（水产品加工及贮藏工程专业论文）海洋酵母菌ys185产红色素的研究.pdf

上海水产大学硕士学位毕业论文 目录 摘要? 2 a b s t r a c t 4 引言5 第一章文献综述一一一一一一一一一一一一一一一6 一、虾青素研究国内外进展一一一一一一一一6 二、酵母菌发酵法生产虾青素一一一一一一一1 2 第二章海洋酵母y s 一1 8 5 红色素的鉴定一一一一一一一一0 1 6 第三章产虾青素海洋酵母菌y s 一1 8 5 原生质体制备与紫外诱变2 0 第四章海洋酵母菌y s - 1 8 5 1 9 产虾青素摇瓶培养优化2 7 第五章海洋酵母菌罐式发酵条件的研究一3 6 第六章海洋酵母y s 1 8 5 1 9 红色素理化及抗脂质过氧化研究4 2 结 仑5 1 致谢5 2 暑e 夕夕岍晦目_ 丽可f ：岁薅蛳台 _ i 下歹莎百一瞬目了孥砰：罗薅岩勘￥歌对杂 ( 。 ，衅掣群华丁相翠粤) 。口鼯蛰生士冒 ￥歌剪杂章。斗砰砰章目耍髫鼯摊匆虿挚固罐龄￥歌秒嘉章 。哥群秆牟察哥昂彰翠￥歌朝翠静。￥歌翦 嘉嘴 咄讶圭滞首参辨群覃幽黪、d | 缮目芳狗且辜锌助幕封群鞣* 单y 嘴嚣掣朝￥歌现柔章赫丢￥毕颦丁砰砰y 章。刨融咄刨覃砭￥ 弧嵌影硎刍砷咄勘由琴朝￥歌革蘩骅衅箪 j 烬* 毕掣箕恩龄斡杂晕 剧罩群朝￥诳再杂日辫、孱龄* 单杂￥毕掣丁彭弓晋y 章 骱革砰群目珊茸镄码杀 夕晦目 研矽薅茅勘￥歌秒嘉 。掣 欺尘擎萁的桨髓的勘串￥翠目解崭考畦- y , 专朝详兽蚤事吊谢延 抱朝￥歌章扭。酱翠辈抱朝苌盆瓣孽擎孑荡目彰骞荜y 妙观髯号母生 ￥歌牢、 彭站掣朝凹l 舍的翟荡目审￥剞。酱掣朝勘蚓勘工距抱些梁 车戳i 旨群朝蛳台翠y 章普￥歌现杂朝尊普鲋：的草事蛾y 章 酯卓羽，f i 号戳茸观 朗卓砰弭甘珊疆酯革羽小号戳茸观码杀 魄i - 。一 上海水产大学硕士学位毕业论文 摘要 用光、色谱法对海洋酵母菌y s - 1 8 5 色素组成进行分析并对色素理 化及抑制脂质过氧化特性进行了研究。结果表明虾青素为海洋酵母菌 y s 一1 8 5 所产红色素的主要成分，含量为6 7 5 。 对海洋酵母菌y s - 1 8 5 原生质体制备、再生条件及紫外诱变育种进 行了研究。结果显示：处于对数生长中后期酵母菌较易形成原生质体， 用0 0 5m o l le d t a 和0 5m o l lb 一巯基乙醇混合溶液预处理1 5m i n 有更高的原生质形成率，原生质体形成及再生率最佳条件为：0 5 蜗 牛酶，3 5 、酶解6 0m i n ，对原生质体紫外线辐射6 0s 诱变出y s - 1 8 5 - 1 9 突变株，其色素产量及虾青素占色素比例较出发菌株提高了4 4 8 和 4 7 。 以海洋酵母菌为生产菌进行摇瓶下的碳源、氮源、起始p h 、接种 量和培养温度发酵条件产虾青素发酵优化研究。结果表明：以3 0 9 l 葡萄糖为碳源，以5 0 9 l 硫酸铵氮源，起始p h 值6 0 ，转速2 0 0 r m i n ， 接种量8 条件下，虾青素产量为1 3 2 1 u g m l ，相比未优化时的产量提 高了9 2 5 6 。 对海洋酵母的不同补料发酵方式进行了研究，期望提高发酵产率， 以便对工业化生产提供一定的指导作用。实验显示溶氧在4 5 2 的溶 氧为发酵过程中的最佳溶氧控制浓度，采用恒p h 葡萄糖一氨水流加培 养，虾青素产量和生物量均具有最大值，分别为6 6 5ug m l 和 6 0 5 m g m 1 ；采用指数流加培养，生物量和色素量分别为5 2 i m g m l 和 5 4 6 u g m l 。 色素理化性质表明，该色素对高温及紫外线敏感，日光照射较为 敏感，对酸作用不稳定，对碱作用较为稳定；其抑制脂质过氧化作用 为v 。1 0 倍以匕。 关键词：海洋酵母菌y s 一1 8 5 ，红色素，虾青素，特性，发酵优化 上海水产大学硕士学位毕业论文 a b s t r a c t ar e dp i g m e n tp r o d u c e db ym a r i n ey e a s ty s - 15 8w a ss t u d i e d t h er e s u l t ss h o w e dt h ep i g m e n t w a sm a i n l ym a d eu po fa s t a x a n t h i n t h ec o n t e n to fw h i c hw e r e6 7 5 b yh p l c i t sp h y s i c o c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c sa n df u n c t i o nw e r ef u r t h e rs t u d i e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e dp i g m e n tw a s s u s c e p t i v et oa c i da n du l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，n o ts os u s c e p t i v et ol i g h tb u ts t a b l et oa l k a l i m o r e o v e r , t h er e dp i g m e n th a ds t r o n gi n h i b i t i o na c t i v i t yo fl i p i ds u p e r o x i d a t o nw i t h1 0t i m e sm o r et o v i t a m i nc t h es u i t a b l ec o n d i t i o no fm a r i n ey e a s ty s 一18 5p r o t o p l a s tf o r m a t i o na n dr e g e n e r a t i o nw e r e s t u d i e dt of i n dh i g hy i e l da s t a x a n t h i ns t r a i n su s i n gu l t r a v i o l e tm u t a g e n e s i sm e t h o d t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h eo p t i m a lc o n d i t i o nw a sf o l l o w i n g ：u s i n gl o g a r i t h m i cg r o w t hm e ta n a p h a s e ，0 0 5 m o l l b m e r c a p t o e t h a n o la n d0 5m o l le d t am i x t u r ep r e t r e a t m e n tf o r 15 m i n ，0 5 s n a i l l a s e t r e a t m e n tf o r6 0m i na t3 5 a f t e rt h a tah i g ha s t a x a n t h i ny i e l dm u t a n ty s - 1 8 5 1 9s t r a i nw a s o b t a i n e d t h ec o r r e s p o n d e dp i g m e n tc o n t e n ta n da s t a x a n t h i o nr a t i o nw a s4 4 8 a n d4 7 h i g h e r t h a nt h eo r i g i n a ls t r a i n t h eo p t i m i z a i o nt e s tc o n c e r n i n gt e s tc o n c e r n i n gt h ef e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n ，s u c ha sc a r b o n s o u r c e s ，n i t r o g e ns o u r c e s ，i n i t i a lp h ，i n o c u l u ms i z e ，i sc o n d u c t e d ，w i t ham a r i n ey e a s ty s - 18 5 t h e r e s u l t ss h o wt h a tw h e nt h es t r a i ng r e wu n d e rt h em e d i u m ( i n i t i a lp h6 0 ) o f3 0 9 lg l u c o s e ，5 0 9 l ( n h 4 ) 2 8 0 4n i t r o g e n ，t h ec o n c e n t r a t i o na s t a x a n t h i nc o u l dr e a c h1 3 2 l u g m l ，9 2 5 6 h i g h e rt h a n t h eo r i g i ns t r a i na f t e r4 8 hc u l t u r ei n2 0 。ca n d2 0 0 r m i n s t u d i e do nt h ed i f f e r e n tf e d - b a t c hf e r m e n t a t i o nm o d e l so fm a r i n ey e a s ty s 一18 5 ，e x p e c tt o i m p r o v et h ey i e l d o ff e r m e n t a t i o ni no r d e rt oh a v eap o s i t i v ee f f e c to ni n d u s t r yp r o d u c t i o n t h e r e s u l ts h o w e dt h a t4 5 4 - 2 d i s s o l v e do x y g e nc o n c e n t r a t i o nw a ss u i t a b l ef o rp r o d u c t i o no fa s t a x a n t h i n a n dp h - s t a tg l u c o s e a m m o n i af e e d i n gc u l t u r eb r o u g h tt h eb i g g e s ta s t a x a n t h i ny i e l d6 6 5 p g m la n d t h eb i g g e s td r yc e l lw e i g h t6 0 5 m g m 1 w h i l ei tw a s5 2 1 m g m la s t a x a n t h i ny i e l da n d5 4 6 u g m ld r y c e l lw e i g h tf o re x p o n e n t i a lf e e d i n gc u l t u r e k e yw o r d s m a r i n ey e a s tr e dp i g m e n ta s t a x a n t h i n c h a r a c t e rf e r m e n t a t i o n 4 上海水产大学硕士学位毕业论文 引言 海洋微生物资源丰富种类繁多，生活环境的独特性导致其在物种、 基因组成、代谢系统和机体防御系统上的多样性，是研究开发海洋药 物重要资源。目前已从海洋微生物中筛选得到多种有价值化合物，有 的已获得其基因结构并申请专利保护，海洋微生物已成为发达国家寻 求新型产品的重要来源。我国关于海洋微生物研究开发刚刚起步，基 础研究薄弱，面对国际上激烈的竞争，必须加强基础研究和应用研究 的投入，为长期合理地开发利用海洋微生物及其代谢产物资源提供科 学依据。 色素因其艳丽的颜色及一定的生理功效被广泛应用于食品及化妆 品工业中，色素分为天然色素和合成色素两大类，由于合成色素的潜 在危害性正逐渐被人们所认知，天然色素必将受到人民的亲睐，然而 我国天然色素生产方式极为原始，科研方面投入也极其有限，天然色 素的生产主要为德国、美国、日本等国的大公司所垄断，所以，加大 天然色素的开发，已成为我国一个亟待解决的重要课题。 本论文对海洋酵母菌产红色色素进行了研究，为开发海洋色素的 研究和应用研究打下一定的基础，对依靠我国海洋生物资源，发展我 国天然色素事业和提高相关企业的生产水平具有重大的经济和社会效 益，同时对海洋资源的可持续发展也具有重要的战略意义。 上海水产大学硕士学位毕业论文 第一章虾青素国内外研究进展( 文献综述) 第一节虾青素的结构、功麓及来源 虾青素( a s t a x a n t h i n ) 化学名称为3 ，3 一二羟基一b ，g 一胡萝卜素一 4 ，4 一二酮，分子式为c 。h 。0 。，广泛存在于生物界中，特别是水产动物的虾、蟹、 鱼和鸟类的羽毛中。虾青素是动物界中分布最广泛的一种叶黄素，呈粉红色，具 有独特的着色功能，能够促进抗体的产生，增强动物的免疫力；在抗氧化性，清 除自由基方面，其能力强于b 一胡萝卜素。具有水溶性和亲脂性，易溶于二硫化 碳、丙酮、苯和氯仿等有机溶剂。虾青素是一种极具潜力的类胡萝卜素，在水产、 食品、饲料、化妆品、医药等领域有着广阔的前景。 本文从虾青素的结构、功能、来源三个方面展开综述。 1 虾青素的化学结构 1 1 立体异构体 虾青素有两个手性( 或不对称) 中心，它们是分子中两端环结构的c 3 和c 一3 7 。 一个手性中心可以有两种构象，虾青素的两个手性碳原子c 一3 、c 一3 都能以r 或s 的形式存在，这样就有3 种旋光异构体：3 s 、3 s ，3 r 、3s 矛i j 3 r 、3 r ，3 s 、3s 和 3 r 、3r 异构体互为镜像( 对映体) ，每一对映体有着相反的旋光性，能使平面偏振 光向左或向右旋转，3 r 、3 s 无旋光性。自然生物合成的虾青素以3 r ，3r 或3 s ， 3s 异构体的形式存在n 1 ；而人工化学合成的虾青素为3 s ，3s 、3 r ，3r 及3 r ，3 s 三种异构体存在，它们的比例为1 ：2 ：1 。由此可见，生物合成的虾青素要优于 化学合成的虾青素乜1 。 1 - 2 几何异构体 因为原子不能绕双键扭曲或旋转缘故，与c c 双键结仓的原子的排列方式是 可以完全不同的，如果两个基团位于双键的同一侧称为z 结构，如果两个基团位于 双键的对应面称为e 结构，虾青素在其分子的线型部分有多个双键，每个双键都可 以是z 或e 式，全一e 结构是最稳定的结构，因为分支甲基基团不竞争空间位置。现 已发现，天然虾青素中9 、1 3 和1 5 位有z 式结构，因此虾青素可能的几何异构体有： 全一e ，( 9 z ) ，( 1 3 z ) ，( 1 5 z ) ，( 9 z 、1 3 z ) ，( 9 z 、1 5 z ) ，( 1 3 z 、1 5 z ) ，禾口( 9 z 、1 3 z 、 1 5 z ) 等1 。 1 3 虾青素存在形式 天然虾青素主要以3 s 、3s 或3 r 、3r 形式存在，虾青素在其末端环状结构中 上海水产大学硕士学位毕业论文 各有一个羟基，这种自由羟基可与脂肪酸形成酯，也可和蛋白质结合形成虾青素 蛋白复合体，产生出不同的颜色( 如龙虾中的蓝色、绿色和黄色) 1 。如南极鳞虾中 虾青素的主要立体异构体为3 r 、3r ，以酯化形式存，在野生鲑鱼肉中虾青素的主 要立体异构体为3 s 、3 7 s ，以游离形式存在n 1 ；而红发夫酵母中的虾青素，以酯化 的3 r 、3 r 为主n 1 ；血球藻中虾青素的立体异构体是3 s 、3 s ，单酯约占8 0 ，双酯 约占1 5 ，主要的脂肪酸有油酸、反油酸、蓖麻酸和花生酸等陆3 ，人工投喂富含虾 青素的红法夫酵母饲养的金鱼中的虾青素主要是以酯化形式存在哺1 。 化学合成的虾青素均为游离虾青素，立体异构体的比例为：n ( 3 s 、37 s ) ：n ( 3 r 、 3s ) ：n ( 3 r 、3r ) = l ：2 1 ，它们之间的比例是固定的，消旋体占5 0 。在生物体 内，游离的虾青素很少存在，因为虾青素在自然界不稳定。合成虾青素和天然虾 青素相比，合成虾青素在生物体内沉积能力要差于天然虾青素。比较合成虾青素 和天然虾青素饲养虹鳟鱼的效果表明：以含相同量合成虾青素或天然虾青素的饲 料分别喂养虹鳟鱼，结果却大不一样，在虹鳟鱼体中天然虾青素积累效果明显要 好于人工合成虾青素。 1 9 9 8 年美国正式批准虾青素可用于饲料、食品、医药、化妆品等，产品批号为： u sc o d ef e d e r a lr e g u l a t i o nt il e21p a r t7 3 - l i s t i no fc o l o ra d d i t i v e se x e m p t f r o mc e r t 工f i c a t 工0 n s u b p a r taf o o d ( s e c 7 3 7 5a s t a x a t h i n ) 。 2 虾青素的生物学功能研究 2 1 抗氧化作用 在虾青素分子中，有很长的共轭双键，有羟基和在共轭双键链末端的不饱和 酮，其中羟基和酮基又构成q 一羟基酮。这些结构特点使其具有较活泼的电子效应， 能向自由基提供电子或吸引自由基的未配对电子，极易与自由基反应而清除自由 基，起到抗氧化作用。生物氧化是生命活动所必需的，正常情况下氧化反应受机 体的调节和控制，但如遇心理压力、空气污染、烟薰、接触化学药剂、紫外线照 射和其它离子辐射都会促进自由基的产生。当这些自由基产生时就会发生过氧化 反应，自由基非常活泼，反应性极强，能触发链式反应而致生物膜上的脂质过氧 化，从而破坏脂类的结构和功能；同时它也能引起蛋a 质变性和交联，使酶及激 素失活，机体的免疫力降低，破坏核酸的结构并导致代谢异常等。 虾青素的分子结构具有比较活泼的电子效应，能向自由基提供电子或吸引自 由基的末配对电子，通过吸收自由基多余的能量到分子链中，导致分子降解，阻 止其它分子或组织受破坏，同时还可阻止富含脂质的膜迅速降解。可见，虾青素 的结构特点使其极易与自由基反应而清除自由基，起到抗氧化作用。 d i 等1 利用内生过氧化物的温敏消散产生分子氧研究了多种类胡萝卜素猝灭 分子氧的能力。发现猝灭分子氧的能力为：虾青素 q 一胡萝f 素 1 3 一胡萝卜素 红 上海水产大学硕士学位毕业论文 木素 玉米黄质 黄体素 胆红素 k b 绿素。l e e 等阳1 比较了包括虾青素在内共轭双键 数不同的5 种类胡萝卜素在豆油光氧化作用中猝灭活性氧的作用。发现此作用随 类胡萝卜素共轭双键数增加而增加，以虾青素的作用最强。虾青素淬灭单线态氧、 清除自由基的能力高于叶黄素和玉米黄质；也有研究表明其活力是1 3 一胡萝卜素的 1 7 3 8 倍( 依据不同的测试条件。也有研究表明在保护膜磷脂和防止其它脂质的 过氧化方面，虾青素是最好的类胡萝卜素。j p i l a r 等n 叫则比较了虾青素和其它 类胡萝卜素与生育酚清除自由基的能力，发现虾青素最强，而且认为类胡萝卜素 中羟基和酮基的存在与数目对清除自由基的作用十分重要。用鼠的红细胞和线粒 体作体外研究表明，虾青素清除自由基和淬灭活性氧的能力是0 一胡萝卜素、玉米 黄素、叶黄素和角黄素等类胡萝卜素的1 0 倍，是维生素e 的8 0 5 5 0 倍，因而被 誉为“超级维生素“e ”、“超级抗氧化剂”。 虾青素的强抗氧化活性还表现在解除光诱导的胁迫，可作为潜在的光保护剂， 用于阻止皮肤的光老化。s a v o u r e n l l 等研究了太阳光辐射对缺乏维生素a 或喂食视 黄醇、b 一胡萝卜素和虾青素的s k h i 无毛老鼠的影响，结果表明，和视黄醇相比， 虾青素具有更强的抑制腐胺积累的作用，并能降低亚精胺和精胺的浓度，显示了 其对转谷氨酰胺酶的特殊作用。c o r n n o r 等n 2 1 人分析了虾青素、胡萝卜素等保护小 鼠肾纤维细胞免受u v a 诱导产生的氧化压力的能力，结果表明虾青素保护机体免受 u v a 光诱导的氧化效果最佳。 2 2 着色作用 动物自身不能合成虾青素，只能从野生植物或者浮游动物中获得。大规模商业 养殖时必须在饲料中着色剂满足动物生长需要，虾青素作为高档着色剂在鱼类中 的吸收能力和肉体沉积能力明显高于鸡油菌素、叶黄素和玉米黄质等着色剂 ( t o r i s s e n 和c h r i s t i a n s e n1 9 9 5 ) 。 虾青素是类胡萝i - 素合成的终点，它进入动物体后可以不经修饰或生物转化而 直接贮存、沉积在组织中。并可与肌动蛋白非特异性结合。它在畜禽、水产养殖 业上都显示出良好的着色性能。 2 3 抗癌作用 。 免疫学研究表明，口服类胡萝1 - 素具有抗癌作用，能直接作用于免疫系统， 导致肿瘤缩小。n i s h i n on 3 1 研究了天然类胡萝卜素的抗癌作用，发现虾青素具有 很强的抗癌作用。g r a d e l e t 等n 4 3 用老鼠腹腔注射法研究了虾青素等几种类胡萝卜 素对黄曲霉毒素b l ( a f b l ) 引发肝致癌作用的影响发现虾青素、b 一胡萝卜素及3 一甲 基胆葸在降低肝癌病灶的数目和大小方面效果显著，而番茄红素和过量v a 无效。 这是因为虾青素等可降低体内a f b i 诱导的d n a 的单链断裂，减少了a f b i s u 肝d n a 及 血浆白蛋白的结合，加快体# b a f b i 代谢为另一种毒性较弱的黄曲霉毒素m 1 。最新 上海水产大学硕士学位毕业论文 研究成果表明，虾青素等类胡萝卜素具有比d 一胡萝卜素更强的抑制癌变的能力。 k o z u k i 等n 朝对虾青素等8 种类胡萝卜素抑制老鼠腹水肝细胞瘤( a h l 0 9 a 细胞) 发病 的活性进行了研究，证明这些类胡萝卜素可以减少a h l 0 9 a 的发作。t n a k a n 刚等研究 了虾青素对由一种亚硝胺所引起的雄性i c r 老鼠的膀胱癌和由一种硝基喹啉氧化 物所引起的雄性f 3 4 4 老鼠的口腔癌的化学预防作用后发现，对于膀胱癌和口腔癌 的发生，虾青素是一种潜在的化学预防剂，并提出虾青素的这种作用可能是由于 对细胞繁殖的抑制作用所引起的n7 。另外，虾青素作为光保护剂，可以防止由光 辐射引起的皮肤衰老和皮肤癌。可见，虾青素对膀胱癌、口腔癌、舌癌、大肠癌、 皮肤癌以及由黄曲霉毒素诱发的肝癌等癌症的发生起着一定的预防作用。 2 4 增强免疫作用 许多研究表明虾青素能促进人体免疫球蛋白的产生，增强抗体反应和增加体液 免疫的功能。j y o n o c h i 等n 7 3 人研究了虾青素和b 一胡萝卜素两种类胡萝卜素对小鼠 淋巴体外组织培养系统的免疫调节效应，结果表明类胡萝卜素的免疫作用与有无 v 活性无关，虾青素表现出更强的作用。j y o n o y c h i 等n 踟报道认为虾青素能增强t 细胞刺激人体血细胞免疫球蛋白的产生，可有效防止视网膜的氧化和感光器细胞 的损伤，改良视网膜的功能；l i n g n e l l 等研究发现口服虾青素可明显增强人的肌 肉力量和耐受力j o k a i 和h i g a s h i o k a i n 明通过体外细胞培养试验研究了虾青素对 鼠免疫活性细胞的繁殖及功能的影响，结果表明虾青素对于增强鼠免疫活性细胞 的繁殖及其它功能方面具有可能的免疫调节活性。结果还显示，虾青素比裸藻酮 和b 一胡萝卜素具有更高的免疫调节活性。j y o n o u c h i 等乜0 3 使用来自成年志愿者和 足月新生婴儿( 脐带血) 的血液样品，研究了类胡萝卜素对由外周血液单核细胞在 体外产生免疫球蛋白的影响。该研究结果显示了虾青素能提高人体免疫球蛋白的 产生。对于养殖的水产品、家畜、家禽等，虾青素在防治疾病方面有与对人类同 样的功用，如果喂以含有一定浓度虾青素的饲料后，会提高它们的抗病能力。因 此，喂以含有虾青素的饵料是解决养殖中成活率低的方法之一。 3 虾青素的生产 。3 1t h 学合成虾青素 化学合成虾青素比较困难，技术为少数跨国公司掌握。人工合成大多数为顺 式结构，并且在体内不能转化成天然的反式构型。尽管这样市场上虾青素主要还 是通过化学合成，主要用途还是作为鱼类饲料添加剂而使用晗。 虾青素化学合成法要经多步化学和生物催化反应才能完成。其化学合成的前 体物质为( s ) 一3 一乙酸基一4 一氧代一1 3 一紫罗酮，它是不同的微生物对( r ) 萜烯醇醋酸 盐不对称水解，经过萃取、反流分布及重结晶等技术处理而得到产物。这种前体 质经过反应，转化成十五个碳的维悌希盐，最后有两个十五碳的维悌希盐同一个 9 上海水产大学硕士学位毕业论文 十个碳的双醛反应合成虾青素。虾青素化学合成路线主要有两种：一是间接由 c ，。+ c 。+ c 。合成其它类胡萝卜素如四十碳的角黄素，再由该类胡萝卜素氧化生成双一 甲硅烷基一烯醇醚中间体，再经酸酰化而得。另一种方式是直接由c 。+ c 。+ c 。合成而 得。r o c h e 公司所生产的虾青素以化学合成为主，其产品商品名为加丽素粉红 ( c a r r o p h y l lp i n k ) ，虾青素含量为5 1 0 。其产品几乎占有整个虾青素市场，特 别是在水产饲料市场上，值得一提的是2 0 0 2 年1 0 月罗氏公司将其该项业务随同其 维生素及精细化工品部业务一起售给了荷兰的帝斯曼公司。 通过化学合成虾青素的动物吸收、着色能力及生物效价都低于天然虾青素。 目前为止，美国食品卫生管理局( f d a ) 不准任何化学合成产品进入保健食品市场， 仅是批准了反式结构的虾青素用于水产养殖的添加剂。但鉴于生物来源的虾青素 产量还不够高，化学合成的虾青素在生产中特别是水产养殖中仍具有一定的竞争 优势。随着天然虾青素产业的兴起，这种低效的产品会逐渐被淘汰。 3 2 天然虾青素的生产 天然虾青素从动植物及微生物中，尽管提取来源广泛，但含量极低。如在虾、 蟹的废壳的含量只有约8 0 u g g 。法夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 中含量一般在 1 5 0 0 5 0 0 0 u g g 之间，在淡水单细胞绿藻一雨生红球藻( h a e m a t o c o c c u sp l u v i a l i s ) 中，虾青素的含量可达i 0 0 0 0 4 0 0 0 0 u g g ，被认为是自然界中天然虾青素含量最高 的生物。天然虾青素的工业化生产，目前也主要是采用法夫酵母的工业发酵和雨 生红球藻的大规模养殖来进行的心引，由于生产成本及技术难度高，天然虾青素的 产量有限，国际市场上的价格很高，这也一定程度上制约了天然虾青素的应用。 发夫酵母发酵法是一种获取天然虾青素的重要的生物学途径，红发夫酵母最早 由p h a f f 等人于1 9 7 0 年在美国阿拉斯加的高山上和日本北海道一带山区落叶树的 渗出液中分离得到的，1 9 7 6 年a n d r e w e s 等人在其中发现了虾青素。红发夫酵母具有 生产速度快；培养条件温和；虾青素是其所产色素中的主要成分；细胞 中不但含有丰富的蛋白质、脂类、维生素，而且还含有大量的不饱和脂肪酸及多 种虾青素的前体等优点。但由于野生红发夫酵母总类胡萝卜素的产量不超过 5 0 0 m g g 干酵母，且细胞壁很厚，因此研究工作者首先要从事于菌种的改良。、发酵 条件的优化和虾青素的提取等三个方面进行。国内开展了一些实验研究工作，取 得了一些进展，但离工业化生产还有一段距离，尚未见有用发夫酵母生产虾青素 的企业。国外研究科研投入相对较大，已实现了工业化生产，例如，美国红星公司 ( 3 0 0 0 4 0 0 0 9 t 干酵母) 及i g e n eb i o t e c h n o l o g yi n c 等。 另一种获取天然虾青素的重要途径是通过大量培养雨生红球藻 ( h a e m a t o c o c c u sp l u v i a li s ) 来进行。雨生红球藻是一种具有双鞭毛的淡水单细 胞绿藻，为所有己知的虾青素合成的生物体中积累量最高的物种，其积累量最高 上海水产大学硕士学位毕业论文 可达细胞干重的4 ，且所含的类胡萝卜素中虾青素含量高，国外报道有优良的雨 生红球藻体中虾青素一般占类胡萝卜素总量的9 0 以上。但其缺点是这种藻类的生 长条件要求条件苛刻，对水质、环境及光的要求高，大规模生产依然存在难度 ( j o h n n s o n 等，1 9 9 1 ) ，且细胞壁厚，提取困难。以该法生产天虾素主要有c y a o t e c h c o r p 公司，在h a w i i 有1 0 8 英亩开放式大池，用于培养藻类生产虾青素，其产品已 获得美国f d a 及加拿大c f i a 比准使用，注册商标为n o t u r o s e ，在食品、医药、化妆 品及饲料等领域都占有一定的市场。 另一种获得虾青素的方式是从富含虾青素的水生甲壳类动物( 如南极鳞虾加工 副产品) 及火烈鸟的羽毛中提取，但这种往往因为提取分离虾青素时困难、提取成 本太高，环境污染等因素没进行工业化生产。该法提取生产虾青素常见工艺为：首先， 在生产虾青素时，将贮存于双层乙烯袋中在- 7 0 保存的废弃物，粉碎成膏状物。按 重量比1 ：1 加入大豆油，搅拌均匀后，用铅或铂把容器围起来避光缓缓加热到9 0 ，利 用低温离心技术( o 。c ，11 0 0 0 r m i n ，l o m i n ) ，收集油溶液，使之分层虾青素存在于上层 色素液中。用分液装置分离、提纯，即得虾青素。此法生产条件要求苛刻，生产成本 高，产量较低，产品纯度不高。因此，目前仅有少数国家应用这种技术生产虾青素。 上海水产大学硕士学位毕业论文 第二节酵母菌发酵法生产虾青素 虾青素( a s t a x a n t h ，3 ，3 一二羟基一0 ，0 一胡萝卜素一4 ，4 一二酮) ， 属于酮式类胡萝卜素。生理研究表明，虾青素具有很强的抗氧化功能，能清除体 内由紫外线照射产生的自由基，调节降低这些由于光化学引起的伤害，对紫外线 引起的皮肤癌有很好的治疗效果。虾青索的抗氧化功能高于角黄素 ( c a n t h a x a n t h i n ) 、b 一胡萝卜素( b - c a r o t e n e ) 、玉米黄素( z e a x a n t h i n ) 等其它类 胡萝卜素，能抑制生物膜被氧化，显著促进淋巴结抗体的产生。 虾青素广泛存在于生物界中，特别是水生甲壳类动物如虾、蟹等。因此，虾 青素可以从食品加工的废弃物中提取分离得到。但由于微生物发酵法生产虾青素 具有生长速度快、生产周期短的特点，易于工业化生产，己成为虾青素生产的主 要方法。目前，微生物发酵法生产虾青素的主要微生物是红发夫酵母( p h a f f i a r h o d o z y m a ) 。该酵母是p h a f f 等人于7 0 年代所发现，后经鉴定并命名为新属范菲 亚属。1 9 7 6 年a n d r e w s 心3 3 等人发现它能够生产虾青素，1 9 8 0 年j o h n s o n 乜钔把发酵 培养菌体用于鲑鳟鱼和鲟鱼饲料中，获得了良好的效果。鲑鳟鱼和鲟鱼食用了红 发夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 的发酵培养菌体后，鱼皮和肌肉中由于积累了虾青 素而呈红色，增加了鲑鳟鱼和鲟鱼的食用美感。也增加了食用功效，在市场上大 受欢迎。在欧美等国，虾青素的年销售额已达十几亿美元。同时，虾青素可开发成 医药品、化妆品、食品添加剂等，具有抗癌变、抗衰老和增强免疫等功能，有着 重要的经济价值。 1 虾青素产生菌和虾青素的生物合成途径 能够产生虾青素的微生物菌株并不多。目前，国内外主要利用红发夫酵母 ( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 生产虾青素。y a m a n e 等乜朝指出，红发夫酵母被普遍使用的主 要原因是由于其所产生的类胡萝卜素物质中虾青素是主要的一种成份以及生产过 程较易控制。一些文献也已报道其他些微生物菌株。但有些菌生长较慢且虾青素 含量低，无工业应用前景。在一些文献中提到的菌株尽管能产生较高的虾青素含 量，如深红酵母( p h o d o t o r a l ar u b r a ) 、粘红酵母( r h o d o t o r u l ag l u t i n s ) 2 引、黄 杆菌( f l a v o b a c t e r i u ms p p ) c ，堋等，但没有见到详细的研究报告。 g i r a r d 等乜引总结了a n d r e w s 、c e i g l e r 乜8 1 、a n 乜印等人的研究工作，指出红发夫 酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 合成虾青素的代谢途径为：异戊烯焦磷酸( i s o p e n t e n y l d i p h o s p h a t e ) 首先合成为牦牛儿焦磷酸( g e v a n y l g e r a n y ld i p h o s p h a t e ) ，牦牛儿 焦磷酸再转化成八氢番茄红素( p h y t o e n e ) ，然后八氢番茄红素脱氢形成番茄红素 ( l y c o p e n e ) ，番茄红素环化形成b 一胡萝卜素( b - c a r t o n e ) 。b 一胡萝卜素可以先 上海水产大学硕士学位毕业论文 在c - 3 ，3 位羟基化形成中间产物d 一隐黄质( b c r y p t o x a n t h i n ) 和玉米黄素 ( z e a x a n t h i n ) 。再在c - 4 位氧化形成中间产物3 一二羟基一2 一酮一b 一胡萝卜素 ( a d o n i x a n t h i n ) ，进一步氧化a d o n i x a n t h i n 最后形成虾青素。d 一胡萝卜素也可 以先在c - 4 ，4 氧化形成中间产物海胆酮( e c h i n e n o n e ) 和鸡油菌黄质 ( c a n t h a x a n t h i n ) 。再在c 一3 位羟基化形成中间产物4 一二酮一3 一羟基一b 一胡萝h 素( a d o n i m b u i n ) ，进一步将a d o n i m b u i n d 在c 一3 位羟基化形成虾青素。g i r a r d 等羽对红发夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 进行诱变处理，发现从无色到红色的诱变 突变菌株。分析突变菌株的虾青素合成中间产物，可以发现，番茄红素环化形成 0 一胡萝卜素这一步骤不会受到诱变处理的影响，但诱变处理能影响到其他的步 骤，即诱变处理主要影响b 一胡萝卜素合成之前的步骤。虾青素有三种不同的旋光 异构体。红发夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 合成的虾青素为3 r ，3 1r 异构体( 3 s ， 3 + s 异构体的对称体) 。而人工化学合成的虾青素为3 s ，3 + s 异构体口0 。、3 r ，3 r 异构体和3 r ，3 s 异构体。由此可见，生物合成的虾青索要优于化学合成的虾青 素。 2 培养条件对胞内虾青素积累的影响 微生物细胞内虾青素的生物合成基本上由它们的遗传特性所控制，通过诱变育 种技术，改变微生物的遗传特征。得到高产虾青素的微生物菌株。但是，微生物 胞内虾青素的积累也受各种环境因子的影响，会随发酵培养基的改变而改变。还 受诸如温度、p h 和溶氧等因素的影响。j o h n s o n 乜伽首先考察了红发夫酵母( p h a f i a r h o d o z y m a ) 的发酵工艺条件，发现虾青素积累的最佳碳源为纤维二糖，葡萄糖和 蔗糖都会加快菌体的生长速度，但当菌体生长速率较高时，胞内虾青索含量将会 下降；发酵过程中的溶解氧浓度对菌体合成虾青素的影响较大，当溶氧值低于 3 0 m m o l l h o ：时，菌体主要积累b 一胡萝卜素和单烯酮类。虾青素生物合成途径受 到抑制。在6 浓度的葡萄糖含量条件下，生物量、胞内虾青素的含量以及虾青索 的产量分别为1 6 m g m l ，3 0 0 u g g 和5 u g m l 。m e y e r 等用红发夫酵母( p h a f f i a r h o d o z y m a ) 诱变株，进行不同碳源、氮源的研究，发现采用甘露糖醇和琥珀酸作 碳源时，与其他碳源相比可以有效地增强胞内虾青素的合成，缬氨酸作为唯一氮 源时，也可以有效地增加胞内虾青素的积累。但是，酵母的比生长速率较低，菌 体得率也较低。在整个发酵过程中，酵母的生长最适p h 在4 5 5 5 之间，而虾 青素合成的p h 值则在3 0 以上。k u s d i v a n t i n i 等b 2 1 发现用甘油作为碳源，酵母膏 和蛋白胨作为有机氮源的情况下，红发夫酵母的最大比生长速率可达到0 2 4 h 叫左 右。胞内虾青素占总色素量约为7 8 。最大的虾青素产量为3 7 7 u g m l ，胞内虾 青素含量为1 8 0 0 u g g 干菌体。但是用甘油作为唯一碳源时，其发酵周期要达到 1 6 8 h 。p a r a j o 等口副利用半纤维素的水解液作为红发夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 上海水产大学硕士学位毕业论文 生产虾青素的碳源，在较佳的氮源情况下，虾青素产量可达到4 6 u g m l ，胞内虾 青素可达4 3 9 o u g g 干菌体。在工业生产中，必须考虑生产的成本，实现这一目 标的措施之一，是利用一些廉价的工业副产物。为此，h a a r d 口叫利用糖蜜作为碳源， f o n t a n a 等印和h a y m a n 等人聆6 1 则利用了甘蔗汁和米厂湿粉碎的副产品。h a a r d 采 用1 0 的糖蜜替代葡萄糖作为碳源获得的结果是：胞内虾青索含量为l l o o u g g 干 菌体，虾青素产量为1 5 u g m l 。但是，当糖蜜作为培养基的碳源时，由于糖蜜中主 要成份为蔗糖，蔗糖为红发夫酵母利用时，分解的葡萄糖和果糖将会阻抑蔗糖的 利用，结果降低了蔗糖利用速率，许多学者都指出了这一点，并考察了蔗糖的利 用与单糖传递的关系。几乎在所有的研究中都指出，由于红发夫酵母形成虾青素 的生物合成途径属于生长偶联型，因此，低氧和高糖都要影响虾青素的产量。 从虾青素合成途径中可以看到，合成虾青素的前体物质有多种，如b 一胡萝卜 素、番茄红素等。j o h n s o n 等人在培养液中加人番茄汁，因为番茄汁中含有虾青素 台成的时体物质番茄红索，结果使得胞内虾青素的含量提高到8 1 4 u g g 干菌体心引。 类胡萝b 素合成的起点物质是甲羟戊酸( m v a ) ，c a l o 等人在培养基中加入0 1 甲 羟戊酸，胞内虾青素和总色素增加了4 倍。m e y e r 等人口 在培养液中加入单萜烯类 物质来考察对发酵的影响。l e w i s 和o k a g b u e 等则分别报告了b 一紫罗酮( d l o n o t i e ) 和皂苷( s a p o n i n ) 对红发夫酵母的虾青素合成有抑制作用。m e y e r 等口刚 以醋酸作为滴定剂调节p h 值，当培养液中醋酸的浓度达到2 9 l 时，细胞生长完 全被抑制。在适当的醋酸浓度下，虾青素含量最大可增加到1 4 3 0 u g g 干菌体。 国内有人研究了用玉米水解液、大米水解液、薯干粉水解液、糖蜜等作为红发 夫酵母碳源研究了发酵的工艺条件，将迅速利用碳源和缓慢利用碳源相复合控制 酵母的比生长速率，并通过加入前体物质、控制发酵温度等手段有效地提高胞内 虾青素含量，并使发酵液中的生物量提高到4 0 5 0 9 干重l 以上。 3 虾青素的提取以及分析检测 虾青素在细胞内合成，是细胞内物质。为了促进虾青素的释放，o k a g b u e 和 l e w i s 口9 删采用蒸馏水或柠檬酸自溶法。a n 等人和h a a r d 等先用机械破碎的方法破 坏红发夫酵母( p h a f f i ar h o d o z y m a ) 的细胞结构，然后用有机溶剂提取。o k a g b u e 等人在发酵结束后先热处理，灭活酵母，调整p h 后加人芽孢杆菌( b a c i l l u s c i r c u t a n s ) ，芽孢杆菌分泌胞外酶溶解酵母壁，使虾青素释放。比较各种提取方 法，较为理想且能实现产业化的是有机溶剂萃取的方法。在这种固一液萃取过程， 包括了溶剂渗透、色素溶解、溶液度扩散等一系列步骤。有机溶剂的选择对于提 取虾青素是