（发酵工程专业论文）重组人胰岛素原在毕赤酵母中的表达及分离纯化的研究.pdf

北京化j ：大学硕士学位论文 重组人胰岛素原在毕赤酵母中的表达及势离纯他的研究 摘要 糖尿病及其并发癜严重斑害人类健康。对于糖尿病患者，胰岛素 干预作为替代或补充治疗是最直接有效的方法。胰岛素药物历经8 0 多 年豹发袋，麸旱期的动魏胰髓中提致动物羧鸯素，到魂褒豹生物合成 人胰岛素以及人胰岛素类似物，胰岛素药物一直具肖广阏的发展嚣景。 本实验室将人胰岛索原然因整合到甲醇营养型酵母融斯德毕赤酵 母中，构成基因工程蘸，诱导表达重组入胰岛索原。酋先对基阁工程 菌避褥重悬培养，s d s 。p a g e 霜w e s t e r nb l o t t i n g 梭验褥表达熬爨鑫分 子量与理论分子量吻合，著且具有胰岛素的免疫原性。 对基因工程菌发酵过程的研究得出的结论为：工程谣发酵生长阶 段菌体的生长与限制髋基质甘油残留浓度酶关系符合m o n o d 关系式， 落体生长维持系数m = 0 。0 0 7 9 g + h ，说骥奉株蘸藏绥胞高密浚培养来说是 一株优良菌，其有高密度培养的潜力；在傀化工程菌的发酵条件和基 础盐培养基配方的基础上，研究了工程蔷的诱导策略，使蛋白的表达 鬣提高了倍多。和用优化了的摇瓶培养条件进行1 0 l 发酵罐的上罐 试验，蛋自产量是摇瓶发酵蛋白产量的5 倍多。 对表达的重组人胰岛素原的鹾分离纯化步骤研究锝到了优化 北京化工大学硕士学位论文 的分离步骤组合和分离条件。发酵液离心去除菌体一e 清液过中空 纤维柱脱盐浓缩，再过金属螯合层析柱分离目的蛋白，然后经凝胶层 析除盐转换缓冲液体系，肠激酶酶切4 h ，凝胶层析分离胰岛素与连接 肽，收集胰岛素样品液。 利用免疫酶标法，l m l 样品测得活性8 4 p i u ，证明实验所得样品 具有人胰岛素活性。 关键词：重组人胰岛素，毕赤酵母，发酵，分离纯化 u 北京化工大学硕士学位论文 s p e c i f i cg r o w t hr a t ea n dr e s i d u a lc o n c e n t r a t i o no fg l y c e r o li sa c c o r d e dw i t h m o n o de q u a t i o ni n p h a s eo fc e l lg r o w t h t h eg r o w t hm a i n t a i n i n g c o e f f i c i e n tm 2 0 0 0 7 9 g he v i d e n c e dt h a tt h es t r a i nh a sp o t e n t i a lo fh i g h d e n s i t yc u l t i v a t i o n t h ey i e l do fh e t e r o l o g o u sp r o t e i ni n c r e a s e do b v i o u s l y b yo p t i m i z a t i o ne x p e r i m e n to ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o na n db a s a ls a l t m e d i u mf o r m u l a ，a sw e l la s e x p e r i m e n to fi n d u c t i o ns t r a t e g y t h e h e t e r o l o g o u sp r o t e i nc o n c e n t r a t i o ni s4t i m e sm o r et h a nf l a s kf e r m e n t a t i o n l e v e lb yio lf e r m e n t o rf e r m e n t a t i o n s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nw e r es t u d i e da f t e rf e r m e n t a t i o ni no r d e rt o a c h i e v ep u r i f i e dm a t u r eh u m a ni n s u l i n t h eb r o t hw a sc e n t r i f u g e dt ow i p e o f fc e l l s ，a n dt h e nt h es u p e r n a t a n tw a sd e s a l t e da n dc o n c e n t r a t e db yh o l l o w f i b e rm e m b r a n e a f t e rs e p a r a t i o nb yi m a c ，h e t e r o l o g o u sp r o t e i nw a s d i g e s t e d 4 h o u r sb ye n t e r o k i n a s e a t l a s t ，g e lc h r o m a t o g r a p h yw a s p e r f o r m e dt os e p a r a t eh u m a ni n s u l i na n dl i n k i n gp e p t i d e t h ef i r s te l u a t e p e a kw ec o l l e c t e dw a sh u m a n i n s u l i ns a m p l e e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a ya n a l y s i s i n d i c a t e dt h a tt h e h e t e r o l o g o u sp r o t e i ns a m p l eh a sac e r t a i nb i o a c t i v i t yo f h u m a n i n s u l i n k e yw o r d s ：h u m a ni n s u l i n ；p i c h i ap a s t o r i s ； f e r m e n t a t i o n ； s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n i v 北塞化工大学位论文原创性声明 y8 8 1 8 6 0 本人郑重声骥：。艨呈交豹学位论文，是本入在导薅鳇指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不含任俺其他个人或集体已经发表或撰写避的作品成果。对本文 的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本 人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 作者签名? 整 日期：迎：安二 关于论文使用授权的说明 学位论文作者完全了解北京化工大学有关保留和使用学位论文 的藏定，繇：研究生程校玫读学位赣阚论文工僚静知识产权纂位属北 京化工大学。学校有权保留并肉国家有关部门或帆构送交论文的复印 件和磁盘，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全 部藏郝分蠹容，可以允许采耀影霞、缩印或萁它复麓手段徐存、汇编 学位论文。 保密论文注释：本学位论文属于豫密范围，在量年解密后遥雳 本授权书。非保密论文注释：本学位论文不属于保密范嗣，适用本授 权书。 绍者签名：釜蝗 导师签名：洼掣当 器鬻：翟曼：墨：i 日期：竺! ：笪! 兰 北京化工大学颤士学位论文 糖蒙瘸豹治疗药物有很多静，胰岛素豢药物是治疗i 墅禧藤瘸盼特效强需药物。 其它治疗药物还有胰岛素分泌促进剂、胰岛素增敏剂、影响碳水化合物吸收的药 携、一氧纯氮台酶捧涮裁、耱琢器生季牵裁裁绫及蛋巍貉氨酸激辩麴裁裁疆l 等。嚣 l 孑 膦岛素类药物正朝着蜜全，起效快，使用方便方向发展，品种已很多：捱规( 短 效) 胰基素、中效骧秘索、长效麟岛素、颓湿簇岛豢援辏品耪齐荟。 l 。3 胰岛素及其l 巍瘫佟用然余 胰岛素怒治疗i 型糖尿病的姆效必 需药物，其肖极大的市场需求鞠。胰岛 索是在胰岛的b x 北京化工大学硕士学位论文 基酸。猪胰岛素b 链末端，即b 3 0 是丙氨酸，而人的b 3 0 为苏氨酸。在胰岛素的生 物合成过程中还有一个疏水的肽链与胰岛素原的b 链n 端相连，这种形式的胰岛 素被称为前胰岛素原。这个接在b 链n 端的疏水肽链是信号肽，其作用是引导新 合成的胰岛素原穿过内质网膜。人的前胰岛素原是一个由2 4 个氨基酸残基组成的 信号肽和一个含8 6 个氨基酸残基的胰岛素组成，由n 端至c 端的连接顺序为 s - b - a r g - a r g c l y s - a r g - a ，其中s 为信号肽，c 代表c 肽，由3 5 个氨基酸残基组 成，a 和b 分别为胰岛素的a 链和b 链。在胰岛素的合成过程中，包括前胰岛素 原的m r n a 在内质网的向质面被翻译成一条肽链的前胰岛素原，新生的多肽链在 信号肽的引导下穿过内质网进入内质网腔，同时移去信号肽成为胰岛素原，然后 胰岛素原进入高尔基体，经过折叠、配对和包装进入分泌颗粒，最后由类似胰蛋 白酶和羧肽酶b 的专一的蛋白水解酶加工成两条链的胰岛素和c 肽释放到血液中 去。 胰岛素原的生物学作用同胰岛素基本一样，只是活性较弱，生物合成的胰岛 素原在外周利用葡萄糖的能力只有胰岛素的5 - 1 0 ，但它抑制肝脏释放葡萄糖的 能力则为利用外周葡萄糖能力的1 5 倍。尽管胰岛素原的生物活性较弱，但它的降 糖作用较胰岛素持久，这可能是由于胰岛素原具有较长的半衰期的缘故嘲。 胰岛素的主要药效是调节糖代谢。由于它能减少糖原异生、促进糖原合成、抑 制糖原分解、加速葡萄糖的无氧酵解和有氧氧化、促进组织对葡萄糖的利用并能 促进葡萄糖转变为脂肪，i 临床上可用来降低血糖。胰岛素还有促进脂肪合成、抑 制脂肪分解、减少酮体生成的作用，所以亦被用来纠正胰岛素相关酮症和酸斑症 的各种症状。胰岛素疗效确切，其上市已长迭八十年，至今仍是维持各型糖尿病， 尤其是中、重度糖尿病患者正常血糖水平和治疗糖屎瘸相关酮症、酸血症及糖尿 病性昏迷不可或缺的药物，临床地位十分重要【3 】。 1 4 胰岛素药物的研究历程及现状 胰岛素最早是由多伦多大学的b a n t i n g 和b e s t 于1 9 2 1 年发现，并随即由美国 l i l l y 公司于1 9 2 3 年上市的。在以后近6 0 年的时间内，胰岛素一直由猪、牛等动 物胰腺提取而得，但这些产品与人胰岛素结构有所不同，故存在免疫原性，易发 4 一 北京化工大学硕士学位论文 生胰岛素过敏、注射部位肌肉萎缩和胰岛素抗性等副作用。而且应用于临床的胰 岛素是不纯净的、酸性的、短效的、且浓度仅为l u m l ，因此患者不得不每天注射 7 - 9 次，每次胰岛素制剂的体积还很大。为有效克服上述缺陷，人们做出巨大的努 力，5 0 年代初，n p h ( n e u t r a l p r o t a m i n e h a g e d o m ) 和l e n t e 胰岛素的问世，解决 了上述问题。此后，人们又着手改进胰岛素制剂的纯度，在7 0 年代，单组分( m c l 胰岛素出现在市场上。并相继出现全合成和半合成的人胰岛素产品，由于它们采 用的是化学方法，收率低，成本过高。那以后的十余年间，n o v on o f d i s k 专门致 力于与人胰岛素结构完全相同的胰岛素制剂的研制工作，八十年代初、中期美国 l i l l y 和丹麦n o v on o f d i s k 公司相继开发出基因重组人胰岛素生产技术，人胰岛素 方才逐渐走上临床。 到了九十年代，尽管很多问题都被解决，但又有不少新问题被提出，而这些问 题只是部分被解决。胰岛素分子三级结构提供的b 链末端具有定向作用，使胰岛 素分子与分子之间以反向序列形成稳定的、非共价键结合的b 折叠的二聚体。这 种二聚作用是胰岛素自我聚合的基础。在锌离子存在的情况下，三个胰岛素二聚 体先后自我聚合而构成稳定的六聚体，在极度稀释的溶液中才存在单分子胰岛素。 但是皮下注射胰岛素后，只有单分子和二聚体能穿过毛细血管屏障吸收，六聚体 必须解离后才能吸收，目前认为该解离过程是胰岛素吸收的限速【9 l 。因此，人们试 图能发展单分子胰岛素以加快其吸收。 当前，国际上经过对重组人胰岛素的多年研究和生产，开发出了临床需要的 新种类的人胰岛素类似物或称“类胰岛素”，主要是指将天然胰岛素上一个或几个 氨基酸更改，产生出活性更高的超效胰岛素和作用时间更长的胰岛素以及快速吸 收、快速作用的胰岛素。 例如由美国f d a 批准上市的速效胰岛素l i s p r o 是一种能快速吸收、比普通胰岛 素作用时间短的人胰岛素类似物。具有胰岛素类似的生物效应，与胰岛素相比， 不仅更加安全方便，而且避免了抗体引起的胰岛素耐药性f 1 0 1 。a s p a r t 胰岛素也是一 种新型短效人胰岛素类似物，皮下注射后的吸收速度，起效速度均较胰岛素快。 再如n o v on o r d i s k 公司的速效胰岛素h u m a l o g 就是将胰岛素b 链的 p r 0 2 8 l y s 2 9 突变为l y s 2 8 p r 0 2 9 ，而速效胰岛素n o v o l o g 则是将b 链的p r 0 2 8 突变 为a s p 2 8 ，这样，胰岛素突变体h m m o g 、n o v o l o g 在皮下注射后具有吸收快、起 效快、作用时间短和餐后尖峰状的生理学分泌相似的特点，用药灵活方便；另外 北京化工大学硕士学位论文 长效胰岛素l a n t u s 是将胰岛素a 链的a s h 2 1 突变为g l y 2 l ，在b 链的末端增加了 a r 9 3 1 a r 9 3 2 两个氨基酸，使其成为第一个真正长效药物，恒定的药代动力学和药 效动力学时间至少持续2 4 1 3 ，和相对恒定基线胰岛素生理水平相似。 由于随着生活水平的提高，全球糖尿病发病率有上升的趋势，基因重组胰岛素 类产品的年销售额已超过5 0 亿美元，成为除e p o 和抗体类药物外的第三大类生物 技术药物。表1 1 【1 l 】列出了2 0 0 3 6 至2 0 0 4 6 年度销售额排生物技术药物前5 0 位的 1 1 种基因重组胰岛素类产品。 表1 - 12 0 0 3 6 2 0 0 4 6 年度销售额捧生物技术药物前5 0 位的胰岛素类产品 t a b l e1 - 1r e c o m b i n a n ti n s u l i n - p r o d u c t si nt h et o p5 0b i o m e d i e i n e sb ya n n u a ls a l e so f 2 0 0 3 6 也0 0 4 6 1 5 重组人胰岛素的研究 胰岛素是治疗糖尿病的特效药物，用于i 临床己有7 0 多年，但在过去相当长的 一段时间里，医用胰岛素都是从猪和牛的胰腺提取的，由于一级结构的差异，患 者长期使用易产生免疫反应，并导致一系列的副作用。为此，人们设法采用各种 方法来降低其免疫副作用。首先成功地生产人胰岛素的方法就是对猪胰岛素的改 造。猪胰岛素与天然人胰岛素组成最相近，仅b 3 0 氨基酸不同，前者是丙氨酸，后 者是苏氨酸，通过酶修饰法( 转肽法) ，就可将b 3 0 丙氨酸改变成苏氨酸，于是猪胰 岛素就被转变成人胰岛素。d n a 重组技术的出现为胰岛素的生产开创了新的途径。 第一个重组d n a 分子报道后不久，u n n c h 锄t 报道了胰岛素在大肠杆菌中的成功 表达，成为最早在微生物中被表达的哺乳动物蛋白质之一。目前人们更多地通过 - 6 北京化工大学硕士学位论文 基因工程发酵生产胰岛素原，然后加工成有活性的人胰岛素。胰岛素原及其类似 物基因在许多系统如大肠杆菌，酵母，枯草杆菌及链球菌中都得到了表达，而比 较多地被采用的胰岛素原表达系统主要有两个：大肠杆菌表达系统和酵母表达系 统。 1 5 1 人胰岛素原在大肠杆菌中的表达 大肠杆菌是一个高效的表达系统，但缺点是不利于表达人胰岛素这样的小蛋 白，产物易降解。在高效表达的过程中，表达产物在细胞质中往往形成不溶性包 涵体，需要有效破碎细胞才能收集这些表达产物，而且需要复杂的复性变性过程 及活性的加工过程，胰岛素原才能转变成有活性的胰岛素，这无疑增加了后处理 的难度和复杂程度。 最先用化学方法分别合成a 链和b 链编码的d n a 片段，并在其5 端分别加 上甲硫氨酸密码子。将上述基因插入克隆载体，置于载体上色氨酸合成酶操纵子 的后面。转化大肠杆菌，经过发酵，分别从细胞中分离出含有a 链和b 链的融合 蛋白，用溴化氰处理此融合蛋白，裂解甲硫氨酸使a 链和b 链释放出来，并将其 转化成稳定的s 一磺酸盐。经过纯化，在过量的a 链存在下，由b 链和a 链组合成 人胰岛素【1 2 】。 1 5 1 1 采用融合蛋白形式表达人胰岛素原及其类似物 应用大肠杆菌系统表达真核生物时，常常遇到的困难是外源蛋白在大肠杆菌 中不易积累，尤其是小蛋白很容易被酶降解，因此赢接表达此类蛋白时往往表达 效率较低。所以一般采用融合蛋白的形式，适当加大外源蛋白，提高其稳定性及 表达效率。在人胰岛素原基因的5 端加上甲硫氨酸密码子，接在色氨酸合成酶操纵 子的后面，插入质粒，转化大肠杆菌。表达产生的色氨酸合成酶人胰岛素原融合 蛋白沉淀于细胞浆中。从细胞中分离融合蛋白，经溴化氰裂解后得到人胰岛素原， 将其转变成稳定的s 磺酸盐。分离纯化后得到s 磺酸型人胰岛素原，经变性复性和 二硫键配对，折叠成天然构象的人胰岛素原，产率可达4 5 。同分异构体和多聚体 副产物回收后可重复利用。具有天然构象的人胰岛紊原经胰蛋白酶和羧肽酶b 处 理，去除c 肽得到结晶人胰岛素 1 2 , 1 3 l 。 1 5 1 2 用均一性的短肽提高人胰岛素原的表达 s u n gw l 等人【1 4 】曾经报道将均一性的短肽插入到人胰岛素原的n 端，再在前 北京化工大学硕士学位论文 面接上b 一半乳甘酶n 端的8 个氨基酸残基，胰岛素原的表达量可以明显提高。该报 道指出，在2 0 种氨基酸中，( a l a ) 6 ，( a s n ) 6 ，( c y s ) 7 ，( g i n ) 7 ，( h i s ) 6 ，( s e r ) 6 和( 1 1 h ，6 效果最好，胰岛素原的表达量可达到总细菌蛋白的6 到2 6 不等。这些均一性的 短肽具有两个明显的共同特征：( 1 ) 它们对普通蛋白酶的水解作用相对而言不是很 敏感，( 2 ) 由于极性的关系这些短肽位于胰岛素原分子结构的外围，保护了胰岛素 原的敏感部位免受大肠杆菌蛋白酶的水解作用，从而稳定了胰岛素原，有利于产 物的高表达。值得提出的是( h i s ) 6 ，它是一个具有广阔前景的前导肽。除了具有稳 定胰岛索原的作用外，用( h i s ) 6 建立的表达系统还具有如下优点：f 1 ) 不会干扰表达 产物的结构和功能，( 2 ) 后处理时不必专门酶切除去( h i s ) 6 ，( 3 ) 不会干扰胰岛素的分 泌，( 4 ) 可以用n i - n t a 亲和层析达到快速纯化的目的，( 5 ) 由于含有大量的碱性氨基 酸，表达产物的p i 较高，有利于用离子交换层析纯化表达产物，便于降低成本以应 用于生产。 1 5 1 3 在大肠杆菌中串连表达胰岛素原 在表达胰岛素这样的小蛋白时，为了避免表选产物的降解，常用的办法是将 目的蛋白基因与一个分子量较大的蛋白的基因重组在一起，以融合蛋白的形式表 达。然而，在融合蛋白中，目的蛋白所占比例小，从而降低了表达量。而且在后 处理时需要将切割下来的融合蛋白与目的蛋白胰岛素进行分离，这无疑增加了下 游处理的复杂性，也降低了胰岛素的最后收率。s h e ns h 报道【”1 的在大肠杆菌中 串联表达胰岛素原的办法或许可以解决这一困难。将2 个，3 个或更多的胰岛素原 基因插入大肠杆菌质粒组成表达载体，表达产物胰岛素原的稳定性明显增加。c n b r 裂解可以将串联的胰岛素原定量转变成单体胰岛素原。 房德兴【1 6 】等采用大肠杆菌偏爱密码子合成人胰岛素原类似物基因( b k - r - a ) 以k - r - 肽取代人胰岛素原的c 肽，将2 个b - k - r - a 基因经接头串连起来，实现了在 大肠杆菌中的表达。随后，他们又引进人工接头( 接头序列r r n s m ) ，构建基因 三联体，实现了在大肠杆菌中的高效融合表达，约占细胞总蛋白的3 1 。 1 5 1 4 从基因工程小c 肽人胰岛素原类似物制备人胰岛素 在大肠杆菌系统中，基因工程生产人胰岛素的后加工问题，尤其是复性率是 提高胰岛素产率的关键问题之一。在研究胰岛素的结构与生物功能的关系中，过 去人们一直认为c 肽含有使胰岛素二硫键正确配对的足够的结构信息。随着对胰岛 素a b 链重组研究的深入，人们对“c 肽含有使胰岛素二硫键正确配对的足够的结 北京化工大学硕士学位论文 梅信塞”邀一论点产生了矮聚。医既在2 0 毽纪8 0 年代至9 0 年代，科学容对不闵妖 腹的c 肽进行了研究，结果表明，c 肽程胰岛素a b 链正确配对时，可能只起柔性 连接敖魏露穗，傻褥双分子反残交务分予疼反应。蒋a b 链惫含了足够懿往二蔽镳 正确配对的信息，c 脓的长短可能会对a b 链的重组产生影响。 陈寒嗣麓人采蹋特有的藏鳃方法，姆小c 驶入胰岛素爨类似物f b 。a r g 。矗f 静a ) 与人胰岛素原( b c a ) 进行重组条件的比较，结果发现二者在p h l 0 6 左右处熏组率 达列最大，基在相同躲条传下b 衄a r g - a 蛋自质的重组率( 舛蚴较b a 蛋盎质 ( 8 2 绚的高，进一步验证了“胰岛索的a b 链含有足够使二硫键磁确配对的结构信息” 的论点。为了提高胰岛索原的戋曙藏效率和胰岛素的产率，韩国的c h a n gs g 等人f 心1 设计了小c 黢久疆岛豢原类钕秘m 2 p i 。奁丈肠杆菌审戳融合鬣自形式表达，表达 墩可达细胞总蛋白量的2 5 。缀磺酸解，c n a r 裂解以及离子交换层析初步纯化该 ，l 、c 蘸获舀豢嚣爱进行还覆重缀，垂缝攀魄同等条转下簇岛素潦懿重鬣搴裔 2 0 - 4 0 。 l ，5 5 入壤褰素攥藻嚣在文麟抒藏枣分泌表达 在大肠杆菌中，寝达产物襁细胞质中往往形成镪涵体，这虽有利昔：产物的高 效表达及稳定，但这魑产物需经过变性复性恢复天然结枣每班及活性的加工，缮鸯鞋 了后处理的复杂性。肖报道指出，金色葡萄球菌蛋白a 的基因在大肠杆菌中，在特 定条件下表达产物能分泌到细胞外的培养慧中。为了使胰岛索原基因程大肠杆菌 中商东平袭迭且表达产物筢有天然话性结构，陈燕簿t 2 0 将获龋素原基戳融合到金 色葡萄球菌蛋白a 的熬因上，构建成大肠杆菌中基因融合的外分泌表达裁体。它熊 离羧表这藏有效遣分泌表运产镶。翻耀豢和屡耩憩方便遮藏培养滚孛分离密熬台 鬣白，融台凝白经c n b r 裂解后，经r p h p l c 分析，分离得到舆有天然结构的胰岛 胰磊素摄，磐进露了蘩定。簇麓素暴基爨与蛋蠹a 爨透在e 鳍梅壤3 溃融会，在大 肠杆菌中表达时蛋白a 的表达并不妨碍胰岛素原的折叠，仍能形成正确的二硫键。 麟岛素原酶表达，亦不影响蛋自a 与l g g 黪络套戆秀。这耱融仑蛋白可以方便建瘸 亲和层析进行分离。这种外分泌表达系统不仅有利予表达蛋自的正确祈臌，也能 保护寄主缨腮不受外源表达产物的不利 x 北京化工大学硕士学位论文 用温度诱导启动子快速而且高效诱导表达人胰岛素原。陈来同等【2 2 1 通过基因定点 突变的方法在b 链的转角区回折点b 2 3 并q b 2 4 撇- - 个g l y ，表达的b 2 3 g l y - b 2 4 人胰岛素放免活性和受体活性分别是人胰岛素的1 1 6 和1 1 1 。陈雅惠等t 2 3 1 通过构 建并表达m e t l y s 双c 肽人胰岛素原制备人胰岛素，w i l l i a mf 等t 2 4 ) 则通过表达a b 链 倒转的胰岛素原即a c b s t 备人胰岛素等等。这些探索思路均从不同角度改进和完 善了胰岛素的大肠杆菌表达系统。 1 5 2 人胰岛素原在酵母中的表达 1 5 2 1 人胰岛素原在酿酒酵母中的表达 以融合蛋白形式表达的人胰岛素的a 链和b 链或胰岛索原，在加工成胰岛素 的过程中都需要若干化学处理以完成裂解、二硫键的形成、变性、复性等，为了 最大限度的减少对表达产物的化学处理，m a r k u s s e n 与t h i m 的小组分别研究了用 酿酒酵母分泌表达单链胰岛素原的工作。 m a r k u s s e n 等 2 5 1 在酿酒酵母中表达了单碱性氨基酸c 肽的单链胰岛素前体，如 b ( 1 2 9 ) - s e r - l y s - a ( 1 - 2 1 ) 、8 ( 1 - 2 9 ) - a l a - a i a - a ( 1 2 1 ) 等。用于在酵母中分泌表达上述 单链胰岛索前体的基因包括磷酸丙糖异构酶启动子、交配因子a l ( m f a l ) 信号肽、 磷酸丙糖异构酶的终止顺序。这些基因不仅保证了单链胰岛素前体基因高效转录， 而且借助信号肽将表达产物分泌到发酵液中。 值得指出的是，m a r k u s s e n 等在将表达产物加工成人胰岛素时采用了转肽方 法。纯化的单碱性氨基酸c 肽的单链胰岛素前体物在过量的苏氨酸酪( t h r - o r ) 的 存在下，用胰蛋白酶转肽获得 b 3 0 t h r - o r 人胰岛素。用三氟乙酸脱去苏氨酸上的 酯后，得到结晶人胰岛素。张友尚f 2 6 】等受猪胰岛素能够转肽获得人胰岛素的启发， 人工合成了猪单链胰岛素原基因，将其插入质粒p v t ，转化酵母，获得猪单链胰 岛素原表达量达4 0 - 5 0 m e , ，l 。表达产物经简便的分离纯化和转肽获得结晶人胰岛 素。 t h i m 等【2 7 l 将单链胰岛素前体基因插入质粒c p o t ，实现了人胰岛素在酵母中 的分泌表达，并证明表达的小c 肤单链胰岛素前体活性高于天然人胰岛索原。与 m a r k u s s e n 等不同的是：( 1 ) t h i m 等用的是双碱性氨基酸c 肽单链胰岛索前体 b a r g - a r g - a 、b a r g l y s - a 等；( 2 ) 联合使用胰蛋白酶和羧肽酶b ，加工纯化单链 胰岛素前体获得人胰岛素。 1 5 2 2 人胰岛素原在巴斯德毕赤酵母中的表达 - 1 0 蔻哀铯工大学矮士攀袋论文 将巴斯德毕赤酵母用于人胰岛素的表达鼹最近才开始的，中科院动物所、上 海生化所以及n o v o 的研究人员分别进行了邋方面的研究。我国的郭永志等人和王 燕等人分别在甲醇酵母p i c h i a p a s t o r i s 中获褥了人胰岛素的高效袭达。甲醇酵母是 一类霹激j 霹l 甲簿终兔噬一凝源戆 誊麓酵母，p i c h i a p a s t o r i s 楚箕审秘，它夔承 了酿溉酵母s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e 的许多优点，包括有性繁殖，孢予形成，转化 后整合和复制载体，通过同源重组进行基因取代，是表达内源和外源基因的理想 系统，已成功地表达了多种外源蛋白质。 舔瘩恚等f 2 龃将簇菇爨溅基因连接到穿梭矮粒# r l - s l 上，魄赘法转诧蛋自酶 缺黧糠s m d l l 6 8 ，臻逡表迭榛，经i 舞发辞罐诱导表达，获岛素藤产搴这3 0 0 m g l ， 约占总强白量的2 0 。壬燕掣2 卅将猪胰岛素前体基因和在其5 ，端引入9 个氨 基酸的间隔肽序列的p i p 熬 鲴( s p - p i p ) 插入剿穷梭质粒p p i c 9 k 中，用原生质球法 转他g s l l 5 ，点杂交筛选离拷贝转化予，获褥m u t + 表型的赢拷贝转他子p 3 9 ( - s p ) 器$ 5 1 ( s 。l 蠢疆簸发黪，s p - p i p 在8 5 1 审鹣表达量蠹4 0 m # 。，p i p 在p 3 9 串 的表达照为l o m g r l ，经下游纯化，得到纯的s p - p i p 和p i p ，经转肽操作，都获得 了重组人胰岛素结晶。1 0 辩发酵罐发酵，s p - p i p 表达量为2 5 0 m g l ，纯化后得到 8 6 m g 的纯爿r p o 在他们的谶一步报道中，表嘲p 3 9 的外源基因拷贝数为6 - 8 。在 1 6 舞发簿罐孛，按5 舞熬装液量，烈p 表达爨逸l 。5 9 l e 3 0 l 。 n o v o 的研究人员戮】麓鑫报道了骧岛素琢程肇券酵母秘酿滔酵母审表达豹情况， 他们用毕赤酵母g s l l 5 精株，结合载体p p i c 3 5 k ；酿酒酵母m t 6 6 3 菌株，结合载 体c t o p 。用、t a 3 9 、t a 7 1 、l a l 9 、t a 5 7 莉导肤以及不同长度的间隔序列在两 种系绫中同时构建重组质靛，经转伍获得相艘的萤栋。对各自静液这情况包括表 达与孬、表运蛋鑫静分予爨逶行了溅定，毽没蠢甥确戆往劣结论。嚣王燕等【2 霹黧 明确表示毕赤酵母的表达水平明照优于她 j 此前研究过的s c e m 订 列在两 种系绫中同时构建重组质靛，经转伍获得相艘的萤栋。对各自静液这情况包括表 达与孬、表运蛋鑫静分予爨逶行了溅定，毽没蠢甥确戆往劣结论。嚣王燕等【2 霹黧 明确表示毕赤酵母的表达水平明照优于她 j 此前研究过的s cem订siae。 北京化工大学硕士学位论文 1 6 1 巴斯德毕赤酵母表达系统的优点 巴斯德毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ，p p ) 表达系统是近几年来发展起来的较为完 善的，被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。该系统有许多优点： p p 的a o x i ( 乙醇氧化酶) 启动子具有强诱导性和强启动性，适用于外源基因的高水 平诱导表达；p p 作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行加工和翻译后修饰，从 而使表达出的蛋白具有生物活性；p p 中表达的糖蛋白的糖链长度为8 - 1 4 个甘露糖， 而酿酒酵母中表达的糖蛋白糖链中的甘露糖多达5 5 0 个，且其分泌的糖蛋白的核 心寡糖具有终端a - i ，3 糖甘联结，使其糖蛋白的抗原性明显增强，p p 分泌的糖蛋白 糖基化位点与哺乳类细胞相同，免疫原性较低，更利于临床应用【3 2 】；p p 生长快， 营养要求低，所需的盐、微量元素、生物素和碳源都较易得到且廉价，具有强烈 的好氧生长偏爱性，可高密度发酵，这均有利于工业放大生产：p d 中表达的蛋白 既可存在细胞内，也可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，有利于分离和纯化。 至今已有3 0 0 多种外源蛋白在该系统中成功表达，许多蛋白的表达量可达到g ，l 以上 水平【3 3 】。表1 2 列出了毕赤酵母高效表达外源基因的实例。 表1 - 2 巴斯德毕券酵母高教表达外源基因的实饲 t a b l e1 - 2e x a m p l e sf o rh j g he x p r e s s i o no f h e t e r o i o g o u sg e n ei n p p a s t o v s _ - _ _ - _ - _ - _ _ _ _ - _ - _ _ - _ _ - _ - _ - _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ - 。一ii i - - - - - - - _ 。- - - _ _ _ - - _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - 一 外源蛋白表达水平表达方式 1 6 ，2 宿主菌 毕赤酵母表达宿主菌于8 0 年代初开发获得，大多应用宿主菌是通过对野生型 石油酵母y l1 4 3 0 进行突变改造丽来。在组氨酸脱氢酶基因( h i s 4 ) 处有一突变，用 于转化后筛选重组菌株。其它的一些营养缺陷宿主蘸或生物合成基因也可作为筛 选标记。 目前主要有3 种宿主菌，它们之间的区别在于a o x 一个或两个基因的缺失而 造成对甲醇利用能力高低豹不同。常用的是o s l l s o a i s 4 ) ，它含有a o x i 和a o x 2 基因，在含甲醇的培养基上以野生型速率生长。k m 7 1 宿主菌的a o x l 已被酿酒 酵母的a r g 4 所代替，因此，此菌株只有依靠a o x 2 基因合成a o x ，在甲酵中低 一1 2 一 北京化工大学硕士学位论文 速度生长。m c l 0 0 - 3 宿主菌静蘸个a o x 基霞都被去豫翊，不能在含甲醇的墙养基 上生长。对上述宿主菌进行改遗，得到的衍生宿主菌已达十几种。 此外，为增加分泌蛋白的稳定性，避免被宿主鬣白酶降解，开发了一类蛋白 酶缺陷型薄棣，如s m d l 6 8 ( h i s 4 p e p 4 ) 、s m d l l 6 5 ( h i s 4p r b o 、s m d l l 6 3 ( h i s 4p e p 4 p r b ) ，p e p 4 季羹p r b l 分臻表示编璐蛋自酶a 帮蛋蠢酶狂豹基因袭隧3 s 】。 表l o 常见的毕赤酵母表达麓株 t a b l e1 - 3h o s t so f p i c h i a p a s t o r 妇 菌株基因溅表现型 y - 1 1 4 3 0 w i l dt y p e g s i l 5h i s 4m u t + h i s k m 7 1 a o x l a ：s a r g 4 弑b 8h i s h i s 4a r 9 4 m c l 0 0 2 3a o x la a ：s a r g 4m u t - h i s - a o x 2 a ：p h i s 4 s m d l1 6 8h i s 4a r 9 4 m u t + h i s ，p r o t e a s e 2 d e f i e i e n t p e p 4 h i s 4 s m d l l 6 5 p r b lh i s 4m 1 r * h i s ，p r o t e a s e 2 d e f i e i e m s m d l l 6 3 p e p 4p r b lh i s 4 m e fh i s 。w o t e a s e 2 d e f i c i e m 1 6 3 表达载体、 巴斯德毕赤酵母表达载体戗括自我复制型的游离载体和整合型载体，以整合 型载体为主。常见的攘合型载体又分为表达胞内鬣翔和分泌蛋白两类，常见载体 熨于表1 4 。表达载髂一般由嬲旗予、终丘予、选糖橼记、报告基因、笺铡起点等 元俸缀戒，辩分泌垄l 载体还嚣豢信号歇序列。 表1 - 4 毕券酵母常见衰_ 逡躐体 t a b l e1 - 4v e c t o r so f p t c h i a t 懈t o r l s 载体选择标记特征 胞p a 0 8 1 5 h i s 4 在b a m h i 和b g ti i 闷产生多拷贝的裘达缀件 p p i c 3 k h i s 4a n dk 7 a 藿e ( 3 4 1 8 8 选禅多拷受予 雨p p i c z掰m c s ；z e o c i n a 选撵多拷受子；融合， 滚蛋白形 成h i s 6 和m y e 表原标记 型p h w 0 1 0 h i s 4 组成型g a p 扁渤子 p g a p z b i d组成型g a p 扁幼子；m c $ ；z e o e i n “选择多拷 贝子融合外涌缀自形成h i s 6 和m y c 袭原标记 胞p p i c 9 kh i s 4a n dk a f f a o x t p 融套因子的蓠导获序列f8 - f a c t o r ) ； x h o l 蔫单一) 、e e o r l ，n o t t ，a w l i ，s n a b i 位点# g 4 1 8 8 b l e r a o x l p 融合n f a c t o r ；m c s ；z e o c h 产筛选多 拷贝子；融合外源蛋白形成h i s 6 和m y c 表原标 记 1 3 一 北京化工大学硕士学位论文 注：h i s 4 ：组胺酸脱氢酶基因；k ：卡那霉素族抗性基因；b l e r ：博来霉素族抗性基因。 巴斯德毕赤酵母表达最常用的启动子为乙醇氧化酶a o x l ，a o ) ( 2 启动子是甲 醇诱导型启动子。如果外源蛋白不能表达或表达量过低，可以选择其他强启动子 进行表达。p g a _ p ( 三磷酸甘油醛脱氢酶启动予) 是一种组成型启动子。使p g a p 在 发酵时不需要甲醇诱导，不需更换碳源，工艺简单，而且产量更高，所以成为替 代p a o x l 的最强有力的启动子f 3 6 1 。 对于一个原本就不能分泌的蛋白来说，采用分泌方式生产是非常困难甚至是 不可能的。但为了下游工程处理的方便，外源蛋白的生产应尽量考虑采用分泌表 达的方式。有些情况下外源蛋白自身的信号肽就足够了。如果不能利用自身信号 肽，那么酿酒酵母转换酶或n 配对因子( a m f ) 的前导序列可以非常有效地引导体积 稍小的产物出胞【矧。一般情况下，应用酵母特有的分泌信号表达外源基因获得成 功的可能性大。目前所使用的信号肽包括某些外源蛋白自身的天然信号肽、酿酒 酵母a - 交配因子( a - m f ) 信号肽序列和蔗糖酶基因s u c 2 信号肽序列、酸性磷酸酶基 因p h o i 的信号肽序列、间质金属蛋白酶圆伽p ) 问质金属蛋白酶组织抑制剂信号肽 序列。其中，a - m f 信号肽使用最广。 1 6 4 转化方法 毕赤酵母转化方法有4 种，如表1 5 所示但5 1 。最常用的是电转化法和原生质 体法，其中电转化法最为方便，转化效率最高，最容易产生多拷贝整合。由于原 生质体法必须首先制各去除细胞壁的原生质体细胞以利于d n a 进入，然后细胞再 生细胞壁，产生转化体，而z e o c i n r 抑制细胞壁的形成，导致不能产生转化体。 因此利用z c o d n r 作为选择标记的载体 x j l 衷纯工大学殒士学缱论文 融斯德毕赤酵母表达外源蛋白产量很商，如破伤风毒素徽白的产量高达 1 2 9 l 删，这在已知的表达系统中是十分罕见的。虽然已有许多蛋白在巴斯德毕赤 酵母中实现了高效表达，健仍有一些蛋白表达爨褶对较低，如a f p 谯摇瓶中表达 薅羧糍窳挚不超过s m g 曩【揪，多瘗痰毒大零揍藤疑蠢o 。5 爨0 4 稍，嚣珏表嚣蕤 蛋自旗至不能表达刚。此外，酵母表达系统豹局限性还在于分泌褒达产物的刁i 均 一性，如信号肽加工不完全，其表达的外源基阕产物比设计的多几个氨基酸残基， 这可能摄酵母自身调节机制对外源基因高表达的应答反应。所以，对外源蛋自在 巴戴德肇泰酵母中赢效表达的策略懿分柝礤究缀蠢意义。 鏊函裁量、整合整点、m r n a 5 帮3 菲翻译嚣、e d n a 静a t 禽量、黧译起始 区和储母肽等因素都是影响毕赤酵母表达外源骚白的上游因素，遮燃因素跟外源 基因的设计有关，在这里仪举例简单阐述。如外源基因本身的4 种核瞢酸的组成 对基趿的表达起重要作用。谗多商a + t 含量鲍黎因通常会出于提前终止丽不能蠢 羧转蒙，共骞每裂越鄹澎撇 x 北京化工大学硕士学位论文 两点注定了毕赤酵母具有可用于高密度发酵的巨大潜力4 4 1 。但毕赤酵母表达不同 的外源蛋白的表达水平相差很大，这种外源蛋白表达的差异，一方面是由于外源 基因本身的特性所致，另一方面发酵条件也对表达量起了极其重要的作用。发酵 条件包括培养基成分、温度、p h 值、溶氧、甲醇的流加及其他发酵工艺上的控制。 1 7 1 培养基 培养基的组成、配比、缓冲能力、粘度、消毒是否易彻底、消毒后营养破坏 程度及原料中杂质的含量都对菌体生长和产物合成有影响。但目前还不能完全从 生化反应的基本原理来推断和计算出适合某一菌种的培养基配方【4 5 】。目前还只能 在生物化学，细胞生物学等的基本理论指导下，参照前人所使用的较适合于莱一 类菌种的经验配方，再结合所用菌种和产品的特性，采用摇瓶、玻璃罐等小型发 酵设备，对碳源、氮源、无机盐等因素进行逐个单因子试验，观察这些因子对菌 体生长和产物合成量的影响。最后再综合考虑各因素的影响，得到一个比较适合 本菌种的生产配方，以求得到高产。为了节省试验时间，可考虑用“正交试验设 计”等数学方法来确定培养基的组成和浓度，它可以通过比较少的试验次数，得 到比较满意的试验结果。另外还可以通过方差分析，了解哪个因素影响较大，然 后对其进行重点优化考虑。 在考虑培养基总体要求时，要注意一些问题。第一，考虑碳源、氮源时要注 意快速利用的碳( 氮) 源和慢速利用的碳( 氮) 源的相互配合，发挥各自的优势。 第二，选用适当的碳氮比。培养基中碳氮比的影响极为明显。氮源过多，会使菌 体生长过于旺盛，p h 偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少， 从而影响产量；碳源过多，则容易形成较低的p h ；若碳源不足，易引起菌体衰老 和自溶。另外，碳氮比不当还会影响菌体按比例地吸收营养物质，直接影响菌体 的生长和产物的合成。第三，要注意生理酸，碱性盐和p h 缓冲剂的加入和搭配。 这是根据该菌种在现有工艺设备条件下其生长和合成产物时p h 的变化情况，娃及 最适p h 的控制范围等，综合考虑选用什么生理酸碱性物质及其用量，从而保证在 整个发酵过程中口h 都能维持在最佳状态。 1 7 2 温度 温度对菌体的生长和发酵的影响是各种因素综合表现的结果。温度对毕赤酵 母发酵产物的活性、发酵液的物理性质( 溶解氧量、基质的分解吸收速率等) 及 生物合成方向等都有影响。从酶动力学角度看，温度升高，反应速率加大，生长 1 6 ， 北京化工大学硕士学位论文 长代谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大， 溶解氧的浓度过高或过低都会影响酵母的代谢，使后