（发酵工程专业论文）重组毕赤酵母高密度发酵生产碱性果胶酶的策略研究.pdf

摘要 墒尊 r - ， 碱性果胶酶( e c 4 2 2 2 ) ，简称p g l ，是指在碱性环境下具有高活性的一类果胶酶， 可以通过以反式消去作用切断聚乳糖醛酸的a 1 ，4 一糖苷键并释放出不饱和的寡聚半乳 糖醛酸。碱性果胶酶作为煮练助剂用于纺织纤维的脱胶预处理，对纤维胶质有较好的去 除作用，且对天然纤维素纤维损伤较小。因此，以碱性果胶酶为关键技术的生物酶精练 替代传统的化学精练工艺，不仅可解决环境和能源等问题，而且可提高棉纺织物的品质。 本论文前期研究基础为：从分离筛选得到的一株碱性果胶酶高产菌株b a c i l l u ss p w s h b 0 4 0 2 ，扩增出编码碱性果胶酶的基因，成功表达于p i c h i ap a s t o r i sg s l1 5 。在此 基础上，本论文通过详尽分析菌体和甲醇浓度对重组p p a s t o r i sg s l1 5 高效表达的影响， 得出诱导阶段甲醇浓度和菌体浓度的最佳比值；通过菌体生长阶段甘油的指数流加和诱 导阶段甲醇分阶段流加策略控制甲醇和菌体浓度的最佳比值，实现了p g l 的高效表达。 在此基础上，探讨了诱导温度对毕赤酵母表达系统中外源蛋白降解的作用。主要研究结 果如下： 1 ) 为提高重组pp a s t o r i sg s l1 5 发酵生产碱性果胶酶的产量和生产强度，在摇瓶中优 化了重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的关键因素。结果表明，初始甘油浓度4 0e g l 、 初始甲醇浓度9 ，按每2 4h 添加1 5 ，诱导表达周期7 2h 、2 5 0m l 三角瓶诱导 培养基装液量3 0m l 、初始p h6 0 ，最适于菌体生长与产物表达，发酵结束时菌体 干重可达4 0g l ，p g l 酶活可达1 3 0 6u m l ； 2 ) 当诱导初始阶段菌体浓度分别为6 2 5g l 和9 0g 几时，甲醇用于细胞生长，而是p g l 生产能力受限；当诱导阶段初始菌体浓度为1 2 2g l ，甲醇几乎不用于细胞生长，而 是高效地用于诱导产酶。控制体系中甲醇浓度为2 0g 几时，p g l 酶活最高并且生产强 度最大，分别为3 7 6u m l 和4 0 6u m l h 。另外，在一定菌体浓度下，一定范围内增 加甲醇和菌体浓度的比值有利于提高p g l 酶活和生产强度； 3 ) 菌体生长阶段采用甘油指数流加策略，能在较短的时间内实现菌体生长最大化。指 数流加甘油1 9h ，菌体浓度可达到1 4 0g l ，细胞生产强度是d o s t a r 法的3 4 倍； 4 ) 甲醇的诱导阶段采用甲醇分阶段流加策略，成功地将甲醇与菌体浓度比例控制在 0 1 6 3 - 0 1 7 1g 儋。p g l 酶活最高达4 3 0u m l ，生产强度达到4 3 4u m l h ，产量和生 产强度分别是d o s t a r 法的2 2 倍和2 4 倍，实现了高产量和高生产强度生产p g l ； 5 ) 通过考察诱导温度发现：当诱导温度为3 0o c 时，整个过程中细胞干重基本维持在1 2 2 g l ，而在低温( 2 6 。c 署1 2 2 。c ) 下，菌体明显呈现出生长现象，菌体浓度分别增加到1 4 7 g l 和1 4 8g l 。并且低温对p g l 表达具有极大的促进作用。诱导温度为2 2 。c 时，p g l 最高酶活达9 2 2u m l ，分别是3 0 。c ( 3 2 2u m l ) 并1 2 6 。c ( 6 5 7u m i d 的2 9 倍和1 4 倍； 江南大学硕士学位论文 6 ) 在甲醇的非限制状态下，温度成为影响细胞活力的关键因素。通过检测发酵液中细 胞活性和总蛋白酶活，发现：低度有利于增加细胞活力和降低细胞的死亡率。在低 温下诱导，发酵上清液中几乎检测不到蛋白酶；而在高诱导温度( 3 0 。c ) t ，蛋白酶 活性明显增大，加剧了p g l 的降解； 7 ) 降低诱导温度使胞i 勾a o x 酶活性大幅度增加，从而增强了目的蛋白p g l 的表达。 另外，低温下胞内参与能量代谢的各腺苷酸类物质( a t p 、a d p 、a m p ) 的含量同样 也显著提高，在细胞适应甲醇后的2 0h 4 0h 内，能荷迅速降低，用作碳流转变的信 号或直接用作调控重组蛋白质的合成。 关键词：重组毕赤酵母，碱性果胶酶，甲醇诱导，流加策略，诱导温度，蛋白降解 a b s t r a c t a b s t r a c t a l k a l i n ep o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e ( p g l ，e c 4 2 2 2 ) ，i sak i n do fm i c r o b i a lp e c t i n a s e sw i t h h i g h a c t i v i t yi na l k a l i n ee n v i r o n m e n t , w h i c hc l e a v e st h ea - 1 ，4 - g a l a c t u r o n o s i d i cl i n k a g e so f p o l y g a l a c t u r o n i ca c i d ( p g a ) a n dr e le a s e su n s a t u r a t e ds o l u b l eo l i g o g a l a c t u r o n a t e sv i aa t r a n s - e l i m i n a t i o nm e c h a n i s m i tc a l lb ea p p l i e di nd e g u m m i n gp r e t r e a t m e n to ft e x t i l ef i b e r s a n du s e da ss c o u r i n ga s s i s t a n td u et oi t sf i n er e m o v a le f f e c to nf i b r o g l i aa n dr e l a t i v e l ys m a l l d a m a g et on a t u r a lc e l l u l o s eb a s ef i b e r t h e r e f o r e ，an o v e la n dm i l db i o t e c h n o l o g i c a l d e g u m m i n gn o to n l yp r e s e n t sa ne c o f r i e n d l ya n de c o n o m i ca l t e r n a t i v et ot h ep r o b l e m si n t e x t i l ei n d u s t r y ，b u ta l s oi m p r o v e st h eq u a l i t yo fc o t t o nf a b r i c s i np r e v i o u ss t u d i e s ，t h ec o d i n gs e q u e n c eo fp g l g e n e ，e x t r a c t e df r o mah i g h - y i e l ds t r a i n w s h b 0 4 - 0 2 ，w a ss u c c e s s f u l l ya m p l i f i e da n dt h e ne x p r e s s e di np i c h i ap a s t o r i sg s l 15b y p r e v i o u ss t u d y i no r d e rt oe n h a n c et h ep r o d u c t i o no f p g lb yr e c o m b i n a n tp p a s t o r i sg s l1 5 。 t h ee f f e c to fc e l la n dm e t h a n o lc o n c e n t r a t i o no nt h ep g lp r o d u c t i o nw a sc a r e f u l l y i n v e s t i g a t e db ys i n g l ef a c t o re x p e r i m e n ts oa st od e t e r m i n et h eo p t i m a lr a t i oo fm e t h a n o la n d c e l lc o n c e n t r a t i o n t h eo p t i m i z e dr a t i oo fm e t h a n o la n dc e l lc o n c e n t r a t i o nc o u l db e s u c c e s f u l l yc o n t r o l l e db ye x p o n e n t i a lg l y c e r o lf e e d i n gs t r a t e g yi n c e l lg r o w t hp h a s ea n d m u l t i p h a s i cm e t h a n o lf e e d i n gs t r a t e g yi nh e t e r o l o g o u sp r o t e i np r o d u c t i o np h a s e m o r e o v e r ， t h ee f f e c to fi n d u c t i o nt e m p e r a t u r eo nd e g r a d a t i o no fh e t e r o l o g o u sp r o t e i ni np i c h i ap a s t o r i s e x p r e s s i n gs y s t e mw a sd i s s c u s s e d t h em a j o rr e s u l t sw e r ep r e s e n t e da sf o l l o w s ： 1 ) t h ek e yf a c t o r so nh i g h l e v e lp g lp r o d u c t i o ni nr e c o m b i n a n tp i c h i ap a s t o r i sg s 115 w e r ei n v e s t i g a t e d i n2 5 0m ls h a k ef l a s k ，t h eo p t i m a lg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n ，i n i t i a l m e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n ，m e t h a n o ls u p p l e m e n t a t i o nq u a n t i t y ，d u r a t i o no fi n d u c t i o n ，i n i t i a l p h ，m e d i u mv o l u m ew e r e4 0e e l ，9 ，1 5 ( i ne v e r y2 4h ) ，7 2h ，p h 6 0a n d3 0m l ， r e s p e c t i v e l y f i n a l l y ，t h ed r yc e l lw e i g h tw a s4 0g l ，a n dt h em a x i m u my i e l do fp g l w a s a c h j e v e dt o13 06i j m l 2 ) i n3lf e r m e n t o r ，c e l l su t i l i z e dm e t h a n o lf o rg r o w t hw h e ni n i t i a lc e l lc o n c e n t r a t i o nw e r e 6 2 5g la n d9 0g l ，r e s u l t e di nl i m i t e dp r o d u c t i o no fp g ld u et om e t h a n o ls h o r t a g e h o w e v e ri,cellsw e r en o ta b l et ou t i l i z em e t h a n o lf o rg r o w t hw h e nn i t i a l c e l l c o n c e n t r a t i o nr e a c h e d1 2 2g l s om e t h a n o lw a sm a i n l yc o n s u m e df o rp g lp r o d u c t i o n a tt h i sp o i n t ，h i g h e s tp g la c t i v i t y ( 3 7 6u m l ) a n dh i g h e s tp g lp r o d u c t i v i t y ( 4 0 6 u m l h ) w e r ea c h i e v e da tt h em e t h a n o lc o n c e n t r a t i o n2 0g l m o r e o v e r , i tw a sf o u n d t l l a tp r o p e r l yi n c r e a s i n gt h er a t i oo fm e t h a n o lt oc e l lc o n c e n t r a t i o nw a sb e n e f i c i a lf o r e n h a n c e m e n to fp g lp r o d u c t i o n 3 ) i tw a so b s e r v e dt h a tt h ea p p l i c a t i o no fe x p o n e n t i a lg l y c e r o lf e e d i n gs t r a t e g yi nc e l l g r o w t hp h a s ec o u l da c h i e v et h em a x i m u mc e l lg r o w t hw i t hh i g h e f f i c i e n c y d 巧c e l l w e i g h tc o u l d r e a c h1 4 0g lb ya1 9 一he x p o n e n t i a lg l y c e r o lf e e d i n g ，g a i n e dt h e p r o d u c t i v i t y2 4 一f o l dh i g h e rt h a nt h a to fd o s t a t 4 ) ar e a s o n a b l em e t h a n o l f e dp r o f i l ew a sp r o p o s e dt oc o n t r o lt h er a t i oo fm e t h a n o lt oc e l l 江南大学硕士学位论文 c o n c e n t r a t i o na tt h er a n g eo f0 16 3t oo 171 e g g f i n a l l y ，t h eh i g h e s tp g la c t i v i t y ( 4 3 0 u m l ) a n dh i g h e s tp g lp r o d u c t i v i t y ( 4 3 4u m l h ) w e r ea c h i e v e d ，w h i c hw e r e1 2 - f o l d a n d1 4 - f o l dh i g h e rt h a nt h a to fd o s t a ts t r a t e g y 5 、l i tw a sd i s c o v e r e dt h a tc e l lc o n c e n t r a t i o nr e m a i n e dc o n s t a n tt i l lt h ee n do fc u l t i v a t i o nw i t h i n d u c t i o nt e m p e r a t u r ea t3 0o c w h i l et h e y e a s to b v i o u s l yd e m o s t r a t e dg r o w t h p h e n o m e n o nd u r i n gi n d u c t i o np h a s ea t2 6o ca n d2 2o c w i t hi n i t i a lc e l lc o n c e n t r a t i o n i n c r e a s e dt o1 4 7g la n dt o1 4 8g l ，r e s p e c t i v e l y b i p h a s i cc u l t i v a t i o n 谢t ht e m p e r a t u r e s h i n i n gf r o m3 0o ct o 2 2 o ci np r o d u c t i o np h a s el e dt o2 9 f o l da n d1 4 f o l d i m p r o v e m e n to fp g la c t v i t y ( 9 3 1u m l ) c o m p a r e dt o3 0o c ( 3 2 2u m l ) a n d2 6o c ( 6 5 7 u m l ) ，r e s p e c t i v e l y 6 l i tw a so b s e r v e dt h a tt h ei n d u c t i o nt e m p e r a t u r ew a st h ek e yf a c t o rt oi n f l u e n c ec e l l v i a b i l i t y t os e e kt h er e a s o no fp g ld e g r a d a t i o n t h ee x s i s t e n c eo fp r o t e a s ea n dc e l l v i a b i l i t yw e r ea n a l y z e d a t1 0 w e ri n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ，t h ec e l lm o r t a l i t yw a sg r e a t l y d e c r e a s e d ，a n dt h e r ew a sa l m o s tn op r o t e a s er e l e a s e di n t oi nc u l t u r es u p e m a t a n t ，w h i l ea t h i g h e ri n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ，p r o t e a s ea c t i v i t yi n c r e a s e do b v i o u s l y ，w h i c hm a yr e s u l ti n t h ed e g r a d a t i o no fh e t e r o l o g o u sp g l 7 ) t h ei n d u c t i o nt e m p e r a t u r eh a dar e m a r k a b l ee f f e c to ni n t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ti n t r a c e l l u l a ra o xc o u l db ee n h a n c e dl a r g e l yb yd e c r e a s i n gt h e i n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ，w h i c hm a ys t r e n g t h e ne x p r e s s i o no fd o w n s t r e a md e s i r e dg e n eo f p g l m e a n w h i l e ，a t p ，a d pa n da m pc o n t e n tw a sm u c hh i g h e r , a n dt h ee cd r o p p e d s i g n i f i c a n t l yb e t w e e n2 0a n d4 0ha f t e ra d a p t i o nu n d e rl o wt e m p e r a t u r e i ts u g g e s t e dt h a t v a r i e t yo fe cm a ye i t h e rs i g n a las h i f ti nc a r b o nf l u xo rm a yd i r e c t l yr e g u l a t e r e c o m b i n a n tp r o t e i ns y n t h e s i s k e y w o r d s ：p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e ，r e c o m b i n a n tp i c h i a p a s t o r i sg s 115 ，m e t h a n o li n d u c t i o n ， f e e d i n gs t r a t e g y ，i n d u c t i o nt e m p e r a t u r e ，p r o t e i nd e g r a d a t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是誉人在导师指导 f 进, i s - 的研究工作及取 得的研究成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意 签名：日 期： 细2 6 j 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致 保密的学位论文在解密后也遵守此规定 签名： 王美 导师签名： 丝 如2 c 0 日 期：盘盘：鱼：竺墨卜d v 第一章绪论 第一章绪论 1 1 研究背景 在世界范围内，由于环境质量的恶化和生态平衡的失调，人们越来越关注和重视可 能对人体健康有影响的各方面因素。许多国家政府从保护本国公民身体健康的角度出 发，相继颁布法规法令，对纺织品上有毒有害物质从法律上给予限量或禁止。目前国际 上推行的环保标准i s 0 1 4 0 0 0 ，纺织品生态标准o k o - t e xs t a n d a r d1 0 0 以及发达国家的“绿 色壁垒 政策等已使以前仅要求“末端治理 的观念转变为“源头治理 的全程环保观 念。2 0 0 7 年1 0 月在中国无锡召开的第五届国际纺织生物技术大会，对纺织工业中的各 项主题展开了讨论，酶法对棉纺织物进行预处理代替传统工艺就是其中之一。近年来， 随着工业催化领域对生物酶资源的认识和开发，研究者们提出了针对染整工艺中的环境 背景而引入相应生物酶的绿色工艺构想。因此，利用酶法进行生物精练替代早先使用的 有毒有腐蚀性的苏打是实现绿色纺织品生产的趋势之一i l j 。在众多开发的酶制剂中，果 胶酶在工业上有巨大发展前景，尤其是以碱性果胶酶为关键技术的全新温和的生物酶精 练工艺，在纺织清洁生产得到广泛运用，具有巨大商业潜力。 1 1 1 果胶质及果胶酶 1 1 1 1 果胶质 果胶质是在一种在植物中形成的高分子量、带负电荷、酸性的复杂多糖，其组分主 要包括半乳糖醛酸、鼠李糖半乳糖醛酸( 半乳糖醛酸的c - 6 被氧化为羧基) 、阿拉伯糖和 阿拉伯半乳糖【2 1 等，它们是一组复杂的胶质聚合物，其相对分子量为2 5 3 6 0k d a ( 表 1 1 ) 。其结构特点为：主要由半乳糖醛酸酐单元作为主架组成【3 ，4 1 ；半乳糖醛酸的羧基部 分被甲基化，部分或全部被钠、钾和铵离子中并1 1 5 , 6 】；c 2 和c 3 的部分羟基有的可能乙 酰化巴其主链由a - d 半乳糖醛酸单元以a - ( 1 ，4 ) 糖苷键连接构成，其中2 4 由l 鼠李 糖单元和半乳糖单元通过声一( 1 ，2 ) 及f l - ( 1 ，4 ) 键连接组成【2 】( 图1 1 ) ；鼠李糖半乳糖醛酸在 p h i _ 5 时带负电荷；阿拉伯糖、半乳糖、阿拉伯半乳糖、木糖及海藻糖的侧链通过c 1 和c 2 原子与主链相连接【o 】；果胶质以果胶酸钙和果胶酸镁的形式作为主要化合物存 在于植物组织的细胞间质和细胞初生壁中，胞间层主要由果胶质组成。果胶质在植物原 料中占鲜重的o 5 4 o 【5 l 。果胶质在植物细胞中以多种形式存在，这可能是多种形式 果胶酶存在的原因。 图1 1 果胶质的主要结构【1 2 1 f i g 1 一lp r i m a 哆s t r u c t u r eo fp e c t i cs u b s t a n c e s 表1 1 一些果胶质的分子量 t a b l e1 一lm o l e c u l a rw e i g h t so fs o m ep e c t i cs u b s t a n c e s 江南大学硕士学位论文 来源 分子量( k d a ) 苹果、柠檬 梨、李子 橘子 甜菜 果胶酶一词最早是由f r e m y 于1 8 4 0 年提出，现在果胶酶是指可以水解果胶质尤其 是植物果胶的一类酶的总称，主要由植物和微生物合成分泌【2 1 。对于植物来说，果胶酶 【1 3 ，1 4 1 。果胶酶的分解作用在维持生态平衡和废弃植物组织的循环上也有作用，同时果胶 酶的作用还表现在植物病理和水果蔬菜的腐烂上【2 ，1 5 , 1 6 1 。 果胶酶可以分为以下三种类型【1 7 1 ( 表1 - 2 ) ：( i ) 原果胶酶：降解不溶性原果胶为高度 聚合的可溶性果胶；( i i ) 酯酶：通过切除甲基促进果胶酯的水解；( ) 解聚酶：断开果 胶物质中部分d 。半乳糖醛酸的0 c ( 1 ，4 ) 糖苷键，包括水解酶和裂解酶。作用方式见图1 - 2 。 。藩一一心+ 枣， ”脚k ”。” 。一一。蛰寸 。 p 一+ 蛳“，上。 一 图1 - 2 果胶酶的作用形式【1 7 】 f i g 1 2m o d eo fa c t i o no fp e c t i n a s e s ( a ) r = h 时称聚半乳糖醛酸酶p g ，r = c h 3 时称聚甲基半乳糖醛酸酶p m g ； ( b ) 果胶酯酶p e ； ( c ) r = h 时称聚半乳糖醛酸裂解酶p g l ，r c h 3 时称聚甲基半乳糖醛酸裂解酶p l 。箭头表示 果胶酶作用于果胶的反应位点。 表1 - 2 果胶酶的分类1 2 , 3 5 ，6 ，1 2 1 t a b l e1 - 2a ne x t e n s i v ec l a s s i f i c a t i o no fp e c f i n a s e s 2 吣筋柏 第一章绪论 解聚酶 a 水解酶 1 内切聚半乳 磊醛酸酶 3 2 1 1 5 2 外切聚半乳 糖醛酸酶 3 外切聚半乳 糖醛酸一双分 子半乳糖醛酸 水解酶 4 寡聚半乳糖 醛酸水解酶 5 a4 ：5 不饱 和寡聚半乳糖 醛酸水解酶 6 内切聚甲基 半乳糖醛酸酶 7 内切聚甲基 半乳糖醛酸酶 b 裂解酶 3 2 1 6 7 3 2 1 8 2 p 0 l y - ( 1 ，4 ) - 仅d g a l a c t o s i d u r o n a t e g l y c a n o h y d r o l a s e p o l y - o ，4 ) - a d - g a l a c t o s i d u r o n a t e g l y c a n o h y d r o l a s e v o l y 一( 1 ，4 ) - a - d - g a l a e t o s i d u r o n a t e g l y c a n o h y d r o l a s e 水解随机果胶酸 水解末端果胶酸 水解 倒笨毳二 果胶酸 水解 水解 末端 主篡菱麦 末端 乳a 糖4 ：5 醛( 酸- - 半- - ) 水解随机 水解末端 i 内切裂解酶4 2 2 2 p o l y l l ，4 ) - d - 反式消去随机 g a l a c t o s l d u r o n a l el y a s e s 2 外切裂解酶4 2 2 9 p o l y 一( 1 ，4 ) 扑d g a l a c t o s i d u r o n a t e e x o l y a s e 反式消去 倒罘薹二 寡聚半 乳糖醛 酸 单分子 半乳糖 醛酸 双分子 半乳糖 醛酸 单分子 半乳糖 醛酸 不饱和 的单分 子半乳 糖醛酸 & 饱和 的( n 1 ) 寡聚甲 基半乳 糖醛酸 寡聚半 乳糖糖 醛酸 不饱和 的寡聚 半乳糖 醛酸 不饱和 的半乳 糖醛酸 ( i ) 原果胶酶 原果胶酶根据其作用机理可分为两种类型【1 8 ，1 9 】。a 型原果胶酶作用于原果胶内部的 聚半乳糖醛酸部位，而b 型原果胶酶作用于外部即聚半乳糖醛酸链和细胞壁组分相连的 多糖链。原果胶酶可以促进聚半乳糖醛酸的水解，降低聚半乳糖醛酸粘度【2 0 1 。三种a 型原果胶酶的生物学性质是相似的，分子量都是3 0k d a 。p p a s e - f 是酸性蛋白质，而 p p a s e l 和p p a s e s 是碱性蛋白质。p p a s e b ，p p a s e c 和p p a s e t 的分子量分别为4 5 ， 3 江南大学硕士学位论文 3 0 和5 0k d a 。p p a s e b 和p p a s e c 的等电点在9 0 左右，而p p a s e t 的等电点为8 7 t 1 3 】。 p p a s e b ，p p a s e c 和p p a s e t 作用于各种柑橘属水果的果皮及其它植物组织产生果胶 【1 3 1 o ( i i ) 果胶酯酶 果胶酯酶( p e c t i np e c t l y l h y d r o l a s e ，e c 3 1 1 1 l ，简称p e ) 通常指果胶甲基酯酶和一 种羧基酸酯酶【2 1 1 。果胶酯酶促进果胶质中半乳糖醛酸主链中甲基酯键的反酯化作用，产 生酸性果胶和甲醇1 2 2 1 ，产生的果胶再被聚半乳糖醛酸酶和裂解酶作用f 2 3 1 。p e 的作用形 式随着来源不同而有所不同1 2 4 1 ，真菌果胶酯酶通过多链机理随机去除甲基，相对的，植 物果胶酯酶趋向于作用于末端或自由羧基的后端，并且以单链机制继续作用下去。果胶 酯酶活性作用于6 5 7 5 甲基化的果胶时是最高的，这是因为果胶酯酶作用于与自由羧 基毗邻的甲基上之故【2 1 1 。果胶酯酶对果胶溶液的粘度变化几乎没有作用，除非有二价离 子存在，它们可以通过交叉结合增加粘度。大多数果胶酯酶的分子量在3 5 5 0k d a 之间， 果胶酯酶的作用p h 为4 o 8 0 ，真菌果胶酯酶的最适p h 比由细菌果胶酯酶的最适p h 要低，多数果胶酯酶发挥最高活性的适宜温度为4 0 - - 6 0o c 。 p e 的作用体现于细胞壁新陈代谢及细胞成长，果实成熟、脱落、衰老和病理之中【2 5 ， 堋，而商业果胶酯酶则用于保护和改善织物质地和多次加工水果的稳定性以及蔬菜提炼 和果汁澄清中1 2 7 1 。来源于日本曲霉( a s p e r g i l l u s a p o n i c u s ) 的果胶酯酶有两种相似形式， 其等电点均为3 8 ，5 0o c 时测得最高活性1 2 8 1 。来源于菊欧文氏菌( e r w m i ac h r y s a n t h e m i ) 的两种不同的果胶酯酶，p m e a 为种胞外酶【2 9 1 ，p m e b 是一种外膜蛋白质3 0 1 ，据报道 来源于e r w i n i ac h r y s a n t h e m i 的p e 在碱性p h 和5 0o c 时表现最高活性【3 1 1 。分泌p e 的 细菌和真菌有红酵母( r h o d o t o r u l as p ) 3 2 1 ，致病疫霉( p h y t o p h t h o r ai n f e s t a n s ) t 3 3 1 ，菊欧文 氏菌( e r w m i ac h r y s a n t h e m ib 3 41 ) 1 3 4 1 ，酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i d e ) t 3 卯，裂果胶毛 螺菌( l a c h n o s p i r ap e c t i n o s c h i z a ) 1 3 6 1 ，假杆菌( p s e u d o m o n a ss o l a n a c e a r u m ) t 3 7 1 ，黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) t 3 铂，乳杆菌亚种( l a c t o b a c i l l u s l a c t i s s u b s p c r e m o r i s ) 3 9 1 ，常现青霉 ( p e n i c i l l i u m r e q u e n t a n s ) 1 4 0 1 ，菊欧文氏菌压c h r y s a n t h e m i36 0 4 ) 2 9 1 ，青霉( p e n i c i l l i u m o c c t i a n i s ) t 4 1 1 ，日本曲霉研j a p o n i c u s ) 4 2 1 等。同时番木瓜( q 撕伽弘删) 【4 3 】，l y c o p e r s i u m e s c u l e n t u m 钏，野樱桃( e r u n u sm a l u s ) 4 5 1 ，i o t i sv i n i f e r a i 矧，柑桔( c i t r u ss p ) 【明，p o u t e r i a s a p o t a 4 8 1 和金虎尾( m a l p i g h i ag l a b r al ) 【4 9 1 等植物中也有p e 存在。 o i l ) 解聚酶 ( a ) 水解酶 果胶水解酶( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a s e ，p o l y g a l a c t u r o n a s e ) 是一种通过外界水分子作用 氧桥而促使聚半乳糖醛酸链断裂的果胶酶，是研究最广泛的一种果胶酶，果胶水解酶有 内切( e n d o - ) 和外切( e x o ) 两种。从不同微生物分离出来的水解酶在物理化学、生物学性 质及作用形式上有明显不同，大多数果胶水解酶的最适p h 为3 5 5 5 ，最适温度在3 0 5 5 o c 之间。分离于a s p e r g i l l u sn i g e r 的两种内切水解酶( p gi 和p gi i ) 的最适p h 分别在 3 8 4 8 和3 叫6 之间1 5 0 i 。大多数己报道的水解酶在酸性p h 条件下有较高活性，但是 也有少数分离于地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) 和镰刀霉( f u s a r i u mo x y s p o r u mfs p 4 第一章绪论 l y c o p e r s c o ”】的碱性果胶酶，其最适p h 为1 1 0 。b a r n b y 报道了四种同工酶，即p gi 、 p g i i 、p g i i i 和p g n ，它们有相同的分子量，但等电点不同。虽然大多数果胶水解酶在 3 0 - - 4 0o c 时活性较高，但有少数分离于b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s l l 6 j ，杆菌( b a c i l l u ss p k s m - p 4 4 3 ) t 5 2 1 和f u s a r i u mo x y s p o r u mfs p 1 y c o p e r s c i 5 3 】的水解酶可以在较高温度下促进 果胶水解。据报道，在其他微生物如金丝菌u r e o b a s i d i u mp u l l u u l a n s ) t ”】，丝核菌 ( r h i z o c t o n i as o l a n ik u h n ) t 5 5 】，镰刀霉( f u s a r i u mm o n i l i f o r m e ) t 弘】，脉孢菌( n e u r o s p o r a c r a s s a ) 5 7 1 ， ( r h i z o p u ss t o l o n i f e r ) 1 5 引，曲霉似胖哪s p ) 5 9 1 ，t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u 1 6 0 l ，p e a c i l o m y c e sc l a v i s p o r u s 6 1 】中也发现了果胶水解酶。许多内切水解酶已被克隆并在 大量微生物种属中进行基因研刭6 撕9 1 。然而，外切水解酶的克隆则很少见，据报道在 e r w i n i ac a r o t o v o r a ，根癌农杆菌( a g r o b a c t e i u mt u m e f a c i e n s ) t 7 ，多形拟杆菌( b a c t e r o i d e s t h e t a i o t a n i c r o n ) t 7 1 1 ，e c h r y s a n t h e m i ，a l t e r n a r i am a l l 7 羽，f u s a r i u mo x y s p o r u m 7 3 1 ，r a l s t o n i a s o l a n a c e a r u m l 7 4 1 ，b a c i l l u ss p 【5 2 1 中发现外切水解酶。外切水解酶可分为两种类型：真菌 外切酶，以单分子半乳糖醛酸作为主要终产物；细菌外切酶，以双分子半乳糖醛酸作为 主要终产物1 1 1 】，同时也有报道称植物中有该酶的存在 7 5 , 7 6 】。 ( b ) 裂解酶 果胶裂解酶( p o l y m e t h y l g a l a c t u r o n a t el y a s e ，p o l y g a l a c t u r o n a t el y a s e ) 分为内切( e n d o - ) 和外切( e x o 一) 裂解酶两种，裂解酶( 反式消去酶) 不通过水解作用而分解果胶酸酯，以反式 消去作用断开果胶聚合物主链为特征。裂解酶在c 4 处打开糖苷键，同时从c 5 上消去 h 原子，产生一个a4 ：5 不饱和产物。多数裂解酶的分子量在3 0 - 4 0k d a 之间，等电点 为7 0 11 0 ，裂解酶的适宜p h 在碱性范围内( 7 5 1 0 o ) ，适宜温度为4 0 5 0o c 。来源 a s p e r g i l l u s a p o n i c u s 的裂解酶的米氏常数为0 1 6 ，在p h 6 0 ，5 5o c 下活性最大【7 7 】。在 细菌中，裂解酶是最大的一组果胶酶，而且直接与植物病理有关。果胶裂解酶对钙离子 有明显的依赖，因此螯合剂如e d t a 对其有非常明显的抑制作用。 能产果胶裂解酶的微生物较能产水解酶的微生物要少得多，相关研究也较少。果胶 裂解酶主要是由细菌和真菌产生，而且一些致病真菌产生的内切果胶裂解酶比外切果胶 裂解酶更丰富。果胶裂解酶可以从细菌和导致食品损坏和腐烂的真菌中分离出来。在 c l l e t o t r i c h u ml i n d e m u t h i o n u m1 7 8 】，b a c t e r o i d e st h e t a i o t a o m i c r o n 【7 9 1 ，胡萝卜软腐欧文氏菌 ( e r w i n i ac a r o t o v o r a ) s o