（发酵工程专业论文）脂肪酶的固定化及其非水相合成己酸乙酯的研究.pdf

天津科技大学坝士学位论文 摘要 为促进我国酶法生物技术的发展和提高非水相酶学研究水平，改善己酸乙 酯的品质，本论文对脂肪酶的固定化、固定化脂肪酶催化己酸乙酯的反应过程、 产物分离提纯进行了研究。 其主要内容如下： 、对微生物脂肪酶在不同介质( 水相、溶剂相、无溶剂体系) 中转化进行比 较证明：脂肪酶在有机溶剂中的酯化效果远高于在水相和无溶剂体系。同 删，在对己酸乙酯的催化研究中表明：选择合适的脂肪酶酶源是反应的关 键，并选出催化效果最好的c a n d i d a s p 脂肪酶。 二、脂肪酶的固定化：研究了在有机溶剂中的脂肪酶的固定化。并确定了固定 化脂肪酶的条件，如载体、有机溶剂、初水量、酶量、固定化时间等。固 定化脂肪酶的回收率达到6 2 ，且稳定性好，其半衰期为2 4 0 h 。 三、非水相固定化脂肪酶合成己酸乙酯：利用固定化脂肪酶在溶剂相中催化己 酸和乙醇的合成反应。研究了反应体系中的含水量、溶剂、反应温度、加 酶量、加入分子筛等因素对催化己酸乙酯反应的影响规律：含水量为 o 4 、温度3 0 。c 、加酶量0 5 9 ，在环己烷溶剂中，经过8 h 的反应，加入 1 9 分子筛，己酸乙酯的合成转化率可达8 6 6 9 。 四、己酸乙酯的提取：在比较了蒸馏产物分离方式的基础上，成功地用减压蒸 馏提取出己酸乙酯。用红外光谱、气相色谱对样品检测，确定为己酸乙酯。 对样品的品质分析的结果表明：其重金属离子砷和铅为p p m 级，远远低于 化学产品：其它品质均符合国家标准。 关键词：脂肪酶；己酸乙酯：固定化酶； 酯化 a b s t r a c t t o i m p r o v e t h eb i o t r a n s f o r m a t i o n t e c h n o l o g y ，a n du p g r a d en o n a q u e o u s e n z y m o l o g y r e s e a r c h ，a n di m p r o v e t h e q u a l i t y o f e t h y l h e x a n o a t e ，t h e i m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e ，t h es y n t h e s i so fe t h y lh e x a n o a t eb yi m m o b i l i z e dl i p a s e a n d e t h y lh e x a n o a t e e x t r a c t i o nw e r es t u d i e d m a i n p o i n t sa r ea sf o l l o w s ： 1t h e c o m p a r i s o no f e s t e rs y n t h e s i sb ym i c r o b i a ll i p a s ei nd i f f e r e n tm e d i a ( w a t e r , s o l v e n t ，s o l v e n t f r e es o l u t i o n ) s h o w e dt h a tt h er e s u l t si ns y n t h e s i sw e r e b e t t e ri n s o l v e n tp h a s et h a ni nw a t e ra n ds o l v e n t f r e es o l u t i o n i tw a si d e n t i f i e dt h a tt h e c 臼n d i & ls pl i p a s ei sb e s ti nt h er e a c t i o no fb i o c a t a l y s t se t h y lh e x a n o a t ef o u r k i n d so f l i p a s e ，a n dc h o o s i n gp r o p e rl i p a s es o u r c e s w a st h er e a c t i o n sk e y 2 t h ei m m o b i l i z a t i o no f l i p a s e ：i nt h eo r g a n i cs o l v e n ti m m o b i l i z a t i o no fl i p a s e w a ss t u d i e d t h ei m m o b i l i z a t i o nc o n d i t i o n ss u c ha ss u p p o s i n gm a t e r i a l s ，w a t e r c o n t e n t ，o r g a n i cs o l v e n t ，t h et i m eo fi m m o b i l i z a t i o na n dt h ea m o u n to fe n z y m e a d d e dw e r ed e t e r m i n e d ，t h ea c t i v i t yr e c o v e r yo fi m m o b i l i z e dl i p a s ei s6 2 ，t h e i m m o b i l i z e d l i p a s ei ss t a b i l i t ya n d i t so p e r a t i o n a lh a l f - l i f ei sa b o u t2 4 0h o u r s 3t h es y n t h e s i so f e t h y lh e x a n o a t eb yi m m o b i l i z e dl i p a s e ：+ f h ee f f e c t so f f a c t so n e s t e r i f i c a t i o no fh e x a n o i ca c i da n de t h a n o lb yi m m o b i l i z e dl i p a s ei ns o l v e n th a v e b e e ns t u d i e d ，s u c ha sw a t e rc o n t e n t ，s o l v e n t s ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r e ，a m o u n t so f l i p a s ea d d e de ta 1 a f t e r8h ，t h ec o n v e r s i o ny i e l di ne t h y lh e x a n o a t es y n t h e s i s b yi m m o b i l i z e dl i p a s ew a s8 6 6 9 i nt h ec y c l i h e x a n e w i t h0 1g l i p a s e a n d0 4 o f w a t e r , a d d e d1 0 9o f m o l e c u l a rs i e v ea t3 0 c 4 e t h y lh e x a n o a t ee x t r a c t i o n ：o nb a s i so fc o m p a r i n gp r o d u c t c o l l e c t i n gm e t h o d s ， v a c u u m d i s t i l l i n gw a ss e l e c t e da n d u s e ds u c c e s s f u l l y b yi ra n d g c ，t h er e s u l t i n g s a m p l ew a sd e t e c t e da n di d e n t i f i e da se t h y lh e x a n o a t e t h ea n a l y s i so fp r o d u c t s h o w st h a tt h eq u a l i t yi t e m sa r ei nk e e p i n gw i t ht h en a t i o n a ls t a n d a r df o rf o o d a d d i t i v e e t h y lh e x a n o a t e c o m p a r e dw i t he t h y lh e x a n o a t ef r o mc h e m i c a l s y n t h e s i s ，t h eh e a v ym e t a li nt h a tf r o me n z y m a t i ce s t e r i f i c a t i o n ，s u c ha sa sa n d p d a r ei nv e r yi o wc o n c e n t r a t i o n k e yw o r d s ：l i p a s e ；e t h y lh e x a n o a t e ；i m m o b i l i z e de n z y m e ；e s t e r i f i c a t i o n i i 天律科技大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 引言+ ： 微生物脂肪酶( e c3 1 1 3 ) ，又称三酰基甘油酰基水解酶，是指分解或合成 高级脂肪酸和丙三醇形成的甘油三酸酯酯键的酶。应用于油脂水解、食品风味 和香味的改进、医疗医药、皮革绢纺脱脂、低等油脂的改性、添加于洗涤剂和 化妆品中等。特别是在油脂化工和有机合成工业中，脂肪酶催化的反应具有条 件温和、耗能低、原料要求低、成品质量高等优点，尤其是1 ，3 专一脂肪酶， 可用于特殊脂肪酸、单甘酯的合成及立体选择性化学合成和拆分，且具有巨大 应用潜力。 1 2 非水介质中脂肪酶研究进展 1 2 1 非水介质酶学的一般概况 生物大分子酶能在疏水环境中表现出生物活性，这在生物体中是早已 被人们所知道，如在生物膜内外表面的疏水环境中。而在非生物体系的疏水有 机溶剂中仍表现出生物活性，这无疑是对长期以来认为：生物功能大分子( 酶、 抗体、核酸) 只能在水溶液中行使其生物功能的一个挑战。 1 9 8 4 年美国k l i b a n o v ，a m 在s c i e n c e 上发表了一篇关于脂肪酶在有机介 质中催化条件和特点的综述。他们在仅含微量水的有机介质( m i c r o a q u e o u s m e d i a ) 中成功地酶促合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。他明确指出， 只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性 底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机 溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂中表现出催 化活性【i i 。这无疑是对酶只能在水溶液中起作用这一传统酶学思想的挑战。此 后十几年来，酶在非水介质中催化反应的研究十分活跃。现已报导，酯酶、脂 肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶等水解酶类；过氧化物酶、过氧化氢酶、醇 脱氢酶、胆固醇氧化酶、多酚氧化酶、多细胞色素氧化酶等氧化还原酶类和醛 缩酶等转移酶类中的十几种酶在适宜的有机溶剂中具有与水溶液中可比的催化 活性。因此酶学领域诞生了一个全新的学科方向非水酶学( n o n a q u e o u s e n z y m o l o g y ) 【2 【3 】【4 】。 有机相中酶促反应成为研究的热点，除了具有水相中酶的催化优点外，还 具有以下特点垆【“： 1 使反应热力学平衡从加水分解反应转为其逆反应，如酯合成、肽合成、酯交 换反应等。 2 酶不溶于有机溶剂，容易回收再利用。 3 从低沸点的溶剂中分离纯化产物比水中容易。 4 酶的热稳定性比水中要高。 第一章前言 5 固定化酶方法简单，可以只沉积在载体表面，在无水介质中酶不易脱离 吸附表面。 6 增加了非极性底物的溶解性，有利于高浓度底物连续生物转化。 7 抑制与水有关的副产物。 8 没有微生物污染。 9 有着广泛的底物专一性。 目前，非水相酶学研究主要集中在以下三个方面： 第一、有机溶剂中酶的结构特点与稳定性； 第二、有机溶剂中酶催化性和选择性的调节与控制： 第三、有机溶剂中酶催化反应的应用。 1 2 2 非水介质中脂肪酶的结构与酶学性质 一、 非水相中脂肪酶的结构 按照热力学预测，球状蛋白的结构在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是 不稳定的。但在有机环境还能表现出催化活性这一事实说明：酶的结构至少是 酶的活性部位的结构与水溶液中的结构是相同，这是研究有机相中酶催化的最 基本问题。众所周知，酶在水溶液中以一定构象的三级结构存在，这种结构与 构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”( c o m p a c t ) ，又有“柔性”( f l e x i b i l i t y ) 的状态【”。紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢键，而溶液水分子与蛋白质 分子的功能基团所形成的氢键使蛋白质分子内的氢键受到一定破坏，蛋白质分 子变得松散，呈一种“开启”( u n l o c k i n g ) 状态。这种“紧密”和“开启”两种 状态处于一种可变动的平衡中，表现出一定的柔性( 图l 一1 ) ，所以酶在水溶液 中以其紧密的空间结构和相当大的柔性发挥催化功能【8 】o z a k s 9 】认为酶在疏水环 境( h 2 0 1 ) 的有机溶剂中，与蛋白质分子形成氢键的水分子极少。蛋白质 分子内的氢键起主导作用，使蛋白质变得“刚硬”( r i g i d i t y ) ，活动自由度变小， 限制了疏水环境下的蛋白质构象向热力学稳定状态转化，能维持着和水溶液中 同样的结构与构象，不变性还能表现出催化活性。 蛋白质分子内氢键蛋白质分予问氢键 一表示氢键 图1 1 蛋白质分子内氢键和分子间氢键 m u c o rm i e h e i 脂肪酶是目前对其结构研究比较多和较清楚的真菌脂肪酶 。 邮 一 天津科投大学顺：卜学位论文 之一。作为一个典型脂肪酶的代表，x 一衍射结晶学的研究表明：m u c o rm i e h e i 脂肪酶的二级结构主链是由九股的p 一中心折叠系统和五股a 螺旋所组成。所 有的a 一口连接都是右手螺旋。这就产生了由在一边d 一中心折叠和一系列。一 螺旋以及片断形成的一个复杂的蛋白质结构。总的来况，a 一螺旋由于受到自身 与b 一折叠的连接，结果也平行与0 一折叠股的方向。它的催化活性是以s e r 为 主的与a s p 、h i s 组成的三分子催化中心进行的。但是这个中心却埋在一+ 段螺旋 结构的“盖子”下面。“盖子”的疏水基团与这个三分子的疏水区域相结合。这 个带有t r p 的盖子是具有两亲性的，t r p 疏水表面与催化中心的疏水区域相结 合，暴露出的另一亲水端则面向外，与水分子以氢键作用连接 。o 】。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，这早在1 9 5 8 年被 s a r d a 和d e s n n e l v 发现。所谓的界面被认为是两个彼此分离的完全不同的相差， 在分子水平上相当于两个临接的有序分子层，一个比较亲水，一个比较疏水。 对界面的形成可提高脂肪酶活性的理论解释如下：1 所有脂肪酶的一级结构都 相似，包括重要区域h i s g l y z - s e r - g l y 和y - g i y h i s s e r - w - g l y ( 这里x 、y 、 z 、w 表示基因氨基酸残基) ；2 活性部位的丝氨酸残基被a - 螺旋掩盖，当脂肪 酶与界面接触时a - 螺旋打开，这导致脂肪酶通过在丝氨酸周围创造一亲电区域， 暴露疏水残基，增加与脂类底物的亲和力并保持催化过程中过渡中间产物稳定 。 二、 非水介质中的酶学性质 酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，因此它能发 挥催化功能。但是有机溶剂在很大程度上也会影响酶的稳定性和酶的底物特异 性。由于有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶的 结合部位，而且有机溶剂也会改变底物存在状态。因此酶和底物相结合的自由 能就会受到影响，而这些至少会部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、立 体选择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质。 f 1 1 热力学稳定性 脂肪酶在催化许多反应中表现出较水要高的稳定性，如脂肪酶在苯中催化 酯交换反应中，酶的活力在2 0 - 7 0 温度范围内随温度的升高而增加，7 0 。c 条 件下反应七次( 9 6 小时次) 后，仍保持了6 0 的酶活力，表1 1 列出了一些酶 在有机溶剂中的热力学稳定性【9 】。k l i b a n o v l l 2 】认为酶稳定性的提高是由于缺少 水，限制了由水引起的酶分子中的天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用和天冬氨酸 处肽键的水解以及二硫键的破坏，使蛋白质失活全过程难以进行。水是酶失活 的必须的因素，酶的热失活需要其本身具有高度的柔性。但在有机溶剂中酶的 不溶性使酶分子的构象的刚性大大增强。所以在高温下酶在有机溶剂中也能保 持适当的折叠，热稳定性大为提高的同时活性中一t l , 还类似其在水中。 第一章前言 ( 2 ) 底物特异性( s u b s t r a t es p e c i f i c i t y ) 和水溶液中的酶催化一样，酶在有机溶剂中对底物的化学结构 和立体结构均有严格的选择性。例如青耀脂肪酶在正己烷中催化2 一 辛醇与不同链长的脂肪酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有 较强的特异性，这与它催化甘油三酯水解反应时的脂肪酸特异性是 相同的。但是，由于酶与底物的结合能取决于酶与底物复合物的结 合能和酶、底物及溶剂相互作用能的差，因此酶与底物的结合受到 溶剂的影响。其原因是酶在水溶液中，酶与底物的结合主要是疏水 作用，而在有机溶剂中，底物与酶之间的疏水作用已不重要。酶能 够利用它与底物结合的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶 与底物之间的结合能和酶与水分子之间的结合能的差值。因此介质 4 天津科技人学硕士学位论文 改变时，酶的底物专性( k c a t k m ) 和催化效率会发生改变。另一一方 面，底物在反应介质与酶活性中心之问分配的变化也是影响酶的底 物专一性及其催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影 响底物在两者之f 刮的分配3 1 。猪胰脂肪酶催化月桂酸与月桂醇的酯 合成反应叫，在非极性强的十二烷( 1 9 p = 6 6 ) ( 1 9 p ，溶剂的极性参数， 其中：p 是指某种溶剂在辛醇和水混合体系中的分配系数) 中酶的 催化活性仅是苯( 1 9 p = 2 ) 中酶催化活性的一半，这是因为疏水性底物 在介质与酶活性中心之间的分配比例不同，十二烷与苯相比，底物 更倾向于分配在十二烷中。 ( 3 ) 化学键选择性( c h e m o s e l e c t i v i t y l 化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点。 a s p e r g i l l u sn i n g e r 脂肪酶催化6 一氨基1 _ 己醇的酰化反应时，羟基的 酰化占绝对优势，这种选择性与传统的化学催化完全相反。这样就 可以在不需基团保护的情况下合成氨基醇的酯。例如图l 一2 中化合 物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在叔丁醇中和在1 ，2 二氯乙烷中的 酰化程度不同i l ”。在p s e u d o m o n a ss p 脂肪酶的催化下，羟基更容易 被酰化。有趣的是在同样的溶剂中m u e o rm e i h e 脂肪酶则更容易使 氨基酰化，它对氨基与羟基的选择性差l8 倍。并且酶的化学键选择 性与氢键参数有关，m u c o rm e i h e r 脂肪酶催化羟基酰化时形成氢键 的倾向强，而对于氨基酰化则刚好相反。为了实现对酶底物复合物 中间体的进攻，亲核基团应该不易形成氢键，由于羟基基团易于形 成氢键，因此不利于亲核进攻，氨基不易形成氢键，有利于亲核进 攻，进行催化反应【j6 1 。 h 2 n h o h 图1 2 验证脂肪酶化学键选择性的化合物结构 ( 4 ) 对映体选择性( e n a n t i o s e l e c t i v i t y ) 酶的立体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的 能力，这种选择性是由两种对映体的非对映异构体的自由能差别造 成的。有机溶剂中酶对底物的对映体选择性是随介质的亲( 疏) 水 性的变化而发生改变。如在环己烷中脂肪酶的选择性e 值大于8 ， 第一。章前言 而在乙氰仅略高于1 。曹淑桂等认为脂肪酶的选择性( e 值) 与溶剂 的介电常数、及偶极矩有较好的相关性。溶剂的介电常数、及偶极 矩越大，酶的对映体选择性越差。并用不同溶剂对脂肪酶催化辛酸 与外消旋2 辛醇酯化反应动力学进行了研究，提出“口袋”模型来 解释对映体选择性，认为脂肪酶内供亲核基团结合的位点，存在大 小不同的两个“口袋”。2 一辛醇的r 型异构体以图1 3 左边所示的方 式与酶结合，其己基占据较大的口袋，甲基占据较小的口袋。这种 结合方式使2 一辛醇的羟基能够顺利地进攻酰基一酶中间体上的羰基。 如果s 型异构体以相同方式与酶结合，则其羟基将远离酶分子上的 羰蜒而使亲核反应无法进行。为了使亲核进攻能顺利进行，s 异构 体必须以图1 3 右边所示的方式与酰基酶中间体结合，可以看出己 基在结合进小口袋时遇到较大的空间障碍。因此2 。辛醇的r 型异构 体较s 型异构体容易与酶结合，从而具有较大的反应活性【1 7 】。 图1 - 3 脂肪酶立体选择性的大小不同的“口袋”学说 ( 5 ) 位置选择性( r e g i o s e l e c t i v i t y ) 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性( r e g i o s e l e c t i v i t y ) ，即酶 能够选择性地催化底物中某个区域的基团发生反应。k l i b a n o v 1 s 】用 猪胰脂肪酶在无水吡啶中催化各种脂肪酸( c 2 ，c 4 ，c 8 ，c 1 2 ) 的三 氯乙酯与单糖的酯交换反应，实现了葡萄糖l 位羟基的选择性酰化。 当然不同来源的脂肪酶催化上述反应时，选择性酰化羟基的位置不 同。因此，选择合适的酶，能够实现糖类、二元醇和类固醇的选择 性酰化，制各具有特殊生理活性的糖酯和类固，醇酯。目前对于酶在 非水介质中的位置选择性研究得比较少。r u b i o n ” 报道了p c e p a c i a 脂肪酶催化图1 4 所示的酯交换反应的速率v 1 与v 2 显著不同，反 应的位置选择性园子( k c a t k m ) l ( k c a t k m ) 2 与溶剂的疏水性常数 l g p 有较好的相关性。为了解释这种现象，设想脂肪酶的活性中心附 近有一个疏水裂缝，催化过程中如果底物a 的辛基进入这个疏水口 6 天津科投大学硕士学位论文 袋，那么丁酰基团就位于催化中心，形成产物b ，如果丁酰基团位于 疏水性口袋中形成产物c 。由于在疏水介质中，从热力学分析，辛 基基团不易进入此疏水口袋，因此易生成产物c ，而在亲水性溶剂 中则相反。 a + b u o h b 0 8 h 1 7 c 图i 4 反应介质对酶位置选择性的影响 ( 6 ) p h 记忆与p h 忘记 有机溶剂中的酶能够“记忆”它冻干或丙酮沉淀前所在缓冲液中的p h 值。 z a k s 2 0 】等称这种现象为“p h 记忆”( p h i m p r i n t i n g ) 。他们在研究脂肪酶催化三 丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反应中发现，酶的反应速度与其冻干前水溶液的p h 密切相关，反应的最适p h 接近于水溶液中的最适p h 。他们认为在缓冲液中酶 的解离状态取决于环境因素，而在有机溶剂中不存在发生质子化或去质子化的 条件，当酶分子从水溶液转移到有机溶剂中时，它保持了原有的离子化状态， 环境因素不能改变酶的这种解离状态，或者说酶在缓冲液中所处的p h 状态仍 被保持在有机溶剂中。利用酶的p i t 记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适 p h 。，众多的研究也表明【2 1 【2 2 1 1 2 3 1 ：有机相中酶最适p h 与水相中酶催化的最适 p h 是一致的。这样在有机溶剂中酶分子表面的必需水，在特定的p h 和离子强 度下，酶分子活性中心周围的基团处于最佳的离子化状态，有利于酶活性的表 现。最近，v a l i v e r t y ”j 和l o h m e i e r - v o g e p 5 j 分别用缓冲液中磷原子的核磁共振 谱的变化和利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冻干或有机溶剂沉淀 后，转入微水有机溶剂中的p h 值。酶可以保持原缓冲液中的p h 的“记忆”， 从而维系原缓冲液中构象。 b l a c k w o o d 2 6 1 在研究有机溶剂中酶的解离状态时，发现在微水有机溶剂中 疏水性的酸或碱与它们相应的盐所组成的混合物，可以作为有机相缓冲液 ( o r g a n i cp h a s eb u f f e r ) ，它们以中性和离子对形式能够充分溶于有机相，而不能 进入水或其它极性溶液，这两种存在形式的比例控制着有机相中酶的解离状态， 1 第一章前斋 使酶完全忘记( f o r g e t ) 干燥前它所处的水溶液的p h ，即干燥前缓冲液的p h 值对 微水有机溶剂中的酶活性几乎没有什么影响。 ( 7 ) 系统含水量 在有机溶剂中酶的催化活性与反应系统的含水量密切相关。系统含水量包 括与酶粉水合的结合水，溶于有机溶剂中的自由水以及固定载体和其它杂质的 结合水。与酶结合的水量是影响酶的活性、稳定性以及专一性的决定因素。要 成功地应用非水介质中的酶催化反应，控制酶结合的水量和水在酶分子中的位 置是关键。在基本无水的有机溶剂中，水对于酶催化活性构象的获得与保持是 必须的。大量的研究表明：在有机溶剂中，酶的催化活性与反应系统的含水量 有着密切的联系。水直接或间接参与维持蛋白质结构的氢键、疏水作用和范德 华力i 2 7 】。a l e k e r y f 2 8 】研究了3 种不相关的酶在不同的有机溶剂中的酶反应，发现 在溶解度限制范围内，酶活都随着有机溶剂中水含量的增加而提高，且达到最 大酶活所需的水量，疏水溶剂比亲水溶剂少( 见图l 一5 ) 。 r u p t y ，j a l ”j 和f i n n e y , j l 川用u v 、i r 、n m r 、e s r 、r a m a d s c 等方法 洋细研究了溶菌酶在水合过程中，酶活性与水量之间的关系。最适水量是保证 酶的极性部分水和表现活力所必需的“必需水”( e s s e n t i a lw a t e r ) ，是用于维持 活性构象的柔性所必需的。各种酶因其结构不同，维持酶具有活性构象所需的 必须水量也是不同的口”。例如：一胰凝乳蛋白酶的每个分子需要十个水分子刁 能活化。少于或高于其必需水的含量都会造成酶构象的变化。而影响酶的催化 活性1 3 2 j 。对于水在酶分子上的结合过程和结合水量，r u p l e y ，j a 2 9 】等详细地研 究了溶菌酶酶粉在水合过程中酶活性与酶含水量间的关系。当结合水量在0 - 7 ( 重量) 范围时，每一酶分子周围有o 6 0 个水分子，这些水分子大部分在蛋白 质侧链，可离子化残基。即首先是羧基脱质子，其次是氨基质子化。这种状态 下蛋白质活动的自由度非常小，没观察到活性。当含水量在7 - 2 5 ( 重量) 范 围时，每个酶分子周围有6 0 2 2 0 个水分子。含水量在7 左右时，侧链残基离 子化后，水分子在其它极性部位形成簇( c l u s t e r ) ；含水量在2 5 时肽键的n h 被水合，局部介电常数升高，同时蛋白质分子的活动自由度急剧增大，但是蛋 白质结构基本不变，构象基本相同，酶显示活性：当含水量在2 5 3 8 范围时， 每个酶分子周围有2 2 0 3 0 0 个水分子，肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶 活性随着含水量增加而增加。这是因为水和酶分子之间形成多个氢键，水作为 分子润滑剂增大了酶构象的柔性，增加了界面的表面积。然而，太多的水会使 酶的活性降低。当含水量在3 8 以上时，每个酶分子周围有3 0 0 个以上水分子， 整个酶分子( 包括非极性部位) 被一层单分子水层包围，酶活性是水溶液中的 十分之一。其中一个原因是水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽作 用，掩盖了活性位点的极性；另一个原因是太多的水会使酶积聚成团，导致疏 水底物较难迸入酶的活性部位，引起传质阻力。有机溶剂中酶含水量低于最适 天津科技大学倾l 学位论文 水含量时酶构象过于“刚性”而失去催化活性；含水量高于最适水量时，酶结 构的柔性过大，酶的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构 的改变和失活。只有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性( k i n e t i cr i g i d i t y ) 平t l 热力学稳定性( t h e r m o d v n a m i cs t a b i l i t y ) 之间达到最佳平衡点( 见图1 - 6 ) ，酶表 现出最大活力。因此，最适水量是保证酶的极性部位水合，表现活力所必需的。 由于水的高介电性，有机溶剂中少量的必需水能够有效地屏蔽有机溶剂与酶蛋 白表面某点之间的静电相互作用，酶分子构象与结晶状态一致，即与水溶液中 酶的结构类似。只有当溶剂的极性非常强，水的介电能力不足以屏蔽溶剂与酶 蛋白分子之间的静电相互作用，或者溶剂的亲水性大于与水相互作用的蛋白质 表面的亲水性，水脱离蛋白质进入有机溶剂时，酶蛋白分子的结构爿会受到溶 剂的影响。当水加入到溶剂酶体系中时，水在溶剂和酶之间分配，与酶紧密键 合的结构水是决定酶活性的关键因素，在有机介质中，只要有少量的水与酶结 合，那么酶就会保持其活性。但是有时在脱水的酶体系中也观察到了酶的活性， 这可能是由于伸展的蛋白质充当了少量天然酶的稳定剂而产生的结果。 1 0 一，。 j a 嚣 1 j ? i 。，之fj ， 御l 一5 妁| a l， a n 一辛醇 b ： 1 一丁醇 弘 ；! “ f ? 一” 溶制审瓣鸯水量( v s v ) 酵母醇氧化酶：( a ) 乙醚 ( b ) ( e ) 叔戊醇( f ) 2 - 丁醇 蘑茹多酚氧化酶：( a ) 乙酸己酯 ( e ) 叔戊醇 乙酸丁酯 ( c ) 乙酸乙酯 ( d ) ( b ) n 辛醇 ( c ) 乙酸已酯 ( d ) c ：马肝醇脱氢酶：( a ) 二氯甲烷 ( b ) 异丙醚 ( c ) 乙酸丁酯 ( d ) 乙酸甲酯( e ) l 珏t 氢呋哺( f ) 乙腈 图1 5 有机溶剂中酶活性与含水量的关系 9 第一章前言 动力学刚性热力学不稽定性 图1 - 6 有机溶剂中酶活性与酶含水量的关系 因为系统的含水量与溶剂的亲水性、疏水性也是密切相关的。如 p s e u d o m o n a ss p 在环己烷中最适加水量为0 4 ，而在甲苯中为o 8 。为了排 除溶剂对含水量的影响【2 7 】。h a i l i n g l 7 1 1 3 4 1 提出用a w 水活度( t h e r m o d y n a m i c a c t i v i t yo fw a t e r ) 来代替水浓度去描述水对有机相中酶促反应的影响。从而解决 了这一问题。水活度( a w ) 定义为系统中水的逸度与纯水逸度之比，水的逸度在 理想条件下用水的蒸气压代替，因此a w 可以用体系中的水的蒸气压与同样条 件下纯水蒸气压之比表示。 a w 2 y w x w x w = 水的摩尔比，y 。：活度系数 对于极性小的溶剂，v 。不依赖于组成，因此a w 可以确定为在相同温度下 的水的摩尔比。对极性大的溶剂，活度系数v 。可以用溶剂，水混合物的气液平 衡方法计算。 a w = y w p r p oy w = a 埘x w y 。：气相中的水的摩尔比例， p t ：总的压力 p o ：相同温度下水的饱和蒸气压 x 。：液相中水的摩尔比例 h a i l i n g 在物理化学所定义的标准状态下得出以下规律： 利用水活度能 准确描述水解反应的平衡位置，只要水活度不变，反应平衡就基本保持不变。 当a w 有机相 o 酶活性 天津科技大学硕。l 学位论文 中酶的最适水活度( 即酶活力达到虽高时的水活度) 与酶量无关，而对于系统 含水量则随酶量的增加而增加； 在含有不同底物的各种有机溶剂中，酶的 最适水活度都在0 5 5 左右，即酶最适水活度与溶剂的极性、底物的性质及浓度 无关。水活度可由反应体系中水的蒸气压除以在相同条件下纯水的蒸气压而测 得。在不同有机溶剂中获得恒定的水活度至少可通过如下三种方式： 用一个饱和盐水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。 向反应体系中直接加一种水合盐。 向每一溶剂中加入不同量的水。 反应系统的含水量除了影响酶的催化活性以外，还影响着酶的选择性。 k i t a g u i c h i 【35 】等报道：在水量于很窄的范围内( o 0 1 2 5 v v ) 时，随着水量的 增加，酶的催化活性和对应选择性都有所提高。认为是由于水量的微小增加使 刚性很强的酶构象增加了柔韧性和可移动性，从而提高了酶的催化活力和对应 选择性。 ( 8 ) 有机溶剂 酶活性和溶剂属性的定量关系模型 有机溶剂对酶催化活力的影响是非水酶学所要阐明的另一重要因素，溶剂 不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性( 包括 底物特异性、立体选择性、前手性选择性等) 。通常有机溶剂通过与水、酶、底 物和产物的相互作用来影响酶的这些性质( 见图1 7 ) 。l a a n e 等人3 6 谰溶剂的极 性参数l g p ( p 为某溶剂在正辛醇和水双体体系中的分配系数) 描述了溶剂的极 性与酶活性的关系。 ，瑚 00 图1 7 脂肪酶在有机溶剂中的反应体系 有机溶剂对酶催化活性的影响主要有两种方式：一是溶剂夺取维持酶活性 构象的必需水，从