（发酵工程专业论文）酶法提取酸枣仁皂苷研究.pdf

摘要 酸枣仁是鼠李科植物酸枣z i z i p h u s j u j u b am i l l v a t ：s p i n o s a ( b u n g e ) h ue xh fc h o u 的 成熟种子，神农本草经列为上品，其味酸性平、归肝、胆、心经，具有补肝、宁心、 敛汗和生津的功效，是一较为常用的镇静催眠中药。主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦， 体虚多汗，津伤口渴等症。药理学实验证明，酸枣仁中的皂苷对各种病因引起的失眠症和 神经衰弱症均有良好的效果，几乎无毒副作用，与西药相比，是安全性较好的天然镇静催 眠药。 为提高酸枣仁提取物中皂苷这一镇静催眠药用有效成分含量，本文对照研究了传统水 提、醇提、半仿生提取酸枣仁皂苷工艺，重点研究了酶法提取酸枣仁皂苷工艺，酶法提高 了酸枣仁皂苷的提取率。优化出酶法提取酸枣仁皂苷的最佳工艺条件。研究了超滤和大孔 吸附树脂纯化提取物的工艺。以酸枣仁皂苷a 作对照，对酶法制备的酸枣仁提取物进行了 薄层扫描验证，酶法制备的提取物中酸枣仁皂苷成分与标准品一致。并研究了酶法制备的 酸枣仁提取物的镇静催眠药理作用。结果： l 、确定酶法为酸枣仁皂昔的最佳提取工艺，优化出酶法提取酸枣仁皂苷的最佳工艺 条件：酶解温度为4 0 c ，酶解液初始p h 值为4 5 ，纤维素酶与果胶酶用量均为3 0 u g 生药， 酶解时间为5 h ，提取。 2 、经薄层色谱扫描验证，酶法制备的提取物中酸枣仁皂苷成分与标准品一致。 3 、采用超滤技术与大孔吸附树脂技术分离纯化酸枣仁提取物，酶法提取物酸枣仁皂 苷纯度为4 8 9 6 。 4 、对酶法提取的酸枣仁提取物进行了镇静催眠作用的药理研究，结果表明酶法酸枣 仁皂苷提取物对于小鼠睡眠有较好的调节作用，可增加阈下戊巴比妥钠小鼠的入睡率，显 著缩短小鼠睡h 民潜伏期；延长戊巴比妥钠诱导小鼠睡眠时间。 5 、建立了分光光度法测定酸枣仁皂苷含量的方法，通过高效液相色谱法研究了不同 工艺酸枣仁皂苷提取物的图谱，为建立酸枣仁皂苷提取物的质量标准打下基础。 结论：酶法比水提、醇提工艺提高了酸枣仁皂苷提取率。酶法提取酸枣仁皂苷是将酶 生物技术应用于提取酸枣仁皂苷镇静催眠药效成分的有效方法。 关键词：酸枣仁皂苷；酶法；提取；超滤；大孔吸附树脂；纯化；镇静催眠 a b s t r a c t s e m e nz i z i p h is p i n o s a ei st h e “e dr i p es e e do fz i z i p h u s j u j u b am i l l v a r s p e n o s a ( b u n g e ) h ue xh f i c h o ua n di sd e f i n e da sag o o dm e d i c i n ei nc o m p e n d i u mo f m a t e r i am e d i c a i ti ss o u l i nt a s t ea n dn e u t r a li nn a t u r ea n di sd i s t r i b u t e dt ot h el i v e r , h e a r ta n dg a l l b l a d d e rc h a n n e l s i tc a l l r e p l e n i s ht h el i v e r ，c a l mt h en e r v o u ss y s t e m ，a r r e s te x c e s s i v ep e r s p i r a t i o na n dp r o m o t et h e p r o d u c t i o no fs a l i v aa n dh a sb e e nt r a d i t i o n a l l yu s e d t ot r e a ti n s o m n i a , d r e a m i n e s s ，e x c e s s i v e p e r s p i r a t i o na n dt h i r s t y p h a r m a c o l o g i c a l s t u d i e sh a v es h o w nt h a ts a p o n i n se x t r a c t e df r o m s e m e nz i z i p h is p i n o s a eh a sf a v o r a b l ee f f i c a c yi ni n s o m n i aa n dn e u r a s t h e n i ai n d u c e db yv a r i o u s c a u s a t i o n s ，w i t hl o wt o x i c i t ya n dr a r es i d ee f f e c t s s oi t i san a m r ms e d a t i v ea n dh y p n o t i c t r a d i t i o n a lc h i n e s em e d i c i n e ，w i t hab e t t e rs e c u r i t yt h a nt h a to fw e s t e r nm e d i c i n e i no r d e rt oi n c r e a s et h ec o n t e n to f j u j u b o s i d e si nt h ee x t r a c to fs e m e nz i z i p h is p i n o s a e ，t h e e x t r a c t i o no fj u j u b o s i d e sb ye n z y m a t i cm e t h o dc o m p a r e dw i t ht r a d i t i o n a lw a t e re x t r a c t i o n ， e t h a n o le x t r a c t i o na n ds e m i - b i o n i ce x t r a c t i o nm e t h o dw e r ep e r f o r m e d t h eo p t i m a lt e c h n i q u e c o n d i t i o no fj u j u b o s i d e se x t r a c t i o nb ye n z y m a t i cm e t h o dw a si n v e s t i g a t e da n dp u r i f i c a t o r y t e c h n i q u eb yu l t r a f i l t r a t i o na n dm a c r o p o r o u sa d s o r p t i o nr e s i nw a ss t u d i e d w i t hj u j u b o s i d ea a s t h ec o m p a r i s o n ，t h ee x t r a c tw a sv a l i d a t e db yt l c t h es a p o n i n se x t r a c t e db ye n z y m a t i cm e t h o d m e tt h ec r i t e r i o no fs t a n d a r dp r o d u c t t h es e d a t i v ea n dh y p n o t i ce f f e c to ft h ee x t r a c tw a s s i m u l t a n e o u s l yo b s e r v e d 。t h er e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 t h ee x t r a c t i o no fj u j u b o s i d e sb ye n z y m a t i cm e t h o di st h eb e s te x t r a c t i o nm e t h o d t h e o p t i m a lt e c h n i q u e c o n d i t i o no f j u j u b o s i d e s e x t r a c t i o n b ye n z y m a t i c m e t h o dw a s i n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n si n c l u d e d4 0 cf o re n z y m o l y s i s ，4 5i np hv a l u eo ft h e i n i t i a le n z y m o l y s i sl i q u i d ，c e l l u l o s ee n z y m ea t3 0 u g ，c o m p o u n dp e c t i ce n z y m ea t3 0 u g ，a n d5 h f o re n z y m o l y s i s 2 w i t hj u j u b o s i d eaa st h ec o m p a r i s o n ，t h ee x t r a c tw a sv a l i d a t e db yt l c t h es a p o n i n s e x t r a c t e db ye n z y m a t i cm e t h o dm e tt h ec r i t e r i o no fs t a n d a r dp r o d u c t 3 t h ee x t r a c to f j u j u b o s i d e sw a sr e f i n e db yu l t r a f i l t r a t i o na n dt h em a c r o p o r o u sa d s o r p t i o n r e s i n ，a n dt h ep u r i t yo ft h ee x t r a c to f j u j u b o s i d e sb ye n z y m a t i cm e t h o dw a su pt o4 8 9 6 4 t h ep h a r m a c o l o g i c a ls t u d ys h o w e dt h a tj u j u b o s i d e se x t r a c t e db ye n z y m a t i cm e t h o dh a d p r e f e r a b l er e g u l a t o r ye f f e c to nt h ed o r m a n c yo fm i c e t h e yc a ni n c r e a s et h es l e e p i n gr a t eo f m i c et r e a t e dw i t hl o wd o s es o d i u mp e n t o b a r b i t a l ，r e m a r k a b l ys h o r t e nt h es l e e p i n gl a t e n c y , a n d p r o l o n gt h es l e e p i n gt i m e 5 a nu vs p e c t r o p h o t o m e t r ym e t h o dw a se s t a b l i s h e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to f j u j u b o s i d e s t h es p e c t r u m so fj u j u b o s i d ee x t r a c tw i t hd i f f e r e n tt e c h n i q u e sw e r es t u d i e db y h p l c e l s d ，w h i c hl a i daf o u n d a t i o nf o re s t a b l i s h i n gt h eq u a l i t ys t a n d a r do fj u j u b o s i d e s e x t r a c t e df r o ms e m e nz i z i p h is p i n o s a e c o n c l u s i o nt h ee x t r a c t i o nr a t eo f j u j u b o s i d e sb ye n z y m a t i cm e t h o dw a sh i g h e rt h a nt h a t o fb yw a t e re x t r a c t i o na n de t h a n o le x t r a c t i o n t h ee x t r a c t i o nw h i c ha p p l i e se n z y m eb i o l o g i c a l t e c h n o l o g yt og e tj u j u b o s i d e sf r o ms e m e nz i z i p h is p i n o s a ei sa ne f f e c t i v em e t h o d k e y w o r d s ：j u j u b o s i d e s ；e n z y m a t i cm e t h o d ；e x t r a c t i o n ；u l t r a f i l t r a t i o n ；m a c r o p o r o u s a d s o r p t i o nr e s i n ；p u r i f i c a t i o n ；s e d a t i v ea n dh y p n o t i ce f f e c t 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 论文、参加科研情况说明以及学位论文使用授权声明 一、发表论文 应用纤维素酶提取中草药有效成分的研究进展上海中医药杂志，2 0 0 7 ，4 1 ( 1 ) ：7 9 8 1 二、参加科研情况 研究生期间参与天津市科技支撑计划重点项目2 0 0 7 ( 项目编号：0 7 z c k f n c 0 0 3 0 0 ) “蓟 县山区酸枣生物技术开发研究与应用打 三、学位论文使用授权声明 本人同意授权天津商业大学将论文的全部内容或部分内容提供给有关方面，编入 中国学位论文全文数据库、中国优秀博硕士学位论文全文数据库、天津商业大学博 硕士学位论文全文数据库等有关数据库进行检索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编以供查阅或借阅。同意学校向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 璇书炱 纠9 箩，o 第一章前言 第一章前言 酸枣仁是鼠李科植物酸枣z i z i p h u s j u j u b a 施髓v a r s p i n o s a ( b u n g e ) h ue xh ec h o u 的 成熟种子，神农本草经列为上品，其味酸性平、归肝、胆、心经，具有补肝、宁心、 敛汗和生津的功效，是一较为常用的镇静催眠中药。主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦， 体虚多汗，津伤口渴等症”3 1 。药理学实验证明，酸枣仁中的皂苷对各种病因引起的失眠 症和神经衰弱症均有良好的效果，几乎无毒副作用，与西药相比，是安全性较好的天然镇 静催眠药。 1 1 酸枣仁概述 酸枣仁为鼠李科植物酸枣z i z i p h u s j u j u b a 施髓v a r s p i n o s a ( b u n g e ) h ue x 置ec h o u 的 干燥成熟种子。秋末冬初采收成熟果实，除去果肉及核壳，收集种子，晒干。分布于辽宁、 内蒙古、河北、河南、山东、山西、陕西、甘肃、安徽、江苏等地【4 1 。其中燕山山脉的酸 枣仁为道地药材。酸枣仁具有补肝、宁心、敛汗、生津等功效，多用于治疗虚烦不眠、惊 厥、多梦、体虚多汗和津伤口渴。其镇静催眠作用，疗效确切。 1 1 1 酸枣仁的药理作用 据文献报道，酸枣仁的药理作用主要为镇静、催眠，其他还有镇痛、抗惊厥、降温、 降压、降脂、抗缺氧、增强免疫功能以及对心脏的保护作用等。近年的药理研究大部分还 是以研究酸枣仁及其所含成分对中枢神经系统的影响，包括镇静、催眠、镇痛、抗惊厥等 作用，只是研究方法和手段有了较大的进步，研究深度和广度有所加强，对酸枣仁的抗过 氧化脂质及抗衰老作用也作了一些深入的研究工作【5 】。 对中枢神经系统的影响。随着社会的发展，竞争的激烈，人们的工作压力越来越大， 随之产生的焦虑、失眠等症状也不断困扰着人们的正常生活，对于养心安神药物的研究和 开发日益迫切，所以人们开始对酸枣仁作用机制和活性的研究逐渐深入。研究表明酸枣仁 的催眠作用主要是影响慢波睡眠的深睡阶段，对慢波睡眠中的浅睡阶段和快波睡眠无影 响。酸枣仁可降低多巴胺和3 ，4 一二羟基苯乙酸的含量，降低单胺类神经递质起到使中枢镇 静的作用。酸枣仁具有宁心安神的作用，治疗虚烦不甘民，惊悸多梦有比较好的疗效，对中 1 第一章前言 枢神经系统具有抑制作用。 1 1 2 酸枣仁化学成分研究 ( 1 ) 三萜皂苷 白桦脂酸( b e t u l i l l i ca c i d ) 、白桦脂醇( b e t u l i n ) 、酸枣仁皂苷a 、b 、b 1 ( j u j u b o s i d ea ，b ，b 1 ) 1 ， 其皂苷元为枣仁苷元( j u j u b o g e n i n ) ，属新的达码树脂烷系的四环三萜皂苷，乙酰酸枣仁皂 苷b ( a e e t y l j u - b a s i d eb ) 【7 1 和原酸枣仁皂苷b 1 ( p r o t o j u j u b o s i d e sb 1 ) 8 1 。 ( 2 ) 黄酮 斯皮诺素( s p i n o s i n ) ，酸枣黄素( z i v u l a g a r i n ) ，6 - 芥子酰斯皮诺素( 6 一s i n a p o y l s p i n o s i n ) ， 6 一阿魏酰斯皮诺素( 6 一f e r u l o y l s p i n o s i n ) ，6 一对香豆酰斯皮诺素( 6 - p c o u m a r o y l s p i n o s i n ) ， 当药素( s w e r t i s i n ) ，6 ，8 二一碳葡萄糖基芹菜素( v i c e n i ni i ) ，芹菜素6c ( 6 o 对羟基 苯甲酰) 一伊d 吡喃葡萄基( 1 2 ) 一# - d 葡萄糖苷( a p i g e n i n 一6 c ( 6 一o - p h y d r o x y - b e n z o y l ) 一# - d g l u c o p y r a n o s y l ( 1 2 ) 一伊d g l u c o p y r a n o s i d e ) 。 ( 3 ) 脂肪油【9 】 酸枣仁中含油量约3 2 。可皂化部分有4 1 个组分，其中鉴定了2 4 个化合物大部分是脂 肪酸类：己酸甲酯、庚酸甲酯、辛酸甲酯、壬酸甲酯、2 ，4 葵二烯醇一1 、葵酸甲酯、十一烷 酸甲酯、2 丁基一辛醇一l 、十四烷酸甲酯、十五烷酸甲酯、十六烷酸甲酯、十七烷酸甲酯、9 ， 1 2 一十八碳二烯酸甲酯、9 十八碳烯酸甲酯、十八烷酸甲酯、1 1 二十一烷烯酸甲酯、二十一 烷酸甲酯、二十烷酸甲酯、二十二烷酸甲酯、二十三烷酸甲酯、二十四烷酸甲酯、二十五烷 酸甲酯、二十六烷酸甲酯，等。 ( 4 ) 其它成分1 7 , 1 1 1 1 含挥发油、糖、蛋白质、生物碱、有机酸、氨基酸、维生素c 、阿魏酸、苦味粘液质、 植物甾醇、多种无机元素( k 、n a 、c a 、z n 、f e 、c u 、m n 、c d 、s e 、m o ) 等。 酸枣仁从五代开始即有“睡多生使，不得睡炒熟”的记载，但经研究证实酸枣仁生、熟 作用一致。现代对酸枣仁的炮制主要有生酸枣仁和炒酸枣仁两种规格，炒后味香易服，便 于煎出成分，增加治疗虚烦不眠的作用。酸枣仁皂苷是酸枣仁的主要有效成分，其中主要 含有酸枣仁皂苷a 、b ，酸枣仁皂苷属于四环三萜类皂苷。其结构式为如图1 1 所示： 第一章前言 酗 j u j u b o s i d ea ：ghr i m j l l j 曲伪i d e a l ： g i n弛 j e j u t , o s i d eb ：h r i l l j u j u b o s i d eb , ： h f l 蓐 图1 1 酸枣仁皂苷结构式 1 2 酸枣仁皂苷提取与分离纯化技术研究现状 酸枣仁皂苷属于三萜类，提取酸枣仁皂苷，传统方法是水提法，一般先用水提取，提取 液减压浓缩后，用石油醚等亲脂性溶剂萃取，除去脂肪油，然后用正丁醇萃取，减压蒸干得 到酸枣仁总皂苷粗品。仅用此方法提取，提取物中酸枣仁皂苷纯度较低，还需要进行进一步 分离纯化。也有报道称，用乙醇代替水提取酸枣仁皂苷，提取率高于水提法，提取率约为 2 2 【12 1 ，但是成本较高。 目前，酸枣仁皂苷的分离纯化有用大孔吸附树脂法，将提取液减压浓缩后，用少量水洗 除去糖等其他水溶性成分，用3 0 8 0 甲醇或乙醇梯度洗脱，洗脱液减压蒸干，在一定程 度上可以提高酸枣仁提取物皂苷含量。 制备较纯的酸枣仁皂苷单体的方法有衍生物制备法、凝胶色谱法、硅胶柱色谱和反相硅 胶柱色谱法、高效液相色谱法。 衍生物制备法，将皂苷制成极性较小的衍生物，如制成乙酸酯，增大其亲脂性，则可溶 于非极性溶剂中进行分离，得到的乙酸酯，溶于乙醚，用水沈去极性大的成分，乙醚溶液浓 缩后，溶于乙醇，加活性炭脱色，再用色谱法分离成乙酰化皂苷单体，单体经b a ( o h ) 2 水解，通c 0 2 除去过量的钡盐，得到皂苷单体。此种方法工艺为纯化学法。 凝胶色谱法，是利用凝胶分子中的网格结构对不同大小的分子具有不同的滞留作用。洗 3 第一章前言 脱时，按相对分子质量大小递减的顺序排列。目前应用较多的是s e p h a d e xl h - 2 0 ，用甲醇洗 脱。此方法成本较高。 硅胶柱色谱和反相硅胶柱色谱法，常用硅胶为支持剂，以c h c b c h 3 0 h h 2 0 为溶剂系 统进行洗脱。除使用正相硅胶柱外，也可使用反相硅烷化硅胶柱，以反相键合相r p 一1 8 、r p 8 或r p 2 为填充剂，用c h 3 0 h - h 2 0 或乙睛水为洗脱剂。反相色谱柱需用相对应的反相薄层 色谱进行检识，有预制的r p 1 8 、r p 8 反相高效薄层板。但是酸枣仁提取物中含有亲水性色 素和杂质，在薄层板上得不到分离较好的斑点，而是一条线。 高效液相色谱分离皂苷单体，灵敏度最高。固定相用o d s 硅胶柱，或用反相柱r p 8 ， 用梯度洗脱法洗脱。虽然制备型液相可制各纯度9 8 的皂苷，但成本很高。 1 3 中药有效成分提取分离新技术 近年来，一些新的提取技术应用到中药有效成分的提取工艺中，如生物酶解技术、膜分 离技术、大孔树脂分离技术等。这些技术的应用，使得中药有效成分的收率得到提高。 1 3 1 生物酶解技术 1 3 1 1 应用于中药提取的生物酶种判1 3 】 ( 1 ) 纤维素酶近年来，酶在农业、食品等领域的应用广泛，用于中药提取方面研究较多 的是纤维素酶。大部分中药材是植物，药用有效成分往往被包裹在细胞壁内。植物的细胞 壁是由纤维素构成，纤维素则是由肛d 葡萄糖以肛l ，4 葡萄糖苷键连接，用纤维素酶酶解可 以破坏伊d 。葡萄糖苷键，使细胞壁破坏，有利于有效成分的溶出。纤维素酶作用的最适p h 值4 , - - , 5 ，最适温度4 0 - - - 6 0 。 ( 2 ) 半纤维素酶半纤维素包括木聚糖、甘露聚糖、阿拉伯聚糖、阿拉伯半乳聚糖和木葡 聚糖等多种组分，约占植物干重的3 5 ，含量仅次于纤维素。半纤维素酶由伊甘露聚糖酶、 肛木聚糖酶等内切型酶，肛葡萄糖苷酶、肛甘露糖苷酶、肛木糖苷酶等外切型酶以及阿拉伯 糖苷酶、半乳糖苷酶、葡萄糖苷酸酶和乙酰木聚糖酶等组成。具有消化植物细胞壁的作用。 ( 3 ) 果胶酶果胶质属于黏液质类，是植物细胞的正常产物，多见于植物的地下部分及种 子中，存在于细胞问质中。果胶酶是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。一般果胶酶作 用的最适p h 值3 6 ，最适温度4 5 5 0 。 1 3 1 2 纤维素酶降解纤维素的作用机理 第一章前言 1 3 1 2 1 纤维素的分子结构 纤维素( c e l l u l o s e ) 是由d 一吡喃型葡萄糖基经肛1 ，4 糖苷键联结而成的直链多糖，一般为 8 0 0 0 - - 1 0 0 0 0 个葡萄糖残型m 1 6 1 。直链状大分子纤维素折迭起来，形成具有高结晶的基本构 成单位，由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位，再由很多的微小单位构成纤 维素1 17 1 。 在自然界，纤维素分子一般均包埋或嵌合在半纤维素、木质素里，三者以复合体形式 存在，木质素包围着纤维素且和半纤维素有着共价关系，共同形成较复杂的网状结构【1 8 i 。 纤维素分子量为1 5 x 1 0 6 1 8 4 x 1 0 6 ，相当于1 1 3 0 0 个葡萄糖残基，这些纤维素分子以 氢键构成平行的微晶束，约6 0 个为1 剌1 9 1 。2 0 世纪4 0 年代h e r m a n s 提出了纤维素的弯曲 模型【2 们，如图1 2 所示 图1 2h e r m a n s 式纤维素的椅式结构 1 3 1 2 2 纤维素酶的组成及分子结构 纤维素酶是将纤维素水解成纤维二糖和葡萄糖的一组复杂酶系的总称，又称纤维素酶 系 2 1 - - 2 2 】。 纤维素酶系根据其中各酶功能的差异，主要被分为3 大类：内切葡聚糖酶 ( 1 , 4 - 3 一d g l u c a ng i u c a n o h y d r o l a s e 或e n d o - l ，4 一肛d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 4 ，来自真菌简称e g ) ； 外切葡聚糖酶( 1 ，4 # - d g l u c a n c e l l o b i o h y d r o l a s e 或e x o 一1 ，4 一p d g l u c a n a s e ，e c 3 2 1 9 1 ，来自 真菌简称c b h ；来自细菌简称c e x ) 伊葡萄糖苷酶( 8 - 1 ，4 一g l u c o s i d a s e ，e c 3 2 1 2 1 ，简称 b g ) 。 降解纤维素的纤维素酶是由约5 6 k d 球状的催化( 水解) 活力的核心蛋白催化区域( c d 或 c p ) 、链结区( 1 i n k e r ) 和没有催化作用但具有纤维素吸附能力的纤维素结合区域( c b d ) 3 部分 组成。酶的蝌蚪状分子模型，如图1 3 所示例。 第一章前言 图1 3 酶的蝌蚪状分子模型 1 3 1 2 3 纤维素酶降解纤维素的机理 天然纤维素酶解过程可分3 个阶段。首先是纤维素对纤维素酶的可接触性；其次是纤 维素酶的被吸附与扩散过程；最后是由c b h c m c a s e 和口g a s e 自组织复合体( c 1 ) 协同作用降 解纤维素的结晶区，同时由c b h c m c 嬲e 和口g a s e 随机作用纤维素的无定形区。 1 9 5 0 年，r e e s e 等人1 2 4 j 阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维 素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维 素，因而提出了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的c 1 c x 假 说。这个假说认为：当纤维素酶作用时，c l 酶( 内切葡聚糖酶) 首先作用于纤维素结晶区， 使其转变成可被c x 酶( 外切葡聚糖酶) 作用的非结晶形式，c x 酶随机水解非结晶纤维素，然 后肛1 ，4 葡萄糖苷酶将纤维二糖水解成葡萄糖，如图1 - 4 所示。 非结晶纤维索 图1 4c 1 一c x 假说的酶解机理 但_ w o o d l 2 5 1 在研究木( t r i c h o d e r m a - r e e s e i ) 、青霉( p e n i c i l l i u m f u n i c u l o s u m d e ) f l o j 纤维素 酶水解纤维素时，发现培养液中2 种外切酶在液化微晶纤维素和棉纤维时具有协同作用。 t h o n a r t 2 6 1 也发现2 种外切酶( c h ii 和c b hi i ) 具有协同作用。k a n d a 等人【2 7 】还发现了只是对可 溶性纤维素进攻方式不同的2 种内切葡聚糖酶在结晶纤维素的水解过程中也具有协同作 6 第一章前言 用。目前认为纤维素酶水解纤维素的协同作用为：e g ( c ) 酶随机水解切断无定形区的纤维 素分子链，使结晶纤维素出现更多的纤维素分子端基，为c b h ( c x ) 酶水解纤维素创造了条 件。c b h 酶与e g 酶再共同作用得水解产物纤维二糖。f l j b g 酶水解成葡萄糖。因而纤维素 酶水解结晶纤维素的过程可以简单表示为：e c b h - * b g ，如图1 5 所示。这种协同作用 顺序与传统的c 1 c x 假说相类似，都说明了纤维素的降解是纤维素酶的3 种成分共同作用的 结果【2 8 】。 结品呸三兰三三三三三三三三企无定形区 l 争一1 ，4 内切葡聚瓣酶( e g s ) 兰兰三三文秸 一一扩 p 一1 ，4 外切葡聚精酶( c b h s ) 璐= 薹墨 e 专 e gc b h o 6p 一葡萄麟苷酶 c g o 一 。葡萄糖 图1 5 纤维素各组分的协同作用 现在更新的理论认为，天然纤维素首先在一种非水解性质的解链因子或解氢键酶作用 下，使纤维素链间和链内氢键打开，形成无序的非结晶纤维素，然后在3 种酶的协同作用 下水解为纤维糊精和葡萄剖2 们。 虽然目前对纤维素酶作用结晶纤维素的机理已经有了比较一致的认识，但新的现象不 断被发现如方靖等人【3 l 】在实验中发现裂褶菌纤维二糖脱氢酶( c d h ) 在降解棉花纤维素时 与纤维二糖水解酶或内切纤维素酶没有表现出协同效应，但若棉花事先在纤维二糖存在下 用c d h 预处理，则变得易于被水解，水解效率提高。但至今人们还没有完全搞清楚它的真 第一章前言 正的生物学功能。由于纤维素酶的复杂组分，其作用的机理有何不同，至今仍不清楚。高 培基1 3 0 在研究中又提出了新的观点，认为结晶纤维素难以被降解的主要原因可能是忽略了 纤维素酶的超分子结构，即聚集态结构对降解的影响，但具体的影响机理尚不清楚。纤维 素酶的c b d 在催化水解纤维素过程中的具体功能还不是特别清楚，h e l e n aa z e v e d o 3 2 j 认为 c b d 并不是纤维素酶活性部位的结合位置，若去除纤维素酶的c b d 纤维素酶仍然表现出催 化活性。因此，目前对纤维素酶的降解机理还需深入研究。 1 3 1 3 影响纤维素酶降解纤维素效率的因素 1 3 1 3 1 温度 温度是影响纤维素酶解的重要因素，用d n s 法测定纤维素酶活时，发现不同的厂家和 单位采用的酶促反应温度差别很大，如有的采用5 0 ，有的采用4 5 。c ，还有的采用4 0 c 。王 林等人【3 3 1 在利用河南省生物工程中心提供的木霉纤维素酶样品实验中，纤维素酶活随温度 变化情况是当温度大于5 8 。c 时相对酶活不再升高。多数研究表明纤维素酶作用底物的最适 温度在4 5 , - - 6 5 。c 之间【3 5 1 。 1 3 1 3 2 p h 值及酶促反应时间 大部分纤维素酶的活性受p h 值的影响较大。在最适p h 值下，酶反应具有最大速度。不 同种类的纤维素酶及同类纤维素酶的不同亚组分对应的最适p h 也不一样。一般认为纤维素 酶的最适p h 值在4 0 5 5 之间。 酶促反应时间过长或过短都不能准确反映样品的酶活力大小。较多资料表明：能较准 确地反映酶的活力大小的酶促反应时间、显色时间在用d n s 法测定酶活时以酶促反应时间 3 0 r a i n 、显色时f n j 5 m i n 较宜【3 3 q 6 1 。 1 3 1 3 3 抑制剂及激活剂 纤维素酶可由酶促反应的产物和类似底物的某些物质引起竞争性抑制，比如纤维二 糖、葡萄糖和甲基纤维素通常是纤维素酶的竞争性抑制剂；植物体内的某些酚、单宁和花 色素也是其天然的抑制剂；卤化物、重金属、去垢剂和染料等也能使其失活其中在酶解 过程中产生的纤维二糖和葡萄糖是抑制剂、使得酶解效率不高的主要因素，为了消除这种 反馈抑制，国内外展开了大量研究，提出了在培养物中添加诱导物激活剂，如槐糖、乳糖、 龙胆二糖、醋酸酯及一些表面活性剂等。另外，加金属离子也是一种研究较多且普遍使用 的提高酶活力起激活剂作用的新方法。 在c h u n z h iz h a n g 等的研究中，l 鞫述y c u 2 + 等对纤维素酶起抑制作用，c a 2 + 、m 9 2 + 、 第一章前言 z n 2 + 对纤维素酶的活性影响不大；c r i s p e n t 3 8 1 的研究也表明：c 0 2 + 对酶有激活作用赵玉蓉 掣3 9 1 在金属离子对纤维素酶及木聚糖酶活性影响的研究中也表明n a + 、k + 、m g + 、m n 2 + 、 z n 2 + 、f e 2 + 、c a 2 + 等离子对纤维素酶活性起激活作用，而c u 2 + 起抑制作用在张丽萍等 4 0 】 的研究中也认为c u 2 + 、m n 2 + 、c 0 2 + 等离子在一定浓度范围内对绿色木霉所产纤维素酶活 力有激活作用，m 9 2 + 、z n 2 + 、f e 2 + 则有抑制作用；单谷等1 4 1 】也阐述了金属离子在纤维素 酶生产过程中，金属元素( f e 、m n 、z n 、c o 等) 与纤维素酶的活力密切相关，可作为酶的活 性基成分，也可作为酶的激活剂徐伟民等【4 2 j 的最新研究中表明：稀土离子l a 3 + 、n d 3 + 在 浓度为1 0 或1 0 - 9 9 l 1 时对纤维素酶水解滤纸、羧甲基纤维素钠、纤维二糖的活性均有最大 的激活作用。 提高纤维素酶降解纤维素效率的研究主要包括：( 1 ) 通过筛选产酶菌种和培养条件，寻 找高活性纤维素酶；( 2 ) 采用各种方法处理纤维素，使其更易于分解，如：物理法( 爆破法、 机械法) 、化学法( 酸或碱处理法) 、生物法掣4 3 】；( 3 ) 筛选酶解工艺条件：温度、p h 值，酶 促反应时间，激活剂等 1 3 1 4 果胶酶降解果胶的机理 果胶分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以a - 1 ，4 糖苷键聚合而成的多糖链。它存在于 所有的高等植物中。沉积于初生细胞壁和细胞间层，在初生壁中与不同含量的纤维素、半 纤维素、木质素的微纤丝以及某些伸展蛋白相互交联。使各种细胞组织结构坚硬，表现出 固有的形态。果胶分子的结构因植物的种类、组织部位、生长条件等的不同而不同。其大 致的结构简图如图1 - 6 所示。总体可分为光滑i x ( s m o o t hr e g i o n ) 和须状区( h a i r yr e g i o n ) n 部 分。主要由h g a 、r g i 和r g i i 三个结构区域构成，其中r g - i i 常以二聚体的形式存在。 同其它植物多糖一样，果胶也是多分子的、多分散的、多结构的、有高级空间构象的也具 有一定的相对分子质量分布 槔4 5 1 。 第一章前言 固姥拣一 l 墨| 1 - 6 果胶的结构简图 果胶酶( p e c t o l y t i ce n z y m eo tp e c t i n a s e ) 是指能够分解果胶物质的多种酶的总称。也是一 个多酶复合物，它通常包括原果胶酶、果胶甲酯水解酶、果胶酸酶3 种酶。这3 种酶的联 合作用使果胶质得以完全分解。天然的果胶质在原果胶酶的作用下，被转化为水可溶性的 果胶，果胶被果胶甲酯水解酶催化去掉甲酯基团，生成果胶酸酶，果胶酸酶切断果胶酸中 的2 - 1 ，4 糖苷键，牛成半乳糖醛酸，半乳糖醛酸进入糖代谢途径被分解放出能量。 1 315 影响果胶酶酶降解果胶质效率的因素 与纤维素酶降解纤维素相同，影响果胶酶酶降解果胶质效率的因素也包括酶解温度、 酶解液的p h 值，酶解时间、抑制剂及激活剂等。 1 3 16 酶法在中药提取中的应用 中药中植物药约i 9 0 ，植物细胞由细胞壁及原生质体组成，细胞壁是由纤维素、半纤 维素、粜胶质、木质素等物质构成的致密结构，一般分为3 层，即胞m 层、初生壁和次生壁。 胞间层的主要成分为果胶质。初生壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成，初生壁的结构 甚为复杂，由纤维素分子组成的微纤丝构成了其基本骨架。在微纤丝之问的空隙中，填着果 胶质和半纤维素的胶体状物质。和初f l ：壁一样，次生壁的骨架也足山纤维素分子组成的微纤 丝构成的。 在中草药提取过程中，存在于细胞原生质中的有效成分向提取介质扩散时，必须克服细 胞壁及细胞问质的双重阻力。选用适当的酶作用于植物材料，如水解纤维素的纤维酶、水解 第一章前言 果胶质的果胶酶等等，可以使细胞壁及细胞质中的纤维素、半纤维素、果胶质等物质降解， 破坏细胞壁的致密结构，引起细胞壁及细胞质结构产生局部疏松、膨胀、崩溃等变化，减少 细胞壁细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，从而有利于有效 成分的溶出1 4 7 5 1 1 。 酶法提取反应条件温和，能保持天然产物的构像，不破坏其立体结构和生物活性，有利 于保持有效成分的原有药效，还可以大大提高中草药有效成分的提取率，此法广泛应用于多 种中草药有效成分的分离提取中，但国内尚未有人应用微生物酶解技术提取分离酸枣仁有效 成分。 提取皂苷类成分的应用研究。高晓明【5 2 1 研究了苦瓜皂甙的酶法提取和大孔树脂纯化工 艺。与高温水提法相比，苦瓜皂甙的复合酶解提取具有提取速度快、条件温和的优点。利 用微孔技术精制提取液，除去一些大分子化合物和多糖。微滤后的精制液上大孔树脂柱进 行纯化，乙醇洗脱，冷冻干燥洗脱液所得的产品苦瓜皂甙含量可达7 9 。姜彬慧提取胡芦 巴【5 3 j 有效成分进行了加纤维素酶与不加纤维素酶的对比试验，加酶组胡芦巴有效成分的收 率约是对照组的3 6 倍。对三七叶皂苷【5 4 】酶水解产物进行提取分离和结构鉴定，得n 2 种酶 水解产物，利用大孔树脂提取及柱层析分离技术实现了三七叶皂苷酶水解产物的分离与制 备。张黎吲5 5 】应用正交实验设计优化胡芦巴种子中甾体皂苷的酶法提取工艺，加酶后简体 皂苷元提取率的平均值为8 3 6 ，而未加酶的结果仅为5 8 4 ，实验结果表明纤维素酶处理 能显著提高甾体皂苷的提取率。在提取黄芪有效成分的研究中，郑立颖1 5 6 1 分别用0 3 、o 4 和0 5 纤维素酶预处理后再用常规水提法。结果表明，不同浓度的纤维素酶预处理能明显 提高黄芪甲苷的收率，收率平均高于水提法5 0 以上，而在纤维素酶用量为0 3 时黄芪甲 苷的收率最高。吕立华【5 7 l 以甾体菝葜皂苷元的提取率为指标，应用l 9 ( 3 4 ) 正交试验设计优 化了知母中甾体皂苷的纤维素酶法提取工艺。纤维素酶处理能显著提高甾体皂苷的提取 率，加酶后 体菝葜皂苷元提取率的平均值为8 4 6 ，而未加酶的结果则为5 8 1 。 提取黄酮类成分的应用研究。施英英【5 8 】将葛根渣的酶法预处理与乙醇抽提工艺相结合。 采用纤维素酶和木聚糖酶均明显提高了异黄酮的提取率，分别达1 1 4 和1 2 8 。为常规醇提 法的1 3 6 倍和1 5 2 倍。奚奇辉【5 9 】等采用纤维素酶提取竹叶总黄酮，经过纤维素酶处理后再 进行水回流提取，总黄酮含量比直接水提提高2 3 5 。高保英【6 0 】等进行了复合酶法和微波 法提取甘草黄酮的比较实验研究，复合酶由纤维素酶和果胶酶组成，酶法提取率可达1 6 5 ， 与微波法相比提取成本低，耗能少。田秀兰【6 1 1 等用杭白菊提取总黄酮，进行了加纤维素酶与 不加酶的对比实验，在纤维素酶的作用下，杭白菊总黄酮的收率提高了1 2 。薄层层析结果 第章前言 显示加酶与不加酶提取的成份一致，说明酶解没有破坏杭白菊的成分。陈晓慧【6 2 l 采用纤维素 酶酶解预处理与醇溶液浸提相结合的提取工艺从树莓叶中萃取黄酮类化合物，分光光度法测 总黄酮含量，探讨了影响提取率的主要因素，最后用正交法确定了最佳提取工艺，为酶浓度 0 3 5 m g m l ，酶解时间1 5 0 m i n ，酶解温度5 0 。c ，介质p h 为4 0 ，总黄酮得率达2 9 4 。唐 仕荣【6 3 】以银杏叶为原料，研究了复合提取酶对银杏叶的酶解工艺，探讨了不同p h 值、酶用 量、酶解时间以及酶解温度等对银杏黄酮提取率的影响，结果表明复合提取酶有利于银杏黄 酮的提取，在p h 值4 8 的缓冲液中添加o 4 的复合酶于5 0 。c 下酶解1 2 h 的最佳工艺条件下， 银杏黄酮的得率达到1 5 0 ，银杏叶中黄酮成分的提取率达到9 5 5 ，比直接醇提法提高了 2 8 2 。 提取其他类成分的应用研究。酶法也逐渐应用于中草药其它有效成分提取。沈爱英m 】 采用有纤维素酶、果胶酶和蛋白酶按一定比例组成的复合酶，