（发酵工程专业论文）微生物产纤溶酶的研究.pdf

摘要 利用平板透明圈法作为初筛方法，从酿造酱油曲样中筛选出1 株产纤溶酶酶活较高 的米曲霉菌株s a 6 ，其产纤溶酶酶活为2 5 i m i ，。在试验过程中，通过比较发现，可以 用自制纤维蛋白代替纤维蛋白原和尿激酶测定发酵液的纤溶酶酶活，在大通量的菌株筛 选过程中可以节省大量费用。s a 6 经过紫外线、6 0 c o 和亚硝基胍诱变，筛选得到突变 株n a - 2 5 ，其酶活为6 3 u 触l ，是出发菌株s a 6 的2 5 2 倍。突变株n a 2 5 的发酵性状 发生改变，其产纤溶酶的高峰比出发菌株迟了约1 0 h 。 通过单因素实验确定米曲霉n a 2 5 产纤溶酶的最佳碳源为麸皮，最佳氮源为蛋白 胨和n a n 0 3 。利用s a s 软件的p l 加k e t b 唧a n 设计法对米曲霉n a - 2 5 产纤溶酶的培养 基组成进行筛选，筛选出3 个影响较大的重要因素，即蛋白胨、n 州0 3 、c a c l 2 ，然后 用中心组合实验设计进一步优化，经优化后，在上述因素分别为n 0 31 8 5 9 几，蛋白 胨4 9 7 9 ，l ，c a c l 2 1 6 3 毫l 时发酵液的酶活为9 8 1 3u f m l ，比原来提高了5 5 8 。最后优 化了产纤溶酶的培养条件：接种量为5 的1 0 6 个m l 孢子悬液，培养温度为3 0 ，摇 床转速为1 8 0 r i i l i l l 。在最佳的发酵条件下，菌株n a 2 5 产纤溶酶酶活为1 2 3 1 7 ，m i ，比 在原来发酵条件下提高了9 3 4 。 最后对发酵液中的米曲霉纤溶酶进行了初步分离纯化。发酵液经过抽滤、硫酸铵盐 析、透析浓缩、d 必e 离子交换色谱后，最终纤溶酶的回收率为1 2 9 ，纯化倍数为7 5 ， 纯化效果明显。 然后初步研究了米曲霉纤溶酶的一些性质。初步纯化后，酶的最适温度为3 7 ， 最适p h 为9 o ，p h 稳定范围为6 o 9 o ；k + 及c a 2 + 对酶活有激活作用；c u 2 + 、m p 对酶 活有抑制作用。米曲霉纤溶酶除能直接降解纤维蛋白外，还能激活纤溶酶原成纤溶酶， 间接降解纤维蛋白。 关键词纤溶酶；米曲霉；诱变育种：响应面；分离纯化；酶学性质 、 l 江南大学硕士学位论文 a b s t r a c t a 爿印盯讲淞圮卯s t r a i l l ，s a - 6 、v a si s o l 锨d 矗o ms a u c ep r o p a g a t i o n 谢mt i l ec l 撕t y c i r c l em e t h o do np l a t e 孤dt l l ea c t i 访t yo ff i b r i n o l y t i ce n z y m ew 嬲2 5u ，m li tw 勰s h o w e d t l l a t6 b r i n o g e na n dm m m b i nc o l l l db er 印l a c e d 诫t l l6 b 血t od e t 咖曲et h ea c t i v i t yo f 肋r i l l o l y t i ce 1 1 z y m em u g l le x p d m 曲t a t i o n ，w i l i c hc a l ls a v em u c hm o n c y 锄o n gs c r e e l l i n g o f m 柚vs n 面n s 1 1 1 em 删w 嬲i s o l a c e da r c rs a 6w 船订e a t e dw 砌1u v 、删c o 锄dn t g a n d m ea c t i v 姆o ff i r 晰n o i y t i ce n 巧m ew 鹊e l l l l a n c e dt o6 3 呲谢l i c hw a s1 5 2 血n e sh i 曲e r t i l 柚m a to fs a - 6 c o m p 盯i gw i mt h ei l l i t i a ls 妇i i l ，t h ef a s t i 西啪o fm em 咖tp r o d u c i n g f i b r i l 州ce 1 1 z y m ew 鸽l a t e ra b o u t1 0h o u r s b y 血西e 0 弛o fe x p 蒯妇e n 坞也e 叩血脚c a r b o ns o u r c eo f n a - 2 5p r o d u c i n g 五b r i l l 0 1 y l i c e r l z y m ew a sb r a na n dt h eq l 在m 羽m t r o g e ns o u r c ew a sp e m o n ea n dn a n 0 3 p l k i n - b u n n a i l d c s i g n 啪sm l d e r t a k e n t oe 、，a l u a t e 也ee 弼e c t so fd i 日e r e n tf h c t o 船b yt h es 州s t i c a lr e g r c s s i o n 锄a l y s i s ，t h es i 鲥f i d 葡a 虢c t i n gt l l e 丘嘶n 0 1 如ce 嗡，i n ea c t i v i t y i nf b n i l e n 僦o n l i q u o rw e r ed 咖皿h d 嬲f 0 1 l o w s ：n 州0 3 ，p e p t o n e ，c a c l 2 m 血es e c o n dp i l a s eo fm e o p t i m i z a t i o np r o c e s s ，ac e m r a ：ic o m p o s i t ed e s i g nw 船u s e dt oo p 僦z e t l l ea b o v ec r i t i c a l i n t e r n a lf h c t o r s b ys o l v i n g 也eq 陇i d r a _ t i cr e g r c 豁i o n l o d e le q t i o nu s i n ga p p r o p r ia _ e s 妊m s t i cm e m o d s ，t i l eq ，t i 血a lc o n c e n t r a t i o no f1 1 l ev a r i a b l e sw e r ed e t e m l i n c d 积：1 8 5 9 儡 n a n 0 3 ，4 9 7 9 ，lp e p 怕舶，1 6 3 9 ，lc a c l 2 1 1 1t l l eo p 恤a lm e d i u mc o n d i d o n st h ea c t i v i t yo f f i b r i n o l 如ce n z y n l ei f c 衄e n 伽0 nl i q u o r 啪s9 8 1 3u 触。，沁r e a s e d b y5 5 8 t h e no t h c r c o n d i 石s 、张r eo l 岖1 n i z e d ：r o t a t es p e e d1 8 0m n i l l ，t e m p e r a c i l r c3 0 ht l l eo 埘m a l f e r n l e n 协t i o nc o i l d i 虹o n st h e 剃v 时o ff i b r i | 1 0 l ”i ce n z y m ei nf e r n l e i l 诅垃o nl i q u o rw 船1 2 3 i m i ，i n c 搬db y9 3 4 b y 丘l 恤吐吣锄m o n i 岫s u l p h a t e 丘a c t i o 枷p r e c i p i 觚o i l ，d i a l y s e 趾dd 队e - c e l l m o s e i o ne x c h 锄g ec 岫a _ t o g 砌，t h ef i b r i l l o l y t i c 即孕n ew a sp u r i f i e d t h er a t eo fr e c o v e r y 、a s 1 2 9 a n 吐廿l ep l l r i f i c a t i o n 舢l t i p l ew a s 7 5 a r e rt h 矗丘1 ) d n o l ”i ce n 巧m e 吼sp 叫i e ds i m p l y ，t h eo p 他唧t 1 p e r a t u r ew 勰3 7 锄d 也eo p t i i i l 啪p hw a s9 o h 1t 1 1 ep h 啪g e6 o 一9 o ，m e 丘m n o 蛐cc n z 肿ew a ss t a b l e l em e t a l 沁n sk + ，c a 2 + s h o w e da c 咖a t i o n 锄dc u 2 十，m n 2 + s h o w e di n l l i b m o n 0 nm e 丘b r i n p i a t ca n dp i a s l l l i n o g c n 一舶e 6 b r i np l 蹴，m e 劢血0 1 y d cc n z y r n ed i d f l ts 王l o wt h cs 黼 矗b r i n o l y t i ca c t i v 时1 kr c s u l ti n d i c a t e dt 1 1 a tt l l ee n 巧m em i g h tc o 栅nb o laf i b 血o l ”i c e n z y m ew h i c hd e 簪a d e d 丘b d nd h c t l ya n d ap l a s m i n o g e na c t i v a t o rw 1 1 i c hd e 掣a d e d 丘b r i i lb y a c t 沁a t i n gp l a s m i n o g e n 2 摘要 k c y w o r d s ：6 b r i n o l y t i ce r 目恤e ；一置卵r 讲搬d 侈z 册；m u t a g e n c s i sa n ds c r e e 芏l i n g ；r e s p o n s e 吼f a c em e 出o d o l o g 羽懋m ) ；p 矗a t i o n ；e 1 1 z y m ec h a r a c t e r 3 独创性声明 本人声明所星交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名；为占釜 日期：州5 年占月。日 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：占i 奎 导师签名： 日期；乃佃 第一章绪论 第一章绪论 血栓病是严重危害人类健康的常见病、多发病，是死亡威胁最大的疾病之一，世界 每年心血管病死亡人数约1 3 0 0 万，仅美国患急性心肌梗死的人数即为1 5 0 万，约l 3 致命，占美国疾病总死亡率的3 0 【”。据卫生部统计，我国血栓栓塞性疾病发病人数已 超过3 0 0 万，死亡率超过6 0 【2 】o 今后2 0 年，随着我国人口老龄化趋势的发展，心脑 血管疾病将会越来越多的威胁我们的健康。研制高效的溶栓药已成为临床的迫切要求。 1 1 血栓形成和溶解机制 1 1 1 血栓形成机制 正常情况下人体内的血液是不会凝固的，因为在人体内有抗凝血因子和凝血因子相 互制约。一旦这种相互制约关系受到干扰或破坏，就会出现病理现象，产生血栓。血栓， 是指人体内血液成份( 血小板、凝血因子等) 在血管或心脏腔内形成的凝块：栓塞，是 指在心或血管内形成的血栓，全部或部分脱落，随血液流向远端，堵塞血管腔。因此， 血栓形成的原因，简言之，是随着人年龄的增长，体内纤溶系统功能逐渐降低导致血液 中凝血与抗凝血功能失去平衡从而出现凝血。具体地讲，是人体内的纤维蛋白原在凝血 酶的作用下生成纤维蛋白多肽a 和纤维蛋白多肽b ，两种纤维蛋白多肽转化成纤维蛋 白单体( q ，p ，t ) 后自发聚合成不稳定的纤维蛋白多聚体，不稳定的纤维蛋白多聚体在 c a 2 + 、i i 因子的作用下交联成稳定的纤维蛋白多聚体，此即血栓的主要基质【3 】。 血管栓塞性疾病是涉及到血液和循环系统的疾病，常见的有：冠状动脉栓塞引起肺 梗塞或急性肺原性心脏病；肢体动脉血栓形成栓塞引起肢端疼痛或坏死；肢体静脉血栓 引起局部水肿和疼痛：全身毛细血管发生迷漫性血栓，形成独特的播撒性血管内凝血。 此外还有其它脏器的动脉栓塞引起的各脏器梗塞等。 血栓形成和溶解的机制。如下图1 1 ： 江南大学硕士学位论文 血管壁损伤 凝血因子擞活 凝血酶原 凝血酶 纤维蛋白上纤维蛋白原 血细胞_ + 交 纤溶酶原激话物 l 纤溶酶+ j - - 纤溶酶原 i ；i 纤难蛋向为骨架i 血细胞沉积酣者f l 、 血栓生成 圈l 血栓形成与血栓溶解的途径 血拴彤成途径 一 血栓溶解途径 图1 1 血栓形成和溶解机制 f i g 1 1p m c e d u r eo f 1 r o m b o s i s 锄dm m m b o i y s i s 1 1 2 血栓溶解机制 纤维蛋白溶解系统是无活性的纤溶酶原、纤溶酶原激活剂和纤溶抑制物等三个方面 的总称。纤维蛋白溶解的生物学作用之一是除去血管、组织、导管、体液中过剩的纤维 蛋白沉积物，以保持血循环、组织液管道和分泌管道等的畅通。 人体内的纤溶酶分子内部分成两部分，n 末端区称为a 链或重链，c 末端区称为b 链 或轻链。a 链部分有赖氨酸结合部位( 1 y s 血eb i l l d i i l gs i t e ，l b s ) ，此赖氨酸结合部位能与纤 维蛋白原、纤维蛋白结合，也能与赖氨酸以及具有o m e g a 氨基结构的凝血酸、氨基己酸 等抗纤维蛋白溶解的氨基酸类可逆地结合，如此则在调节纤维蛋白溶解反应方面发挥重 要作用。b 链部分有纤溶酶的活性中心，降解纤维蛋白( 原) 。血栓形成后，体内的纤 溶酶原在纤溶酶原激活物的作用下变成纤溶酶，纤溶酶溶解血栓的骨架蛋白一纤维蛋自， 纤溶酶是纤溶系统中的关键酶，它还可以降解纤维蛋白原、凝血因子，从而使血栓溶解 【s 1 。 从以上可以看出纤溶酶和纤溶酶原激活剂是通过直接或间接降解纤维蛋白来溶解 血栓。因此具有纤维蛋白降解活性的纤维蛋白水解酶可能被用作溶栓剂。 第一章绪论 1 2 血栓疾病的治疗方法 目前对该症的治疗方法主要有三种： 外科手术疗法【6 j ，这是去除血栓最迅速直接地方法，开始于2 0 世纪3 0 年代的法国， 5 0 年代流行于美国。这种方法要求条件复杂，费用高，一般适用于管腔完全闭塞或狭 窄程度超过5 0 者，外科手术造成的死亡率在所有治疗手段中最高，手术取栓后往往引 起血管狭窄且再发血管闭塞，并且需要配合溶栓药物使用。 保守疗法【7 】，即给患者长期服用扩张血管药物和稀释血液的药物。其中扩张血管药 物只能暂时缓解心肌或脑部缺血，但无法消除动脉硬化：稀释血液的药物只能能使血液 粘稠度降低，血液容易通过，但破坏了血液成分的平衡，增大了心脏负担，血栓、动脉 硬化依旧。 溶栓疗法【3 】，通过使用溶栓剂，使血凝块中的纤维蛋白降解成可溶物质而使循环畅 通，这是目前使用的主要方法，致死的危险性比保守疗法降低1 0 5 0 。 1 3 溶栓药物的研究进展 随着溶栓剂的推广使用，血栓栓塞疾病人的死亡率明显下降。人们已经发现并研究 了多种天然溶栓剂，最近1 0 年，溶栓剂发展很快。根据溶栓剂的发现时间、疗效和副 作用的大小，可以将溶栓药物分为三代。 1 3 1 第一代溶血栓药物 临床上常用的第一代溶栓剂是链激酶( s 仃e p t ol ( i n a s e ，s k ) 和尿激酶( u r o k i n a s e ， u k p 。 s k 不直接激活纤溶酶原，而是通过与纤溶酶原结合成s k 纤溶酶原复合物，此复 合物使纤溶酶原转化为纤溶酶，溶解血栓及激活循环中纤溶系统。临床应用表明，链激 酶的优点是有效、价廉、冠状脉开通率为5 8 ，缺点是具有抗原性，半衰期短。据报道 链激酶还可诱发成人呼吸窘迫综合症。由于天然产生的s k 抗体广为存在，在应用s k 的治疗过程中，严重的免疫反应时有发生。 2 0 世纪5 0 年代初从人尿中发现并分离纯化了一种对碱性氨基酸肽腱比胰蛋白酶 更为专一的蛋白水解酶一u k 。生理条件下，除纤溶酶原外，它没有其他底物，通过水解 m 9 5 6 0 v a l 5 6 l 肽腱，将血液循环中大量存在的纤溶酶原激活为纤溶酶，进而由纤溶酶 来降解血管中聚集凝结的血纤维蛋白。 第一代溶栓剂虽然具有较好的溶栓效果，但缺乏纤维蛋白选择性，除了能激活血栓 表面的纤溶酶原外也能激活血浆中游离的纤溶酶原，使a 2 一抗纤溶酶大量消耗及纤维蛋 白原降解，产生全身性出血的副作用。这类溶栓药物由于难以克服这类缺陷已经被淘汰。 江南大学硕士学位论文 1 3 2 第二代溶栓药物 有重组组织型纤溶酶原激活剂t - p a ( 单链a l t e p l a s e 和双链d u t e p l a s e ) ，还有重组单链 尿激酶纤溶酶原激活剂( s a n l p l a s e ，s c u - p a ) ，即前尿激酶( p m u r o k i n a s e ，p m u k ) ，重组葡 萄球菌激酶( r e c o m b i n a n ts t a p h y l o l ( i n a s e ) 及其衍生物，乙酰化纤溶酶原一链激酶激活剂复 合物( a n i s 仃e p l a s e ，a p s a c ) 1 1o 】等。 第二代溶栓药物溶栓效果优于第一代，并且具有纤维蛋白特异性，减轻了过敏反应 的副作用，需要与抗凝剂、抗血小板药物等联合作用治疗血栓，并且半衰期短，需短时 间内大量给药，价格昂贵，引起颅内出血的危险同样大，而且价格较高。 1 3 3 第三代溶栓药物 第三代溶栓药物是利用基因工程方法对t - p a 和s c u p a 进行改造和重组得到的突变 体或嵌和体【l j 。如r e t 印l a s e ( 商品名r e t a v a s e ，瑞替普酶) ，t n k a s e ( t e n e p l a s e ，邢( t p a ) 、 m o n t e p l a s e 、l an o t e p l a s e ( n a t e p l a s e ，n - p a ) 【l l 】等。 第三代溶栓药物是应用现代分子生物学对第一代和第二代溶栓药物进行改造，在特 异性、半衰期、溶栓效率等方面进行改进和提高，但目前大多处于试验阶段。值得注意 的是，溶栓药物的分子结构的改变势必会或多或少地引起整个分子空间构象的改变，进 而打破此类重要生理病理调节分子多种功能的自然平衡，影响其自身的调节功能，这类 问题需要在实际应用中不断地进行探索。从现阶段看来，引起颅内出血和胃出血的危 险性依然存在，是目前急待解决的问题之一。 1 4 纤溶酶的来源及国内外微生物产纤溶酶的研究现状 1 4 1 纤溶酶的来源 “理想”的溶栓药应该具有下列特点：快速溶栓，对纤维蛋自特异，只作用于血栓 而全身反应低，效力持久；出血危险性低；无全身性副反应，无抗原性，避免全身性纤溶、 价廉等。因此寻找天然来源的纤溶酶也成了个研究热点。 在动物、植物、微生物中都发现了天然的溶栓物质。在动物来源的纤溶酶中，人们 研究的较多的是从蚯蚓1 2 1 、毒蛇和蝙蝠的唾液中提取的纤溶酶。植物来源的纤溶 酶主要是从蒲黄【”】中提取。 微生物是纤溶物质的一种重要来源，目前在细菌、真菌、藻类中都发现了纤溶酶， 其来源如下表。 第一章绪论 表1 1 纤溶酶微生物的来源 t 曲l e1 1t h es o u r c e so f m i c m o 唱a 1 1 i s mp r o d u c i n g t h e 肋r i n o l ”i ce n 纠m e 1 4 2 溶血链球菌 链激酶来源于p 溶血链球菌跏印幻c d c c 螂 o 朋d o 讲c 螂) 是最早用于临床的溶栓剂，发 现于1 9 4 9 年，直到1 9 5 8 年才开始作为药物，主要用于治疗心肌梗塞【1 6 】。 1 4 3 金黄色葡萄球菌 葡激酶即葡萄球菌激酶，也是目前获准用于急性心肌梗塞的溶栓药物之一。葡激酶 ( s t a p h y l o h n a s e ，s a k ) 是由金黄色葡萄球菌分泌的一种胞外蛋白质。葡激酶的作用机制与 s k 有相似之处，它是“间接型”纤溶酶原激活物，其本身无生物学功能。该酶不能直 接使纤溶酶原( p l g ) 转变为纤溶酶1 a s m i n ，p “) ，而是先与纤溶酶原按1 ：1 比例结合形一 成无活性的复合物p l g s a k ，继之在机体产生的少量纤溶酶启动下，纤溶酶原活性部位 暴露，由单链变为双链的纤溶酶，形成活性p l i s a k 复合物，后者进一步激活纤溶酶原 分子，使之转变为纤溶酶并进一步溶解血栓【l ”。 1 4 4 枯草芽孢杆菌 1 9 8 7 年日本学者h s 啪i 【1 9 j 等人经过对1 0 0 多种食品的筛选，首先发现日本传统大豆 发酵食品一纳豆中含有一种高效溶栓剂，该酶被命名为纳豆激酶，是由一种纳豆芽孢杆 菌c f f f 淞月口“o ) 分泌的。纳豆激酶的另一代号s u b t i l i s i n n a t 。1 9 9 2 年n a l ( 锄u m t f 2 6 】首次 对一株纳豆芽孢杆菌勘c 川姗”d f f dn c 2 1 中的纳豆激酶基因进行了研究，测定了包括调 控顺序在内全基因序列。纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶，直接降解纤维蛋白。 1 9 9 6 年韩国学者飚m 【27 】等人从本国的传统发酵食品c h u n k o o k j a i l g 中分离到一种高 活性纤溶酶，因其是由一株被命名为曰c f f f 螂印c k l l 一4 的枯草芽孢杆菌分泌的，故被命 名为c k 。c k 的n 端1 4 个氨基酸中有三个与纳豆激酶不同，而与枯草菌素c a r l s b e 理完全 相同。该酶也属于丝氨酸蛋白酶，该酶不仅能直接降解纤维蛋白也可将纤溶酶原激活成 纤溶酶，而且降解纤维蛋白的能力比纳豆激酶高6 倍。该研究组认为c k 作为口服溶栓剂 是很有前途的。2 0 0 4 1 2 s 】年韩国的n a c k s h i c kc h o i 等人克隆了纤溶酶s u b t i l i s i nd j 一4 ( 从 b d c 讲螂印d j 4 中提取) 的基因，并测定了其核苷酸序列。s u b t i l i s i n d j 4 被克隆表达后， f c f 对纤维蛋白的活性和对干酪素的活性的比值) 值是原来的2 6 7 倍。 江南大学硕士学位论文 国内对芽孢杆菌产纤溶酶也有较多的研究，最早在1 9 9 7 年傅莉等【2 9 j 报道筛选到一 株产纤溶酶的枯草芽孢杆菌，在最适条件下，酶活为2 0 0 u m l 。2 0 0 0 f 3 0 1 年懂明盛等报 道从1 7 份豆豉和1 5 份纳豆中筛选到一株产纤溶酶的菌株，经鉴定为枯草芽孢杆菌，在 条件优化后酶活达到6 8 3 u m l 。2 0 0 4 齐海萍口l j 报道从纳豆和豆豉中筛选到一株产纤溶 酶的枯草芽孢杆菌，经诱变、培养基优化后，酶活达到1 2 0 0 u m l 。四川大学的彭勇等 人【蚓从豆豉中筛选到一株产纤溶酶的解淀粉芽孢杆菌，在最适条件下发酵液酶活达到 8 2 0 u 抽l 。 1 4 5 链霉菌 由中国医学科学院和中国协和医科大学的王骏、王敏、王以光等【2 0 ，3 3 1 报道的一株土 壤链霉菌m ，0 叼忙臼够) y 4 0 5 所产生的新型的纤溶酶s w 一1 ，为一种单肽链蛋白酶。 s w 1 ，分子量为3 0 k d ，等电点为8 5 ，测定其n 端1 7 个氨基酸序列为 g a s l l p h e p r 0 ，a s p - g 1 y m e t - t 1 1 r a 1 a - i l e a l a - a s n g m a s n 一1 h g 1 n 1 1 e a s n ，n 端第一和 第二残基具有不均一性，根据氨基酸组成分析推算s w 一1 由2 6 2 个氨基酸组成。s w 1 的纤 溶活性可被1 0n 珊o l lp m s f 、1 衄o l le d t a 和1 m 0 1 l 赖氨酸完全抑制，表明s w 1 其 赖氨酸结合位点与活性有关。s w 1 的纤溶活性在4 3 7 和p h4 肚9 o 具有较好的稳定 性，最适p h 为8 0 。s w 1 对纤维蛋白具有直接的降解作用，而不具有激活纤溶酶原的活 性，是一种纤溶酶而不是纤溶酶原激活剂。 1 4 6 根霉 天津科技大学的杜连祥、刘晓兰，路福平等人从南方小药酒中筛选到一株产纤溶酶 的华根霉，根霉1 2 4 口4 】。在优化条件下的根霉1 24 固态发酵纤溶酶产量平均达7 4 5 u 儋物料 【3 5 1 。根霉1 24 纤溶酶，有直接溶解血栓和激活纤溶酶原的双重溶栓作用，降解纤维蛋白a 、 p 和t 肽链速度快；最适作用温度4 5 ，适宜作用p h 范围6 ，8 8 8 ；等电聚焦方法测定该酶 等电点8 5 士o 1 ；只分解生色底物n s u c c i n y l a 1 a - 砧a p r o - p h e p n a ，其米氏常数腼为 o 2 3 m m o lp l ，酶转换数a t 为1 6 3 6s ；m o h s h 实验和甲苯胺蓝实验均证明该酶为糖蛋 白，地衣酚一硫酸法测得该酶含糖量4 7 0 ；e d r r a 、p m s f 、p c m b 对该纤溶酶有抑制作 用，说明活性中心含有巯基、金属和丝氨，n 端1 2 个氨基酸序列为 n h 2 s e r - v a l 一s e r g l u _ i l e g i i l l e u m e t h i s a s n l e u g l y ，与其它生物来源的纤溶酶相比 较没有同源性【3 6 期。 1 4 7 脉胞霉 许爱清，刘晓兰等【3 8 】人用脉胞霉固态发酵产纤溶酶进行研究，通过紫外线一氯化锂 复合诱变，得到高产菌株，5 9 3 u g ；并研究了脉孢霉纤溶酶的部分酶学性质，确定该酶 由双亚基组成，亚基分子量分别为3 0 0 0 0 d a 、1 5 5 0 0 d a ，等电点为7 9 士o 2 ，最适作用p h 值为7 4 ，最适作用温度为5 0 ，在p h 6 6 9 和温度3 2 4 2 时较稳定。 第一章绪论 1 4 8 里氏木霉 里氏木霉( 丹七幻如r 删朋钌p 力3 0 6 是能够生物合成组织型纤溶酶原激活剂( f p a ) 的基 因工程菌株。江洁等人【3 9 】采用正交设计和响应面分析等实验方法对基因工程菌株里氏木 霉( 乃勋幻如瑚口，鲍s p f ) 3 0 6 产组织型纤溶酶原激活剂( t p a ) 的液体发酵条件进行了优化。 确定了适宜的培养基配方和最佳发酵工艺条件。在优化发酵条件下，摇瓶液体发酵液中 的t p a 酶活力达3 3 8 6 u m l ，比初始发酵条件下酶活力提高上千倍。在对其液态深层培养 时，发现菌体形态和t p a 的产生密切相关。培养基中无机盐和表面活性剂的种类和添加 量以及接种量和p h 等培养条件是影响里氏木霉3 0 6 菌体形态和t p a 合成的主要因素。在 液态深层培养过程中，菌体以松散的菌丝体形态生长，形成纸浆状发酵液刑于t p a 的合 成。 1 4 9 海洋假单胞菌 这是由青岛海洋大学刘晨光等1 4 0 】报道的又一来自微生物有待开发的溶栓药物，不过 该假单胞菌株来源特别，来自海洋中。与陆栖微生物相比，海洋微生物具有其独特的生 理特性，如：耐盐、耐高压、嗜低温等，所以海洋微生物是获取新生物活性物质的又一 重要来源，为人类提供更好的生物制品。 1 5 立题意义 中国同世界各国样，血栓病的发病率呈逐年增加的趋势，每年对溶栓剂的需求也 逐渐增加，这说明溶栓剂有广阔的应用前景。但目前l 临床治疗血栓性疾病最常用的溶栓 剂( 如尿激酶、链激酶、重组组织型纤溶酶原激活剂等) 却不尽如人意：或特异性差， 有严重负作用，或作用时间短，溶栓能力弱，需长时间大剂量使用：或生产不易，价格 昂贵。这说明研制高效率、特异性强的溶栓剂具有重要意义。因此寻找天然来源的纤溶 酶也成了一个研究热点。最近一些心血管疾病专家研究发现有些微生物所产的纤溶酶比 以上溶栓剂有效，而且安全无毒负作用。 而作为纤溶酶来源之一的微生物具有：种类繁多，容易得到，微生物繁殖快，生产 周期短，利于工业化生产，产量高，成本低等优点。 还可以将纤溶酶开发成各种剂型的产品，作为食品添加剂、食品补充剂、功能性食 品，用于心血管疾病的预防和辅助治疗。 因此从微生物中获取新的纤溶酶具有一定的优势，不仅具有重要的学术意义，而且 还具有重要的社会经济意义。 1 6 研究内容 ( 1 ) 纤溶酶测定方法的研究 江南大学硕士学位论文 采用纤维蛋白代替纤维蛋白原和凝血酶来测定酶活，与a s t n l p t 的纤维蛋白平板法 确实有一致性。因此在筛选出发菌时可采用纤维蛋白代替纤维蛋白原和凝血酶测酶活， 最终测定酶活是可采用纤维蛋白原平板法。 ( 2 ) 出发菌的筛选 产纤溶酶的微生物有很多，枯草芽孢杆菌、根霉等国内外有很多人在研究。在筛选 出发菌的过程中，从无锡调味品厂的酱油曲中筛选出几株产纤溶酶的米曲霉，具有溶解 纤维蛋白的特性，酶活达到一定水平。鉴于在国内外很少有人研究米曲霉的纤溶酶。因 此以米曲霉为出发株，进行筛选高产专一性高的纤溶酶的米曲霉菌株。 ( 3 ) 菌种的改造 采用紫外线、”c o 、亚硝基胍等诱变剂筛选高产菌株。 ( 4 ) 营养条件与培养条件的优化 通过单因素实验确定最佳氮源、碳源，然后用响应面( 中心组合实验) 法优化培养 基的组成，最后通过优化产酶的培养条件，进一步提高酶活。 圆酶的纯化及其酶学性质的初步研究 通过脱色、盐析、透析浓缩，然后再经过离子交换、凝胶层析，分离纯化纤溶酶， 并对纤溶酶的基本酶学性质进行初步的研究。 第二章菌种选育 第二章菌种选育 菌种选育是酶生产过程的关键一步，菌种性能的优劣，产量高低直接影响到微生物 发酵生产的成本，因此对纤溶酶产生菌种进行改造很有必要。随着生物科学技术的发展， 对菌种改造的手段越来越多，例如传统的诱变、构建基因工程菌、原生质体融合、转导、 转化等。而传统的诱变由于其操作简单，突变率高的优点，仍然是现在育种的常用手段 【4 l ，4 2 1 。 本研究拟从国内外尚未深入研究的产纤溶酶的米曲霉为出发菌株，通过诱变育种方 法，筛选特异性强，活性高的突变株。 2 1 材料和方法 2 1 1 实验仪器 y p 型电子天平 手提式灭菌锅 无菌操作台 x s p 1 8 生物显微镜 电热恒温培养箱 电热鼓风干燥箱 t n 1 0 0 b 型托盘扭力天平 磁力搅拌器 h 1 微型混合器 h y g 回转式恒温摇瓶柜 p h s 2 5 型精密数显酸度计 数显恒温水浴锅 水浴恒温振荡器 f a l 0 0 4 上皿电子天平 2 1 2 主要试剂 人纤维蛋白原 凝血酶 尿激酶 纤维蛋白粉 琼脂糖 上海精科天平 上海三申医疗器械有限公司 苏州净化设备厂 中国南京江南光学仪器厂 连云港医疗器械设备厂 上海实验仪器有限公司 上海第二天平仪器厂 上海曹行无线电元件厂 上海彭氏实业有限公司 上海欣芯自动化设备有限公司 上海天达仪器厂 金坛市富华仪器有限公司 江苏省太仓市医疗器械厂 上海精密科学仪器有限公司 上海莱士血制品有限公司 珠海经济特区生物化学制药厂 珠海经济特区生物化学制药厂 江南大学食品学院 中国医药集团上海化学试剂公司 江南大学硕士学位论文 亚硝基胍( n 1 g ) 6 0 c o 源 豆饼粉 麸皮 酱油大曲 2 1 3 培养基 s i g m a 无锡轻工大学辐照中心 无锡山禾集团提供 购于无锡吴桥农贸市场 无锡酱油厂 斜面培养基( 豆汁培养基) ：黄豆l o g ，浸泡过夜，煮沸2 h ，取豆汁1 0 0 m l ，然 后加入：蔗糖3 9 ，琼脂1 5 9 ，m g s 0 4 0 0 5 9 ，k 2 h p 0 4 0 ，0 3 5 9 平板培养基( 察氏培养基) ：n a n 0 32 9 ，k 2 h p 0 4l 岛k c l0 5 9 ，m g s 0 40 5 岛f e s 0 4 0 0 1 9 ，蔗糖3 0 9 ，琼脂1 5 2 0 舀加水至1 0 0 0m l ，p h 自然 初筛培养基：在察氏培养基中加入5 舡纤维蛋白粉。 基础发酵培养基：麸皮4 0 9 l 、豆饼粉2 0 9 l 、水3 0m l ，p h 自然，2 5 0m l 三角 瓶分装，0 1m p a 下灭菌2 0r i l i n 。 2 1 4 菌株筛选 将分离的样品放入灭菌三角瓶中，加入2 5 m l 灭菌生理盐水，震荡摇晃，然后稀释 一定的梯度，取o 2 i n l 涂布在含有青霉素( 5 0 m g ，l 培养基) 和过氧胆酸钠( o 1 9 ，l 培 养基) 的初筛培养基上，培养3 d ，观察菌落形态，镜检菌丝体和孢子。霉菌的鉴定参 照文献【4 3 l 2 1 5 筛选方法 初筛：米曲霉所产纤溶酶会使纤维蛋白溶解，在初筛平板上会出现透明圈。可以根 据透明圈初步筛选产纤溶酶菌株。 复筛：把初筛得到的菌株用基础发酵培养基进行摇瓶发酵，温度为3 0 ，摇床转 速为2 0 0 r m i n ，发酵6 0 h ，然后测定发酵液纤溶酶酶活。 21 6 纤溶酶酶活测定方法 2 1 6 1 终维蛋白原平板法( 方法i ) 酶活测定方法参照文献，45 1 ，的方法，在血纤维蛋白平板上，以尿激酶为标准品进 行测定，测得的结果为相当于尿激酶的单位数。具体方法如下： 血纤维蛋白平板制各 取0 2 5 9 琼脂糖加入5 0 m l 巴比妥缓冲液( p h 7 8 ) ，加热溶解后置5 0 水浴中保温 3 0 m i n 后加入2 0 0 u m l 的凝血酶1 m l ，混匀。取o 2 9 血纤维蛋白原溶于5 0 m l 巴比妥缓冲 液( p h7 8 ) 中，置5 0 水浴中保温3 m i n 。分别取5 m l 凝血酶溶液与5 m l 血纤维蛋白原溶 液混合均匀后快速倒入平板中，待冷却后放入冰箱中备用。 标准曲线绘制 1 0 第二章菌种选育 把尿激酶标准品稀释成1 0 u 、2 0 u 、3 0 u 、4 0 u 、5 0 u ，然后取不同浓度的标准品1 0 此， 点于血纤维平板上，3 7 培养18 h ，然后取出测量溶圈的垂直的两个直径，计算两个直 径的乘积，反复测定3 次，求得平均值。根据a s t m p 等的报道，溶圈的两垂直直径之积 ( a ) 与浓度( c ) 有以下关系，a = k c o ，所以以测定的不同浓度的溶圈的垂直直径乘积的 对数对不同浓度标准品的对数作一元线性回归，得到标准曲线。 酶活力测定 取待测品1 0 此，用同样的方法检测，从标准曲线上查得待测品的单位数。 2 1 6 2 纤维蛋白平板法( 方法) 取o 2 5 9 琼脂糖加入5 0 m l 巴比妥缓冲液( p h7 8 ) ，加热溶解后置5 0 水浴中保温 3 0 m i n 。取0 2 9 自制血纤维蛋白于5 0 m l 巴比妥缓冲液( p h7 8 ) 中，置5 0 水浴中保温3 m i n 。 分别取5 m l 琼脂糖溶液与5 m l 自制血纤维蛋白溶液混合均匀后快速倒入平板中，待冷却 后放入冰箱中备用。由于纤维蛋白不溶于缓冲液，在做纤维蛋白平板时一定要混均匀。 把发酵液1 0 儿l 点于纤维蛋白平板上，3 7 培养1 8 h ，然后取出测量溶圈的垂直的两个直 径，计算两个直径的乘积，反复测定3 次，求得平均值。 2 1 7 诱变方法 2 1 7 1 紫外诱变 孢子悬浮液的制备：取3 0 培养3 d 的斜面菌种，加无菌生理盐水洗下孢子，两层擦 镜纸过滤至盛有玻璃珠的无菌三角瓶中，3 0 ，l o o r m i n 振荡6 h 使孢子分散，将其浓度调 至约l o 。个m l 。 诱变：吸取l o m l 单孢子悬浮液于直径为9 c m 的培养皿中，磁力搅拌下用紫外灯照射。 紫外灯功率为1 5 w ，距离为2 0 c m ，时间为2 1 5 m j n ，适当稀释，取o 1 m l 涂布于初筛平 板。3 0 培养3 d ，并计算其致死率。 2 1 7 - 2 ”c o 诱变 首先制备浓度约为1 0 6 个m l 的单孢子悬液，然后用”c o 辐射，照射剂量为6 1 0 4 r 、 8 1 0 4 r 、1 0 1 0 4 r 、1 2 1 0 4 r 、1 4 1 0 4 r ，适当稀释，取0 1 m l 涂布于初筛平板。3 0 培 养3 d ，并计算其致死率。 2 1 7 3 亚硝基胍诱变 浓度约为1 0 6 个m l 的孢子悬液1 m l 与浓度为1 m m l 亚硝基胍溶液( 用p h 6 o 的磷酸 缓冲液配制) l m l 混合，3 0 ，作用4 5 m i n 。立即稀释1 0 0 0 倍停止作用，然后适当稀释， 分别吸取o 1 m l 涂布初筛平板。3 0 ，培养3 d 。 2 2 结果 2 2 1 产纤溶酶米曲霉的筛选与鉴定 由于以前很多产纤溶酶的微生物是从大豆发酵制品中分离出来的，因此作者所取样 江南大学硕士学位论文 品大都与发酵豆制品有关，如：酱油大曲( 无锡酱油厂) 、堆放豆腐渣场地的土样、豆 豉、酱、屠宰场阴沟土样。 先从初筛平板中挑取有透明圈的菌株，如图2 1 ，然后利用摇瓶复筛获得高产菌株。 对筛选到的菌株进行培养观察和镜检。产纤溶酶曲霉菌株，菌落形态：菌落初为白色， 黄色，继而变为黄褐色，淡黄绿色。镜检：分生孢子头呈放射形，少有疏松柱状，分生 孢子梗多为单层，少有双层，分生孢子洋梨形。根据菌落形态和镜检，初步鉴定分离到 的菌株为米曲霉。 产纤溶酶的细菌菌株，通过镜检发现是带有芽孢的杆菌。 图2 1 带有透明圈的菌株 f i g 2 1c l a r i t yc i r c l eo f t h es 诅i n 从样品酱油大曲中筛选出一株产酶活性最高的米曲霉菌株为s a 一6 ，其纤溶酶酶活为 2 5 o u ，m l 。鉴于国内外尚未深入研究米曲霉产纤溶酶，所以选择s a 。6 为出发菌株，进一 步进行菌种改造。利用米曲霉所产纤溶酶会使纤维蛋白溶解，在平板上会出现透明圈的 方法作为初筛方法，大大减少了工作量，增加了筛选的目的性和确定性。 2 2 2 两种酶活测定方法的比较 2 2 2 1 尿激酶标准曲线 尿激酶标准品在纤维蛋白原平板上的标准曲线如图2 2 。尿激酶标准曲线方程为 y = 0 5 7 4 6 x + 1 3 5 6 4 第二章稿种选育 坦 瓤 霞25 萎 墓 z 墨 嘲 l5 l5 225 酶活单位数对数值 | 封2 2 标准曲线 f l g22t h es t a n d a r dc u r v eo f u k 2 2 2 2 两种方法的比较 发酵液在纤维蛋白原平板和纤维蛋白平板上的透明阁如图23 和2 4 。从图中可看出 发酵液在两种i 板上都有l ! _ | 显的清晰的透明圈。 用方法f 测定f “不同发酵液在纤维蛋白原5 f i 板上的透明圈而积，汁算出酶活。同时 用方法i i 测定出不同发酵液在纤维蛋白平板上的透明圈面积，以两种透明圈面积和酶活 作图翻f 图25 。从耍l 图2 5 中可看出方法i j 的透明圈面积随着酶活的增大而增大，透】 陶而积的增大能反应出酶活增加的趋势，因此可以用方法i i 中的透l 圈而积大小米表示 发酵液酶活的商低。虽然方法1 i 的准确性不如方法i ，但是纤维蛋白比纤维蛋白原价格 便宜很多，而且方法j i 操作村l 对简单。 在诱变育种筛选菌株时。需要通过大量测定发酵液酶活。来筛选高产菌株，如采用 价格很便宜纤维蛋白代替价格昂贵的纤维蛋白原和凝血酶，进行初筛，就可以大大减少 纤维蛋白原的使用，节省很多试验经费。因此在菌株的大通量筛选过程中用方法1 1 测定 晦活，最终确定酶活时j ；l = j 方法i 。 图2 1 3 纤维蛋白原平板 f l g2 3t h op l a t eo fp l a s m i n o g e n 图2 4 纤维蛋白平扳 f 1 924t 1 1 ep l a t eo f p l a s m m 江南大学硕士学位论文 3 5 0 。3 0 0 e2 5 0 娶2 0 0 辩 蝌5 0 o u2 u4 t j6 【j8 0l ( ) 0 纤溶酶酶活0 ，m i