（发酵工程专业论文）葡萄糖酸钠高产菌的筛选及其发酵动力学研究.pdf

j 4 、 i l l l l liqiii i i l lilli lli iii 1 1 11111111 y 17 1 4 6 5 8 at h e s i ss u b m i t t e df o rt h ea p p l i c a t i o no f t h em a s t e r sd e g r e eo fe n g i n e e r i n g s c r e e n i n go f s o d i u mg l u c o n a t e h i g hp r o d u c i n gs t r a i na n ds t u d i e s o nl t sf e r m e n t a t i o nk i n e t i c s c a n d i d a t e ： j i a n g f e i f e i f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g p r o f e s s o rw a n gr u i m i n g s h a n d o n gi n s t i t u t eo fl i g h tl n d u s t r y , j i n a n ，c h i n a 2 6 m a y , 2 0 1 0 t 学位论文独创性声明 本人声明，所呈交的学位论文系在导师指导下本人独立完成的研究成果。文中 引用他人的成果，均已做出明确标注或得到许叮。论文内容未包含法律意义上已 属于他人的任何形式的研究成果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成 果，与我一同二 作的同志对本研究所做的任何贞献均已在论文中作了明确的说明 并表示谢意。 论文作者签名： f i l l ：碰! ! 年上月丛同 学位论文知识产权权属声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属山东轻工业 学院。山东轻工、i k 学院享有以任何方式发表、复制、公丌阅览、借阅以及申请专 利等权利，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或成果时，署名 单位仍然为山东轻工业学院。 论文作者签名： 导师签名： 同期：2 翌里年月- = 丛r 日期：迎年月j 磊 山东轻丁业学院硕f j 学位论文 目录 摘要i a b s t r a c t li l 符号说明v 第一章前言1 1 1 引言1 1 2 葡萄糖酸钠的用途2 1 2 1 建筑工、l k 方面2 1 2 2 食品及其它方面2 1 3 葡萄糖酸理化性质3 1 4 葡萄糖酸钠的生产方法4 1 4 1 生物发酵法4 1 4 2 均桐化学氧化法5 1 4 3 电解氧化法5 1 4 4 多相催化氧化法5 1 5 葡萄糖酸钠产生菌的育种思路6 1 5 1 葡萄糖酸钠的生物合成途径6 1 5 2 产葡萄糖酸钠黑曲霉应具备的生化特征7 1 5 3 葡萄糖酸钠高产菌的育种思路7 1 5 3 1 增加培养基中初始葡萄糖浓度一7 1 5 3 2 解除菌体自身的反馈抑制7 1 5 3 3 切断进一步代谢途径7 1 6 黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠条件控制7 1 6 1 营养条件的控制8 1 6 1 1 碳源和氮源的影响8 1 6 1 2 无机盐的影响8 1 6 2 环境条件的控制9 1 6 2 1 温度的影响9 1 6 2 2p h 、溶氧的影响9 1 7 菌种保藏1 0 1 8 论文立题背景及主要研究内容1 0 1 8 1 立题背景10 日录 1 8 2 主要研究内容1 1 1 9 论文撰写说明1 1 第二章高产葡萄糖酸钠菌种选育13 2 1 引言13 2 2 实验材料1 4 2 2 1 土样1 4 2 2 2 主要仪器1 4 2 2 3 主要试剂1 4 2 2 4 培养基1 5 2 3 实验方法1 5 2 3 1 土样菌悬液的制备1 5 2 3 2 菌种活化筛选( 初筛一) 1 5 2 3 3 菌种平板筛选( 初筛二) 1 6 2 3 4 摇瓶产酸筛选( 复筛) 1 6 2 3 4 1 复筛方法1 6 2 3 4 2 血球计数板计数方法l7 2 3 4 3 发酵液中总糖及还原糖含量的测定1 7 2 3 4 4 葡萄糖酸钠定性方法一纸层析法2 0 2 3 4 5 葡萄糖酸钠定量方法2 1 2 4 结果与讨论2 3 2 4 1 初筛结果与讨论2 3 2 4 2 初筛二结果与讨论2 4 2 4 3 摇瓶结果与讨论2 4 2 4 3 1 发酵液葡萄糖酸钠定性2 4 2 4 3 2 分光光度法标准曲线的制作2 5 2 4 3 3 测葡萄糖标准曲线的制作2 50 2 4 3 4 摇瓶复筛结果2 6 2 5 本章小结2 7 第三章高产葡萄糖酸钠菌株摇瓶分批发酵条件研究2 9 3 1 引言2 9 3 2 实验材料2 9 3 2 1 菌种2 9 3 2 2 主要仪器2 9 3 2 3 主要试剂2 9 2 山东轻i j 业学院硕 ：学位论文 3 2 4 培养基3 0 3 3 实验方法3 0 3 3 1 种子培养方法3 0 3 3 2 摇瓶发酵培养方法3 0 3 3 3 寡核苷酸编目分析3 0 3 3 4 菌丝浓度的测定3l 3 3 5 葡萄糖氧化酶活力测定3l 3 3 5 1 酸碱滴定法3 2 3 3 5 2 氧化还原滴定法3 2 3 4 结果与讨论3 3 3 4 1 种子培养条件优化研究3 3 3 4 1 1 正交实验法优化种子培养基3 3 3 4 1 2 种子培养时问确定3 5 3 4 1 3 种子培养基装料最的确定3 6 3 4 1 4 种子培养温度的确定3 6 3 4 1 5 种子接种量的确定3 7 3 4 1 6 种子摇瓶转速的确定3 8 3 4 2 发酵培养基优化研究3 9 3 4 2 1 发酵培养基中各组分意义3 9 3 4 2 2 正交实验结果讨论4 0 3 4 2 3 发酵培养基初糖浓度的单因素实验4 l 3 4 3 最优菌种的确定4 3 3 4 3 1 最优菌株的确定4 3 3 4 3 2q y - 6 9 菌株的鉴定结果4 3 3 5 本章小结4 6 第四章5 l 发酵罐分批发酵葡萄糖酸钠条件优化研究4 7 4 1 引一言：4 7 4 2 实验材料4 8 4 2 1 供试菌种4 8 4 2 2 主要仪器4 8 4 2 3 主要试剂4 8 4 2 4 培养基4 8 4 35 l 发酵罐分批发酵实验方法4 8 4 4 结果与讨论4 8 日录 4 4 15 l 发酵培养条件优化研究4 8 4 4 1 1 搅拌转速和通气量对产量的影响4 8 4 4 1 2 发酵p h 值对产量的影响5 0 4 4 1 3 发酵温度对葡萄糖酸钠产量的影响5 1 4 4 2 发酵培养条件优化结果5 2 4 4 2 1 最优条件下的发酵过程曲线5 2 4 4 2 2 发酵液与分析纯样品的液相图谱比对5 2 4 4 35 l 发酵罐发酵生产葡萄糖酸钠过程分析一5 2 4 4 3 15 l 发酵罐以葡萄糖为碳源的发酵糖酸得率计算5 4 4 4 3 2 葡萄糖睃钠5 l 发酵罐分批发酵生产率计算5 4 4 5 本章小结5 4 第五章5 l 发酵罐分批发酵葡萄糖酸钠动力学研究5 7 5 1 引言5 7 5 2 分批发酵动力学建模分析一5 7 5 2 1 动力学模型的建立5 7 5 2 2 动力学模型的选择5 7 5 2 2 1 菌体生长动力学模型韵建立5 8 5 2 2 2 葡萄糖酸钠产物生成动力学模型5 9 5 2 2 3 底物消耗动力学6 0 5 2 3 模型拟合分析6 0 5 2 3 1 模型参数求解6 1 5 2 3 2 拟合曲线分析6 l 5 2 3 3 模型拟合值与实验值对比分析6 l 5 3 本章小结一6 4 致谢6 9 硕士期间发表论文7 1 4 山东轻t 业学院硕i j 学位论文 摘要 本论文根据代谢控制发酵和有机酸发酵工艺学分析理论，研究了葡萄糖酸钠 高产荫筛选及其发酵条件和发酵动力学。主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 应用“纸层析法”对发酵液中葡萄糖酸钠进行了定性分析研究，用“分光 光度法”进行了定量分析，确定了葡萄糖酸钠定性和定最测定条件和研究方法。 ( 2 ) 以果园： 壤为出发土样，经过耐高糖平板筛选、单菌落分离和摇瓶复筛，筛 选出1 0 株具有潜在i , j k 价值的黑曲霉特征荫株。在培养基未经优化的发酵条件下， 平均葡萄糖酸钠质鼍得率为9 8 9 6 ，糖酸物质的量转化率为8 1 6 6 ，生产强度为 3 6 9g l h 。 ( 3 ) 应用j 下交试验对种子培养基和发酵培养基配比进行了优化，并用蕾冈素实验 对种子培养条件进行了优化，由此确定了最优种子培养基、最优发酵培养基和最 优种子培养条件。 ( 4 ) 摇瓶发酵确定q y 一6 9 为最优高产菌株，应用寡核苷酸编f 1 榆测确定其为黑曲 霉。 ( 5 ) 通过5 l 发酵罐培养条件的单因素实验，对发酵条件进行优化，确定发酵最 优培养条件。 ( 6 ) 应用m a t l a b 软件得到三个发酵动力学模型： d x ：0 3 8 7 ( 1 一姜) x ；d z ：1 3 0 8 x + 1 0 8 4 一d x ；一d s ：1 3 7 7d x + 0 7 5 5 6 d p d t 2 o ld td t 。d td td t 本模型能够较好的反映q y - 6 9 在5 l 发酵罐中的分批发酵情况。 ( 7 ) 最优培养条件下，对5 l 发酵罐分批发酵葡萄糖酸钠的过程进行了评测。计 算得到葡萄糖酸钠质量得率y 叫为11 5 3 2 ，糖酸物质的量转化率为9 5 1 5 以及尘 产强度1 2 2 2 9 l h 一。 本论文在葡萄糖酸钠发酵研究领域的创新之处在于，成功的应用m a t l a b 软件 对葡萄糖酸钠分批发酵过程进行数掘拟合，建立了菌体生长、产物合成和底物消 耗的动力学模型，拟合模型较好的反映出葡萄糖酸钠在5 l 发酵罐中分批发酵过程， 对工业化生产葡萄糖酸钠提供了理论依据，具有较强的指导意义。 关键词：葡萄糖酸钠；发酵：动力学：菌种筛选 摘受 i i 门 。 一一_ 一一一一_ 堂塑塑型塑坠 a b s t r a c t e n p o i e n t i a li n d u s t r i a lv a l u a b l es t r a i n s o w n i n gc h a r a c t 嘶s t i c s 。fa s p e 删u s n ：g 虬w e r e s c r e e n e d 仔o m m e s t a n i n g 。r c h a r ds 。i 1 s a m p l e sb yp l a t es c r e e n i n ；。i i 曲 g j u c o s e r e s l s t a n t , i s o l a t i o n 。fs i n g l ec o l o n ya n d s e c 。n d s c r e e n i n g 。fs h a k i n gc 。u l t u r e 。i n t h ，e m e d i u mw i t h o u t t h e 。p r i m u mc o n d i t io n s ，t h e a v e r a g ey i e i dq u a l i t y 。fs 。i i d t l i u , m 1 1 1 竺呦姐t er e a c h e d 9 8 9 6 c o n v 吲0 nr a t eo f a m o u n t - 哦u b s t a n c eo f g l u c o n i c a c i d t o 州吣e 1e a c n 印o a n d t h ep r o d u c t i o n s t r e n g t hr e a c h e d3 6 9 g l - j h lu 儿h e ：；e e d m e d i u m 如df e r m e n t a t i o nm e d i u mw e r e 。p t i m i z e d b y 。n h 。g 。n a jt e s t 孤! t h e ，s e e d c u l t u r ec o 耐i t i o n sw e 。p t i m i z e d b ys i n g l ef a c t 。re x p 二m e n t 焉：泛 竺m 1 8 e e d c u l t u r em e 击u m t h e o p t i m a lf e m e n t a t i 。nm e d i u ma n d t h e o p t i m a l s e e d ( 4 ) t h es t r a i n 。f q y - 6 9w a s d e t e m i n e d 硒r t h e 。p t i l n a ly i e l d s t r a i nb ys h a k en a s k c u l t u r e 。 。 ix ( 5 ) t h ef e r m e n t a t i o n c o n d i t j 。n sw e r e 。p t 岫e db ys i n g l e f a c t 。r e x p e r i m e n t s f ? 们n 1 攀吖5 lf e r m e n t o ra n d t h eo p t i l n a l c u l t u r ec 。枷。n s 。ff e r m e n t a t i o nw a u s i d e t e r m i n e d ( 6 ) t h r e e f e n n e n t a t i 。nl ( i n e t i c sm 。d e l sw e r e g o t t e nb yt h ea p p i i c a t i 。n 。fm a t l a b s o i t w a r e ( 7 ) t h eb a t c h e n t a t i o np r o c e s s 。fs o d i u m g l u c o n a t ei nt h e5 l e n t 。rw a s i i i c a k 吣 一 眦 w 髑嘴? m d 曲 觚 鲫n m 矸 订 伽洫 吼 删 础 g 阳b 曲砌 m i 刍 斌 m 暑 双 鼯 击 c 瞅 耐 c u 饥 的南 n ；l俄衙撕 西 湖 撇 性呻 k 岫弧硒 o ”d 8 e g n 0 恤 吧缸 陀 t i l l 0川 n 门 0 n m 如的胁薹胝 g m 踟 增鲥 专； 咖兰= a 钮 妒胤m 曲小觚竺 d 前 m w m 毗m 呖 伧 卸 如 删砌 枷 缅m 咖 ， 巾司= 箸拳 船计 哪批 一m 咖 k 砒h曲眦帅甜裟罴 d 町h：砉抓呻m s w 甜 舶 砌m 黜 l 1 ( s 蓍甜 黜 r 1 r o 盯 m h t x ， j e k 杈 揪 嘣砌 6 m n + o 争：喜 ” o r i 呈 = m s一0 d型幽蚰 ； 眦缺一出_ 蚕 4 玎 韶 地 ，l r m h x 曲 您 缸 3 、 k 忙 l m 胁 ； 陀 x 盯 、j tx 一肼曲 ：z觚 兀 d 勰 甜 n m l j j 沦 的等： a b s t r a c t t e s t e du n d e rt h eo p t i m a lc u l t u r ec o n d i t i o n b yc a l c u l a t e d ，t h ey i e l do fs o d i u mg l u c o n a t e r e a c h e d115 3 2 ，c o n v e r s i o nr a t eo fa m o u n t o f - s u b s t a n c eo fg l u c o n i ca c i dt og l u c o s e r e a c h e d9 5 15 a n dt h ep r o d u c t i o ns t r e n g t hr e a c h e d1 2 2 2g l 1 h 一 t h ei n n o v a t i o no ft h i sd i s s e r t a t i o ni nt h er e s e a r c hf i e l do fs o d i u mg l u c o n a t e f e r m e n t a t i o ni st h a tm a t l a bs o f t w a r ei ss u c c e s s f u l l ya p p l i e dt oc o m p l e t ed a t af i t t i n g f o rt h eb a t c hf e r m e n t a t i o np r o c e s so fs o d i u mg l u c o n a t e t h ek i n e t i cm o d e l sh a v eb e e n c o n s t r u c t e dw h i c hc o u l dr e f l e c tt h er e g u l a r i t yo fg r o w t h ，p r o d u c tf o r m a t i o na n ds u b s t r a t e c o n s u m p t i o n t h e s em o d e l sc a nb e t t e rr e f l e c tt h eb a t c hf e r m e n t a t i o np r o c e s so fs o d i u m g l u c o n a t ei n t h e5lf e r m e n t o r t h e s er e s u l t sc o u l dp r o v i d eat h e o r e t i c a lb a s i sf o rt h e i n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f s o d i u mg l u c o n a t ea n dh a v es t r o n gg u i d a n c e k e yw o r d s ：s o d i u mg l u c o n a t e ，f e r m e n t a t i o n ，d y n a m i c s ，s e l e c t i o no fb a c t e r i a 山东轻t 业学院侦i j 学位论文 二= 二二一 符号说明 p ：产物浓度( g l ) t ：时间( h ) x 。：菌体生长最大浓度( g l ) k 1 ，k 2 - 待定系数 b ：与菌体浓度相关的产物生成系数 y 。s ：产物对基质的得率系数 v s ：基质浓度( g l ) x ：菌体干重( g l ) u 。：菌体最大比生长速率 q ：与菌体生长相关的产物生成系数 m ：菌体维持系数( h 一1 ) 符0 说明 山东轻t 业学院硕 j 学位论文 第一章前言 1 1 引言 1 8 8 0 年，b o u t r o u x 最先发现利用醋化醋杆菌( 彳c p 幻施c 研a c e d ) 能够发酵葡 萄糖产生一种不挥发酸类物质，后来被确定为葡萄糖酸。此后相继有研究者报道 其他数种细菌也有氧化葡萄糖成葡萄糖酸或酮基葡萄糖酸的能力。在上世纪三十 年代以前，生产葡萄糖酸钠的主要方法足细菌发酵法。1 9 2 2 年，m o l l i a r d 发现霉 菌也有氧化葡萄糖生产葡萄糖酸的能力，随后人们发现黑曲霉、米曲霉、文民曲 霉和青霉都有这种氧化作用。1 9 2 4 年b e r n h a g e r 发现采用中和生成酸的方法，黑曲 霉能高效地将葡萄糖转化成葡糖酸，并且中和过程添加碳酸钙效果最好。在发酵 温度较低、限制发酵氮源的情况下，生成的葡萄糖酸几乎能够达到理论产率。1 9 3 3 年，c u r r i e 等用青霉或曲霉，采用现代通气搅拌深层发酵技术，发酵4 8 - - 6 0 h ，转 化率达到9 0 ，并由此获得专利。随后若干年问，人们在，e 产工艺方面的进展部是 围绕增j j i l 糖浓度、提高转化率和缩短发酵时问等方法。上世纪四十年代，有研究 者发现添加硼酸盐可以防止葡萄糖酸钙沉淀，f h 是这种方法会增加产品提取难度， 成本也会增加，故不能应用于工业生产。1 9 5 2 年b i o m 等发明了采用流加n a 0 h ， 维持p 值在6 5 以上的方法生产葡糖酸钠，使葡糖酸对糖的转化率达9 5 以上， 发酵时问缩短到2 0 h 之内，这种工艺形成了现代工业深层发酵的基础。1 9 1 7 年， z i f f e r 等发表的专利方法采用了流加糖和部分中和的工艺，竟使总糖浓度提高到 6 0 0 9 l 。 也有其他学者对葡萄糖酸的其他生产方法进行过研究，1 9 3 2 年，i s b e l l 等报 道了采用化学氧化法生产葡萄糖的方法。上世纪丘f 。年代起，也有学者研究在酶 或其他催化剂作用下，用空气、氧气或是过氧化氢来氧化葡萄糖生产葡萄糖酸， 包括固定化细胞和固定化酶的研究。许多学者预计，采用葡萄糖氧化酶作催化剂， 用空气氧化的方法是今后研究的大方向，也有学者认为今后可能朝固定化细胞或 固定化酶方向发展，但是由于葡萄糖酸发酵的耗氧量极大，不但价格高，而且对 葡萄糖氧化酶有一定毒性，因此要在经济上胜过常规发酵法还有较大差距，发酵 法生产葡萄糖仍是现代最有竞争力的，生产方法。 我国在1 9 5 5 年由轻工业部上海：1 二业试验所试制葡糖酸成功，选出了黑曲霉8 7 号菌种，不久即在山东投入生产n 1 。我国葡萄糖酸衍生物丌发应用取得了显著的成 果，产品的发展越来越快，尤其足近几年来，步子迈得越来越大，大量产品走出 了国门。目日矿，国内葡萄糖酸衍生物已从过去比较单一的品种发展到现在的多品 种，规模已从过去比较低的年产量上千吨发展到现在2 6 万吨的水平，工艺技术的 第一章前高 开发与创新，使我国现在某些企业的产品质量已能达到固际水平，而且万吨规模 的厂家已达1 0 家以上，主要分布在湖北、河南、浙江、山东、广东、天津等地。 1 2 葡萄糖酸钠的用途 葡萄糖酸衍生物产品在医药、食品、化：1 二建筑等行业得到了比较广泛的应用 1 2 1 建筑工业方面 随着我国城市化进程的加快，混凝土利用率越来越高，增加混凝土的减水作 用与缓凝作用势在必行，相对其他化：i ：原料，如顺丁烯二酸衍生共聚物、芳香族 氨基磺酸系高分子化合物、木质素衍生物与烷基芳香磺酸盐等，葡萄糖酸钠在减 水缓凝效果上具有明显优势h 。 葡萄糖酸钠是多羧酸系高性能减水剂中一类，只有一个羧基，其减水率、搅拌 混凝土含气量、粘聚性、保水性、坍落度保持性和水泥强度贡献率等指标均优于 其它减水剂瞄1 。在w c 不变的情况下，加入葡萄糖酸钠能增进混凝土的和易性，这 时葡萄糖酸钠是起增塑刺的作用，有关文献表明，在葡萄糖酸钠掺量在0 1 以下 时，其改进和易性的程度与掺量成j 下比；掺量为0 1 时，减水率为1 0 ，能够有效 增加混凝土强度：同时能够降低水泥含量，作为水泥减水剂使用哺3 。 葡萄糖酸钠作为缓凝剂能够显著延缓混凝土的初凝和终凝时间，有报道n 1 说用 量在0 1 5 以下时，初凝时l 日j 的对数与掺量成i f 比例关系，这就使得工作时i 日j 大幅 增加，尤其是在夏季和需要放置的时间较长时，可以延长工作时i 日j 从几个小时到 几天而对强度影响f i 大。 1 2 2 食品及其它方面 ( 1 ) 葡萄糖酸钠的结构特点和味质上的优点为：可取代食盐的加工功能； 有改善呈味的作用；有屏蔽异味的作用；可作调整p h 用；有整合作用； 分散作用等。具有多种可供食品加工利刚的特性功能。 2 ) 用于医药方面1 ：调节人体内酸碱平衡，以恢复神经i f 常作用，钠对维持 细胞外渗透压和容量，调节酸碱平衡，发挥神经肌肉的正常功能具有重要的作用。 本品可有效地防止低纳综合症的发生。基r 同样的目的，用于食品添加剂。 ( 3 ) 具有优异的缓蚀阻垢作用呻1 ：被广泛应用于水质稳定剂，其优异性表现在： 具有明显的协调效应，适用于钼、硅、磷、钨、亚硝酸盐等各种配方；缓蚀 率随温度升高而增加；阻垢能力强，对钙、镁、铁盐具有很强的络合能力；作 为循环冷却水缓蚀阻垢剂达到灭公害也是其一大优点。 ( 4 ) 用做钢铁表面清洗剂n 引：钢铁表面如需要镀钵、镀铬、镀锡、镀镍以适应 特殊用途时，其钢坯表面均需经过严格清洗，使镀层物与钢铁表面牢固结合，这 时候其清洗药剂中添加葡萄糖酸钠将会达到十分理想的效果。这一点已被国际上 2 山东轻t 业学院颁i ：学位论文 制造马口铁的一些火公司所应用证实。 ( 5 ) 作玻璃瓶争用清沈n - 用葡萄糖酸钠为主要配方的玻璃瓶专业清洗剂可改 善以下常见问题：去垢力不强，易堵塞洗瓶机的喷咀及管路；对瓶贴及瓶颈铁锈 去染力不理想；洗后微量残留物对食用安全性不理想( 如磷酸盐残留) ；洗涤水排 放成公害( 不能符合国家规定之标准) 。 1 3 葡萄糖酸理化性质 葡萄糖酸是一种有机弱酸，分子量1 9 6 1 6 ，在水溶液中能够电离出一个质子， 电离常数k a = 2 4 0 1 0 ，或p k a = 3 6 2 心1 。 葡萄糖酸在水溶液中存在以下动态平衡： 、 h 弋c 一 o 葡萄糖酸葡萄糖酸一6 一内酯 图1 1 3 葡萄糖酸和葡萄糖酸一6 一内酯在水中的动态平衡 从结构上看，葡糖酸是一种五羟基己酸，含有4 个不对称c 原子，整个分子 也是不对称的，冈此具有旋光性。纯葡萄糖酸比旋光度( a ) 2 。0 = - 6 7 。，熔点1 3 1 。 葡糖酸易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，3 0 叮以从水溶液中以针状结 晶析出，但晶体与母液的分离困难，而要在乙醇中彳易于分离，因此，工业级葡 糖酸一般制成5 0 浓缩液直接出售。葡糖酸在2 3 以f 易于带一个结晶水，从水 溶液中呈片状结晶析出( c 。h 。：0 7 h 2 0 ) ，分子量2 1 4 1 8 ，外观为白色片状晶体或白 色粉木。葡糖酸水溶液在温度3 0 - - - 7 0 之间，于过饱和情况下可以结晶出6 内酯， 常用结晶温度为3 6 5 0 。 葡萄糖酸钠分子式为c 。h 。o ：n a ，根据纯度不同，外观为白色、黄色至棕色粉 术，易溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，分子量2 1 8 1 4 ，2 0 以下易于从水溶 液中以椰花状结晶析出。”。工业用葡萄糖酸钠可以直接将发酵液过滤，浓缩，加品 种使晶体析出。 第一章前寺 1 4 葡萄糖酸钠的生产方法 葡萄糖酸钠常用的生产方法主要有生物发酵法、均相化学氧化法、电解氧化 法、多相催化氧化法。 1 4 1 生物发酵法 生物发酵法所用菌种包括真菌和细菌，另外还有同定化细胞发酵，较普遍采 用的方法是黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠2 | 。该方法卣先利用麸曲培养基培养种子， 种子接种7 2 h 后成熟，加入无菌生理盐水制成孢了悬浮液，加入无菌的初糖为2 5 0 3 0 0 9 l 的发酵培养基中，培养基中限制氮源和磷源，接种体积一般为1 0 ，发酵 过程开搅拌，通气，同时流加n a o h 溶液维持p h 6 0 6 5 ，温度维持3 5 ( 2 ，发酵 过程流加消泡剂。整个发酵过程大约需要2 5 h 石! 右，当残糖降到l g l 以下时呵以 下罐。发酵液经过滤浓缩后加入品种结晶，将将晶体离心烘f 就得到葡萄糖酸钠 产品。 山东轻丁业学院硕l j 学位论文 产葡萄糖酸钠和葡萄糖酸钙的 ：艺流程。 生物发酵法是当日玎陶内生产葡萄糖酸钠最有竞争力的生产方法，其优点包括 发酵周期短、发酵过程易于控制、发酵液纯度高、产品易于提取、设备要求低等。 但是也存在无菌要求高、产品色泽不易控制的缺点。 1 4 2 均相化学氧化法 结晶葡萄糖加水溶解后加入催化剂，在适宜温度下滴加次氯酸钠溶液，通过 滴加离子膜液碱控制体系p h 值，促使反应平衡向生成葡萄糖酸钠的方向移动。其 工艺流程图如 葡萄糖溶液 次氯酸钠 一 一氧化反廊_ 过滤_浓缩_ 结晶一风干铲品 氢氧化钠一r 一 图1 3 均相化学氧化法流稃幽 当残糖降至预定浓度时过滤，浓缩反应液，由于氯化钠溶解度比葡萄糖酸钠 溶解度低，反应液会先析出氯化钠然后才是析出葡萄糖酸钠。这种次氯酸钠氧化 法具有转化率高、工艺过程简单、成本低的优点。但是中l 日j 步骤多，副产物多， 产物难于分离，因此存在诸多限制。 1 4 3 电解氧化法【1 3 】 电解氧化法是在电解槽中加入一定浓度的葡萄糖溶液，在特定电解质的参与 下，通过一定电流密度的恒电流电解。具体工艺参数跟电解质有关，电解完成后 将电解液浓缩结晶，即得葡萄糖酸钠晶体。 电解氧化法由于能耗过大，控制难度高，因此在工业化生产中极少采用。 1 4 4 多相催化氧化法 四口烧瓶中加入一定浓度的葡萄糖溶液，加入催化剂，恒温条件下向溶液中 通入空气，并不断滴加n a o h 溶液维持p h 值。反应完成后的溶液冷却后抽滤，同 时回收催化剂，滤液减j e 蒸馏浓缩后结晶，得到葡萄糖酸钠。 工艺流程图如下引： 该法工艺简单，反应易于控制，反应条件温和，葡萄糖转化率较高，故而在 工业上有所应用。但是缺点足催化剂在循环使用了一定次数后其效率会下降，使 转化率降低，反应时帕j 延长，增加生产成本，所以多相催化氧化法的关键就是催 化剂品质的商低。 第一章前言 压缩空气 钠l + j l 液j 葡萄糖酸衍生物的，| 产工艺技术路线有多种。目f i f ，因内有一定生产规模的 生产工艺技术路线主要是催化氧化法和生物发酵法生产工艺技术路线。与发酵法 相比，催化氧化法生产葡萄糖酸及其衍生物成本高，工艺技术不够成熟，存在技 术瓶颈，设备要求及操作要求严格，对工业化生产有一定阻碍作用。如果能够克 服工艺方面的瓶颈，如催化剂使用一定次数后效率下降等，将有叮能成为葡萄糖 酸发酵的主流趋势。生物发酵法凭借其生产工艺成熟，成本低，设备要求相对较 低，产率大的优点目前在国内筒萄糖酸生产中占据主导地位。 1 5 葡萄糖酸钠产生菌的育种思路 现有研究表明微，扣物利用葡萄糖合成葡萄糖酸钠的生物历程非常简单，中问 的反应步骤很少，调节机制也相当简单。 1 5 1 葡萄糖酸钠的生物合成途径 有人对细菌进行研究后认为n5 1 ，葡萄糖转化为葡糖酸是糖的醛基直接氧化为 羧基的结果。葡萄糖的自然存在方式主要是环式，但丌链的醛式也存在，两者可 以自发地互相转化，因此都可以通过醛式氧化成葡糖酸，真菌中的转化历程也相 当简单。首先出葡萄糖氧化酶催化，将葡萄糖氧化成葡糖酸一6 一内酯，后者可自 发水解成葡萄糖酸m 1 。生成的过氧化氢被真菌的过氧化氢酶分解，反应过程如下： 反应式表示7 叫： 葡萄糖+ f a d d 一葡萄糖酸一万一内酯+ f a d h ： d 一葡萄糖酸一万一内酯+ h 2 0 一d 一葡萄糖酸 总反应式： 葡萄糖+ 2 0 ：一d 一葡萄糖酸 6 i l j 东轻t 业学院硕i ：学位论文 c h 2 0 h 葡萄糖氧化酶 。h 7 弋 f a d f a d h 2 c h 2 0 h o 自发水解 葡萄糖 h 2 0 2 o zd 一葡萄糖酸占馏 图i 5 葡萄糖酸钠生成的反席过榉 1 5 2 产葡萄糖酸钠黑曲霉应具备的生化特征 根据葡萄糖酸的代谢调节途径可以的得出产葡萄糖酸钠黑曲霉应具备的生化 特征有： ( 1 ) 葡萄糖氧化酶活性高： ( 2 ) 切断进一步的代谢途径。 ( 3 ) 能利用高浓度葡萄糖，高效牛产葡萄糖酸钠。 1 5 3 葡萄糖酸钠高产菌的育种思路 1 5 3 - 1 增加培养基中初始葡萄糖浓度钔 培养基中初始葡萄糖浓度增加，如果葡萄糖氧化酶活性高，能够在短时f h j 高 转化率的将其转化为葡萄糖酸，就h 丁以提高设备等的利用率，减少生产成本，对 工业化，匕产意义重大。筛选菌种时町以通过高浓度葡萄糖来筛选耐高糖菌株。 1 5 3 2 解除菌体自身的反馈抑制 由代谢图可以看出，d 一葡萄糖一6 一内酯与d 一葡萄糖直接存在动念平衡，通过 流加碱液，不断中和产生的葡萄糖酸，使平衡不断向生成葡萄糖酸的方向进行。 1 5 3 3 切断进一步代谢途径 由葡糖酸的代谢途径可以看出，要大量积累葡萄糖酸，需切断或减弱葡萄糖 酸进一步向下代谢的途径，使j 累的葡萄糖酸不再消耗，y j 有可能实现葡萄糖酸 的积累1 。 1 6 黑曲霉发酵生产葡萄糖酸钠条件控制 提高葡萄糖酸钠生产菌株的产量不仅取决于代谢控制机制被解除和解除的程 度，发酵的外界环境对产量也有着蕈要影响。通过代谢途径方面的优化筛选后， 所选菌株已经具备了大量积累葡萄糖酸的潜能，但是要成功高产的得到葡萄糖酸 钠，还必须研究突变菌种发酵时的营养条件和培养条件。通常，发酵培养基的成 第一章前苦 份、p h 、培养温度、溶氧、搅拌等会明显的影响葡萄糖酸钠的产量呛。 1 6 1 营养条件的控制 发酵过程中碳源、氮源以及若干微量元素、维生素、会属离子等对发酵显著， 通过改变发酵培养基中的关键营养物质浓度，可以将菌种的最优发酵力充分表现 【2 1 o 1 6 1 1 碳源和氮源的影响 碳源是构成菌体和合成葡萄糖酸钠的碳架及能量来源。氮源足构成蔺体蛋白、 核酸等含氮物质的来源。实验窀常用碳源为葡萄糖，氮源则多种多样，尿素、磷 酸氨盐、玉米浆等。工业生产中多以淀粉为碳源，通过液化糖化成葡萄糖发酵， 产。 培养基中糖浓度对葡萄糖酸钠的发酵影响很大，在一定范围内，葡萄糖酸钠 的产量随糖浓度的增加而增加，并且据有关报道称瞳引，高浓度糖有诱导葡萄糖氧 化酶的作用。但糖浓度达到一定的限度后，糖浓度过高，出于渗透j 矗增大，对菌 体生长和发酵均不利，使黑曲霉对糖的转化率反而降低，同时培养基浓度太大， 氧溶解的阻力大，影响供氧效率，对发酵产酸不利。氮源主要用于合成荫体，所 以若是氮源过多，发酵过程中菌体量会大大增加，伴随着的呼吸作用增加，这些 都会消耗葡萄糖，减少葡萄糖酸钠的产量，并且菌体过多会增加溶氧和搅拌难度， 无谓浪费能耗，增加生产成本和设备磨损，对工业发酵不利。所以，综合束说， 在同等条件下，选择恰当的碳源和碳氮比对发酵意义重大。 1 6 1 2 无机盐的影响 无机盐是微7 l 物生命活动所不可缺少的物质，其功能33 包括是构成菌体的 组成成分可作为酶的组成部分是酶的激活剂或抑制剂调节培养基的渗透压 调节p h 值和氧化还原电位等。一般微生物所需要的无机盐为硫酸盐、磷酸盐和 含钾、钠、镁、铁的化合物。微生物对无机盐的需要量很少，但又缺一不可，它 的种类和含量对菌体生长和代谢产物的生成影响很大。 生长因子是类对微生物j 下常代谢必不可少却不能用简蕾的碳源或氮源自身 合成的有机物。在配置培养基时，一般不会加入纯的各种生长因子，通常采用加 入酵母膏、玉米浆、麦芽汁、豆饼水解液等起作用。 ( 1 ) 磷 磷主要以h ：p 0 ，一形式加入，是核酸、核蛋白等重要细胞物质的组成部分，又是 许多辅酶( 或辅基) ，高能磷酸键的组成部分，因此，磷在菌体，| 长、繁殖和代谢 活动中起着极其重要的作用，必须在培养基中加入一定量的磷酸箍，以保证菌体 j 下常生长。 山东轻t 业学院硕i ：学位论文 ( 2 ) 硫 硫是荫体细胞蛋白质的组成部分。硫常常以硫酸豁形式加入到培养基中。 ( 3 ) 镁、钟 m g n 足