（发酵工程专业论文）破囊壶菌Δ5desaturase基因及其5端侧翼序列的克隆与功能鉴定.pdf

摘要 中文摘要 破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u m 能够合成大量高度不饱和脂肪酸( p u f a ) ，为探究 海洋真菌t h r a u s t o c h ) ，t r i u mp u f a 的生物合成途径，本课题从t h r a u s t o c h y t r i u m s p f j n - 1 0 中克隆到了p u f a 合成相关的5 脂肪酸脱饱和酶基因的e d n a 序歹l ( g e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r ：e u 6 4 3 6 1 8 ) ，该序列全长1 3 2 0 b p ，编码4 3 9 个氨基酸， 分子量为4 9 8 2k d a ，等电点为8 7 1 。该蛋白质序列含有三个保守的组氨酸富集区， 且第三个组氨酸保守盒的组氨酸被替换成谷氨酰胺，n - 端含有类细胞色素- b 5 结构 域，具有脱饱和酶的典型一级结构特征；氨基酸序列比对分析表明该序列与破囊壶 茵t h r a u s t o c h y t r i u ms p a t c c 2 1 6 8 5 、p a v l o v a $ a l i n a 。, p e r k i n s u sm a r i n u s 的5 一脂肪酸 脱饱和酶分别具有9 9 、4 9 和4 7 的一致性，此外该序列还分别与m a n t o n i e l l a s q u a m a t a 和o s t r e o c o c c u st a u h 的6 一脂肪酸脱饱和酶具有4 2 和4 1 的一致性；进 化树分析表明该酶属于5 胡旨肪酸脱饱和酶家族。将该序列与酵母表达载体p y e s 2 连接构建重组表达载体p y f a d 5 ，并转入酿酒酵母构建重组工程菌，在含底物二高y 亚麻酸( d i - h o n o - 7 1 i n o l e i ca c i d ，d g l a ，2 0 ：3 a 8 1 h1 4 n 6 ) 的培养基中添加半乳糖 诱导表达，提取总脂肪酸，气相色谱质谱分析表明重组工程菌能将底物d g l a 转 化成花生四烯酸( a r a c h i d o n i ca c i d ，a a ，2 0 ：4 a 5 , 8 , 1 1 , 1 4 n 6 ) ，转化率为5 6 4 0 。上述结 果表明从海洋破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 中克隆的脂肪酸脱饱和酶基因的 编码产物具备5 脱饱和酶的功能。 利用l a - p c r 法克隆得到了海洋破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 5 脱饱 和酶基因的5 端侧翼序列( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：e u 9 1 8 3 9 3 ) ，利用多种在线 软件对该序列进行分析，分析结果表明该序列包含了多种启动子的特征元件。将该 序列与人、斑马鱼、恒河猴、线虫以及褐鼠的5 脱饱和酶基因5 端侧翼序列进 行多序列比对，采用邻位相连算法构建距离进化树，进化树结果表明破囊壶菌 t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 的5 脱饱和酶基因的5 端侧翼序列与人类和恒河猴进 化距离最近，破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j - n - 1 0 的5 脱饱和酶基因的调控机制 比较接近高等脊椎动物，此外f o o t p r i n t e r 的分析也支持了上述结果。为了验证海洋 破囊壶菌5 脂肪酸脱饱和酶基因5 端侧翼序列的启动子功能，将该5 端侧翼序列 克隆到真核启动子验证表达载体p y g f p 质粒中的绿色荧光蛋白基因上游，以真核 福建师范大学x x x 硕士学位论文 生物酿酒酵母作为转化的宿主菌，利用荧光显微镜观察酵母的荧光激发状态，实验 结果表明来自于破囊壶菌a 5 一脂肪酸脱饱和酶基因5 端侧翼序列能够在酵母细胞中 启动g f p 基因的表达，使酵母细胞在荧光显微镜的激发下产生绿色荧光，表明克隆 的破囊壶菌a 5 脂肪酸脱饱和酶基因5 端侧翼序列具有启动子的功能。 关键词：5 脂肪酸脱饱和酶；启动子；克隆和表达；破囊壶菌 中文文摘 中文文摘 长链不饱和脂肪酸( l c p u f a s ) 能够为成人和婴儿提供包括前列腺素和白三烯 类的类花生酸类物质，从而在细胞的代谢中扮演着重要的角色。长链不饱和脂肪酸 主要分成n 6 和n 一3 两个家族，分别以亚麻酸或a 亚麻酸为前体，通过一系列脂肪 酸碳链延长和脂肪酸脱氢的交替反应而实现。催化这两种反应的酶系分别为脂肪酸 碳链延长酶和脂肪酸碳链脱饱和酶。在哺乳动物中n 6 途径的主要终产物是二十碳 四烯酸( a a ，2 0 ：4 a 5 8 ，1 1 ，1 4 ) ，而n - 3 途径的终产物是二十碳五烯酸e i c o s a p e n t a e n o i ca c i d ( e p a , 2 0 ：5 a 5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 ) 或二十二碳六烯酸d o c o s a - h e x a e n o i ca c i d ( d h 2 2 ：6 a 4 a , 1 0 , 1 3 , 1 6 , 1 1 ，二十碳四烯酸a a 通过a 1 7 脱饱和酶转化成二十碳五烯酸e p a ， 继而在a 5 延长酶和4 脱饱和酶的作用下生成二十二碳六烯酸d h a ，且a a 还为 其它类花生酸类活性物质的生成提供了前体，因此是细胞中重要的高不饱和脂肪酸。 转化从生成的最后一个关键酶是5 脱饱和酶，该酶通过向二十碳三烯酸 ( d i h o m o - y 1 i n o l e n i ca c i d ，d g l a ，2 0 ：3 a8 ，1 1 1 4 ) 的第5 位引入双键生成a a ，因此5 脱饱和酶是长链不饱和脂肪酸合成的关键酶，对其进行研究将有助于揭示 l c p u f a s 的合成机理，同时也为转基因技术生产l c p u f a s 奠定基础。本文以海 洋d h a 高产菌破囊壶菌t t i r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 为研究对象，从5 脂肪酸脱 饱和酶全长基因的克隆和表达、理化表征分析、三级结构预测、酶基因的定点突变 以及5 脂肪酸脱饱和酶基因启动子的克隆和验证等方面开展研究，主要结果如下： 1 、t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 a 5 脂肪酸脱饱和酶全长基因的克隆和表达 利用r t - p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r ) 技术，从海洋真菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 中克隆了l c p u f a s 生物合成途径中的a 5 脂肪酸脱饱和酶全长基因d s r 5 ( g e n b a n k a c c e s s i o n n u m b e r ：e u 6 4 3 6 1 8 ) 。其中d s r 5 脱饱和酶基因全长1 3 2 0b p ， 编码4 3 9 个氨基酸，预测的脱饱和酶分子量为4 9 8 2k d a ，等电点为8 7 1 ，具有4 个跨膜区；在蛋白质序列的n 端含有类细胞色素- b 5 结构域，典型的序列特征是 i - i p g g ，该序列含有三个保守的组氨酸富集区，这些特征是脱饱和酶的典型一级结 构特征，此外，第三个组氨酸保守盒的h 被替换成q ，这种现象普遍存在于5 和 6 一脱饱和酶中；氨基酸序列比对分析表明该序列与破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p v 福建师范大学x x x 硕士学位论文 a t c c 2 1 6 8 5 、p a v l o v as a l i n a 、p e r k i n s u sm a r i n u s 、的5 脂肪酸脱饱和酶分别具有 9 9 、4 9 和4 7 的一致性，此外该序列还分别与m a n t o n i e l l as q u a m a t a 和 o s t r e o c o c c u st a u r i 的a 6 脂肪酸脱饱和酶具有4 2 和4 1 的一致性；进化树分析表 明该酶属于5 脂肪酸脱饱和酶家族。利用h h p r e d 软件，以黄素细胞色素七2 蛋白 为模板构建5 一脱饱和酶的三维空间结构，模拟结果表明该酶包含了两个长的疏水 区域，这两个长疏水区域使得酶蛋白的球状结构部分暴露在内质网的细胞溶质表面， 每个疏水区域由两个跨膜区组成，每个跨膜区包含两个a 螺旋片段把酶蛋白锁定在 特定的磷脂双分子层，使得三个组氨酸保守盒排列在合适的位置从而组成酶蛋白的 活性中心。构建了t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0a 5 一脱饱和酶酵母表达系统，脂肪酸 甲酯的气相色谱质谱分析表明，d s r 5 编码产物f a d 5 具有5 脂肪酸脱饱和酶活 性，它能特异性地利用底物二十碳三烯酸( d i h p m o - 7 - 1 i n o l e n i ca c i d ，d g l a ， 2 0 ：3 a 8 ，n ，1 4 ) ，在其5 位脱氢将其转化成二十碳四筛酸( a r a c h i d o n i ca c i d ，a a ， 2 0 ：4 a 5 , s , i i , 1 4 ) 。5 一脱饱和酶的成功表达，为基因工程技术生产d h a 以及其它高度不 饱和脂肪酸奠定了基础。 2 、t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n 1 0a 5 脂肪酸脱饱f ；f 酶基因57 端侧翼序列的克隆、 分析和功能验证 利用l a - p c r 法克隆得到了海洋破囊壶菌t h a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0a 5 脂肪 酸脱饱和酶基因的57 端侧翼序列( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：e u 9 18 3 9 3 ) ，利用多 种在线软件对该序列进行分析，分析结果表明该序列包含了如：t a t a b o x 、g cb o x 、 c c a a tb o x 、c r e b ( c a m p - r e s p o n s i v e ￥l e m e n t ) 、s t i l e ( s t r e s sr e s p o n s ee l e m e n t ) 、 a d r l ( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s eg e n er e g u l a t o r1 ) 、h s f ( h e a ts h o c kf a c t o r ) 、c a p ( c a ps i g n a l f o rt r a n s c r i p t i o ni n i t i a t i o n ) 、n i t 2 ( a e t i v a t o ro f n i 仃o g e nr e g u l a t e dg e n e 0 、a p 一1 ( a c t i v a t o r p r o t e i n1 ) 、c e b p ( c c a a t - e n h a n c e r - b i n d i n gp r o t e i n ) 等启动子的特征元件。将这些序 列与人、斑马鱼、恒河猴、线虫以及褐鼠的5 脱饱和酶基因57 端侧翼序列进行 多序列比对，使用m e g a 3 1 软件，采用邻位相连算法构建距离进化树，进化树结果 表明破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 的a 5 脱饱和酶基因的5 端侧翼序列和人 类和恒河猴进化距离最近，破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 的5 。脱饱和酶基 因的调控机制比较接近高等脊椎动物，此外f o o t p r i n t e r 的分析也支持了上述结果。 为了验证海洋破囊壶菌5 脂肪酸脱饱和酶基因5 端侧翼序列的启动子功能，构建 了真核启动子验证表达载体p v g f v ，该载体以p y e s 2 为基础，通过删除p y e s 2 的 中文文摘 半乳糖启动子p g a l l ，然后把绿色荧光蛋白g f p ( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) 基因插入 到p y e s 2 多克隆位点中的n o ti 和风i 两个酶切位点之间，从而构建了新的载体 p y g f p 。这个载体由于缺乏启动子，因而不能表达绿色荧光蛋白，所以可以利用该 载体来验证启动子的功能。将5 脱饱和酶基因的5 端侧翼序列克隆到p y g f p 质粒 中的绿色荧光蛋白基因上游，以真核生物酿酒酵母作为转化的宿主菌，利用荧光显 微镜观察酵母的荧光激发状态，实验结果表明来自于破囊壶菌a 5 脂肪酸脱饱和酶 基因5 端侧翼序列能够在酵母细胞中启动g f p 基因的表达，使酵母细胞在荧光显微 镜的激发下产生绿色荧光，表明克隆的破囊壶菌a 5 一脂肪酸脱饱和酶基因5 端侧翼 序列具有启动子的功能。 3 、t h r a u s t o c h y t r i u ms p f i n 1 0a 5 脂肪酸脱饱和酶的定点突变 利用生物信息学方法对5 脂肪酸脱饱和酶进行了疏水分析和跨膜分析以及保 守结构域的预测，由于跨膜区及保守结构域附近区域对于5 脱饱和酶的电子传递 起到了重要的作用，因此如果改变该蛋白某一部位的氨基酸极性或者其保守性就很 有可能对其电子传递起到或增强或减弱的影响。利用这个原理，本实验设计了四个 突变位点，分别位于氨基酸序列的6 2 位、1 6 9 位、3 2 1 位、和4 0 1 位，突变结果分 别为：6 2 位由原来的t a c 突变成t t c ，相应的氨基酸由原来的酪氨酸变成苯丙氨 酸，极性减弱、1 6 9 位由原来的g t c 突变成c t c ，相应的氨基酸由原来的缬氨酸变 成亮氨酸，极性上属于一个中性突变、3 2 1 位由原来的c c c 突变成c t c ，相应的氨 基酸由原来的脯氨酸变成亮氨酸，由原来的杂环氨基酸变成中性脂肪族氨基酸、4 0 1 位由原来的t t c 突变成t c c ，对应的氨基酸由原来的苯丙氨酸变成丝氨酸，增加 了一个巯基，极性增强。此外该实验还在第6 2 位突变体上意外得到了第3 5 位氨基 酸的突变体，由原来的g c g 突变成a c g ，相应的氨基酸由原来的丙氨酸突变成苏 氨酸，由中性氨基酸变为含羟基的氨基酸，极性增强。5 脱饱和酶的定点突变，为 进一步从理论和实践应用上研究海洋破囊壶菌t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n 1 0a 5 脱饱 和酶奠定了基础。 v 摘要 a bs t r a c t ac d n aw i t hh o m o l o g yt o f a t t y a c i dd e s a t u r a s e sw a ss e l e c t e df r o m t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 1 0 ( g e n b a n k a c c e s s i o nn u m b e r ：e u 6 4 3 6 1 8 ) ，w h i c h c o n t a i n s a nn - t e r m i n a le y t o c h r o m eb 5 1 i k ed o m a i na sw e l la st h r e eh i s t i d i n e - r i c hd o m a i n st h a ti sa c o m m o nf e a t u r eo fp r i m a r ys t r u c t u r eo ff a t t ya c i dd e s a t u r a s e ，t h et h i r dh i s t i d i n eb o x c o n t a i n sah i s t i d i n et og l u t a m i n es u b s t i t u t i o n ( h x x h h - 一q x x h h ) t h ec o l o n e do r f w a s 13 2 0 b pe n c o d e sap r o t e i nw i t h4 3 9a m i n oa c i d s ，i t sm o l e c u l a rw e i g h ti s4 9 8 2k d a , a n d t h ep ii s8 7 1 。h o m o l o g ya n a l y s i ss u g g e s tt h es e q u e n c ew a s9 9 i d e n t i t i e sw i t ht h e a 5 d e s a t u r a s eo ft h r a u s t o c h y t r i u ms p a t c c 216 8 5 a n d4 9 ，4 7 w i t h t h e a 5 d e s a t u r a s eo fp a v l o v as a l i n a ，p e r k i n s u sm a r i n u sr e s p e c t i v e l y , t h es e q u e n c ea l s o s h a r e4 2 ，41 i d e n t i t i e sw i t ht h ea 6 一d e s a t u r a s eo fm a n t o n i e l l as q u a m a t aa n d o s t r e o c o c c u st a u r ir e s p e c t i v e l y i t sd e s a t u r a s ea c t i v i t yw a sc o n f i r m e db ye x p r e s s i o no fi t u n d e rt h ei n d u c i b l ep r o m o t e ro fg a l a c t o s ei ns a c c h a r a m y c e sc e r e v i s i a ei nt h ep r e s e n to f d g l aa ss u b s t r a t e ，t o t a ll i p i d sw e r ee x t r a t e df r o mt h e m ，an e wf a t t ya c i dw a sd e t e c t e di n t h el i p i df i a c t i o nb yg c - m s ( g a sc h r o m a t o g r a p h y - m a s ss p e c t r u m ) ，t h er e s u l t ss u g g e s t e d t h er e c o m b i n a n te e l lc o n v e n e dt h ed g l at 0a a ，w i t hac o n v e r s i o ne f f i c i e n c yo f5 6 4 0 t h e r e f o r e ，t h ee d n ae 1 p n e df r o mt h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n 一1 0e x p r e s s e di n c e r e v i s i a e c a l li n 仃o d u c eaa 5d o u b l cb o n di n t od g l a ，c o n v e r t e dd g l at oa a ，衄sr e s u l ti n d i c a t e d i t sa 5 一d e s a t u r a s ea c t i v i t yi n & c e r e v i s i a e t h e5 f l a n k i n gr e g i o no fa 5 - d e s a t u r a s eg e n ew a sc l o n e db yl a - p c ra n d s e q u e n c e d ( g e n b a n ka c c e s s i o nn u m b e r ：e u 9 18 3 9 3 ) ，t h e ni tw a sa n a l y z e db ym a n y o n - l i n es o f t sw h i c ha l ls u g g e s t e dt h er e g i o nc o n t a i n sm a n ys i g n i f i c a n tc h a r a c t e r i s t i c so f p r o m o t e r c h a r a c t e r i z a t i o na n dc o m p a r i s o no f t h i ss e q u e n c e w i t ht h e5 f l a n k i n gr e g i o no f a 5 d e s a t u r a s eg e n ef r o mh u m a n , z e b r a f i s h ，r h e s u s , c e l e g a n ，r a t t u sn o r v e g i c u s , p h y l o g e n e t i ct r e ew a sc o n s t r u c t e db yn e i g h b o r - j o i n i n gm e t h o d ，t h er e s u l ts h o w e dt h a t t h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 10s h a r et h es m a l l e s te v o l u t i o nd i s t a n c ew i t hh u m a na n d r h e s u sw h i c hi m p l i e dt h r a u s t o c h y t r i u ms p f j n - 10m a ys h a r et h es a m er e g u l a t i o n m e c h a n i s mo ft h e e x p r e s s i o n o fa 5 - d e s a t u r a s eg e n e 、7 i r i t l lh i g h e rv e r t e b r a t e s ，t h i s c o n c l u s i o nw a ss u p p o r t e db yf o o t p r i n t e ra n a l y s i sa g a i n i no r d e rt ov e r i f i e dt h ep r o m o t e r f u n c t i o no ft h e 5 f l a n k i n gr e g i o no fa 5 - d e s a t u r a s eg e n e ，w eh a v ec o n s t r u c t e da h i 福建师范大学x x x 硕士学位论文 p r o m o t e rf u n c t i o n i d e n t i f i c a t i o nv e c t o rp y g f r l i g a t e dt h i ss e q u e n c ew i t hp y g f p v e c t o rw h i c hl o c a t e da tt h eu p s t r e a mo fg f pt oc o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n tp l a s m i d p y d 5 g f p , t h e np y d 5 g f pw a st r a n s f o r m e d i n t o s a c c h a r a m y c e sc e r e v i s i a e t h e g f p ( g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n ) g e n ew a se x p r e s s e di ns a c c h a r a m y c e sc e r e v i s i a eu n d e r t h er e g u l a t i o no ft h i ss e q u e n c e ，f l u o r e s c e n c ew a sa s s a y e db ym i c r o s c o p e t h er e s u l t s u g g e s t e dt h a tt h er e c o m b i n a n tc e l l sy i e l d e dag r e e nf l u o r e s c e n tw h e nt h e yw e r ee x c i t e d b yt h ec o r r e s p o n d i n gw a v e l e n g t hl i g h tw h i c hi n d i c a t e di t sf u l lf u n c t i o no fp r o m o t e r k e y w o r d s ：a 5 - d e s a t u r a s e ；p r o m o t e r ；, c l o n i n ga n de x p r e s s i o n ；t h r a u s t o c h y t r i u m i v 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 福建师范大学硕士学位论文独创性和使用授权声明 所呈交的学位论文( 论文题目：破囊壶菌a 5 d e s a t u r a s e 基因及其5 端 侧翼序列的克隆与功能鉴定) 是本人在导师指导下，独立进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除论文中已特别标明引用和致谢的内 容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成 果。对本论文的研究工作做出贡献的个人或集体，均已在论文中作了明 确说明并表示谢意，由此产生的一切法律结果均由本人承担。 本人完全了解福建师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即： 福建师范大学有权保留学位论文( 含纸质版和电子版) ，并允许论文被 查阅和借阅；本人授权福建师范大学可以将本学位论文的全部或部分内 容采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文，并按国家 有关规定，向有关部门或机构( 如国家图书馆、中国科学技术信息研究 所等) 送交学位论文( 含纸质版和电子版) 。 ( 保密的学位论文在解密后亦遵守本声明) 一躲耍混哼师 签字醐鼬p 肌日 辩醐： 芍厶尹 绪论 绪论 一高度不饱和脂肪酸 高度不饱和脂肪酸( p u f a s ) 是指含有两个或两个以上双键，且碳原子数等于或 多于1 8 个的长链不饱和脂肪酸，根据第一个双键的位置把多不饱和脂肪酸分为c o 3 ( 或n - 3 ) 和c 0 6 ( 或n 6 ) 家族( 图1 ，表1 ) 。 h h d h a ( 2 2 ：6 a 4 , 7 , 1 0 , 1 3 , 1 6 , 1 9 n 3 ) d o c o s a h e x a e n o i ca c i d ，c o - 3 脂肪酸 a a ( 2 0 ：4 a 5 , 8 , 1 1 , 1 4 1 1 _ 6 ) a r a c h i d o n i ca c i d ，c o - 6 脂肪酸 匾1c o 3 _ 和t 0 - 6 高度不饱和脂肪酸结构示意图 f i g 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no fc o - 3a n dc o - 6p u f a s 表1 主要的不饱和脂肪酸 t a b l e1t h em a i nk i n do f p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s 名称中文名称分子式缩写 i - 6p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s l i n o l e i ca c i d ( l a ) 亚油酸( 9 ，1 2 十八碳二烯酸)1 8 ：2 9 1 2 n _ 6 十l i n o l e i ca c i d ( g l a ) , t - v 麻酸( 6 ，9 。1 2 十八碳三烯酸) 1 8 ：3 a 6 域1 2 n 6 d i h o m o - t - l i n o l c n i ca c i d ( d g l a )二高牛亚麻酸( 8 ，i i ，1 4 - - 十碳三烯酸) 2 0 ：3 a8 1 1 1 4 i 洒 a r a c h i d o n i ca c i d ( a r a )花生四烯酸( 5 ，8 ，l l ，1 4 - 二十碳四烯酸)2 0 ：4 a 5 8 1 1 1 - 6 日o - 3p o l y u n s a t u r a t e df a t t ya c i d s ml i n o l e i ca c i d ( a l a ) q - 亚麻酸( 9 ，1 2 ，1 5 - 十八碳三烯酸) 1 8 ：3 a 9 , 1 2 , 1 5 n 3 e i c o s a p c n t a e n o i ca c i d ( e p a ) 5 ，8 ，l l ，1 4 ，1 7 二十碳五烯酸2 0 ：5 a 5 , 8 , 1 1 , 1 4 , 1 7 n 3 d o c o s a h e x a c n o i ca c i d ( d h a )4 ，7 ，l o ，1 3 ，1 6 ，1 9 二十二碳六烯酸 2 2 ：6 a 4 , 7 , 1 0 , 1 3 , 1 6 , 1 9 n 3 1 福建师范大学x x x 硕士学位论文 二p u f a s 主要生理功能 d h a 、e p a 、a a 等p u f a s 具有许多重要的生理功能，如促进机体的生长发育， 促进脑和视网膜以及神经系统的发育和完善掣1 对；调节脂代谢，有利于降低心血管 疾病的发生【3 ，4 l ；在预防和治疗心血管疾病方面具有很多积极的作用，主要表现为： ( 1 ) 抑制血栓形成【5 】( 2 ) 调整血脂【6 】，( 3 ) 降低血压 7 1 ，( 4 ) 抗心律失常【8 ，9 1 ；与 细胞免疫功能相关，适当的摄入量，合适的比例能够提高机体免疫能力【1 0 ；能够预 防和降低肿瘤发生的几率 1 1 ，1 2 】；n 3p u f a s 具有抗炎症反应的作用【1 3 , 1 4 】；p u f a s 的 数量和分布能影响细胞膜的流动性和渗透性【l5 】，从而影响细胞的代谢和功能。 三高度不饱和脂肪酸生物合成途径 3 1 脂肪酸碳链延长酶和脱饱和酶共催化的生物合成途径 一般认为p u f a s 是低度长链饱和脂肪酸在碳链延长酶与脱饱和酶的共同作用 下合成的【1 6 ，1 7 1 ( 图2 ) 。该生物途径起始于硬脂酸( s t e a r i ca c i d ，c 1 8 ：0 ) ，由硬脂 酸在a 9 脱饱和酶的作用下生成油酸( o l e i ca c i d ，1 8 ：1 a 9 n 9 ) ，油酸在1 2 脱饱和 酶的作用下生成亚油酸( 1 i n o l e i ca c i d ，1 8 ：2 a 吼1 2 n 6 ) ，亚油酸在a 6 和1 5 脱饱和 酶的作用下分别生成n - 6 途径的丫亚麻酸( g l a ，1 8 ：3 a 69 1 2 n 6 ) 和n 3 途径的a 亚麻酸( a i a ，1 8 ：3 a 9 1 2 5 n 3 ) ，丫亚麻酸在a 6 延长酶的作用下生成二高吖亚麻酸 ( d i - h o n o - t - l i n o l e i ca c i d ，d g l a ，2 0 ：3 乳1 1 4 n 6 ) ，d g l a 再在5 脱饱和酶的 作用下生成花生四烯酸( a r a c h i d o n i ea c i d ，a a ，2 0 ：4 5 - 8 1 1 1 4 n 6 ) ；而仅亚麻酸 则分别在a 6 一脱饱和酶、6 延长酶、5 脱饱和酶、5 延长酶、以及4 脱饱和 酶的作用下生成d h 硝1 8 1 。哺乳动物体内缺乏1 2 ( 6 ) 和a 1 5 佃3 ) 脱饱和酶【1 9 1 ，不 能生成l a 和姒因此必须从食物中补充，这类脂肪酸称为必须脂肪酸。 绪论 2 0 ：2 0 b 匕协一 a - l e b n 睁i a ；喀t c 嘲d i 蛐口i ca c i d l 器：0 b “耐c 曩1 0 j d 1 8 ：1a 9 = 二一上 a 乙d 髓n t n r 矗薯e 向。一土一2 2 ：5a 矗1 x 1 1 m - 6 一2 2 s6 蛾蛐巳西 & 5 - e l e n l l m e + 4 d 曩- t u f - 薹e 2 2 ：5 矗t 1 ，t 1 1 ：m - 3 。_ i 2 2 ：6 矗一 ，- 1 1 ，：- 3 b d a 烈羽冀删翱鞠面ca c i d- d ，置薯k 囊嘲，瑚a b a 明哪峙州黼亭ca c k l 幽袖黼h 哺o i ca 融 图2 高不饱和脂肪酸的生物合成途径 f i g 2b i o s y n t h e s i sp a t h w a yo fl o n g _ c h a i np u f a s 1 8 2 0 】 3 2p o l y k e t i d es y n t h a s e ( p k s ) 脂肪酸生物合成途径 近年来在一些海洋细菌中相继发现了一条独特的p u f a s 合成途径 2 1 , 2 2 】，该途径 中p u f a s 的双键是在脂肪酸的合成过程中加入的【l6 1 。催化该途径反应的酶是多聚乙 酰合成酶( p o l y k e t i d es y n t h a s e ，p k s ) 2 3 1 。p k s 的基本反应如( 图3 ) 1 7 , 2 4 , 2 5 。 3 福建师范大学x x x 硕士学位论文 a c ea c e t y l - c o ac a r b o x y l a s c e pa q r lc 甜啊萌弭o 协i n m 1 m a l o n y lt r a s 笛f e r a s e g rk 毗。倒u 幽 阻e n o y ! r e d u c t a s e k s k c t o s y m h a s e 蹦d e h y d r a t a s e i s o m e m s e 图3 裂殖壶菌s c h i z o c h y t r i u ms p f j u 一51 2 中的d h a 合成途径 f i g 3 p o s s i b l ep u f a b i o s y n t h e s i so f d h a i n s c h i z o c h y t r i u ms p f j u 5 1 2 【2 司 四脂肪酸脱饱和酶的研究进展 4 1 脂肪酸脱饱和酶 脂肪酸脱饱和酶是二类催化脂肪酸碳链特定位置- c c 单键脱氢形成c = c 双键 的酶，是不饱和脂肪酸合成代谢途径的关键酶 2 7 , 2 8 1 。 4 2 脂肪酸脱饱和酶的结构特征 序列分析表明脂肪酸脱饱和酶都含有3 个极度保守的组氨酸富集区，这三个保 守的组氨酸富集区涉及酶活性中心的形成 2 9 , 3 0 】。此外脱饱和酶的中部序列还包含了 两个长的疏水区域，这两个长疏水区域使得酶蛋白的球状结构部分暴露在内质网的 细胞溶质表面，每个疏水区域由两个跨膜区组成，每个跨膜区包含两个a 一螺旋片段 把酶蛋白锁定在特定的磷脂双分子层，使得三个组氨酸保守盒排列在合适的位置从 而组成酶蛋白的活性中心【2 9 ，3 1 】( 图4 ) 。羧基端定向的脱饱和酶n 端存在一个类似 于细胞色素b 5 的血红素结合区h p g g 。细胞色素b 5 作为脱饱和反应的电子供体起 着重要作用，是脂肪酸脱饱和酶功能表达所必需的【3 2 】( 图5 ) 。 “焉r 。! h x x x 堂h 之h x x 亨x8 q x x h h 。 。 。 h 图4 脂肪酸脱饱和酶的拓扑结构示意斟m 1 f i 9 4 t h e t o p o l o g ， o f 自r ya c i dd e s a m r a s e 刚5 肝脏微粒体脂肪酸脱饱和作闱的电子传递链9 4 ) f i g5e l e c t r o n t r a m f 盯c h a i n o f f a t t ya c i d d e s a t u r a t i o n i n l i v e r m i c r o s o m a l 4 3 脂肪酸脱饱和酶的分子生物学研究进展 由于大部分脂肪酸脱饱和酶均为膜结合蛋白其分离纯化十分困难，目前对脱 饱和酶的研究还主要集中在其基因的克隆及其功能表达调控上。国外从2 0 世纪8 0 年代便开始利用分子生物学手段研究脂肪酸脱饱和酶，近几年来相继从多种生物体 内克隆得到脂肪酸脱饱和酶，并获得了功能性表达。本实验室也从海洋真菌破囊壶 菌中克隆到了4 脂肪酸脱饱和酶基因，并在酿酒酵母中成功实现了表达p 5 。”j 。 4 3 1 1 5 脂肪酸脱饱和酶 1 5 脂肪酸脱饱和酶( 15 - f a t t ya c i dd c s a t u r a s e ) 作用的底物是亚油酸l a ( 1 i n o l e i ea c i d ，1 8 ：2 9 ”n 6 ) 。1 9 9 2 年，a r o n d e l v 等人首先从拟南芥叫r a b i d o p s i s ) 中分离到1 5 一脂肪酸脱饱和酶基因1 3 7 1 ，此后相继从多种植物中克隆到1 5 一脂肪酸 脱饱和酶基因 3 8 4 2 1 。大多数动物不具备1 5 脂肪酸脱饱和酶，但是在线虫体内却发 福建师范大学x x x 硕士学位论文 现了1 5 脂肪酸脱饱和酶基因1 4 3 】。 4 3 2 1 2 脂肪酸脱饱和酶 a 1 2 - ) j | 肪酸脱饱和酶催化底物油酸( o l e i ca c i d ，c 1 8 ：l x 9 ) 在其a 1 2 位上脱氢 形成双键而合成亚油酸。由于哺乳动物缺乏在脂肪酸的第9 位碳原子以上位置引入 不饱和顾键的脱饱和酶基因，因此a 1 2 脂肪酸脱饱和酶只存在于植物、微生物以及 一些无脊椎动物中。 4 3 3 9 i 脂肪酸脱饱和酶 a 9 一脂肪酸脱饱和酶以c 1 8 的脂肪酸为底物，在脂肪酸碳链的第9 、1 0 位碳原 干间引入双键，催化硬脂酸( c 1 8 ：0 ) 成油酸( c 1 8 ：i a 9 n - 9 ) 。1 9 9 6 年，l i n d q v i s t 等 4 4 1 首次测定了蓖麻种子a 9 硬脂酰a c p 脱饱和酶的空间结构( p d b i d ：1 a f r ) ( 图 6 ) 。 图6 蓖麻种子a g - 脂肪酸脱饱和酶空间结构 f i g 6 t h e t o l i a l ys a u c t u r e o f a 9 - d e s a t u r a s e f i r m r i c i 脚c m m m n i s 4 3 4 8 _ 脂肪酸脱饱和蘸 研究发现在一些真核生物中p u f a s 的合成还存在8 脱饱和酶途径。该酶能够 在a l l 位已经脱饱和的c 2 0 底物的第8 位和第9 位碳原子问加入双键。在眼虫 ( e u g l e n ag r a c i l i s ) 中已被证明存在8 - 脱饱和酶代谢合成2 0 碳高不饱和脂肪酸的 途径( 图7 ) 。 绪论 c 2 0 ：3a 11 i 1 7 - - l - c 2 0 ：4 8 i1 1 4 ”- _ - 卜c 2 0 ：5a5 1 1 4 1 7 。4n 一- 3 f a 时 睾 一8 一北小e c 1 8 ：3a 9 i2 1 5 8 喀l c 1 8 ：4 厶6 9 1 2 1 5 a 8 _ l ：嵩“i r a s c c 2 0 ：2a1 1 1 4 _ _ a 9 - c i m g a w l n - 6f a t t y a