（环境科学专业论文）自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用.pdf

a b s t r a c t b a s e do nd i f f e r e n tm e t h o d sf o rd e t e r m i n a t i o no fa n t i b i o t i c s ，t h em e c h a n i s mo ft h e f o r m a t i o no fs e l f - o r d e r e dr i n g sa n ds o ri m a g i n gf l u o r e s c e n tt e c h n i q u ew e r e i n t r o d u c e d t h et e s t i n gm e t h o d sw e r es e tu pf o rt h ed e t e r m i n a t i o no fm t c ，m c ，e n x ， c p x ，s da n dd e t e r m i n e dt h ec o n c e n t r a t i o no fa n t i b i o t i c si nm i l k ，t a b l e t s ，i n j e c t i o n ， u r i n e ，s e r u ma n ds y n t h e s i ss a m p l e s i nt h ep r e s e n c eo fn h 3 一n h 4 c lb u f f e rs o l u t i o n ( p h10 6 ) a n dp v a 一12 4 ，t h ed r o p l e t o fm e t a c y c l i n ec a nf o r ma ns o ro nt h es o l i ds u p p o r t sw i t ht h ed i a m e t e ro f1 8 4 m m a n di t sr i n gb e l tw i d t ho f5 9 6 “m t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fm e t a c y c l i n ei sa c h i e v e d w i t ht h el i n e a rr a n g eo f3 3 9 x 1 0 - 1 3 2 0 3 x 1 0 - 1 2m o l r i n g - 1 ( 1 1 3 x 1 0 - 6 _ 6 7 7 x 1 0 - 6 m o l l 一1 ) a n dd e t e c t i o nl i m i to f1 0 5 x 0 - 1 3m o l r i n g - 1 ( 3 5 0 x1 0 m o l l 一1 ) w h e n0 3 i t l d r o p l e tw a ss p o t t e d t h e nt h et e c h n i q u eh a sb e e na p p l i e di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no f m e t a c y c l i n e i nt h et a b l e t sa n dr e s i d u ei nf o u rd i f f e r e n tm i l ks a m p l e s 、析t i lt h e r e c o v e r i e so f 9 5 2 1 0 6 2 a n d9 4 7 1 0 4 o r e s p e c t i v e l y i nt h ep r e s e n c eo fn h 3 一n h 4 c ib u f f e rs o l u t i o n ( p h9 9 9 ) a n dp v a - 12 4 ，m 9 2 + a n d m e t a c y c l i n ef o r mac o m p l e xo f1 ：1 a n dt h ed r o p l e to f m 9 2 + _ m e t a c y c l i n ec a nf o r ma n s o ro nt h eh y d r o p h o b i cs u p p o r t sw i t ht h ed i a m e t e ro f0 9 3 r a ma n di t sr i n gb e l tw i d t h o f2 6 2 1 x m b ym e a s u r i n gt h ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo ft h er i n gb e l t t h eq u a n t i t a t i v e a n a l y s i s o f m e t a c y c l i n e i sa c h i e v e dw i t ht h el i n e a r r a n g e o f 1 3 0 10 - j 3 2 1o xlo 一1 2 m o l r i n g 一1 ( 4 4 0 xlo 一7 7 2 0 10 6 m o l l 一1 ) a n dd e t e c t i o nl i m i t o f1 7 0 1 0 1 4 m o l r i n g 一1 ( 5 6 7 x1 0 8 m o l l 一1 ) w h e n0 3 0 p ld r o p l e tw a ss p o t t e d t h e n t h i sm e t h o dh a sb e e na p p l i e di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no fm e t a c y c l i n ei nt h er a wf r e s h m i l ks a m p l e sw i t ht h er e c o v e r yo f9 3 8 10 7 8 a n dr s dl e s st h a n4 3 i nt h ep r e s e n c eo fp h 8 5 0n h 3 - n h 4 c ib u f f e rs o l u t i o n ，p v a 一12 4a n dm i c r o w a v e h e a t i n g ，t h ed r o p l e to fc a 2 十s e n s i t i z e dm i n o c y c l i n ec o u l df o r ma ns o ro nt h e h y d r o p h o b i cs u p p o r tw i t ht h ed i a m e t e ro f1 7 r a ma n dr i n gb e l tw i d t ho f4 5 ，3 t i na f t e r t h es o l v e n tw a se v a p o r a t e d t h el i n e a rr a n g ew a s1 9 x10 6 6 0 xl0 m o l l 一1a n d l i m i to fd e t e c t i o nw a s1 9 xl0 一m o l l 一1w h e no 3 p ld r o p l e tw a ss p o t t e d t h e nt h e t e c h n i q u ew a sa p p l i e di n t ot h ed e t e c t i o no fm i n o c y c l i n ei nt h ec a p s u l ea n dr e s i d u ei n t h em i l ks a m p l e sw i t ht h e r e c o v e r i e so fl0 4 3 一10 5 0 a n d9 6 0 - 10 5 9 ， r e s p e c t i v e l y , r s dw a sl e s st h a n3 4 7 i nm e p r e s e n c eo fn h 3 一n h 4 c ib u f f e rs o l u t i o n ( p h9 7 0 ) a n dp v a 12 4 ，t h ed r o p l e t o f a l 3 + e n o x a c i nc a nf o r i l la ns o ro nt h es o l i ds u p p o r t sw i t ht h ed i a m e t e ro f1 6 3 m m a n di t sr i n gb e l tw i d t ho f5 0 p m t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fe n o x a c i ni sa c h i e v e dw i t h t h el i n e a r r a n g eo f1 0 0 1 0 - 1 3 5 0 0 1 0 1 3 m o l r i n g 一1 ( 5 0 0 1 0 7 _ 2 5 0 1 0 6 m 0 1 l 一1 ) a n dl i m i to fd e t e c t i o n7 6 5 x 1 0 - b m o l r i n g 。1 ( 3 8 3 1 0 m o l l - 1 ) w h e no 2 0 此d r o p l e t w a ss p o t t e d t h e nt h et e c h n i q u eh a sb e e na p p l i e di n t ot h ed e t e r m i n a t i o no fe n o x a c i n i nt l l ee n o x a c i ng l u c o n a t ei n j e c t i o na n dr e s i d u ei nf o u rd i f f e r e n tm i l ks a m p l e sw i t ht h e r e c o v e r i e so f9 6 9 - 1 0 7 o a n d9 4 2 1 0 2 5 ，r s dl e s st h a n4 1 a n d2 4 r e s p e c t i v e l y , a n de n o x a c i na v e r a g ec o n c e n t r a t i o ni nh e a l t h yv o l u n t e e r su r i n ea f t e r o r a la d m i n i s t r a t i o na n de n o x a c i na v e r a g ec o n c e n t r a t i o ni nr a b b i ts e r u ma f t e ro r a l a d m i n i s t r a t i o nw e r es a t i s f a c t o r i l yd e t e r m i n e d t h es u r f a c t a n tc o u l db ep a r to fah i g h e rl e v e lo fc o m p l e x e si nt h ec o u r s eo fm e t a l i o n sf o r m i n gf l u o r e s c e n tc o m p l e x e s ，t h e r e b yi n c r e a s i n gt h ee f f e c t i v e n e s so fc o m p l e x m o l e c u l a ra b s o r p t i o nc oe f f i c i e n c i e s ，r e s u l t i n gt h ei n c r e a s eo ff l u o r e s c e n c e i nt h e p r e s e n c eo fs u r f a c t a n tc t m a b ，n h 3 - n h 4 c ib u f f e rs o l u t i o n ( p h 9 7 0 ) a n dp o l y v i n y l a l c o h o l - 12 4 ( p v a - 12 4 ) t h ed r o p l e tc o n t a i n i n gt h ec h e l a t eo fc i p r o f l o x a c i n a 1 3 + c o u l df o r ma ns o ro nt h es o l i ds u p p o r ta f t e rs o l v e n te v a p o r a t i o nw i t ht h ed i a m e t e r o f2 7 6 m ma n di t s r i n g b e l tw i d t ho f4 3 5 p m t h e a n a l y t i c a lp a r a m e t e r so f c i p r o f l o x a c i nw e r ea c h i e v e dw i t ht h el i n e a rr a n g eo f1 0 xl0 - 1 3 6 0 xl0 1 3m o l r i n g l ( 5 0 x1 0 7 _ 3 0 x1 0 6m o l l 一1 ) a n dd e t e c t i o nl i m i to f1 0 x1 0 1 4 m o l - r i n g 一1 ( 5 0 x1 0 8 m o l l 叫) w h e n0 2 p ld r o p l e tw a ss p o t t e d t h e nt h et e c h n i q u eh a db e e ns a t i s f a c t o r i l y a p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fc i p r o f l o x a c i ni nd i f f e r e n ts a m p l e so fm i l k ，i n j e c t i o n ， t a b l e t sa n dr a b b i ts e r u ms a m p l e s i nt h ep r e s e n c eo fh a c n a a cb u f f e rs o l u t i o n ( p h 3 12 ) a n dp v a 一1 2 4 ，t h e d r o p l e tc o n t a i n i n gf l u o r e s c a m i n ed e r i v a t i z e ds u l f a d i a z i n ec a nf o r ma ns o ro nt h e s o l i ds u p p o r ta f t e rs o l v e n te v a p o r a t i o nw i t ht h ed i a m e t e ro f1 8 6 m ma n di t sr i n gb e l t w i d t ho f5 4 9 p m t h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i so fs u l f a d i a z i n ei sa c h i e v e dw i t ht h el i n e a r r a n g eo f7 8 1 0 - 1 4 _ 1 8 1 0 1 2m o l r i n g 一1 ( 3 9 x 1 0 - 7 - 9 0 x 1 0 一m 0 1 l 一1 ) a n dd e t e c t i o n l i m i to f7 8 1 0 1 5m o l r i n g 一1 ( 3 9 1 0 8m o l l 一1 ) w h e n0 2 p ld r o p l e tw a ss p o t t e d t h e nt h et e c h n i q u eh a sb e e ns a t i s f a c t o r i l ya p p l i e dt ot h ed e t e r m i n a t i o no fs u l f a d i a z i n e i nt h et a b l e t s ，s y n t h e t i cs a m p l ea n dr e s i d u ei ns i xd i f f e r e n tm i l ks a m p l e sw i t ht h e r e c o v e r i e so f91 0 10 5 8 r e s p e c t i v e l y , r s dl e s st h a n4 4 t h ep r o p o s e ds o rt e c h n i q u es h o w e dg r e a tr e l i a b i l i t ya n dp r a c t i c a l i t yb ys e t t i n gu p s e v e r a lt e s t i n gs y s t e m sf o ra n t i b i o t i c s ，o f f e r e dan e ww a yf o rt h ea n a l y s i sa n d d e t e r m i n a t i o no fa n t i b i o t i cr e s i d u e si nm i l ka n db i o c h e m i c a ls a m p l e s ，a n ds h o w e d s e v e r a la d v a n t a g e ss u c ha sl o w e rb a c k g r o u n di n t e r f e r e n c e ，l e s sc o n s u m p t i o n ， s i m p l i c i t y , n o n p o l l u t i o nt ot h ee n v i r o n m e n t ，e t c k e yw o r d s ：s e l f - o r d e r e dr i n gf l u o r e s c e n ti m a g i n gt e c h n i q u e ，a n t i b i o t i c s ，m i l k ， b i o c h e m i c a ls a m p l e s 目录 第一章前言l 1 1 抗生素简介1 1 2 抗生素残留的现状3 1 3 国内外抗生素分析方法概述5 1 4 固载表面自组装环荧光显微成像技术简介9 1 5 本研究的目的和意义1 7 1 6 本文研究的内容及解决的问题1 8 第二章固载表面四环素类抗生素荧光体系的应用研究1 9 第一节美他环素自身荧光体系1 9 2 1 1 试验部分1 9 2 1 2 结果与分析21 2 1 3 小结2 6 第二节m 9 2 + 敏化美他环素荧光体系2 7 2 2 1 试验部分2 7 2 2 2 结果与分析2 8 2 2 3 小结3 3 第三节c a 2 + 增敏米诺环素荧光体系一3 4 2 3 1 试验部分3 4 2 3 2 结果与分析3 5 2 3 3 小结4 l 第三章固载表而喹诺酮类抗生素荧光体系的应用研究4 2 第一节a 1 3 + 增敏依诺沙星荧光体系4 2 3 1 1 试验部分4 2 3 1 2 结果与分析4 4 3 1 3 小结51 第二节环丙沙星a 1 3 + - c t m a b 三元荧光体系5 2 3 2 1 试验部分5 2 3 2 2 结果与分析5 3 3 2 3 小结6 0 第四章固载表面磺胺嘧啶衍生反应荧光体系的应用研究6 1 4 1 试验部分6l 4 2 结果与分析6 2 4 3 小结6 9 第五章全文总结与展望7 0 参考文献7 2 致谢8 4 攻读硕士学位期间发表的学术论文目录8 5 作者声明8 6 英文名称 s e l f - o r d e r e dr i n g c h a r g e - c o u p l e dd e v i c e h u m a ns e r u ma l b u m i n b o v i n es e r u ma l b u m i n p o l y ( v i n y la l c o h 0 1 ) 一12 4 缩写符号对照表 c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e s o d i u md o d e c y ls u l f a t e s o d i u m d o d e c y lb e n z e n es u l f o n a t e m e t a c y c l i n e m i n o c y c l i n e e n o x a c i n c i p r o f l o x a c i n s u l f a d i a z i n e f l u o r e s c a m i n e 中文名称 自组装环 电荷耦合元件 人血清蛋白 牛血清蛋白 聚乙烯醇1 2 4 十六烷基三甲基溴化铵 十二烷基硫酸钠 十二烷基苯磺酸钠 美他环素 米诺环素 依诺沙星 环丙沙星 磺胺嘧啶 荧光胺 缩写符号 s o r c c d h s a b s a p v a 一1 2 4 c t m a b s d s s d b s m t c m c e n x c p x s d f a 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 第一章前言 1 1 抗生素简介 抗生素( a n t i b i o t i c s ) 是由微生物或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗 病原体或其它活性的一类代谢物，以及用化学方法合成或半合成的化合物，是 临床上使用的十分重要的一类抗菌药物，主要通过干扰细菌细胞壁合成、损伤 细菌细胞膜、抑制细菌蛋白质合成及抑制细菌核酸合成等机制来起到抗菌的作 用。根据化学结构性质分类，抗生素主要包括：四环素类抗生素、喹诺酮类抗 生素、磺胺类抗生素、氨基糖苷类抗生素、一内酰胺类抗生素、氯霉素类抗生 素和大环内酯类抗生素【1 1 ，见表1 。本研究的主要对象为四环素类、喹诺酮类 和磺胺类抗生素。 表1 抗生素种类 抗生素种类举例 四环素类 喹诺酮类 磺胺类 氨基糖苷类 p 内酰胺类 氯霉素类 大环内酯类 美他环素、米诺环素、四环素 依诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星 磺胺嘧啶、磺胺甲恶唑 链霉素、庆大霉素、二氢链霉素 青霉素、头孢霉素 氯霉素、甲砜霉素 红霉素、林可霉素、螺旋霉素 1 1 1 四环素类抗生素( t e t r a c y c l i n e s ，t c s ) 四环素是由放线菌产生的一类口服广谱抗生素及半合成抗生素，为并四苯 ( n a p h t h a c e n e ) 衍生物，具有十二氢化苯的基本结构，分子中的取代基r 1 、r 2 、r 3 、 r 4 不同，构成不同的四环素类药物( 表2 ) 。四环素类抗生素可以抑制多种革兰氏阳 性和革兰氏阴性细菌的活性，从而起到抑菌作用；此外，四环素类抗生素的亲癌作 用使其成为诊断、治疗肿瘤的荧光探针而用于临床检验和治疗。第一个四环素类抗 生素是1 9 4 8 年从金色链丝菌分离得到的会霉素，并相继发现了土霉素、四环素、等 天然产物。研究发现四环素分子中的r 3 甲基并不是抗菌活性不可缺少的基团，对其 进行结构修饰得到了米诺环素、美他环素等。 该类抗生素廉价、易于管理，可通过水和饲料口服而起效。基于以上原因，四 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 环素类抗生素通常用于畜牧兽医预防和治疗疾病，或作为饲料添加剂促进生长。1 9 9 8 年欧洲动物卫生联盟在1 5 个欧盟成员国进行了抗生素的兽药使用情况调查，结果显 示，用于治疗和预防疾病的抗生素消费中，四环素类占到了6 5 嘣2 ，3 1 。 表2 四环素类抗生素基本结构 四环素 美他环素 米诺环素 h h o h h o c h ， h c h 3 h h h n ( c h 3 ) 2 1 1 2 喹诺酮类抗生素( q u i n o l o n e s ，q n s ) 喹诺酮类抗生素是人工合成萘啶酸衍生物，是目前广泛用于治疗各种感染性疾 病的光谱、高效的化学合成药( 表3 ) 。通过抑制d n a 旋转酶的活性杀死细菌，因有 抗菌谱广、吸收好、血液浓度高、能迅速分解到各组织、半衰期长、能制成各种剂 型等特点而得到迅速推广，是兽医临诊、兽禽和水产养殖中最重要的抗感染药物之 一，被大量用于预防和治疗动物疾病及促生长【l 】。 表3 喹诺酮类抗生素基本结构 第一代喹诺酮抗菌药物的药效学特征为抗革兰氏阴性菌药物，对革兰氏阳性菌 几乎无作用，易产生耐药性，其活性属于中等，而且体内易被代谢，作用时间短， 2 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 中枢毒性大。第二代喹诺酮抗菌药特征为药效学特征为抗菌活性增大，抗菌谱也从 革兰氏阴性菌扩大到阳性菌，药代动力学性质得到改善，耐药性低，毒副作用小， 临床上用作治疗泌尿道感染、肠道感染及耳鼻喉感染的抗革兰氏阴性菌药物。第三 代喹诺酮抗菌药的药效学特征为具有革兰氏阳性与阴性菌药物的活性，对支原体、 衣原体、军团菌及分支杆菌有作用。化学结构特征为4 号位引入了氟原子。代表药物 为环丙沙星、依诺沙星、氧氟沙星、诺氟沙星等。由于氟原子及分子中哌嗪基团的 存在，使得此类药物具有良好的组织渗透性，明显改善了药物代谢动力学性质，具 有抗菌谱广，对革兰氏阴性菌和阳性菌都有明显的抑制作用。 1 1 3 磺胺类抗生素( s u l f o n a m i d e s ，s a s ) 磺胺类药物，又称为磺胺，是指具有对氨基苯磺酰胺结构的一类药物的总称 ( 表4 ) ，为人工合成的抗菌药，用于临床已近5 0 年，它具有抗菌谱较广、性 质稳定、使用简便、生产时不耗用粮食等优点。特别是1 9 6 9 年抗菌增效剂一 甲氧苄氨嘧啶( t m p ) 发现以后，与磺胺类联合应用可使其抗菌作用增强、治疗 范围扩大，因此，虽然有大量抗生素问世，但磺胺类药仍是重要的化学治疗药 物【。其主要作用是通过抑制细菌繁殖达到抗菌的目的，而不是直接杀灭病菌。 这类药物对多种球菌、如脑膜炎球菌、溶血性链球菌、肺炎球菌、葡萄球菌、 淋球菌及某些杆菌，如；痢疾杆菌、大肠杆菌、变形杆菌等都有抑制作用。 表4 磺胺类抗生素基本结构 基本结构 渊 s 刚凰 1 2 抗生素残留的现状 1 2 1 牛奶中抗生素残留 随着我国人民生活水平的提高，乳及乳制品在人们膳食结构中的地位越来越重 要。由于近年来奶牛养殖逐步规模化，不合理使用抗生素造成原料奶中抗生素的残 留情况相当严重。在奶牛养殖中，抗生素的主要用途是治疗奶牛临床型、隐性型乳 3 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 房炎。在治疗奶牛乳房炎时，抗生素的不当应用可能会导致牛奶的污染【4 1 。如果在 用药后停止用奶时间不够，或用药过量使患病奶牛分泌含抗生素的奶牛时问延长， 均有可能使原料奶中抗生素残留超标。 1 2 2 抗生素残留对人体健康的危害 口服抗生素可用于治疗细菌感染，但由于个体对抗生素可产生过敏反应，抗生 素的广泛应用对公众健康构成了潜在的威胁【5 1 。牛奶中的抗生素残留可能引过敏症 状，还可能增强细菌的耐药性【6 ，7 j ，并且这种耐药性可能由动物微生物向人类病原菌 传播【s j 。四环素类药物残留毒性作用表现为降解产物的溶血或肝毒作用，对胃肠、 肝脏的损害及使牙齿染色等【9 1 。牛奶中若含有抗生素，对长期饮用者来说无疑是等 于长期服用小剂量的抗生素，即使牛奶中抗生素含量处于较低水平，若长期饮用含 有抗生素残留的牛奶，势必会对引用者的身体健康带来负面影响。长期食用兽药残 留超标的食品，当体内蓄积的药物浓度达到一定量时，会对人体产生多种急慢性中 毒。许多抗菌药物如青霉素类、四环素类、磺胺类和氨基糖苷类等能使部分人群发 生过敏反应甚至休克，并在短时间内出现血压下降、皮疹、喉头水肿、呼吸困难等 严重症状。 1 2 3 抗生素残留对环境的危害 随着畜禽、水产养殖业的快速发展，我国抗生素的种类和用量也在日益增加。 抗生素在动物性产品中的残留不仅引起了食品安全问题，相当一部分还随动物粪便、 医药废物以及饲料投放等进入水环境中，从而增加了环境安全和生态健康风险【1 0 】。 四环素类抗生素是使用广泛、用量大的抗生素种类之一，环境中的大量残留带来了 潜在的环境风险【l 。很大一部分抗生素以原型或者代谢物的形态排入环境中，作为 环境外源性化合物将对环境生物及生态产生影响，并最终可能对人类的健康和生存 造成不利影唰呓j 。 由于具有水溶性较好、体内代谢后大部分以原形排出以及在环境中不易生物降 解等特点，使其容易在水环境中储存和蓄积，是环境中主要抗生素污染源【1 3 】。由此而 引发的环境污染问题，近年来备受关注。四环素类抗生素在环境中不易发生生物降 解，一旦进入环境就会诱导耐药菌株的产生，威胁人类健康和生态环境【1 4 】。 部分抗生素经动物代谢后大部分以原药或代谢物的形式经动物的粪便和尿液的 形式排出体外，进入到生态环境，对土壤、水体等生态环境产生不良影响，并通过食 物链对生态环境产生毒害作用，影响环境中动植物和微生物的生命活动，最终影响 人类的健康，其后果不容忽视。2 0 世纪9 0 年代末，欧洲的一些国家才开始比较系 4 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 统地调查、研究环境中兽药的残留和污染问题。s t e g e r 等分别子1 9 9 7 年和1 9 9 9 年 在德国发现地表水中有“l 级水平的大环内酯类、磺胺类、氟喹诺酮类、氯霉素、 泰乐星、甲氧苄氨嘧啶等抗生素，l i n d s e y 等在美国某地表水中也发现了四环素类抗 生素。此后，在奥地利、德国、英国、意大利、西班牙、瑞士、荷兰、美国和同本 等国的水体中相继检测到8 0 多种抗生素药品，如一些大环内酯类药物、磺胺药物和 四环素类等【1 5 16 1 。 1 2 4 抗生素残留的控制 国家质检总局的一项对中国北方市场的检测结果显示，在近8 0 0 份乳品采样中， 抗生素残留超标居不合格项目第一位。欧盟( e u ) 早在2 0 世纪9 0 年代就对肉类中喹 诺酮类抗生素的最大残留量进行了限制。美国食品药品管理局证实，当地人口动物 性食品中大约有8 0 种药物残留【1 7 1 。e u 规定抗生素残留应小于4 9 9 l - 1 【1 8 1 。我国农 业部2 0 0 1 年颁布实施了无公害食品生鲜牛乳行业标准，规定牛奶中允许的抗生 素最大残留量为1 0 0 i t g l - 1 。2 0 0 8 年9 月，我国发生了严重的s l n 品中三聚氰胺污 染事故。严丽娟掣1 9 】利用亲水作用色谱电喷雾串联质谱法检测了原料奶及奶制品中 的三聚氰胺，污染水平从0 0 5 m g k g - 1 到4 0 5m g k g - 1 不等。此次事件使人们更加认 识到食品安全的重要性。因此，开展牛奶等食品中抗生素残留量的检测工作，对于 保障食用者的健康安全具有重要的现实意义。 1 3 国内外抗生素分析方法概述 目前国内外对于牛奶中抗生素残留的检测方法主要有：微生物法、酶联免疫分 析法、理化检测法等。 ( 1 ) 微生物法：在牛奶抗生素残留检测中，微生物检测方法是应用较广泛的传 统方法。其测定原理基于抗生素对微生物生理机能和代谢的抑制作用来定性或定量 地确定样品中抗生素残留。中华人民共和国国家标准g b t 4 7 8 9 2 7 2 0 0 3 采用的方法 是向被检试样中加入4 2 ，3 ，5 一氯化三苯四氮唑( t t c ) 水溶液，乳中若有抗生素存 在，则检样中虽加菌液培养物，但细菌的繁殖受到抑制，因此指示剂t t c 不还原， 不显色。若没有抗生素存在，则加入菌液即行增殖，t t c 被还原而显红色。即检样 呈乳原色时为阳性，呈红色为阴性【2 0 】。微生物法具有费用低，操作简便，可靠性高 等特点。m a c g r a n e m 2 1 】指出，微生物检测法缺乏特异性和准确性，并不适用于定 量及单一抗生素的鉴别。该法的优点是灵敏度高、分析精度和线性关系好，在大规 模的定性筛选工作中具有一定的应用价值，但存在易受干扰、易漏检和测定结果误 差较大等不足的缺点2 2 , 2 3 】。 5 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 ( 2 ) 酶联免疫分析法( e l i s a ) ：是一种非放射性免疫标记技术，以抗原与抗 体的特异性、可逆性结合反应为基础。绝大多数结构具有一定复杂性有机化合物均 可作为半抗原，如药物、农药和环境化学污染物等。李利东等人于2 0 0 4 年报道研制 了四环素快速酶联免疫分析试剂盒，在3 9 0n g m l - 1 2 0 0 0n g m l - 1 四环素标准浓度 范围内，呈线性相关【2 4 】。t e e m uk o r p i m a k i 等用免疫分析法测定了1 8 种磺胺嘧啶药 物，检测的食物样品中药物最大残留量为1 0 0 p g k g - 1 【2 5 】。h u e t 等人2 0 0 6 年利用该技 术测定了肾脏、海洋产品、鸡蛋、肉类样品中喹诺酮类抗生素的含量水平，在p h = 7 4 的磷酸盐缓冲溶液体系中检测出1 5 种喹诺酮类抗生素【2 6 】。免疫分析技术最突出的 优点是操作简单、速度快、分析成本低；但也有其局限性，如不具备多残留分析能 力，影响因素众多且不易控制，方法建立过程复杂，某些待测物的半抗原难以合成 嵋7 1 ，测定结果是各类抗生素的总量，并不能区分出抗生素单体，还需要借助 l c m s m s 来加以区分【2 4 2 7 1 。 ( 3 ) 理化检测方法：利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测其 含量，是目前国内外使用较多的检测方法，主要有高效液相色谱法【2 8 弼】、气相色谱 法【3 6 1 、电泳、法【3 7 1 、化学发光法【3 8 , 3 9 1 和荧光分析法f 批5 2 1 等。 岳振峰等【2 s 】应用高效液相色谱串联质谱法检测牛奶中土霉素的残留量，检出限 为5 0 “g k g - 1 ，线性范围为5 0 1 2 0 0 “g l _ 1 ；r a f a e lc a r l o s 等【2 9 】采用柱后衍生液相色谱 法测定了牛奶样品中8 种喹诺酮类抗生素残留，其中环丙沙星的检出限为 2 0 n g m l - 1 ，线性范围8 1 1 5 0 0n g m l - 1 。联用技术应用较多的有液相色谱质谱联 用法( l c m s ) f 3 0 1 ，液相色谱荧光法( l c f d ) 【3 l 3 2 1 ，液相色谱串联质谱法 ( h p l c m s m s ) t 3 3 笔j r 。高效液相色谱及气相色谱检测法具有灵敏度高，可进行准确 定性分析( 给出被测组分的结构信息) 和定量分析能力的优点，但检测程序复杂， 且费用较昂贵，耗时较长【3 钔，使用有毒溶剂嗍。 赵立军等【3 6 】为确定抗生素废水中有机污染物构成和显色物质，以二氯甲烷为萃 取剂，萃取废水中的有机物，经过浓缩纯化后，利用气相色谱质谱联用( g c m s ) 技 术对制药废水中的有机成分进行了分析鉴定，结合计算机质谱图库，定性确定了废 水中6 0 种有机污染物。 毛细管电泳是今年来常用的分析检测技术。赵燕燕等【3 7 】利用胶束毛细管电泳法 对组织中残留的痕量环丙沙星、氧氟沙星和恩诺沙星进行了检测，弥补了毛细管电 泳法检测灵敏度低的缺点，大大减化了操作过程，为动物性食品组织中残留的痕量 药物检测提供了一种新的简便可靠的方法。检出限分别为7 0 “l 、1 6 0 u l 、 6 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 2 0 o u l ，平均回收率分别为9 6 6 、9 7 3 、9 7 9 。毛细管电泳法具有分离率高、 操作简单、色谱柱不受样品污染、分离速度快、样品用量少等优点。但制备能力差、 光路太短、非高灵敏度的检测器难以测出样品峰，所需仪器昂贵、复杂。 化学发光检测法是最灵敏的方法之一，其灵敏度比普通荧光法一般高两个数量 级。在酸性介质中，氧氟沙星能够增敏c e ( i w ) 一s 0 3 2 体系的化学发光，r a o 等【3 8 】建 立了测定药物制剂中氧氟沙星含量的化学发光法，实验条件为：c e 4 + 的浓度为 5 x 1 0 - - 4 m 0 1 l - 1 ，n a 2 s 0 3 和h 2 s 0 4 的浓度分别为5 x 1 0 _ 4 和1 2 5 x 1 0 - 2 m 0 1 l 1 ，流速 2 0 m l r a i n - 1 ，进样量1 0 0 “l ，线性范围为0 0 4 4 p g m l - 1 ，检出限为o 0 1 6 p g m l - 1 。 m o h a m m a d 等【3 9 】建立了测定依诺沙星的方法，在r u ( p h e n ) 3 2 + - c e ( r v ) 本g 中，依诺沙 星的化学发光可得到增强，而且增强效果依赖于依诺沙星的浓度，根据该原理，建 立了测定依诺沙星浓度的化学发光法，在最佳实验条件下，依诺沙星的线性范围和 检出限分别是0 6 4 0 6 6 4 0 6l , t g m l - 1 和0 0 2 1 0 p g m l - 1 ，r s d 是1 7 5 ( n = l o ) ，应用 于检测依诺沙星药片和人血清中依诺沙星含量，得到了满意的结果。 电化学分析法：通过测定电化学电池的某些参数，如电导、电位、电量和电流 等，或者测量这些参数在某个过程中的变化情况得到分析结果。g u i d o 等即】采用电 化学生物传感器对牛奶中的喹诺酮类药物残留进行检测，检出限为2 5 “l 。电化学 分析法具有设备简单、分析速度快、灵敏度高、选择性好、适用范围广等优点，但 也存在一些缺点，如易干扰、重现性不好、设备复杂等 4 0 , 4 1 】。 荧光分析法应用于药物分析始于十九世纪六十年代，常规荧光分析法最早被应 用于分析抗疟疾药物奎宁【4 2 1 。近几十年来，随着荧光分析法的发展，其应用范围日 益增大。现代电子技术的发展对于微弱光信号检测的灵敏度已大大提高，因此荧光 分析灵敏度一般都高于吸收光度法，灵敏度常可达亿分之几。强荧光物质具备如下 特征：( i ) 具有大的共轭兀键结构；( i i ) 具有刚性平面结构；( i i i ) 具有最低的单 线电子激发态；( i v ) 取代基团为给电子取代基【4 3 1 。 根据分析样品的状态，荧光分析法主要分为液相荧光分析法和固相荧光分析法。 液相荧光分析法是较为传统的荧光分析法。d a m i a n i 等】在液相条件下测定了尿液 中环丙沙星的含量，线性范围o 2 0 0 m g l _ 1 ，检出限5m g l _ 1 ( 1 5 1 0 _ 5 t o o l - l - 1 ) ， 主要缺点是检出限较高，难以满足对检出结果要求较高的分析实验。 随着分析实验对高灵敏度和低检出限的要求，出现了将待测组分吸附在固体物 质表面上，然后进行荧光测定的固相荧光分析法。目前常用的固体基质种类较多， 主要有非离子树脂【4 5 1 、滤纸f 4 6 1 、硅胶【4 7 】、氧化铝【4 8 】、a l g a a s 4 9 】和疏水性载玻片5 0 ，5 1 】 7 自组装环荧光显微成像技术在牛奶及生化样品中抗生素含量检测的应用 等。 “等【4 6 j 以滤纸为基质建立了七种喹诺酮类药物的固体表面室温磷光分析方法， 对影响药物荧光强度的因素进行了研究，主要有介质、p h