（环境科学专业论文）苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及qsar研究.pdf

a bs t r a c t w i t l l l ed e v e l o p i l 嘲1 to ft 1 1 ei n d u s 仃y 觚da 鲥c i l l t u r e 龃d 谢d ea p p l i c a t i o ft h ec h e m i c a l s ， al a 玛e 姗m b e ro fp o i s o n o u s 吼l b s t m l c 骼h a 、，cc o m ei n t 0n a t u m lw a t e r st h r o u g hv 蜀丽o u sk i i l d so f 、张) ，s ，觚dc 肌s e da q u a t i cp o l l u t i 伽t h 髓ep o l l u t 锄t sc o e x i s t i n gi nt h ew a t e 璐c 孤r e s u l ts 甜0 u s c o m p l e xp o l l u t i o n n i sv a 了i m p o 咖tt 0 s t u d yt o x i ce 伍t so fc o e x i s t i n gp o l l u t 锄t s t 0 o 唱a i i i s m sf o rp r o t e c 血gw a t e r 蚋0 i 瑚饥t 锄dk e e p i i l ge c o l o 百c a ls y s t a nh e 4 l t h aw a t 盯s 锄p l ew 舔g a m e r e d 丘o mm en a n j i n gs c c t i o no fm ey a n 舀z er i v e r 鹪 m i r g a n i s m ss 0 1 l r c e a c u t et o x i c i 锣o fm ep h 肌o la n da j l i l i n e 捌l t i v 鹳t 0t l l er i v 盯b a c t e r i a w 雒d e 蛐e d b 嬲c do n l er 鼯u l t so fa c u t et o x i c i 劬l ej o i i l tt o x i c 时o fb i n a t 锄a d ，觚d q l l a t 锄i o no fm 呦o l s 柚d 被i l i i l 伪w e 他幽m i n c d 觚dm em e d i a l le j j e 抚t v ei i l h i b i t i o n ( i c 5 0 l n 0 、黼g a i n e d 1 1 唿i cu n i t ，m 议t u t o x i ci i l d c x 锄da d d i t i v em d e xm e m o d sw e 托璐e dt 0e 、忸l u a t et l l c j o i n tt o x i c i t ) ，e h i e c t s t h ee v a l u a t i l l g 溺u l t ss h o w e dm a tt o x i cu n i t 觚dm i x t l l r et ) x i cm e t l l o d w e r ea l w a y sc o n s i s t t ，h i l et h a t 舳ma d d i t i v eh d e xm e n l o dw a sd i f | 陆t 谢mo m e 撂w h e n n l ej o i n tt o x i c i 够e 伍e c t s 、阳f em ep a n i a la d d i t i o ne v a l u a t e db yf i r s tt 、oi i 坨t h o d s ，t h e 锄t a g o n i s m b ya d d i t i v e1 1 1 d e xm e t h o d f o rt l l o s em i x t u r e se s t a m i t e dt os y n e f 蜮s t i co r 锄t a g ，如i s 石ce 任& t ，出e r c s u l t s 丘d mn l r c em e t h o d sa r ec o l l s i s t e n t t h eq u 锄t i t a t i v es 觚c t i l r e - a c t i v 毋r e l a t i o n 8 h i p ( q s a r ) m o d e l s 、耽陀d e v e l o p e d 矗wt l l ej o 诚 t o x i c i t ) ro fb i l l a r ) ，a n dt e m a r ym i x t i l r eo fp h e n o l s 觚d 锄i l i n e st 0r i v e rb a c 矧ab yu s i n g 0 c t a l l o 脚a t e rp a n i t i o nc o e m c i 饥tm e t h o d ，t l l em o l e c i l l a rc o i l i l e c t i 啊够i n d e xm e m o d 锄dt h e q u 锄t i l i i lc h 锄i s 仃ym e t h o d ，a n das 耐e so fq s a rm o d e l s 袱粕0 b t a i n e db yu s i i i gs p s s1 0 o s o f h 】l ，a r e 7 r h ed e t a i n e dq s a rm o d e lw i mm em o l e c u l a rc o n n e c t i v i 够i n d e xm e t l l o dt o5 2 鲫l p s o fm i x t u l 鹊i sm em o s ts u c c c s s 龟l ，鹄i t ss q u a r eo fc o r r e l a t i o nc o e 伍c i ti s0 8 5 6 t h eq s a r m o d do f5 2 掣0 u p so ft h em i ) 【t i l r eb yu s i n go c t a n o 撕a t 盱p a n i t i o nc o e m c i 锄tm e t l l o d t h e s q u a r eo fw h i c hi s0 810 忙5 2 ) c o n s i d 耐n gn l em i 】【t i 鹏ss t i l d i e dc o n t 血e dn o to n l yp o l a r n a r c o t i c sb u ta l s or e a c t i v e c o m p o u i l d ，m e 行o n t i e ro r b i t a le n e r g yg a p ew 硒 i n t r o d u c e di no r d e rt 0 i m p m v et l l ep r e d i c t i o n f o rj o i n t t o x i c i 哆：一l g i c 5 0 l i l i x _ 一0 13 4 e 哦+ o 5 6 l o gp 咄+ 4 0 7 6 ( r 2 = o 8 2 3 ，s e = o 13 3 ) q s a 黜、e f eu s e dt 0 p r e d i c tm ej o i n tt o x i c i 咄a n dt h ep r 甜i c t e d 趾dm e 嬲删v a l u 懿w e r ef o u n dt of i tw e l i k e yw o r d s ：p h e i l o la i l da n i l i n ed 舐v a t i v e s ；戳v e fb a c t 嘶a ；j o i i l tt 0 x i c i t ) r ；q s a r 学位论文独创性声明： 本人所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作 及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果。与我一 同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。如不实，本人负全部责任。 论文作者( 签名) 一跟基址 舢墨年多月钐日 学位论文使用授权说明 河海大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术 期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件 或电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论 文外，允许论文被查阅和借阅。论文全部或部分内容的公布( 包括 刊登) 授权河海大学研究生院办理。 论文作者( 签名) ：罡主、盎盘炒每年6 月烨日 河海大学硕：t 学位论文苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 第一章绪论 1 1 联合作用研究的意义 随着工农业生产的迅猛发展，越来越多的污染物质，尤其是人工合成的各 种有机污染物通过各种途径进入到环境中，并在环境中共存【l 】。长期的毒理学 研究己揭示出大量单一化学品的物理化学性质和环境毒性效应，许多标准如安 全浓度标准，废水允许排放标准等都是依据单个化学品的毒性效应建立起来的 【2 3 】。但仅用单一化学品的毒性效应是无法解释其作用机理，因为在多数情况下， 两种或多种化学物质作用于生物体时，会引起与各物质单独作用时完全不同的 毒性反应【4 1 。所以依赖于单一毒性效应制定的标准无法真实地反映环境质量要 求，因此研究两种或多种化学品的联合毒性效应逐渐成为环境毒理学研究的重 要方向，它能为环境标准的制定和生态风险评价提供更可靠的依据。 1 2 联合作用机理 联合毒性作用机理的研究是进行联合毒性作用研究的重点之一，但目前关 于这方面的研究国内外都还处于起步阶段，缺少深入的研究。化合物间相互作 用的复杂性以及影响联合效应因素的多样性，决定了其作用机理的复杂性。 1 2 1 竞争活性位点 物理化学性质相似的污染物由于作用方式和途径相似。因而在细胞表面及 代谢系统的活性部位存在竞争作用，从而影响污染物的相互作用【5 】。对吸附位 点的竞争会导致一种污染物从结合位点上取代另一种处于竞争弱势的污染物。 这种竞争的结果在很大程度上取决于参与竞争的各污染物的种类、浓度比和各 自的吸附特性。m i l l e r 等( 1 9 7 7 ) 认为金属离子之间对生理活性部位的竞争可能是 影响重金属拮抗作用的一个因子【6 】。 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 1 2 2 干扰生物正常的生理过程 化合物之间的联合作用会干扰生物体正常生理活动，影响生物体对特定化 合物的转移、转化、代谢等生理过程。如n i m a l a 等【7 】研究三丁基锡( t b t ) 和多 氯联苯( p c b s ) 对鱼体繁殖率表现出的拮抗作用与毒物在鱼体中的富积并向鱼卵 中转移有关。j a l l a 研究发现h g 、p b 、c d 、c u 复合污染情况下，重金属通过抑 制核酸的生物合成和破坏蛋白质合成机制以及破坏植物组织膜的完整性等活动 促进水生植物的衰老【8 】，重金属离子与酶的活性原子团s h ，n h 2 ，o h ，c o o h 等官能团形成牢固的共价键，从而使酶的立体结构变形，酶活性部位封闭【9 】。 1 2 3 改变细胞的结构与功能 污染物的联合作用可使生物体或有关内含物与外界环境隔离开，从而改变 其透性及主动、被动转运能力，也会改变细胞的结构与功能。如e n s e n b e c h 等【l o 】 研究发现暴露于3 ，4 二氯苯胺的鱼体的肝细胞中粗面内质网穿孔，线粒体膨胀， 溶酶数量增多，加入林丹( 六六六) 后，肝细胞会变得更加肥大。杨志敏等【6 】通过 认为c a 2 + 是通过使细胞膜表面致密，或在细胞膜表面形成保护膜的方式，抑制 z n 2 + 的毒性，即对z n 2 + 产生解毒作用。 1 2 4 影响酶的活性 污染物的联合作用会改变与代谢污染物有关的酶( 系) 的活性，影响污染物 在生物体内的扩散、转化和代谢方式，从而影响污染物在生物体内的行为和毒 性。有些化合物可阻抑生物体内自由基的产生，从而减低过氧化胁迫，使其它 共存的毒物的毒性降低。f i l i p p i s 等通过对z n 和h g 对小球藻细胞的毒性研究 结果表明，细胞膜的稳定性受重金属离子对一s h 的亲和性的影响【l l 】。孙金秀【1 2 】 等认为有机磷增加了拟除虫菊酷的水解酶而出现毒性增加的结果。 1 2 5 干扰生物大分子的结构与功能 污染物通过抑制生物大分子的合成与代谢干扰基因的扩散和表达，对d n a 2 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 造成损伤或使之断裂并影响其修复，或与研峨生成化学加合物。d o 衄e l l 等研 究发现，随着t n t ( 三硝基甲苯) 加入量的增大，苯( a ) 并花( b ( a ) p ) 的毒性逐渐 降低，其原因在于前者干扰了后者与d n a 的结合【1 3 】。 1 2 6 螯合或络合及沉淀作用 自然环境中存在许多络合剂如o h ，- n h 2 ，c o o h 等，它们会改变污染物 的形态分布和其生物有效性。有机鳌合剂和被螯合物可形成生物体不能吸收、 蓄积的螯合物形式，同时污染物间还可形成沉淀，从而降低污染物的溶解性和 可利用性。重金属对蓝藻细菌( m ，l 渤口纪砌) 的毒性能被具有结合重金属离子 的功能团的有机物所控制【1 1 】。s h 与重金属h g ，c d 等都有强的亲和力，因而 许多含有s h 的蛋白质和酶的活性可被h g 和c d 抑制。 r a i 研究抗坏血酸和还原型谷胱甘肽对c r 和p b 的拮抗作用机制是：( 1 ) 抗坏血酸通过供给电子或增强还原能力，从而保护s h 不受氧化；( 2 ) 抗坏血 酸及其代谢产物能结合重金属等无机物并阻止它们通过生物膜。m a p s o n 也认为 抗坏血酸是通过供给电子和保护s h 的完整性来拮抗h g 的毒性【u 】。f i l i p p i s 研 究h g 和z n 对小球藻( c h l a r e u a ) 的毒性时也有类似结论【】。 1 3 影响联合毒性作用的因素 1 3 1 生物因子 混合污染物的联合毒性效应受生物种类、作用部位、生物营养状况以及生 物年龄和性别等因素的影响。b r a e k 等研究表明，c u 和z n 联合作用时对双鞭 甲藻( d f 玎纰肠绍) 的前沟藻属似川p 7 i f 坊，l f “坍) 、四鞭藻属( 国胞，妇) 和硅藻的海 链藻属( 刀l 口，c 琊f 打留) 有明显的协同作用，而对硅藻的褐指藻属佛口e d 出c 纱觑m ) 的效应则表明它们相互拮抗【1 4 】。 1 3 2 污染物因子 污染物因子包括污染物种类、污染物化学结构与性质、处理方式、污染物 3 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 浓度、污染物之间浓度比等。c 砌s o n 等发现p b 和c d 对植物生长的影响随浓度 而变化，低浓度时为加和作用，高浓度时为协同作用【1 5 】；而p i e t i l a i n e i l 等研究 则表明p b 和c d 的交互作用关系与两者的浓度比有关，当p b c d 1 时，它们对 浮游植物初级生产力的影响为拮抗作用；当p b c d m o 时为拮抗作用；m m 1 为部分相加作用。 袁星等跚研究了2 ，4 二硝基甲苯与对硝基苯胺、对硝基苯酚、对硝基甲苯、 对硝基氯苯的联合毒性，按等剂量混合采用毒性单位法评价得出对大型蚤的联 合毒性基本为相加作用。 6 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 高继军等【蚓采用毒性单位方法按等毒性混合，研究得出铜汞、铜锡、铜镍 等3 组混合物对淡水发光菌青海孤菌的联合毒性表现为拮抗作用。 ( 2 ) 相加指数法( a i ) 相加指数法( a 1 ) 是在毒性单位基础上发展起来的，其定义如下： 1 a i - 亡- 1 ( m 1 ) ( 1 4 ) m 、 a i - 1 m ( m 1 )( 1 - 5 ) 相加指数法的评价标准是：a p 0 ，为简单的相加作用( a d d i t i o n ) ；a i o ，为协同作用( s ) ，i l e 哂s m ) 。a i o 是一种理想的相 加作用，在实际实验中，由于存在误差，即使是相加作用，也很难恰好得到a i = o 的结果，因此m a r k i n 一3 7 】提出若a i 的置信区间包含o ，就认为是相加作用。这 种方法在研究多组分混合物的联合作用较多，是目前最为常见的混合物联合毒 性评价方法。 黄小娟等研究了硝基芳烃对盐藻的联合毒性，按照相加指数法进行评价 得出2 ，4 二硝基苯胺、2 ，4 二硝基氯苯胺与间二硝基苯按二元混合和三元混合后 对盐藻的联合作用主要作用为相加作用。 ( 3 ) 混合毒性指数法( m t i ) k i n e m a i l n 于1 9 8 1 年首次提出用混合毒性指数( m t i ) 对多元混合物鱼类联 合毒性的评价研究【3 9 】： m t i = l l o g m l o 疹山 ( 1 6 ) 评价标准为：当m t i _ 1 时联合作用表现为简单相加租用，m t i 1 为协同作用，m t i = o 为独立作用，o m t i 1 为协同作用，0 入 l 为独立或拮抗作用。 ( 5 ) 等效线图模型 1 8 7 0 年f r a s e r 倡导，1 9 2 6 年l o e w e 加以发展的等效应线图法，是先用加权 直线回归法求出单独与混合后的l d 5 0 ，再求其毒性比例t r 值，以t r 界值来 反映结果性质。在实验条件和接触途径相同的情况下，分别求出两个化学物的 l d 5 0 及其9 5 可信限，用纵、横坐标分别代表两种化学物的剂量并将取得的同 一效应的剂量( l d 5 0 ) 点相连即为等效线，然后再将两化学物的9 5 可信限的上、 下限值分别连接。依据混合物实测l d 5 0 在两种化学物质可信限上、下连线之间 位置判定联合作用特征。l a n g e 等人【4 1 埔这种方法评价了硝基苯与二硝基苯对 海洋发光菌的联合抑制作用，效果较好。该法简单，结果直观，适用于粗略观 察。但是只能评价两个化学物的联合作用，与其严密的设计相比信息利用度不 够，也不适用于非概率型效应指标资料。 ( 6 ) v 值法 c l a u s i n g 等【4 2 1 提出，定义为： v = ( o 5 l c 5 0 十o 5 l c 5 0 b ) l c 5 0 ( a 十b ) ( 1 9 ) a ，b 分别为各污染物的单一毒性。 评价标准为：当v o 8 时为拮抗作用，0 8 1 0 0 为协同作用，c t c 一b r - c h o 一c h 3 一f n h 2 - c n 一o h - o c h 3 - c o c h 3 。 f r e e 和w i l s o n 法建立的结构活性关系式较简单而直接，但只适合于存在 多取代位的情况。且这种方法一般也未假定任何模型参数或物理性质作为决定 生物活性的关联因素。因而所得结果对这一相互关系也不提供任何信息，在某 种程度上限制了该方法的应用。 1 5 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 1 6 4 5 线性自由能相关( l f e r ) 法 h a i l s c h 【7 3 1 认为，如果不考虑有机物在生物体内的代谢，那么生物毒性可以 认为是该物质的立体效应( t a r 常数e s ) 、电了效应( h a i r i i i l e t t 常数o ) 及疏水效应 ( ( 1 0 9p ) 的函数，可用下式表达： 一l g l c 5 0 = al o gp - b ( 1 0 9p ) 2 十c e s + 如+ e ( 1 2 4 ) 式中，a ，b ，c ，d ，。为常数。多数h a i l s c h 相关方程，并不一定同时包含l o g p ，e s ，o 三种结构参数，如果有机物分子不太大，电性效应和立体效应有时可以 忽略，则方程( 1 2 5 ) 可简化为方程( 1 1 4 ) ，这就是常用的辛醇水分配系数法。 林志芬等【7 4 】用腈醛混合物对发光菌联合毒性建立q s a r 模型： - l 百c 5 0 n l i x = o 8 4 2 - o 8 3 l o m i 】【 ( 1 2 5 ) n = 8 ，r 2 = o 8 0 3 ，s e = o 2 2 2 ，f = 2 4 4 l5 ，p = o 0 0 3 - l 哲c 5 0 i l l i x = 一o 3 4 8 8 4 5 c 木m i 】【 ( 1 2 6 ) n = 8 ，r 2 = o 8 7 4 ，s e = o 2 1 9 ，f = 4 1 7 3 ，p ：o 0 0 1 方程分别定量描述羟基乙腈与系列醛类化合物和对苯二甲醛与系列腈类化 合物对发光菌的联合毒性，模型具有较高的稳定性和预测能力。 由于h a n s c h 方法的参数较易获得，并具有一定的理论意义，有助于人们 理解生物活性的作用机制，因而直至今日仍有许多q s a r 研究者采用这种方法。 1 6 4 6 线性溶剂化能相关法( l s e r s ，l i n e a rs a l v a t i o ne n e r j g y r e l a t i o n s h i p s ) 线性溶剂化能相关( l s e r ) 是k 锄l e t 等【7 5 1 人在线性自由能关系( l f e r ) 的基 础上提出的。该法指出，化学品的许多性质取决于该溶质与溶剂问的相互作用 因此在预测方程中有三个贡献项相互制约：容积项、偶极项和氢键项。模型如 下【7 6 ，7 7 】 i z z o + m v ；1 0 0 + s 万+ b 氏+ a 口。 ( 1 - 2 7 ) 式中z 代表化合物与溶解分配有关的性质、1 0 0 为分了的容积项，反映 溶解过程中分离溶剂分了并为污染物分了提供空间位穴时所需的自由能；妒为 偶极项，反映溶质与溶剂问偶极偶极作用及诱导偶极作用时的放能效应。氢键 项成和口。表征的是溶质与溶剂间形成氢键时的放能效应，包括两种情况：当 1 6 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 溶质为氢键质了接受体( hb a ) 时，以风表示；当溶质为质了给予体( hb d ) 时， 以表示。式中的z 0 ，m ，s ，b ，a 均为常数。 于瑞莲等【7 8 】用1 2 种卤代苯等对发光菌15 m i l l 半数发光抑制浓度和大型蚤 2 4 h 半数抑制浓度进行q s a r 分析得到的线性回归方程为： 卤代苯对发光菌的l s e r 方程： 一l g e c 5 0 2 0 2 9 + 6 1 9 v i 1 0 0 + 0 1 5 兀串+ 3 8 9 风+ 0 0 6 c ( 1 2 8 ) n = 1 2 ， s e = o 2 2 ， r 2 = o 9 卤代苯对大型蚤的l s e r 方程： 一l g i c 5 0 _ 1 2 9 + 5 0 7 w l o o + 0 0 3 矿一1 4 5 风- o 2 6 ( 1 2 9 ) n = 1 2 ，s e = o 2 2 ，r 2 = o 9 很显然，模型相关性和可靠性都非常高。随着内部分了体积( v i l o o ) 的增 加，化合物的水溶性降低，毒性升高随着偶极极化率丫的增大，分了的毒性呈 增大趋势。这种方法的预测精确度较高，而且具有直观的物理意义，但参数较 难获得。 1 6 4 7 分子表面积法( t s a ) h 锄a i l s 等首次从分子结构角度计算了分子总表面积( t s a ) ，并从理论上 建立了溶解度与t s a 之间的函数关系。用分子表面积为参数研究有机化合物对 生物体的毒性的报道已有很多。t s a 的计算方法有h e n i l a l l s 法、v a l v s l l i 法等。 徐宝峰7 9 1 将氯代芳烃的分子总表面积与摩尔体积对呆鲦鱼的毒性建立了q s a r 模型，具体方程如下： 一l g l c 5 0 - 0 0 5 3 v | m 1 6 3 8 r 亍o 9 8 8( 1 3 0 ) 一l g l c 5 0 = o 0 3 5 5 t s a - o 7 1 4 r i o 9 8 4( 1 - 3 1 ) 如五氯酚的分子表面积t s a 为1 8 9 2 a 2 ，摩尔体积为1 3 6 m l m o l ，根据方程， 分别估算1 9 l c 5 0 的值为6 o o 和5 4 7 ，而报道的测定值为6 1 5 ，两者较接近。相 关性良好。但计算过程较为复杂，应用计算机程序( n e m e s i s ) 计算较为简便。 上述几种方法中，比较常用的q s a r 方法主要有4 种：( 1 ) 辛醇水分配系数 法( i o gp ) ；( 2 ) 线性溶剂化能相关方法( l s e r ) ；( 3 ) 分子连接性指数法；( 4 ) 分子基 1 7 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 团贡献法( f r e e w i l s o n ) 。在实际应用的过程中，各种方法并不是相互排斥的，同 模型中常常会出现两种或几种参数共同对有机化合物性质进行描述。 王晓栋【8 0 】等研究了苯酚类化合物对日本长腿蛙蝌蚪的急性毒性研究中同时 使用了疏水性参数、电性参数、离解常数对毒性数据进行q s a r 研究： - l 舀c 5 0 = o 8 3 6 l o gp o 3 6 2 e 删。一o 2 5 4 p k a + 2 5 2 7 ( 1 - 3 2 ) n = 2 1 ，i 乎= o 9 2 5 ，s e = o 2 2 1 ，f = 6 9 6 ，p = 0 o o o o 方程提供了影响苯酚类化合物对蝌蚪急性毒性的较全面的分子结构信息， 解释了绝大部分的方差( 9 2 4 7 ) ，具有最小的标准误差，并且物理意义明确。 q s a r 方法体系广泛应用于各个领域并日趋完善，近来的q s a r 研究不只 是停留在采用一些经验参数定量描述化合物的生物活性，而是向着更加注重模 型的理论性、智能化和程序化方向发展。 1 7 本文的研究内容、目的及意义 苯胺、苯酚均系毒性较强的物质，有强烈的气味，它们都是重要的有机 工业原料，广泛地被应用于印染、制药、高分子材料、合成树脂和石油等工业 方面，因而在工业废水中常含有各种类型的苯酚和苯胺。苯酚类化合物为原生 质毒物，属于高毒性物质，对一切生物个体都有毒害作用。酚的毒性直接影响 水的饮用和水产养殖，还可以强烈地抑制水体中其它生物如细菌、海藻和软体 动物等的自然生长速度，有时甚至会使它们停止生长。苯胺类化合物是一种重 要的有机化工原料，可用于生产染料，有机颜料，橡胶加助剂，农药、医药及 精细化工中间体等工业成品，可导致皮肤病变和高铁血红蛋白症【8 l 】。 国外对苯胺、苯酚类化合物对各种水生生物的单一毒性研究已有很多报道， 但关于其联合毒性研究少有报道，为了更准确地评价苯胺、苯酚类化合物对水 生生物的毒性，制定出更真实的水质标准和能够更客观地进行生态风险评价， 本文拟在苯胺、苯酚类化合物对江水细菌单一毒性的基础上进一步研究其联合 毒性效应，并建立q s a r 模型，对联合毒性进行定量预测，在此基础上探讨联 合毒性作用机制，为化学品生态风险评价提供科学依据。 1 8 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 第二章实验部分 2 1 仪器与试剂 2 1 1 实验仪器 本文进行的急性毒性和慢性毒性实验所需仪器和器皿如下： ( 1 ) 垂直流超净工作台，z h j h 1 1 1 8 b 型，上海智城分析仪器制造有限公 司； ( 2 ) 生化培养箱，l r h - 2 5 0 - i i ，广东医疗器械厂； ( 3 ) 高压灭菌锅，m l s 3 0 2 0 型，日本s a n y o ； ( 4 ) 紫外可见分光光度计，u v - 2 4 5 0 型，日本岛津； ( 5 ) 电子天平，f a 2 1 0 4 s 型，上海精密科学有限公司； ( 6 ) 酸度计，p h s 3 c 型，上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂： ( 7 ) 恒温震荡培养箱，z h w y - 2 1 1 2 b ，上海智城分析仪器制造有限公司： ( 8 ) 可携式溶氧仪，m o d e l 9 0 l o ，上海任氏电子有限公司； ( 9 ) 常用器皿：容量瓶( 5 0 m l ，1 0 0 m 1 ) ；烧杯；三角瓶( 2 5 0 1 1 1 1 ) ；量筒 ( 2 l ，5 0 m l ，l o 咖) ，试管；移液管( 1 m l ，2 埘，5 m l ，1 嘶1 ) ；培养 皿；温度计；精密p h 试纸。 2 1 2 受试化合物 受试有机化合物包括： ( 1 ) 苯酚( p h ) a r 上海实意化学试剂有限公司； ( 2 ) 2 ，4 二氯苯酚( 2 ，4 d c p ) c r 上海试剂一厂； ( 3 ) 2 氯苯酚( 2 c p ) c r 上海莱泽精细化学品厂； ( 4 ) 3 一氯苯酚( 3 一c p ) c r m o r e c 锄b e ，e n 哲a n d ； ( 5 )4 氯苯酚( 4 c p )c r 上海飞翔化工厂； ( 6 ) 0 【萘酚( 0 【m 谨) a r 上海试剂三厂； ( 7 ) p - 萘酚( p - n a _ p ) a r 上海亭新化工厂； ( 8 ) 3 硝基酚( 3 n p ) a r 国药集团化学试剂有限公司； 1 9 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 ( 9 ) 4 硝基酚( 4 - n p ) a r 国药集团化学试剂有限公司； ( 1 0 ) 2 ，4 ，6 一三氯酚( 2 ，4 ，6 - t c p ) a c r o s ，u s a ； ( 1 1 ) 间苯二酚( i 也s ) a r 上海凌峰化学试剂有限公司； ( 1 2 ) 苯胺( a n ) a r天津市巴斯夫化工有限公司； ( 1 3 ) 2 氯苯胺( 2 c a ) c r 上海群力化工厂； ( 1 4 ) 3 氯苯胺( 3 c a ) c r 中国亭新化工试剂厂； ( 1 5 ) 4 氯苯胺( 4 c a ) c r 中国亭新化工试剂厂； ( 16 ) 2 ，4 ：氯苯胺( 2 ，4 一d c a ) h o n e i l o r u 眦g e 咖雒y ； ( 1 7 ) 3 ，4 一二：氯j 眩( 3 4 d c a ) a c r o s ， u s a ； ( 18 ) 2 ，5 - 二氯j 按( 2 ，5 - d c a )a c r o s ，u s a ； ( 19 ) 2 ，4 ，6 一三氯胺( 2 ，4 ，6 一t c a )a c r o s ，u s a ； ( 2 0 ) 二苯胺( d p a ) c r中国勤耕化工厂( 上海) ； ( 2 1 ) 4 溴苯胺( 4 b a ) c r中国健友化学品厂( 上海) ： ( 2 2 ) 甲萘胺( 0 【- n p a ) c r中国泗联化工厂( 上海) ； ( 2 3 ) n 甲基苯胺( n m a ) c r中国上海化学试剂站； ( 2 4 ) 2 ，4 二硝基苯胺( 2 ，4 d n a ) 上海博蕴生物科技有限公司。 试剂： n a c la r上海实验试剂有限公司； 9 5 乙醇 n a o h h c l 蛋白胨 牛肉膏 琼脂粉 2 2 实验步骤 上海久亿化学试剂有限公司； 南京宁试化学试剂有限公司； a r 上海久亿化学试剂有限公司； b r上海奥博星生物技术有限责任公司； b r上海奥博星生物技术有限责任公司； b r国药集团化学试剂有限公司。 本研究的实验部分由单一急性毒性实验，联合毒性实验两部分组成，具体 操作步骤如下： 河海大学硕士学位论文苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 2 2 1 单一急性毒性实验 2 1 1 1 预实验 为确定各受试化合物对江水细菌急性毒性的浓度范围，首先进行预备实验。 根据毒物的化学性质及对相关化合物的毒性报道，选择高、中、低三个实验浓 度进行预实验，以期得到产生接近l o o 和o 相对抑制率的毒物浓度。然后在 产生接近1 0 0 一o 相对抑制率的毒物浓度之间增设3 个实验浓度。每个浓度 作三个平行，每组分别设一个空白对照和一个种子对照。详细说明见正式实验 的具体步骤。化合物浓度用n l o l - l 表示。 2 1 1 2 正式实验 ( a ) 取长江南京段的江水为细菌种源。采集水样时，在距岸边5 m ，水面下 o 5 m 处用洁净的水样采集器取水，放入干净的塑料桶内，留有一定的空隙保证 有足够的溶解氧。采样期间水温为1 9 3 。c ，溶解氧浓度为7 6 m g l ，p h 值 6 2 石5 。 ( b ) 细菌总数的测定：平板计数法【8 2 】 细菌总数是指l i i l l 水样在牛肉膏、蛋白胨、琼脂培养基中，于3 7o c 经2 4 小时培养后，所生长的细菌菌落的总数。 培养基：牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，琼脂1 5 2 0 9 ，n a c l5 9 ，水1 0 0 0 m l ，将 上述成分混合后，加热溶解，调整p h 值7 4 7 6 ，过滤后分装于玻璃容器中， 经1 2 1 。c 高压灭菌2 0 m i n ，密封，置于冷暗处备用。 接种：以无菌操作的方法用灭过菌的移液管吸取原水样1 “或按一定稀释 比( 1 0 一，1 0 2 ，1 0 一，1 0 4 ) 得到的稀释液1 m l ，注入灭菌平皿中。倾注1 5m l 溶 化并冷却到4 5 。c 左右的培养基，迅速转动培养皿充分混合，水平静置凝固。 另设三皿空白对照。 培养：待培养基冷却凝固后，翻转平皿，使底面朝上，置于3 7 。c 恒温箱 2 l 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 内培养2 4 小时，进行菌落计数。 细菌计数：选取平皿上菌落数在3 肛3 0 0 之间的稀释度进行菌落计数。水样 采回后即进行细菌总数的测定，细菌总数平均为2 1 5 1 0 5 个菌落i i l l 。 ( c ) 化合物储备液的配制 用电子天平采用差减法称取一定量的化合物于5 0 m l 容量瓶中，加入9 5 乙醇溶液常温下溶解并定容。 ( d ) 培养液的配制 称牛肉膏5 9 ，蛋白胨1 0 9 ，n a c l5 9 ，放入1 5 0 0 l i l l 烧杯中，再加入1 0 0 0 “ 蒸馏水中，加热搅拌溶解后，再用1 0 的n a o h 和l o 的h c l 溶液调溶液p h 为7 4 7 6 ，然后分别装入2 5 0 m l 三角瓶中，每瓶4 8 m l ，盖好棉塞，用纸包好； 1 2 1o c 高压灭菌2 0 3 0 m i i l 备用。实验中所有的玻璃仪器在1 2 l 。c 下高压灭菌 2 0 m i n 备用。 ( e ) 培养 根据预备实验结果，每个实验化合物用9 5 乙醇溶液按摩尔浓度的等对数 间距o 2 配制5 7 个浓度梯度。向上述已灭菌的4 8m l 培养液中分别加入1m l 江水和1m l 实验有机物的乙醇溶液，盖上棉塞，摇匀。以4 8 m l 培养液加入1 l i l l 9 5 的乙醇溶液和lm l 灭菌江水作为空白对照；以4 8m l 培养液加入lm l9 5 的乙醇溶液和1m l 江水作为种子对照；样品及对照各做2 组平行，把配好的培 养液置于恒温箱中于2 2 士2 。c 培养2 4 h 后测定。 ( f ) 江水细菌的半抑制浓度( i c 5 0 ) 测定 用紫外可见分光光度计在5 3 0 1 1 1 1 1 测定样品的吸光度。用空白对照校正样品 的浊度、颜色和混合物中的沉淀物；用种子对照来测定2 4 h 内没有毒物时细菌 的生长情况；含有毒物的瓶内会出现透明溶液或吸光度值低于种子对照。样品 的吸光率按下式计算： 吸光率= 害辈篙器- o o c 2 - t ， 将毒物浓度的负对数值与吸光率值作图，由图可求得化合物的i c 5 0 值。 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 2 2 2 联合毒性实验 2 2 2 1 二元联合毒性实验设计 以测得的苯酚苯胺及其衍生物的2 4 h 半数抑制浓度( 2 4 hi c 5 0 ) 为依据，将 3 。4 二氯苯胺与2 3 种苯酚苯胺衍生物等毒性混合。 以各组分毒性单位的o 5 为中点，按o 2 等对数间距分别向两边扩展3 个浓 度。设一个种子对照，一个空白对照，两组平行。向每个瓶中加入4 8 l i l l 的培养 液，l m l 江水，l m l 以9 5 无水乙醇为溶剂的混合物储备液。 以3 ，4 二氯苯胺与4 溴苯胺等毒性混合为例， 它们的1 百c 5 0 分别为4 4 l 、 3 5 8m o l l - 1 。则二元混合物等毒性混合联合毒性实验设计见表2 1 ： 表2 13 ，4 - d c a 与4 - b a 等毒性联合毒性实验设计 2 2 2 2 三元联合毒性实验设计 以2 4 种化合物的单一毒性值( i c 5 0 ) 为依据，以胺类化合物为联合对象进 行三元混合。采用三种化合物的等毒性( i c 5 0 3 ) 混合进行联合毒性实验。 以2 一氯苯胺，3 ，4 二氯苯胺，2 ，4 ，6 三氯苯胺等毒性混合为例介绍联合毒性 实验设计见表2 2 。它们1 9 i c 5 0 分别为3 6 、4 4 l 、4 7 4m o l l 1 ： 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 表2 - 22 - c a ，3 ，4 - d c a ，2 ，4 ，6 t c a 等毒性联合毒性实验设计 2 2 2 3 四元联合毒性实验设计 以4 氯苯胺，3 ，4 二氯苯胺，2 ，4 ，6 三氯苯胺，2 ，4 ，6 三氯苯酚四元联合等毒 性混合为例进行联合毒性实验设计( 见表2 3 ) 。它们的1 百c 5 0 分别为3 9 、4 4 1 、 4 7 4 、4 6 2m 0 1 l - 1 ： 表2 - 34 - b a ，3 ，4 - d c a ，2 ，4 ，每t c a ，2 ，4 ，每t c p 四元联合毒性实验设计 2 2 2 4 非等毒性混合实验设计 以3 ，4 一二氯苯胺与2 ，4 二氯苯酚按照毒性l ：3 混合为例进行联合毒性实验 设计( 见表2 4 ) ，它们1 或c 5 0 分别为4 4 l 、4 4 2m o l l 1 ： 河海大学硕士学位论文 苯酚苯胺类化合物对江水细菌的联合毒性及其q s a r 研究 表2 43 ，4 - d c a 与2 ，4 - d c a 按毒性l ：3 联合毒性实验设计 联合毒性的实验过程和数据的处理与单一毒性的处理相同。 第三章实验结果与讨论 3 1 单一急性毒性研究 3 1 1 单一急性毒性的浓度效应曲线 以受试化合物浓度( m o ；l ) 的负对数为横坐标，相应的吸光率为纵坐标 作图，得到各受试化合物的浓度效应曲线( 见图3 1 图3 1 6 ) 。 1 o o 。8 静0 6 装 整0 4 o 2 o o 2 83 。o3 23 。4 3 63 84 0 1 9 c 图3 - 1 p h 的2 4 h 浓度效应曲线 1 o 0 8 瓣0 。6 皋 整0 4 0 2 o o 4 0 4 55 o 5 5 - l g c 0 8 0 6 褥 装o 4 督 o 2 0 0 44 24 44 64 855 2 - l g c 图3 3p n a p 的2 4 h 浓度效应曲线 1 o 0 8 铸o 6 米 签o 4 0 2 o o y = o 5 6 x - 1 9 0 3 63 94 2 4 54 8 一l g c 图3 2 a - n a p 的2 4 h