l sg r o w t ha n de x p r e s s i o no fa a m y l a s e 2 2 2 4 乳糖诱导时间的优化 在重组菌生长劭6 0 0 值为7 o 左右时一次性加入终浓度为1g l 乳糖，分别诱导6 、8 、 1 0 、1 2 、1 4 、1 6h ，取样测定菌体浓度和酶活力。实验结果表明( 图2 6 ) ，重组酶活力 在诱导6 1 2h 趋于稳定，8h