（发酵工程专业论文）透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究.pdf

摘要 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ) 是一种具有生物相容性的高分子聚合物。由于特殊的生 理作用、独特的流变学特性和极强的持水保湿能力，透明质酸在化妆品工业、医学研 究、临床治疗等领域有广泛的应用。 目前，透明质酸的生产方法逐渐由动物组织提取法转向微生物发酵法。微生物发 酵法生产透明质酸具有不受原料资源限制、成本低、产量高、有较高的相对分子量、 分离纯化工艺简便、易于大规模生产等特点成为透明质酸生产的发展方向，因此开发 先进的微生物发酵法生产1 4 _ a 的技术就显得十分必要。 本文对微生物发酵法生产透明质酸进行了的探索，主要完成了以下几个方面的工 作，并得到了相关结论。 确定了摇瓶发酵培养基的适宜组成。通过5 0 0 毫升摇瓶水平的单因素试验和多因 素正交试验初步确定菌株发酵培养基的成分。即葡萄糖浓度4 0g l 、蛋白胨浓度1 0 g l 、酵母粉浓度1 0g l 、k 2 h p 0 4 浓度2g l 、m g s 0 4 7 h 2 0 浓度0 4 9 l 。 确定了菌株摇瓶发酵的适宜培养条件。绘制出种子培养基中菌体的生长曲线，取 1 4 h 为接种的适宜种龄，发酵培养基中的适宜装液量确定为3 0 n 1 1 5 0 0 1 ，产物h a 积累的最适温度为3 4 ，最适初始p h 值为7 4 。 确定了小罐发酵适宜培养条件。在发酵罐水平上探索了适于产物代谢的适宜温度 为3 4 和p h 值为7 。摸索出适于产物积累的通氧和搅拌策略，即整个发酵过程采取 较低的通氧速率5 l m i n ，搅拌速率分两阶段调控，先采用低搅拌速率3 0 0 r m i n ，待 溶氧将下来以后，再采用高转速6 0 0 r m i n 的调控方式，发酵效果较佳。在线控制发 酵过程中的补料方式，摸索出了最适于产物积累的补料方式，在对数生长期进行葡萄 糖的类指数补料的方式透明质酸的产量最高。 确定了透明质酸的分离提纯工艺。经过一系列提取纯化步骤：乙醇沉淀、沉淀物 溶解、过滤、c p c 络合、h a c p c 解离、成品沉淀、脱水、真空冷冻干燥等，得到 成品。成品最终的各项指标接近于化妆品级的标准。整个提纯工艺的收率在7 5 左 右。 关键词：透明质酸；发酵； 分离提纯；工艺 s t u d y o nt h et e c h n i c so fh y a l u r o n i ca c i df e r m e n t a t i o nb ym i c r o o r g a n i s m a n dd o w n s t r e a me x t r a c t i o n n a m e ：l i u j i n l o n g m a j o r ：f e r m e n t a t i o ne n g i n e e r i n g s u r p e n v i s o r ：z h a n gw e i a b s t r a c t h y a l u r e n i ca c i d ( h a ) i sah i g hm o l e c u l a rw e i g h tl i n e a rp o l y s a c c h a r i d e b e c a u s eo fi t ss p e c i a l p h y s i o l o g i c a la c t i o n , e x - w a o r d i n a r yt h e o l o g i c a lp r o p e r t ya n dm o i s t e r - h o l d i n gf u n c t i o n , h y a l u r o n i ca c i d i se x t e n s i v e l ya p p l i e dt oa n i n c l u d i n gm e d i c a lr e s e a r c h c l i n i c a t h e r a p y , a n dc o s m e t i ci n d u s t r y r e c e n t l y , t r a d i t i o n a lh y a l u r o n i ca c i dp r o d u c i n gm e t l l o db ye x t r a c t i o no fa n i m a lt i s s u e sh a sb e g a nt o t u r nt om i c r o b i a lr o u t e b e c a u s eo fs u f f i c i e n t $ o u r c e 5 ，l o wc o s t , h i g ho u t p u t , r e l a t i v e l yh i g hm o l e c u l a r w e i g ha n de a s yp u r i f i c a t i o n , 1 1 y a l u r o n i ca c i db yb a c t e r i a lf e r m e n t a t i o ns h o u l db ep a i dm o r ea t t e n t i o n a n ds t u d i e df u r t h e r s oi ti sv e r ye s s e n t i a lt op o p u l a r i z et h ea d v a n c e dt e c l m o l o g yo f p r o d u c i n gh a t h i sp a p e rd i ds o m eu s e f u ls t u d i e so l lh y a l u r o n i ca c i dp r o d u c t i o nb yb a c t e r i a lf e r m e n t a t i o n b e l o w w o r k sw e r ec h i e f l yc o m p l e t e da n dc o r r e l a t e dc o n c l u s i o n sw e r eo b t a i n e d 。 o p t i m i z e df e r m e n t a t i o nm e d i u mi nc u l t u r ef l a s kw a sd e t e r m i n e d 。t h r o u g ht h es i n g l e f a c t o r t e s t sa n dm u l t i p l ef a c t o ro r t h o g o n a lt e s t s ，f e r m e n t a t i o nm e d i u mi nc u l t u r ef l a s kw a sd 乱e r m i n e d ， w h i c hw a sc o m p o s e do f4 0g t , g l u c o s e ，1 0g lp e p t o n e ，1 0g l y e a s tp o w d e r ，2g ，lk 2 h p 0 4 ，0 4 9 ，l ，m g s 0 4 7 h 2 0 o p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o i l sw e r ed e t e r m i n e d t h eg r o w t hc u i v eo fb a c t e t i ai ns e e dm e d i u mw e s m e d ea n d1 4 hw a s 辩l e e t e d t h eb e s tt i m eo f i n o c u l a t i o i l 3 0 m lf e r m e n t a t i o nm e d i u mj n5 0 0 m lf l a s k 锄o b t a i nt h eh i g h e s th y a l u r o n i c 扯i do u t p u t a n do p t i m u mp hv a l u ef u rh aa c c u m u l a t i o nw a s7 4 o p t i m u mt e m p e r a t u r ew ef o rh aa c e u m u l a t i o i lw a s3 4 o p t i m i z e dc u l t u r ec o n d i t i o n sw e 他d e t e r m i n e do nt h e1 w e lo ff e r m e n t o r t h ei d e a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o nf o rh aa c c u m u l a t i o ni st h a tp hv a l mi s7 4 a n dt e m p e r a t u r ei s3 4 f i l l t h e rm o r e t h i sp a p e r s g r f a g l lt h eb e s tt a c t i c so fs t i r i n ga n da e r a t i o n , w h i c hi sk e e p i n gt h ea e r a t i o nv o l u m e5 l l m i nt h r o t l g h t h ew h o l ec o u p eo f f e r m e n t a t i o n , w h i l er e g u l a t i n gd i f f e r e n ts t i r i n gs p e e di nt h ec o u mo f f e r m e n t a t i o n ： k e e 2 p i n gt h el o ws p o e do fs t i r i n g3 0 0 r m i na 1t h ef i r s to f t h ec o 啦s e tw h e nt h ed o th a sd e c r e a s e d , c h a n g i n gt h es t i t i n gs p e e di n t o6 0 0 r r a i n t h es i n g l eb a t c h f e e d i n gf e r m e n t a t i o nw a sa d o p t e di nt h i s p a p e r a n dw ef u m b l et h ed i f f e r e n tm e t h o do f f e e d i n g , f m d i n gt h a tt h ee x p o n e n t i a lf e e d i n gm e t h o di st h e b e s tw a yf o rt h eo u t p mo fh a s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e c h n i c sw e l l ed e t e r m i n e d t h r o u g has e r i e so fs t e p s ：e t h a n o ld e p o s i t i o n , d i s s o l v e f l l t e m t i o n , c p cd e p o s i t i o n , h a - c p cd i s s o l v e ，e t h a n o ld e p o s i t i o n , d e h y d r a t i o na n dd r y n e s s t h ep r o d u c ti so b t a i n e d ，t h er e c o v e r yr a t eo ft h i ss e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o nt e e h n i c sr e s e h7 5 1 1 他 q u a l i t yp a r a m e t e ro f e x t r a c t i o nh a sb e e nc h o s et ot h es t a n d a r do f t h ec o s m e t i c - ( e yw o r d s ：h y a l u r o n i ca c i d ；f e r m e n t a t i o n ；s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；t e c h n i c s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经 发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑i 垦盛些盘堂或其他教育机构的学 位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：别爹缸 签字日期纱。7 年月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦壑些盘堂有关保留、使用学位论文的规定， 有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权塑i 垦壅些盘茎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位敝作者躲纠础 签字曝秒文年r 咭e t 学位论文作者毕业后去向 工作单位： 通讯地址： 导师签名 签字日期：2 口a 7 年厂月日签字日期：z o o 年月驴日 电话 邮编 瞎8 1 u 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 1 前言 透明质酸( h y a l u r o n i ca c i d ，h a ) ，又名玻璃酸，自1 9 3 4 年m e y e r 和p l a i n e r 等 人从牛眼玻璃体中分离得到透明质酸及其盐后，经过半个多世纪的研究，对其结构、 理化性质、生理功能和临床应用方面已有了明确的认识。其分子结构【1 j 是由d 葡萄裙 醛酸( g l u c u r o n i ca c i d ) 和n - 乙酰氨基d 葡萄糖胺( n a c e t y lg l u c o s a m i n e ) 通过b - i ，4 和 b 1 ，3 糖苷键反复交替连接而成。分子量在1 o x l 0 6 - 4 o x l 0 6 d a 之间。分子中两种单 糖b d - 葡萄糖醛酸和n 乙酰氨基d 葡萄糖胺按l ：1 的摩尔比组成。其双糖结构如下 图1 ： 一 n 图1h a 的双塘结构 托 lt h e 劬w n mo f h a 1 1 透明质酸的分布，结构，理化性质与生理功能 透明质酸的分布、结构、理化性质和生理功能在许多文献中得到了广泛讨论1 2 卅。 透明质酸已经成为学术研究的热点。 1 1 1 透明质酸的分布 在2 0 世纪3 0 年代和4 0 年代，m e y e r 等人在牛眼玻璃体中提取得h a ，同时 还发现h a 广泛地分布于动物和人体结缔组织细胞外的基质中。现在人们己从结缔 组织中：脐带、皮肤，人血清、鸡冠、关节滑液、脑软骨、眼玻璃体、人尿、鸡胚、 兔卵细胞、动脉和静脉壁中分离得到透明质酸。在哺乳动物体内，以玻璃体、脐带和 关节滑液中的h a 含量最高，鸡冠的含量与滑液相似。h a 常与蛋白质结合，并与其 它粘多糖共存，在玻璃体和滑液中，以溶解形式存在；在鸡冠和脐带中，以凝胶形式 存在。不同的组织中h a 的浓度如表1 所示【8 】 高等动物组织中的透明质酸同样存在于部分细菌中。现在已发现的代谢产生h a 的细菌主要有产气杆菌、绿脓杆菌和a b ，c 溶血性链球菌【9 l 。 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 寰1h a 在组织中的分布 t a b l e 1 t h e d i s m b e t i n g o f h a o n d i f f e z e n t 缸q c 原料 浓度( m g i ) 公鸡冠 7 5 人脐带4100 人关节滑渡 1 2 4 0 - 3 6 0 0 牛鼻软骨 1 2 0 0 兔肌内 2 7 兔脑 舒 人玻璃体1 4 0 - 3 8 0 人表皮 2 0 0 人淋巴液8518 人尿01-03 人血清 0 0 1 - 0 1 1 1 2 透明质酸的结构 r a p p o r t l l o 】等在2 0 世纪5 0 年代提出h a 是由等摩尔的葡萄糖醛酸和乙酰氨基 葡萄糖组成，并确认h a 为链状聚合物，d 葡萄糖醛酸和n 乙酰氨基d 葡萄糖胺 双糖重复单位所组成的直链多聚糖，h a 的结构非常规财，相同的双糖单位为h a 的 基本结构单元，不同动物组织和细菌来源的h a 无种属差异，对人类及动物无抗原 性。用各种相对分子质量测定技术如光散射、沉降和扩散以及粘度法等对不同来源的 h a 进行分子量测定，结果表明，即使是同一组织来源的h a ，其分子链的长度及分 子量也是不均一的1 1 1 j 。分子量范围为1 0 x l d 6 4 0 x 1 0 6 d a ，双糖单位数为2 0 0 0 1 1 0 0 0 对。 h a 为生物大分子，电子显微镜下观察证实h a 结构为线性单链i 叼，在水溶液中 扩展成随机的线圈状。h a 的一级结构是线状、无分支的大分子。在生理条件下非常 疏松、伸展，高分子量h a 在低浓度的溶液中就能形成整体网状结构，低分子量h a 只有在很高浓度的溶液中才具有类似结构，低浓度时仅生成网状结构的碎片。在酸性 条件下，随着水溶液p h 值的下降，分子间的有序度随着分子间氢键作用的增强而增 加，溶液粘度增加。p h 降为2 5 时，溶液变得无法流动，此时溶液中的h a 分子呈 缠绕的双螺旋二级结构。若再增加h a 浓度，则螺旋收缩成蜂巢状三级结构，水分子 则在网络内通过极性键和氢键与h a 分子相互结合，便得h a 象“分子海绵”一样， 可以吸收和保持其自身重量上千倍的水分。事实上，h a 比其它任何天然或合成聚合 物的都具有更强的吸水力，以致1 的纯h a 溶液能将剩余9 9 的水紧紧吸住，使其 像胶状物一样被提起，但它实际上是溶液，能被稀释。当遇到下述条件h a 可发生不 2 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 可逆的降解。第一，p h 值过高或过低；第二，透明质酸酶的存在：第三，许多还原 性物质如半胱氨酸、焦性没食子酸或重金属离子存在；第四，紫外线、电子束照射等。 第一和第二种情况是因为引起了糖苷键的水解而造成的，第三种情况可能是由于还原 剂的作用，机制还不十分清楚，第四种情况辐射破坏是因分子间的解聚造成的。 1 。1 3 透明质酸的理化性质与生理功能 水溶液中的h a 分子由于分子内和分子间的作用，具有特殊的理化性质。h a 的 粘弹性以及符合非牛顿流体的流变学特性是其最显著的两个特征。h a 的浓度和相对 分子质量是影响其溶液粘度的两个主要因烈明。在低浓度或低相对分子质量时，溶液 的粘度随浓度或相对分子质量的增加变化相对较小，但浓度或相对分子质量达到定 值后，粘度随浓度或相对分子质量的增加面显著提高。该现象是因为h a 在较低浓 度或相对分子质量时，分子间不发生缠绕，以独立的单体存在，当达到一定的浓度或 相对分子质量时，h a 分子间相互缠绕，形成网状结构，此时，浓度或相对分子质量 提高1 2 倍可导致粘度提高l o 倍。h a 溶液呈非牛顿流体流变学，即溶液的粘度 随切变速率的增加而明显减少( 假塑性) 。h a l l 4 l 在高切变速度下，h a 分子被拉长， 此时粘度大小不再完全取决于相对分子质量的大小，也取决于分子间的大小即浓度， 如同一浓度的h a ，即使其相对分子质量不同，当切变速率达到一定值对，粘度可降 至相同。而对同一相对分子质量的h a 溶液，在任何切变速率作用下，粘度总是与 浓度呈正相关关系。高浓度的h a 溶液即使分子间不像凝胶那样存在着分子间的共价 交联键，但由于分子间存在着氢键、疏水区的相互作用，所产生的网状结构既具有凝 胶的弹性特征，也具有溶液的粘性，这种双重特征被称之为粘弹性。h a 溶液的粘弹 性是其在体内发挥生理功能和临床应用的基础除了h a 浓度和相对分子质量本身 对溶液秸弹性影响以外，温度、p h 值、离子强度、自由基和酶等或改变h a 在溶液 中的有序排列( 分子构象及网状结构) 或对h a 发生降解等作用都会对h a 的粘弹性 产生重要的影响。 h a 含有大量的羧基，像一般的有机酸那样，可与阳离子发生反应，生成的产物 如透明质酸钠、透明质酸锌等金属盐以及与有机碱反应生成的透明质酸毛果芸香碱 等。h a 分子中的羧基、羟基和乙酰氨基可与交联剂如碳二亚胺、酰肼、醛和醇等发 生反应，生成交联大分子，也可与药物分子发生酯化等反应形成h a 药物加合物， 在预防粘连、软组织填充、粘弹性补充疗法和给药体系中得到广泛的应用。近几年通 过研究发现i l 1 9 1 ，h a 还在组织生成、创伤愈合、肿瘤入侵和调节细胞功能诸多方面 具有重要的生理功能 1 2h a 的应用领域 1 2 1 眦在化妆品中的应用研究 h a 既具有强吸水性，又有调节人体表皮水分的特殊功能。它可以吸收超过自身 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 重量1 0 0 0 倍的水分，但在外部环境湿度变化时，它的保湿性又可调节至适度，这也 是h a 较其它保湿剂的最大优越性l 刎。h a 具有较强的消皱功能，可增加皮肤弹性， 延缓皮肤衰老，使皮肤柔嫩、光滑，在保湿的同时又是良好的透皮吸收促进剂，这就 是h a 保湿性和营养性的双重作用，是其它任何保湿剂无法比拟的。同时，h a 是具 有直链结构的生物高分子制品，其水溶性具有很高的粘度，可使水相增稠，与油相乳 化后的膏体细腻均匀，具有稳定乳化作用1 2 1 】当含有h a 的护肤品涂在皮肤表面时， 化妆品可以从真皮中汲取大量水分。h a 能形成一层弹性水化膜，该水化膜能润湿角 质层，维持和加强角质层的吸水能力和屏障功能，可以防止水分蒸发与散失，达到维 持皮肤水环境的恒定作用。研究表明1 2 2 1 ，h a 可以阻止细胞中一些酶的产生，减少自 由基的形成，在防止自由基破坏细胞结构、产生脂质过氧化和引起肌体衰老等方面起 着重要作用；低分子量h a 具有抗炎、抑制病菌产生、保持皮肤光洁的作用；为细胞 增殖与分化提供合适的场所，直接促进细胞生长、分化、重建与修复等。因此，它被 用作高档膏霜、乳液、化妆水、美容液、口红、粉底等化妆品和盟洗用品必备的添加 剂，以达到增湿保湿、嫩肤抗衰老和抗皱消炎的功效。添加透明质酸的化妆品已成为 国际日化界的主流产品，许多国家都在竞相研究开发。如日本资生堂公司的“b h 2 4 ” 精华素、美国r e v l o n 公司的“m o o n d r o p s ”保湿剂、宝洁公司的。飘柔”、国内 的永芳、自然美、北京大宝等品牌p j 。 1 2 2i i h 在关节病中应用咖 h a 是构成关节软骨和滑液的主要成分圆滑液主要由滑膜细胞和吞噬细胞等合 成。滑液中的h a 赋予滑液高度的弹性和润滑作用，具有吸收应力和减轻组织磨擦的 功能。软骨中的h a 与蛋白聚糖和连接蛋白构成的p g a ，是构成软骨基质的基本单 元。此外，软骨具有一薄薄的无定型层，是h a 与蛋白质形成的复合物，软骨主要发 挥缓冲应力和物理屏障等保护作用。补充外源性高分子量h a 来治疗有关疾病是由 b a l a z s 2 6 1 等人最先提出的，他们认为补充外源性h a 将病理状况下的滑液恢复至正常 状态，重建其润滑、屏障和保护功能，高粘弹性h a 溶液替代滑液为关节提供应有的 保护和屏障功能的同时，为病变的关节创造了一个自然修复的时间，使软骨自然修复 和愈合。此外口n ，高分子量h a 还可抑制血管和组织的增生，抑制炎症反应，屏蔽 痛觉感受器，明显缓解症状 1 2 3h a 在眼科中应用 h a 是眼科手术的优良粘合剂、润滑剂，可制成滴眼药，玻璃体替代品 2 s l 。作为 眼科用粘弹物质，h a 具有近乎完美的特性，其良好的生物相容性，优越的化学特性， 极佳的反应惰性，适宜的p h 值，良好水溶性，高纯度，高透明性，易注入和吸出， 稳定性好等一系列优点，被认为是一种安全理想的眼科手术辅助剂。h a 可作为增稠 保湿剂用于滴眼剂，能增加药物在眼内存留时间，从而更好发挥药效，国内著名品牌 润洁、润舒就属于这类产品。 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 1 2 4 在促伤口愈合和防粘连中的应用 在外科手术后。可应用h a 作为术后防组织粘连，使粘连的发生率大大降低例。 其机理是：h a 具有高分子纤维网状结构，涂布于组织表面起到阻隔作用，在腹膜修 复期起到一个临时屏障的作用：抑制术后出血和渗血，减少能形成永久粘连骨架的数 量，避免组织接触面的纤维蛋白沉着；高浓度，高分子量的h a 能抑制自细胞迁徙和 巨噬作用，并且能抑制血小板的沉积，显示出h a 的抗炎特性i 删；h a 与间质细胞和 成纤维细胞表面与h a 受体蛋白相互作用，提高这些细胞的迁徙能力并使其迁徙定 向，从而改善内源性修复过程：h a 凝胶覆盖于创伤浆膜表面，维持充分的时间不降 解代谢，使早期的创伤组织规则而有序地生长，直至形成连续的间皮细胞层覆盖于创 伤表面，达到生理性修复的效果p u 。 1 2 5h a 对疾病检测中的应用 人体血液中h a 含量的变化也可作为疾病诊断的一种指标【竭，用来辅助诊断某些 疾病，现己发现，肝硬化病人血液中h a 的含量会增加1 0 - 1 0 0 倍，肝脏移植后h a 含量增加则是组织排斥的早期标志1 3 3 1 ，其它疾病如败血病，肿瘤1 3 4 l 关节炎等也会引 起h a 含量的增高。 此外，对h a 研究的新热潮集中于以下几个领域：( 1 ) h a 如何在胚胎细胞发育、 繁殖、附着、识别、形态发生、分化和炎症反应中起重要作用的。( 2 ) h a 与肿瘤发生、 转移、侵染的相互作用的机制。( 3 ) h a 的各种膜受体如c d 4 4 和h a 介导的移动受体 ( r e c e p t o rf o rh a - m e d i a t e dm o t i l i t y ) 作为免疫和细胞移动调节因子的作用机制。( 4 ) 弄 清h a 代谢机制，有助于控制一些疾病，如肝硬化、风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病 和一些癌症。 1 3 透明质酸的市场价值 近年来化妆品级透明质酸的价格己由5 0 0 0 美元公斤降至1 0 0 0 2 0 0 0 美元公斤， 药用级透明质酸价格基本上维持在2 0 万美元公斤。在2 0 0 1 年，全球透明质酸在各 种医疗用途上，总市值就已高达二十亿美元。2 0 0 4 年全球的h a 在化妆品和医疗用 途上，销售总值高达3 0 - 4 0 亿美元，每年以很高的速率增长，估计在未来的几年内， 每年将超过1 0 0 亿美元。我国目前的h a 年需求量从上世纪9 0 年代中期的1 2 吨已 经增长到现在的1 0 吨左右，并且将会继续大幅度增长脚】。 1 4 透明质酸的制备方法 制备h a 主要有两种途径：一种是从动物组织中提取；一种是通过微生物发酵获 得。 从动物组织中提取h a 常用的原料有鸡冠、脐带、猪皮等，主要工艺过程包括脱 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 水、磨碎、浸泡、提取、除杂、沉淀和分离。以从鸡冠中提取h a 为例 3 6 , 3 ”，一般过 程如下：先将组织匀浆冻鸡冠解冻后，用绞肉机绞碎，加适量水用胶体磨磨成糊状， 按每1 k g 鸡冠加水8 l ，加氯化钠8 0 9 ，搅拌加热至9 0 ，保温1 0 r a i n ，冷却至5 0 ， 用l m o l l 氢氧化钠溶液调p h 8 5 - 9 0 ，加入适量胰酶，4 5 - 5 0 保温酶解5 h - 7 h ， 酶解过程中维持p h 8 5 胡0 ，将酶解提取液用滤布加硅藻土加压过滤得澄清滤液，取 滤液，调p h 6 o “5 ，将滤液加到3 倍体积的9 5 乙醇中，反复倾倒3 次，待纤维状 沉淀充分上浮后，取出沉淀，用适量乙醇脱水3 - 5 次，真空干燥，得h a 中问品，将 h a 中间品溶于0 1 m o l l 氯化钠溶液中，溶解浓度为0 3 m o l l ，溶解过程中加少量氯 仿防腐溶解后，调p h 4 5 巧0 ，加入等体积的氯仿搅拌处理2 次，静置分出水相，将 水相用稀氢氧化钠溶液调p h 7 。5 ，加入适量链霉蛋白酶，3 7 酶解2 4 h ，酶解结束后， 向酶解液中加入同体积1 氯化十六烷基吡啶( c p c ) 溶液，静置，收集h a c p c 络合 沉淀，将h a c p c 络合沉淀加入一定浓度的氯化钠溶液中，搅拌解离5 h 一1 0 h ，解 离液先用硅藻土过滤至清，再用0 2 pm 微孔滤膜精滤，将滤液加至3 倍体积的9 5 乙醇中，反复倾倒3 次，取出纤维状h a 沉淀，脱水，真空干燥，得h a 精品。 动物组织提取法是最早采用的h a 生产法，但这种生产方法原料来源局限性大， 产品提取率极低，仅为1 左右，工艺程序复杂，生产成本居高不下，造成商品价格 昂贵，限制了它在医药和化妆品中的广泛应用，并不宜进行大规模工业化生产。而且 在雄鸡鸡冠中，h a 和蛋白多糖结合，使分离高度纯化的、高分子量的h a 成本更加 昂贵。此外，二十世纪八十年代后，越来越多的证据显示一些含有动物组织来源原料 的产品，对使用者有潜在的危险。包括中国在内的许多国家，明令限制含有这些原料 的化妆品、口服保健品及药品的销售与使用。这给发展微生物发酵法生产h a 带来了 良机。微生物产h a 的研究可以追溯到上个世纪3 0 年代，1 9 3 7 年，k e n d a l l 发现链球 菌可以产生h a ，后来发现主要是一些a 群和c 群链球菌，它们具有合成与代谢以 h a 为主要成分的荚膜的能力。经过不断地选育菌种和优化工艺，借助现代深层发酵 技术与设备，h a 的微生物发酵法被建立和应用起来【强加】。与动物组织提取法相比微 生物发酵法有许多的优点，比如成本低，生产规模不受原料限制，发酵液中h a 以游 离状态存在，易于分离纯化和形成规模化工业生产，具体比较见表2 。 6 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 表2 提取法和发酵法生产h a 的比较 1 3 t h l e 2 t h e m p a 枷o nb e l g , e e li h cm e t h o do f e x t r a e t i o aa i dt h em e t h o do f 缸日m 如n 1 5 发酵法生产透明质酸的研究概况 发酵法生产透明质酸主要工艺包括两部分：发酵部分和下游提取部分。现将目前 发酵法生产透明质酸的大致工艺过程1 4 1 4 3 】介绍如下： 取斜面菌种，接种于装有灭菌培养液锥形瓶中，3 7 培养1 2 h 一1 6 h ，接种于种子 罐中。培养液中氮源一般为蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉等，碳源一般为葡萄糖。液体 种子3 7 搅拌培养一段时间，然后接种于发酵罐中。接种比例1 ：1 0 。发酵液配方基 本与种子液相同，只是葡萄糖含量较高。维持一定通气量和一定搅拌转速，3 3 t 3 7 发酵4 0 h * - 4 6 h 。在发酵过程中。发酵液的p h 值不断下降，需调至中性。发酵后期， 葡萄糖浓度下降至0 5 以下，p h 值下降很慢或不再下降时，即为发酵终点。发酵结 束，用三氯乙酸调p h 4 o 一4 5 ，板框过滤除菌体，滤液调整d h 值，加一定体积乙醇， 沉淀出h a 。沉淀用一定浓度的氯化钠水溶液溶解，在搅拌下，加入过量的1 c p c 与滤液中的h a 发生络合沉淀，静置使沉淀下沉。虹吸出母液，加入氯化钠溶液洗涤 沉淀两次。沉淀在较高浓度的氯化钠溶液中搅拌解离过夜。过滤，滤液加乙醇沉淀， 乙醇脱水，真空干燥得h a 。 发酵法生产h a 方面的研究起初主要集中在日本、英国和美国。h o l m s t r o n 和 r i f i c a i 州采用摇瓶和小罐分批发酵研究了h a 发酵的营养条件：k i l n 等1 4 5 l 对兽疫链球 菌突变株的筛选培养条件进行了研究，同时考察了小罐分批发酵的条件；j o h n s 等【4 6 l 就搅拌转速对h a 合成的影响进行了研究，同时在小罐发酵的基础上，考察了培养条 件对h a 分子量的影响。d a v i d 等【4 7 】研究了h a 产生菌生长的营养条件，同时也对影 响h a 分子量的培养条件进行了研究：b a r r i e 等【弼l 的研究包括h a 的合成、代谢、发 酵条件等，还包括分子生物学方面的研究。我国从上世纪年代进行了h a 的组织 分离提取，1 9 9 0 年凌沛学等【柏j 在国内首先开始h a 的发酵生产研究，先后完成了小 试和中试实验。宁夏大学农学院的罗瑞明【删筛选出产h a 的一株兽疫链球菌并对其营 养条件和特性进行了研究。华东理工大学田毅红等阻】研究了高分子量h a 的发酵条 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 件，考察了对h a 分子量有影响的培养条件；北京化工大学的叶华【5 2 1 等对透明质酸发 酵的流加策略进行了研究，比较了不同流加方式对h a 产量的影响，得到了较为理想 的流加方式；西北大学史鹏等，对发酵法生产透明质酸下游提取工艺方法进行了研究。 吉林大学邓开野等对微生物发酵制取透明质酸进行了系统的研究。高海军还对h a 分批发酵进行了动力学模型化，对兽疫链球菌生物合成h a 代谢通量进行了分析并建 立了代谢模型。广西大学凌敏，对马链球菌的透明质酸合成酶基因的分子克隆及表达 进行了研究。清华大学的郝宁【5 3 】等对h a 的生产菌进行了基因改造，将兽疫链球菌 h a 的合成基因h a s a b c 以及合成透明颤菌血红蛋白的v g b 基因导入兽疫链球菌中， 带有这两个基因的重组菌产量可高达6 9g 几。 1 6 透明质酸生产待解决的问题 h a 产业前景广阔，发酵法己成为h a 生产的主流工艺，而发酵法生产h a 的工 艺仍需迸一步完善。要加快发酵法生产h a 的研究开发，应主要从以下几个方面着手： ( 1 ) 从菌种入手，筛选诱变性能优良的菌株，或通过基因工程手段构建新的工程菌， 为工业化生产透明质酸提供优良菌株。( 2 ) 从发酵工艺着手，优化工艺条件，同时开 发与高黏度发酵液匹配的生物反应器，建立完善的在线监测、将r r 技术引入发酵工 艺的控制过程中。( 3 ) 加强对提取工艺的进一步开发，得到一条低成本、低污染、易 于工业化的下游提取工艺。 1 7 本研究主要内容 本研究主要包括两部分：发酵工艺部分和下游提取部分，主要内容如下： 第一，利用5 0 0 毫升摇瓶水平的单因素试验和多因素正交试验初步确定菌株发酵 培养基的成分和发酵培养条件。 第二，通过1 0 升发酵罐试验进一步完善发酵条件，主要是搞清发酵过程中温度 和酸度控制、补料方式、通气和搅拌策略这几个因素对透明质酸产量的影响。 第三，尝试摸索出一条高收率的工业上可行的分离纯化工艺，该工艺主要包括两 大操作单元，去除菌体的工艺和去除杂蛋白的工艺。 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 2 1 实验材料 2 1 1 菌种 2 材料和方法 采用兽疫链球菌( s t r e p t o c o c c u s z o o e p i d e m i c u s ) ，由本实验室保藏。 2 1 2 主要试剂 ( 1 ) 脑心浸粉：生化试剂，北京陆桥技术有限责任公司； ( 2 ) 酵母粉：生化试卉时，北京双旋微生物培养基制品厂： ( 3 ) 蛋白胨：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂： ( 4 ) 葡萄糖：生化试剂，北京双旋微生物培养基制品厂； ( 5 ) 葡萄糖醛酸：分析纯，s i g m a ： ( 6 ) k 2 h p 0 4 ：分析纯，天津福晨化学试剂厂； 四硼酸钠：分析纯，天津福晨化学试剂厂； ( 8 ) 咔唑：分析纯，天津市天大化工实验厂： ( 9 ) 氯化钠：分析纯，天津( 香港) 新通精细化工有限公司； ( 1 0 ) 氢氧化钠：分析纯，天津( 香港) 新通精细化工有限公司； ( 1 1 ) 无水乙醇：分析纯，天津( 香港) 新通精细化工有限公司； ( 1 2 ) 硫酸：分析纯，天津( 香港) 新通精细化工有限公司； ( 1 4 ) 、1 1 ；硫酸氢钠：北京益利精细化学品有限公司； 0 5 ) 酒石酸钾钠：天津市化学试剂一厂； ( 1 6 ) 3 ，5 一二硝基水杨酸：天津市标准科技有限公司； ( 1 7 ) 考马斯亮蓝g 2 5 0 ：北京奥博星生物技术有限公司； ( 1 8 ) 牛血清蛋白：北京奥博星生物技术有限公司； 其他试剂均为分析纯或生化试剂。 2 1 3 主要仪器设备 ( 1 ) b i o f - 2 0 0 0 型i o l 发酵罐：上海高机实业总公司； ( 2 ) 7 5 6 型紫外可见分光光度计：上海光谱仪器厂； 0 ) a p - 0 1 p 型v a c u u m p u m p ：a u t o m a t i cs c i e n c e 玳s t r a n t c 0 l t d ： ( 4 ) f d 1 真空冷冻干燥机：北京博医康技术公司； ( 5 ) 电子恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂； ( 6 ) d l - c j 2 n 医用型洁净工作台：哈尔滨东联电子技术开发公司； ( 7 ) o l y n u p u s 显微镜：o l y m u p u sc o l t d ： ( 8 ) l r h - 2 5 0 a 型生化培养箱：广东省医疗器械厂： ( 9 ) y x q g 0 2 型电热式蒸气消毒器：山东新华医疗器械厂； 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( 1 0 ) g r - 2 0 6 s v q 型l o 冰箱：泰州乐金电子冷机有限公司； ( 1 1 ) p h s - 3 c 酸度计：上海康仪仪器有限公司： f 1 2 ) t g l l 6 m 型离心机：长沙市易达科贸公司； ( 1 3 ) j a 5 0 0 2 电子天平( 百分之一) ：上海精天电子仪器有限公司； f 1 4 ) h q 4 5 z 恒温摇床：中国科学院武汉科学仪器厂： 0 5 ) h z - o q x 全温振荡器：哈尔滨东联电子技术开发公司： ( 1 6 ) h g 7 2 1 恒温干燥箱：北京市朝阳区来广营医疗器械厂： f 1 7 ) o m p 2 0 0 a 型分析天平：上海第二天平仪器厂； 2 1 4 培养基 半固体培养基：牛脑浸粉1 2 5 ，牛心浸粉0 5 ，蛋白胨1 o 。葡萄糖0 2 ， 氯化钠0 5 ，n a 2 r i p 0 4 0 2 5 。琼脂0 5 ，调p h7 4 ，1 2 1 灭菌1 5 r a i n 。 斜面培养基：牛脑浸粉1 2 5 ，牛心浸粉0 5 ，蛋白胨1 0 ，葡萄糖0 2 ，氯 化钠o 5 ，k r j f l 0 4 0 2 5 ，琼脂2 ，调p h7 4 ，1 2 1 灭菌1 5 r a i n 。 基本培养基：葡萄糖2 ，蛋白胨1 ，酵母粉1 。m g s 0 4 7 1 - 1 2 00 0 2 ，k 2 i 口0 4 0 1 ，调p h7 4 ，1 1 5 灭菌2 0 m n 种子培养基：葡萄糖2 ，蛋白胨1 ，酵母粉1 ，m g s 0 4 7 i 1 2 00 0 4 ，k 2 m 0 4 o 2 ，调p n7 4 ，1 1 5 灭菌2 0 r a i n 。 发酵培养基：葡萄糖4 ，蛋白胨1 ，酵母粉1 ， m g s 0 4 7 1 1 2 00 0 4 ， k 2 m 0 4 0 2 ，调p h 7 4 ，1 1 5 灭菌2 0 r a i n 。 2 2 实验方法 2 2 1 培养方法 ( 1 ) 斜面菌种培养方法 将从半固体培养基中穿刺保藏的菌种，于斜面培养基上划线。并将其置于3 7 ( 2 恒温箱中，培养2 4 小时左右。 ( 2 ) 液体种子培养方法 菌种经斜面培养基传代2 3 次以后，用接种针在斜面培养基中挑取生长状态良 好的菌落2 3 环，接入5 0 0 m l 三角瓶中，瓶内装5 0 m l 种子培养基，把接菌后密 封好的5 0 0 m l 三角烧瓶，置于以2 0 0 r r a i n 旋转的摇床中培养1 6 h ，培养温度3 t c 。 ( 3 ) 摇瓶发酵培养方法 液体种子培养结束后，从5 0 0 m l 三角瓶中吸取5 m l 己培养好的菌液，接入内 装5 0 m l 发酵培养基的5 0 0 m l 三角瓶，再将三角瓶置于转速为2 0 0r m i n 的摇床 中振荡培养，在3 4 条件下培养2 4 h 。 ( 4 ) 发酵罐培养 1 0 透明质酸的微生物发酵及下游提取工艺的研究 采用1 0 升的发酵罐，空罐灭菌后，加入5 升发酵培养基，1 2 1 0 实罐灭菌3 0 m i n ， 接种量为1 0 ( v v ) 。发酵过程中以一定的方式进行补料，利用在线检测和控制系统， 对温度、酸度、和溶解氧迸行检测和调控，整个发酵周期为2 4 小时。 2 2 2 测定方法 ( 1 ) 菌体量的测定：采用自紫外可见分光光度计法，将培养液稀释后，在6 6 0 n m 处 测其o d 值。 ( 2 ) h a 含量测定：采用b i t t e r - m u i r 氏法酬。以葡萄糖醛酸标准品为对照，测得样 品溶液中葡萄糖醛酸的含量。由于葡萄糖