（环境科学专业论文）脉冲强光对典型微生物灭活效能与机理研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t w i t hp e o p l e sl i v i n gs t a n d a r d si m p r o v i n g ，r e q u i r e m e n t so nd r i n k i n gw a t e rq u a l i t yh a v e b e c o m em o r es o p h i s t i c a t e d i nr e c e n ty e a r s ，c l i m a t ec h a n g e ，e a r t h q u a k e s ，t s u n a m i sa n do t h e r n a t u r a l d i s a s t e r so nt h eg l o b a lo c c u r r e df r e q u e n t l ya n dc a u s e dag r e a ti m p a c to ns o u r c eo f d r i n k i n gw a t e r ，t h r e a t e n e dt h ed r i n k i n gw a t e rs a f e t y w o r l dh e a l t ho r g a n i z a t i o n ( w h o ) s u r v e yf o u n dt h a tm o r et h a n6 0 h u m a nd i s e a s ew h i c hc a u s e db yt h eb a c t e r i a la r ei n f e c t e d t h r o u g hd r i n k i n gw a t e r s a f e t yo fd r i n k i n gw a t e rf o rp e o p l e , m u s tb ed r i n k i n gw a t e r d i s i n f e c t i o n t h em e t h o do fd r i n k i n gw a t e rd i s i n f e c t i o nm a i n l yi n c l u d et h el i q u i dc h l o r i n et od i s i n f e c t ， t w oo x i d i z ec h l o r i n ed i s i n f e c t i o n ，u l t r a v i o l e tr a d i a t i o nd i s i n f e c t i o na n do z o n et od i s i n f e c te t c t h ed e v e l o p m e n to fm o d e r na n a l y t i c a lt e c h n i q u e sa n dh e a l t ht o x i c o l o g i c a ls t u d i e s ，i tw a s d i s c o v e r e dt h a tc h l o r i n ed i s i n f e c t i o nd i s i n f e c te f f e c t i v e ，t h i n kt o w a r d sc l e a n i n gt h ea q u a t i c o r g a n i cm a t t e rr e s u l td i s r e g a r d ，w o u l da l s ob o m2 0v a r i o u sv i c e - o u t c o m e s ，i n c l u d et h r e e b i t t e r na c e t i ca c i de t c c a r c i n o g e na n dc h l o r i n ed i s i n f e c t i o ni sn o te f f e c t i v ea g a i n s t c r y p t o s p o r i d i u ma n dc y s t s ；i nt h eo z o n a t i o np r o c e s sw i l lp r o d u c eac a r c i n o g e n i ce f f e c to f b r o m o f 0 1 i 1 ，d i b r o m oa c e t i ca c i da n db r o m a t ea n do t h e rb y - p r o d u c t s ，a n dc h l o r i n ed i o x i d ea n d i t sb y p r o d u c t sc h l o r i t ea n i m a l sw i l lh a v es o m en e g a t i v ee f f e c t so ft h eb i o l o g i c a l ；u v d i s i n f e c t i o nu s el o wp r e s s u r em e r c u r yl a m pt od i s i n f e c t i o ni nar o w , l o wp o w e r , p o o r p e n e t r a t i o no f t h ew a t e rl a y e r , w h i l ei n a c t i v a t i o nb yu vi r r a d i a t i o nv i r u s e sa n db a c t e r i ac a nb e l i g h tt or e s t o r et h ed a m a g e dt i s s u ei t s e l f , t or e v i v et h ep u r p o s eo f ( 1 i g h tr e p a i r ) ，a n de v e nr e p a i r i t s e l fw i t h o u tl i g h t ( d a r kc u l t i v a t i o n ) ，s oi t ss t e r i l i z a t i o ni sv e r yr e s t r i c t e d a san e wp u l s e dl i g h ts t e r i l i z a t i o nt e c h n o l o g yh a sb e e np r o v e nt oh a v eap o t e n t i a l d r i n k i n gw a t e rd i s i n f e c t i o ne f f e c t i v e n e s s h o w e v e r , l i t t l er e s e a r c ha th o m ea n da b r o a d ，i tw a s s t i l lab l a n ki nc h i n a t h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h ep u l s e dl i g h ti n a c t i v a t i o no fe s c h e r i c h i ac o i l , s t a p h y l o c o c c u s a u r e u sa n db a c i l l u ss u b t i l i sa n dt h ee f f e c to fi n f l u e n c i n gf a c t o r s ，c o m b i n e dw i t ht r a n s m i s s i o n e l e c t r o nm i c r o s c o p y ( t e m ) a n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p y ( s e m ) ，o b s e r v e dt h ep u l s e d l i g h ti r r a d i a t i o nc h a n g e st h ef o r m a n ds t r u c t u r eo fb a c t e r i a t h er e s u l t ss h o wt h a t ： ( 1 ) p u l s e dl i g h to nt h ew a t e ri ne s c h e r i c h i ac o l i ，s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n db a c i l l u s s u b a l i si n a c t i v a t e ds t r o n gp e r f o r m a n c e t h eb e s tv o l t a g et ot y p i c a lp u l s e dl i g h ti n a c t i v a t i o no f m i c r o o r g a n i s m si s3 0 0 0 v l i g h tf l a s h e s12t i m e se s c h e r i c h i ac o l i , s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s ，l i g h t f l a s h e s1 4t i m e s ，b a c i l l u ss u b t i l i s ，l i g h tf l a s h e s2 0t i m e s ，i n a c t i v a t i o nr a t e sh a v er e a c h e d5 3 1 l o g i n a c t i v a t i o nr a t eo fe s c h e r i c h i ac o i la n db a c i l l u ss u b t i l i si n c r e a s e sw i t ht h eb i o - l o a d ( 2 ) t h ei n f l u e n c eo nt y p i c a lm i c r o o r g a n i s m sw i t hp u l s e dl i g h ts t e r i l i z a t i o ni st h a tb a c i l l u s i i a b s t r a c t s u b t i l i s s t a p h y l o c o c c u sa u r e u s e s c h e r i c h i ac o l i ( 3 ) s t e r i l i z a t i o no fp u l s e dl i g h th a dl i t t l ei n f l u e n c eo np ho fm i c r o o r g a n i s m s t h el o w e s t i n a c t i v a t i o nr a t eo fe s c h e r i c h i ac o ba t6 0 c ，170 c i st h eh i g h e s t ；t h eh i g h e s ti n a c t i v a t i o nr a t eo f s t a p h y l o c o c c u sa u r e u sa n d b a c i l l u ss u b t i l i sa tl5 ，t h el o w e s ta tlo 。c ( 4 ) t h ei n a c t i v a t i o nr a t eo fl i g h tp u l s e si n c r e a s i n gw i t hw a t e rt u r b i d i t yd e c r e a s e d t h e m o r el i g h tf l a s h e st h es m a l l e ro ft h et u r b i d i t y , s ow ec a na p p r o p r i a t ei n c r e a s et h ef r e q u e n c yo f l i g h tf l a s h e sa c c r o d i n gt ot h et u r b i d i t yo f w a t e rt oe n s u r et h ei n a c t i v a t i o nr a t e ( 5 ) a f t e rt h ep u l s el i g h tf l a s h e s ，t h r e es t o r a g ec o n d i t i o n sw e r en o ts i g n i f i c a n t l y p h o t o r e a c t i v a t i o np h e n o m e n o n a n dw i t ht i m e ，t h ec o n c e n t r a t i o no fb a c t e r i aw i l lb er e d u c e di n w a t e rs a m p l e s ( 6 ) u s es c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p ya n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p yt oo b s e r v e t h a tp u l s e dl i g h tc a nd a m a g et h ec e l lm e m b r a n ea n dc e l lw a l lo fb a c t e r i aa n dl o g i s t i c so u to fi t s c o n t e n t s ，r e s u l t i n gi nm i c r o b i a ld e a t h k e y w o r d s p u l s e dl i g h t ；s t e r i l i z a t i o n ；m e c h a n i s m ；d r i n k i n gw a t e r ；e l e c t r o nm i c r o s c o p y 1 1 i i 绪论 1 绪论 1 1 饮用水消毒技术概况 人类在1 9 世纪末就将水质与人体健康联系起来，认识到一些传染病如霍乱、伤 寒、痢疾等是通过饮水传播的。世界卫生组织( w h o ) 调查指出，人类有8 0 疾病与 细菌感染有关，其中6 0 以上是通过饮用水传播的，农村5 0 的疾病是由饮用水污染所 致。为了人们的饮水安全，要对饮用水进行一系列的处理才可饮用，自来水生产一般分 为四个阶段，取水、过滤、消毒、输水，其中消毒是饮用水安全的重要保障。 目前国内外水处理中使用的消毒方法有很多，化学药剂消毒方法有卤素消毒( 氯 气、次氯酸盐、氯胺、二氧化氯) 、臭氧和过氧乙酸；物理消毒方法有砂滤或膜过滤、 超高静压技术、脉冲电场技术、振荡磁场技术、超声波技术；光化学消毒包括辐照杀菌 和紫外线消毒；此外，还包括电化学消毒方法以及一些消毒方法的联合方法，如臭氧生 物活性炭( 0 3 b a c ) 技术【l 】等。而应用较为广泛的消毒方式主要为以下4 种：液氯消 毒、二氧化氯消毒、臭氧消毒、紫外线消毒。 液氯消毒：液氯消毒是最早的消毒技术。主要作用成分是氯溶于水形成的次氯酸， 次氯酸带中性电荷，易穿透细胞壁，而它的强氧化性能损坏细胞膜，使细胞内的蛋白 质、d n a 等物质渗出，使细菌死亡。液氯消毒因效果可靠、操作简便、价格便宜、工 艺成熟等特点，是目前我国绝大部分地区水处理厂消毒的首选。但是随着科技的发展以 及人们对液氯消毒的深入研究，人们发现氯消毒会产生致畸、致癌、致基因突变的卤代 烷等副产物，并且氯消毒不能有效杀灭隐孢子虫及其孢囊，尤其是对于伴随水体富营养 化产生的剑水蚤和摇蚊幼虫污染问题更是作用甚微【2 】。 二氧化氯消毒：二氧化氯是一种强氧化剂，在水中几乎1 0 0 以分子状态存在，易 于透过细胞膜，作用于微生物蛋白质中的氨基酸，控制微生物蛋白质合成导致微生物死 亡。它能杀灭水中的细菌、病毒和具有很强抗氯性的隐孢子虫，而且能杀灭原虫和藻 类，不会生成三卤甲烷等氯化副产物，并且余氯稳定持久，可防输水管网的二次污染， 成为代替氯的重要消毒剂。但随着现代分析检测技术和卫生毒理学研究的发展，研究发 现二氧化氯及其副产物亚氯酸盐会对动物产生一定的生物学负效应【3 1 ，并且二氧化氯具 有爆炸性，使用时一般要现场制备即时使用。 紫外线消毒：紫外线有杀菌作用的光谱范围是2 4 0 - - , 2 8 0 n m ，饮用水消毒常用2 5 4 n m 波长的紫外线。微生物体内核酸、原浆蛋白与酶吸收紫外线，使其发生化学变化而造成 微生物死亡。紫外线还可使d n a 上相邻的胸腺嘧啶键合形成胸腺嘧啶二聚体，致d n a 失去转录能力而死亡。紫外线消毒法以其不产生有毒有害副产物、高效率、广谱性、便 于运行管理和实现自动化等其它消毒手段无法比拟的优点，近2 0 年来广泛应用于污水 处理、净水等领域。但是，由于紫外线消毒使用低压汞灯连续消毒，紫外线发射功率 东北林业人学硕上学化论文 低，对水层穿透能力差，同时被紫外照射失活的病毒细菌可通过光的协助修复自身被破 坏的组织，达到复活目的( 光修复) 【4 j ，甚至可以无需光协助修复自身( 暗修身) 垆j ， 因此其杀菌能力受到很大限制 6 ，7 】，多用于表面杀菌。 臭氧消毒：臭氧是自然界最强的氧化剂之一，几乎对所有病菌、病毒、真菌、霉菌 及原虫、卵囊都具有明显的灭活效果，具广谱杀微生物作用，早在1 9 世纪被应用在水 处理中。臭氧可以改变细菌细胞的通透性，破坏病毒衣壳蛋白的多肽链并损伤r n a 。 臭氧的灭菌速度和效果较二氧化氯和氯好，速度快，很多水厂前处理中已采用它作为氯 的替代消毒剂。但是臭氧极不稳定，容易自行分解，消毒设备复杂，而且水出厂后无法 对管网输水持续消毒，在饮用水消毒中没有广泛使用，却是桶装饮用水消毒的理想手 段，我国大部分正规桶装饮用水生产企业都使用臭氧进行消毒。目前发现，在臭氧化过 程中会产生有致癌作用的溴仿、二溴乙酸和溴酸盐等副产物，易增加水的生物不稳定 性。 随着人们生活水平的提高，人们对饮用水的水质要求也越来越高。然而我国多数水 源的原水水质相对较低，绝大多数水厂仍然主要采用的是常规给水处理工艺，导致我国 城市自来水水质明显低于国外发达国家。近几年气候的变化对全球饮用水造成了很大的 影响，洪水和干旱两极严重，地震等自然灾害频发，更加剧了人们对饮用水安全的需 求。因此综合以上消毒技术的特点与实际应用相结合，完善消毒技术与工艺开发新型杀 菌技术是十分必要和紧迫的。 1 2 脉冲强光杀菌技术 脉冲强光杀菌技术是一种新型冷杀菌技术，利用强烈白光闪照进行杀菌。它的最基 本结构是由一个动力单元和一个惰性气体灯( 氙灯) 单元组成。动力单元可提供高电压 高电流，为氙灯提供脉冲能量，使氙灯发出从紫外线至近红外线区域的光线 ( 2 0 0 - - 1 1 0 0 r i m ) ，其光谱与太阳光接近，动力单元中的电容器以相对长的时间( 几分之 一秒) 来积累电能，却在很短的时间( 最短可达十微秒) 内释放这些贮存的能量【s 】，增 大能量的效果，强度比太阳光强数干倍至数万倍，在有效循环期间有一个非常高的能 量，却只消耗中等能量的费用。脉冲强光是仅次于激光，亮度最高的种光源，宽度一 般为1 0 一1 0 。s ，瞬时亮度可达1 5x1 0 1 0 c d m 2 ，通光量可达1 0 8 l m 。研究表明，脉冲强光 对细菌、酵母茵、霉菌和病毒均有杀灭作用，使其被人们关注。脉冲强光杀菌技术开始 主要应用在医药卫生领域医疗器械表面杀菌消毒和透明药剂溶液杀菌，取得了比较显著 的杀菌效果，随着该杀菌技术和设备的成熟，逐渐过渡应用到食品杀菌保藏中。1 9 9 5 年 一1 9 9 7 年d u n n g a o 等研究发现脉冲强光对饮用水也有很强的杀菌效果。对陆源克雷白氏 菌、小隐球孢子霉的卵囊，及在水中或悬浮状态的其它微生物，均有高的灭活作用。 脉冲强光杀菌技术与传统的杀菌方法相比，具有操作简单、杀菌快速、无残留、对 环境污染小等特点。与紫外线的连续消毒相比，脉冲强光技术优势主要有以下几点： ( 1 ) 对某些细菌、病毒具有更高的杀灭效率，包括具有很强抗性的枯草芽孢杆菌。达 1 绪论 到相同杀灭效率时，脉冲强光和连续紫外的辐射剂量分别为4 m j c m 2 和8 m j c m 2 1 11 , 1 2 ， 二者差别明显。( 2 ) 非常短的脉宽和高峰值能量使脉冲强光具有更快的消毒速率。达到 相同的杀灭效率，脉冲强光只需要几个脉冲就可完成，而连续紫外却需要更长的接触时 间 1 3 , 1 4 。( 3 ) 高峰值能量的紫外脉冲比连续紫外线具有更强的水层穿透能力【15 1 。( 4 ) 短 而高的能量爆发相比较于连续紫外线消毒，消耗了更少的能量；另外，高峰值能量脉冲 诱发了更快速的反应。 1 2 1 脉冲强光杀菌机理 脉冲强光杀菌机理目前还不完全清楚。由于脉冲光的波长很宽( 2 0 0 - 1 1 0 0 n m ) ，处 在电磁波的非离子化段，不能使小分子离子化。最初认为不仅u v c ( 2 0 0 2 8 0 n m ) 波段 而且可见光波段也起杀菌作用【1 6 1 。直到2 1 世纪初，w e k h o t = 【1 7 】发现脉冲强光对微生物的 致死作用主要通过u v c 来完成，同时微生物吸收脉冲紫外的高峰值能量后有机体由于 过热而死亡。这方面许多研究者以广泛研究，脉冲光光谱中所含紫外线波长被蛋白质与 核酸高度结合的碳一对一碳双键系统吸收，进而破坏其结构达到抗微生物效应。w a n g 1 4 1 等进一步证实在2 7 0 n m 附近脉冲强光对大肠杆菌的灭活效率最高，江天宝【l8 】证实脉冲 强光起杀菌作用的主要波段可能是紫外光波段，其他波段的光具有一定的协同作用。张 佰清【1 9 】研究发现脉冲强光会破坏细胞膜和细胞内大分子酶等。但脉冲强光杀菌和紫外线 ，杀菌有明显的区别，脉冲强光具有高能量和高强度特点，对细胞的破坏作用比单独某一 波段的光强，并且脉冲强光宽谱的光能产生全面的、不可逆的破坏作用，使得菌体细胞 的细胞膜、d n a 、蛋白质和其他大分子遭到破坏【2 0 】。 综合已有国内外研究成果，脉冲强光杀菌机理主要有以下三个方面： 一一 ( 1 ) 光化学反应：脉冲强光光谱中的紫外光部分通过形成胸腺嘧啶二聚体损坏细 菌d n a ，导致细胞死亡或孢子钝化。 ( 2 ) 闪照热效应：脉冲强光光谱中的的可见和红外部分对细菌细胞或孢子有一个 热效应，导致了酶和其他细胞成分的钝化。 ( 3 ) 脉冲效应：脉冲强光的穿透性和瞬时冲击损坏了细胞壁和其他细胞成分，导 致细菌死亡。 1 2 2 脉冲强光杀菌装置 1 2 2 1 主要结构 脉冲强光杀菌装置主要结构如图1 - 1 所示。 ( 1 ) 高压直流发生器：高压直流发生器为封闭的直流开关电源，为脉冲光的形成 提供能量，最高电压可达4 k v 。 ( 2 ) 强光发生器：采用惰性气体( 氙) 灯管，在灯管两端装有电极，一根导线 ( 触发丝) 缠绕灯管，通常灯管电流不通，当触发电压足够高时，管内氙气电离，氙气 管成为导体，并闪光。 ( 3 ) 脉冲发生器：脉冲发生器包括电容和电感，从电源获得电能，在氙气灯两端 东北林、i k 人学硕上学化论文 形成高电压，有效产生高频率、短时间脉冲强光。 ( 4 ) 系统触发器：系统触发器可触发电离氙气必须的高压脉冲，通过光电隔离器 与控制器连接。 ( 5 ) 光电隔离器：通过光、电控制系统，在传递控制器作息的同时，隔离高压区 和低压区，以避免系统干扰。 ( 6 ) 控制器：可调节输入电压和闪照次数，显示工作状态。 ( 7 ) 杀菌箱和反光罩：杀菌箱包括金属壳体、处理平台和密封门，反光罩用于固 定氙气灯管并反光。 1 2 2 2 工作原理 图1 1脉冲强光杀菌设备主要结构示意图 i 调压充电 i 键盘 惰 i 性 m c u l 高压脉冲 l 7 气 体 l 灯 i 显示器 i 工作参数测定i 图l - 2 脉冲强光杀西装置工作原理图 如图1 2 所示，脉冲强光杀菌装置由动力单元、惰性气体灯单元及单片机控制单元 三部分组成。设备输入的市电经变压器升压后，形成最高电压可达4 k v 的电压，对高压 直流发生器的电容器进行充电，通过强光发生器( 氙气灯两端) 形成直流高压。通过系 统触发器，产生1 个高压脉冲，升压后电流使缠绕在氙气灯管上的触发丝产生瞬时电 感，使灯管内的氙气电离导通，形成持续时间极短的闪光，对样品进行杀菌。在此同 时，电容放电导致灯管两端高压也随之迅速下降，使氙气灯通路截止，电容器又开始充 电为灯的下一次闪光积蓄能量。 i 绪沦 1 2 3 脉冲强光杀菌的影响因素 脉冲强光杀菌效果也受到很多因素的影响：( 1 ) 脉冲强光的性质：光源中不同光谱 成分对杀菌效果产生影响，同时杀菌时脉冲强光的强度也会对杀菌效果产生影响，杀菌 作用时间、受照射物离光源的距离也对杀菌效果有影响。( 2 ) 微生物的性质：不同种类 的微生物对脉冲强光的抵抗力小同，对脉冲强光杀菌具有较大影响，有研究表明脉冲强 光对一些菌种灭活难易程度顺序是黑曲霉菌、桔青霉菌、枯草芽抱杆菌、耐糖酵母菌、 啤酒酵母菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆创1 8 】。同时微生物存在状态也会影响 杀菌效果，如微生物以菌块或者菌团的形式存在时，可以延缓脉冲强光对微生物的伤 害。( 3 ) 处理对象的物态：被照射物料的透明性决定了脉冲强光在物料中的穿透深度， 物料的透明性好，脉冲强光的穿透深度大，对物料内部的杀菌效果就好。对于空气和 水，因为它们具有很高的透明性，因而可使包括可见光和紫外线在内的宽谱范围内的光 均透过，可以实现对这些物料的整体杀菌。另外一些流体( 液体) 如糖液、酒等则表现 出一定的透明性，脉冲强光的穿透深度有限，实现对这些物料的整体杀菌较为困难。当 物料不透明时，脉冲强光只能对物料表面很薄的一层起作用，而不能穿透到物料的内 部。此外，物料的形状、颜色也都对脉冲强光的杀菌效果有一定的影响。物料不同的包 装材料，脉冲强光对其杀菌效果也有一定程度的影响，对于透光性好的包装材料，内部 产品可直接透过包装来进行杀菌。 1 2 4 脉冲强光杀菌技术国内外研究现状 脉冲强光消毒技术在国内外的研究较晚，目前仍处于起步阶段。关于用脉冲强光进 行消毒的研究报道起源于7 0 年代后期的日本，1 9 8 4 年在美国注册专利【2 1 1 ，上世纪9 0 年代美国圣地亚哥纯脉冲技术研究所发明了一种杀菌新技术，称之为“纯亮”杀菌。此后 美国x e n o nc o r p o r a t i o n 进行系列脉冲强光杀菌设备研发，并与美国宾州大学合作进行各 种食品杀菌试验，获得良好的效果，从而使该公司设备获得美国市场认可，该公司 r s 3 0 0 b 、r s 3 0 0 c 和r s 3 0 0 m 系列脉冲强光杀菌设备被用于鱼片、肉丁等食品以及血液 的杀菌。 通过对国外文献资料的广泛收集、查阅与分析，发现主要是国外大学或研究机构对 脉冲强光技术开展了研究工作，主要集中在微生物的杀灭效果研究上。现有资料表明， 脉冲强光对大多数细菌、真菌、病毒和原生动物具有极为显著的杀灭效率。r o w a n 等对 脉冲强光的杀菌效果进行了研究，结果表明：2 0 0 次脉冲( 脉宽1 0 0 n s ) 可以使食物表 面的金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等细菌的数量减少6l o g ( 1 0 9 = l o g ( n o i v ) ，其中 为灭菌前细菌的数量，为灭菌后细菌的数量) 2 2 1 ，比传统的紫外线更为有效。同样， p e t e r 和a n d r e w 的研究证明在脉冲强光照射剂量为2 j c i n 2 条件下，磷酸盐缓冲溶液中的 生殖器疱疹病毒、痘状病毒、脊髓灰质炎病毒、乙肝病毒和噬菌体的灭活效率都能达到 4 8 l o g 以上【2 3 1 。针对容易引起水果霉变的真菌，m a n u e l 等的研究表明仅需要脉冲强光 处理l o s ( 每次脉冲照射剂量为1 0 m j c m 2 ) ，水果表面真菌的灭活效率能达到5l o g 以上 东北林、眦人学硕上学位论文 1 1 3 ；经5 个脉冲( 照射剂量为3 5 j c m 2 ) 酵母菌的数量由最始的1 0 。7 c f u m l 减少到 1 0 c f u m l 2 4 1 。脉冲强光还能高度灭活水中的隐孢子虫卵囊，当水中隐孢子虫卵囊的数量 为1 0 4 个m l 时，5 0 0 m j c m 2 的照射剂量可达4 01 0 9 的灭活率。由于微生物种类繁多， 形态和特征各不相同，对脉冲紫外照射的敏感性也不同。大多数革兰氏阳性菌比阴性茵 的抗受性更强：细菌比霉菌和酵母菌等真菌更容易被脉冲强光所灭活。例如，1 0 0 0 个脉 冲( 脉宽8 5 n s ) 大肠杆菌的死亡率在8l o g 以上，而曲霉菌仅为4 5l o g 2 5 】。 国内有关脉冲强光技术的研究报道很少，主要是一些综述文章【2 砚引，研究水平与国 外同行相比存在很大的差距。由于缺乏脉冲强光处理装置，很大程度上阻碍了相关研究 工作的进行。近年来国内已展开了相关的研究工作，周万龙1 2 9 j 先采用升压变压器技术， 实现脉冲闪光灯的泵浦电源，后采用电容并联充电、串联放电的特殊电路设计及单片机 控制技术，实现了电源控制、参数检测的自动化，研制了国内首台自动控制脉冲强光杀 菌装置，进行了脉冲强光对细菌、霉菌和酵母茵的灭活试验【3 0 圳，以及在食品杀菌和保 鲜方面的研究1 3 2 , 3 3 ；马风鸣等利用电容的自然放电时间作为脉冲宽度，设计了双电源脉 冲发生电路，研制了脉冲强光杀菌装置，并进行了杀菌试验1 3 4 , 3 5 1 ；江天宝【1 8 】采用玻璃过 滤器研究脉冲强光的光谱成分对微生物的杀灭效果，验证脉冲强光起杀菌作用是一种各 种光谱复杂的协同作用。但是他们对细菌的致死研究都是基于食品及食品包装领域的， 对饮用水处理领域国内除了田承斌【27 】有一篇综述外未见其他报道。 紫外线消毒对水中的病原微生物具有良好的灭活效果，并对贾第虫、隐孢子虫等抗 氯性原生动物具有特效杀灭作用。紫外线消毒的机制是微生物的d n a 受到紫外线照射 后形成胸腺嘧啶二聚体，导致自身不能复制而死亡或被免疫系统消灭。但是一些微生物 在受到可见光照射后，在体内光复活酶的作用下将连接在一起的二聚体解聚形成单体从 而恢复其复制能力，这种现象称为光复活。光复活会引起经紫外线灭活后的细菌重新生 长，从而使水的微生物安全性不能得到保障。紫外消毒的微生物复活现象在水处理领域 内普遍存在，大部分指示性微生物( 如大肠杆菌等) 都具有一定程度的复活功能【3 6 1 ，而 脉冲强光杀菌技术也被证实对微生物的致死作用主要通过u v - c 来完成，那么是否存在 生物光复活现象，国内外对这一领域还没有研究。 1 3 研究意义及主要研究内容 1 3 1 研究意义 脉冲强光技术横跨现代防疫学、光学、生物学、化学、机械学、电子学、流体力学 等多门学科，是典型的学科综合交叉，无论是基础理论，还是开发应用，都有待于深入 研究。国内对于脉冲强光技术的研究，除了一些综述性报道外，只有华南理工大学在 1 9 9 7 年1 9 9 9 年有相关研究报道 3 7 4 1 】，沈阳农业大学在2 0 0 5 年2 0 1 0 年有陆续研究报道 【3 5 4 2 4 4 】，福建农林大学在2 0 0 6 年2 0 0 9 年有相关研究报道【4 5 删，还未有其它相关研究报 道。从目前情况来看，国内外关于脉冲强光技术的研究主要集中在食品及其包装材料的 杀菌处理中【1 3 4 7 4 8 1 ，尚未开展脉冲强光杀菌技术在饮用水处理中应用的基础研究，也很 i 绍论 少有人研究脉冲强光对饮用水中典型微生物的灭活特点【2 4 1 。至于脉冲强光技术的杀菌机 理和光复活现象仍不清楚，目前只有有限的两篇关于酵母菌和大肠杆菌失活机理的报道 4 9 , 1 9 】，尚需进一步研究脉冲强光作用下对细菌的失活机理和光复活规律。 大肠杆菌是我国生活饮用水标准中的重要微生物指标，对其火活效果和特性的研究 具有代表性和实际意义。有研究表明【2 2 】脉冲强光灭活革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更 强，金黄色葡萄球菌是最常见的革兰氏阳性菌，也是常见的致病菌，它能引起一些皮肤 病，因此选用它具有代表意义。研究紫外线消毒时枯草芽饱杆菌一直被作为高度紫外线 抗性的代表性微生物【5 0 1 ，研究其对脉冲强光的抗性也具有重要意义。 本论文以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为代表性微生物，研究脉冲强 光作用下饮用水中典型微生物的灭活规律，确定最佳工艺参数；探讨水质因素对杀菌效 果的影响；观察细菌超微结构变化，揭示脉冲强光对微生物的灭活机理。在此基础上， 研究脉冲强光杀菌的光复活现象，为其在饮用水处理中的应用提供科学依据，也为探索 和开发新型饮用水消毒技术奠定理论基础，具有重要意义。 1 3 2 主要研究内容 ，一 本论文以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌为代表性微生物，研究脉冲强 光作用下典型微生物的灭活规律和灭活机制。 ( 1 ) 建立脉冲强光静态消毒系统，研究不同闪照次数、输入电压、生物负荷条件 下脉冲强光对水中典型微生物的火活效果。 ( 2 ) 考察温度、浊度和p h 值等水质参数对脉冲强光杀菌效果的影响。 ( 3 ) 研究脉冲强光作用后失活微生物在不同保存条件下的复活情况。 ， ( 4 ) 通过扫描电镜、透射电镜观察脉冲强光作用后微生物超微结构的变化。 东北林、l k 人学硕上学化论文 2 脉冲强光对典型微生物灭活效果研究 2 1 试验材料与设备 2 1 1 试验菌种 试验用菌种为大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 、 a u r e u s ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u ss u b t i l i s ) 。 2 1 2 试验设备 脉冲强光装置一套、s w - c j 1 d 型单人净化工作台、1 0 1 2 a b 型电热鼓风干燥箱、 l r h 2 5 0 a 生化培养箱、h z q c 型空气浴振荡器、l d z x 5 0 k b s 立式压力蒸汽灭菌 器、h a i e r 冰箱、p h s 3 c 型p h 计、x s z 1 0 7 型分析天平、移液枪。 2 1 3 试验药品 牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、氯化钠、琼脂粉、l m o l ln a o h 溶液、l m o l lh c l 溶 液、蒸馏水、9 5 医用酒精。 2 1 4 培养基制备 大肠杆菌培养基：1 0 0 0 m l 蒸馏水中加入2 0 9 琼脂粉、1 0 9 蛋白胨、5 9 氯化钠、3 9 牛肉膏，调整p h 至7 2 - 7 4 。 金黄色葡萄球菌培养基：1 0 0 0 m l 蒸馏水中加入2 0 9 琼脂粉、1 0 9 蛋白胨、7 5 9 氯化 钠、3 9 牛肉膏，调整p h 至7 2 7 4 。 枯草芽孢杆菌培养基：1 0 0 0 m l 蒸馏水中加入2 0 9 琼脂粉、2 0 9 葡萄糖、1 5 9 蛋白 胨、5 9 氯化钠、o 5 9 牛肉膏，调整p h 至7 2 - 7 4 。 2 2 试验方法 2 2 1 水样制备 在配制试验水样之前先配制无菌蒸馏水备用。制备方法如下： 无菌蒸馏水制各：在三角瓶中加入适量蒸馏水，用封瓶膜封好，放入高压灭菌锅灭 菌，冷却。 水样制备：每次试验时，在无菌室将斜面试管中的细菌刮入装有无菌蒸馏水的三角 瓶中，并加入数粒无菌玻璃珠，置于恒温空气振荡器上摇匀，静置l o 分钟，取一定体 积的上清液于空无菌三角瓶中，加入适量无菌蒸馏水调节浓度，制成染菌液。 2 2 2 水样处理 用移液枪吸取1 5 r n l 原始菌液移入直径9 0 m m 平板中，置于杀菌处理室平台中央， 调节电压，进行闪照处理。每次试验3 个平行。 2 脉冲强光肘典型微乍物火活效果研究 试验参数如下： ( 1 ) 固定输入电压为3 0 0 0 v ，菌液浓度大肠杆菌2 0 9 0 0 0 c f u m l 、金黄色葡萄球菌 2 0 7 0 0 0 c f u m l 、枯草芽孢杆菌2 0 2 0 0 0 c f u m l ，考察闪照次数o 2 4 次不同菌种的杀灭效 果。 ( 2 ) 菌液浓度大肠杆菌1 1 5 0 0 0 c f u m l 、金黄色葡萄球菌1 6 0 0 0 0 c f u m l 、枯草芽孢杆 菌9 2 5 0 0 c f u m l ，考察输入电压1 5 0 0 v 3 5 0 0 v 对不同菌种的灭活效果的影响。 ( 3 ) 固定输入电压为3 0 0 0 v ，大肠杆菌菌液浓度2 0 0 0 0 0 0 c f u m l 、3 9 0 0 0 0 c f u m l 、 1 4 0 0 c f u m l 、金黄色葡萄球菌菌液浓度1 6 0 0 0 0c f u m l 、1 2 8 0 0c f u m l 、2 3 2 0c f u m l 、 2 3 0 c f u m l 、枯草芽孢杆菌2 0 2 0 0 0c f u m l 、3 0 5 0 0c f u m l 、1 0 0 0 c f u m l ，考察各菌种不同 生物负荷下的灭活效果。 2 2 3 灭活效果评价方法 脉冲强光杀菌效果依据微生物的灭活率来评价，灭活率的计算公式见式( 2 1 ) 。 灭活率= l o g ( 批州) ( 2 1 ) 式中：d 一原始菌液浓度，即未闪照处理的空白对照组的活菌数( c f u m l j ) ，采 用甲板计数并辅以倾倒法测定。 闪照处理后水样中的活菌数( e f u m l 1 ) ，采用平板计数并辅以倾倒法 测定。 ， 平板计数法：用移液枪吸取l m l 菌液加入到装有9 m l 无菌蒸馏水的试管中，依次进 行将菌液稀释一定梯度；将培养基熔化后倒入平板中，待冷却后，用移液枪吸取各梯度 试管中的菌液o 1 “在培养基上，用涂布棒涂匀，然后将平板倒置于3 7 培养箱中培 养2 4 小时，计菌落数，每次试验2 个平行。 倾倒法：用移液枪吸取l m l 各稀释梯度试管中的水样加在空平板中，再倒入一定量 的熔化后温度不高于4 0 的琼脂培养基，迅速摇匀，待培养基凝固后将平板倒置于3 7 培养箱中培养2 4 小时，计菌落数，每次试验2 个平行。 2 3 结果与分析 2 3 1 脉冲强光对典型微生物的灭活效果 图2 1 至图2 3 脉冲强光对三种细菌的杀灭效果曲线。 由图2 1 表明，脉冲强光对三种细菌的灭活效果很强，闪照次数与灭活率成正比。 即闪照次数越多，灭活率越大。 脉冲强光杀菌非常高效。闪照2 次时大肠杆菌灭活率就达到了1 1l o g ，金黄色葡萄 球菌的灭活率达到了0 8l o g ，而枯草芽孢杆菌的灭活率达到了0 5l o g ，大肠杆菌闪照 1 2 次、金黄色葡萄球菌闪照1 4 次、枯草芽孢杆菌闪照2 0 次后灭活率都达到了5 3 l l o g ，此时可使最后残余菌数低于1 c f u m l ，再增加闪照即可全部杀死。 三种菌的杀灭难易程度是枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌。江天宝研 东北林、i k 人学硕士学化论文 善 邑 旦 阱 蜒 k 墓 邑 垫 褂 ! g x 闪照次数 图2 - l 脉冲强光对大肠杆菌的杀灭效果 024681 01 21 4 闪照次数 图2 2 脉冲强光对金黄色葡萄球菌的杀灭效果 善 邑 竺 褥 烬 k o246g1 01 21 41 61 82 0 闪照次数 图2 - 3 脉冲强光对枯草芽孢杆菌的杀灭效果 究脉冲强光对蒸馏水中微生物杀灭效果时也得出了一致的结论。r o w a n 2 2 l 研究脉冲强光 杀菌效果时得出了革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌更敏感的结论。 在一些紫外线消毒的文献 1 5 0 , 5 1 】枯草芽饱杆菌被作为高度紫外线抗性的代表性微生 物，在本实验中枯草芽孢杆菌灭活效果也比其他两种菌差，但是也取得了很好的杀灭效 果，只要达到一定的闪照次数，也能全部杀死。b o e g e r l 4 3 1 研究脉冲强光对枯草芽孢杆菌 处理时，一个脉冲就可以减少1l o g 。枯草芽孢杆菌的细胞结构致使其对多种灭菌方式 2 脉冲强光对典型微生物灭活效果研究 具有一定的抗性垆引，其具产芽孢的特性。芽孢是某些细菌抵抗不良环境而产生的休眠 体，此时细胞处于休眠状态，不进行代谢，细胞壁比较致密，因而对温度、p h 、辐射等 不良因素具有极强的抵抗能力【5 们，所以脉冲光对其的灭活效果相对较低。今后的研究中 可将枯草芽孢杆菌作为对脉冲强光抗性较强的代表性微生物。对于其它产芽孢的细菌对 脉冲强光的抗性还有待深入研究。 另外，在紫外线杀菌的实验中都存在“拖尾”现象【5 3 】，即当灭活率达到一定值时， 即使增加紫外剂量延长辐照时间灭活率也很难提升。而本实验中除了在闪照处理初期能 量积累过程中灭活率上升较慢外，在闪照处理后期三种微生物的灭活效率持续升高，直 至全部杀死，没有“拖尾 现象。 2 3 2 输入电压对脉冲强光灭活效果的影响 本实验装置激发电压范围为1 0 0 0 v - - - 4 0 0 0 v 。由于电压较低时，灯管不易激发，即不 发光，此时不具杀菌的能力，电压过高则灯管容易炸裂，存在安全问题，并且电压越 高，耗能越大，经济成本越大。所以本实验选取电压为1 5 0 0 v 、2 0 0