（环境科学专业论文）脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究.pdf

a b s w a e t a b s t r a c t c y a n o b a c t e r i ao fe u t r o p h i cw a t e rr e l e a s en i t r o g e np o l l u t i o nd u r i n gd y i n ga n d d e g r a d a t i o n , w h i c hc a u s eh i 班n i t r o g e nc o n t e n t s g e t t i n gt h ec y a n o b a c t e r i ao u to f w a t e rb ys a l v a g e ，r e d u c et h en i t r o g e nl e v e lo fw a t e r w h i l e ，d o m e s t i cr e s e a r c ho n s a l v a g et r e m e n to fc y a n o b a c t e r i ar e s o u r c e ，h a v ed o n eal o to fr e s e a r c ho nm e t h a n e p r o d u c t i o nb ya n a e r o b i cf e r m e n t a t i o n i nt h ep r o c e s so fb i o g a sp r o d u c t i o n , r e d u c i n g t h en i t r o g e ng a si nt h ep r o p o r t i o na m d i n c r e a s i n gt h em e t h a n ei nt h ep r o p o r t i o nh a d b e e nr e s e a r c hf o c u s r e s e a r c ho ne f f i c i e n tr e m o v a lo fm i c r o o r g a n i s m s ，c a l lb ea p p l i e d n o to n l yt oc o n t r o le n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , b u ta l s ot or e d u c et h ep r o p o r t i o no f n i t r o g e ni nt h em e t h a n ef e r m e n t a t i o n 1 1 1 ep u r p o s eo ft h i ss t u d yw a st os c r e e n 、i t h a m m o n i f i c a t i o n , n i t r i f i c a t i o n a n dd e n i t r i f i c a t i o n m i c r o o r g a n i s m s ，s t u y i n g t h e c h a r a c t e r i s t i c so ft h em i c r o o r g a n i s m s ，a l g a er e m o v a la n da p p l i e dr e s e a r c h , t op r o v i d e as c i e n t i f i cb a s i st oa c h i e v ee n e r g y u s i n ga n dr e f e r e n c e i nt h i s p a p e r , w es c r e e na n d i s o l a t ea m m o n i f i c a t i o nb a c t e r i a , n i t r i f i c a t i o n b a c t e r i aa n dd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i af r o mt h el a k es e d i m e n to fc h a o h ul a k e t a k e nb y t h ep r i m a r ys c r e e n i n ga n dr e - s c r e e n i n g w ec h o o s ee f f i c i e n ts t r a i n so f a m m o n i f i c a t i o n b a c t e r i a , n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i aa n dd e n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i a , w h i c hw e r es t r a i na 5 ，s t r a i n x 5 ，s t r a i nf 3a n df 6 s t r a i na 5a n dx 5w e r ei d e n t i f i e dg r a m - n e g a t i v ea n d g r a m - p o s i t i v e b y b i o c h e m i c a li d e n t i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f16 sr d n a e x p e r i m e n t , t h es t r a i nx 5w a si d e n t i f i e da sb a c i l l u ss p ，a n dh a sa10 0 s i m i l a r i t yt o t h e1 6 sr d n a s e q u e n c eo f b a c i l l u ss u b t l i s b yd e t e r m i n i n gb i o m a s sa n dd y n a m i c ss t u d y , a n dt h es t u d yo fi n i t i a lp hv a l u e ， t e m p e r a t u r e ，i n o c u l u ms i z ea n do t h e rs i n g l ef a c t o ra n a l y s i s ，t h er e s u l t so fs t r a i na 5 a n dx 5e x p e r i m e n t a la r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) a f t e r2 4 hi nc u l t u r es t r a i na 5m a x i m u mb i o m a s s ，a n da f t e r3 6 h ，t h ea m m o n i a g e n e r a t i o nr a t ew a sa c h i e v eo p t i m u m a 5o p t i m a la m m o n i an i t r o g e np r o d u c t i o n c a p a c i t yo fs t r a i na 5w a so b s e r v e du n d e rc o n d i t i o n so f3 5 c ，3 6h ，p h 7 0 8 0a n d4 i n o c u l u m a b s t r a c t ( 2 ) a f t e r3 6 hi nc u l t u r es t r a i na 5m a x i m u mb i o m a s s ，t h ea m m o n i ag e n e r a t i o nr a t ew a s a c h i e v eo p t i m u m o p t i m a la m m o n i an i t r o g e np r o d u c t i o nc a p a c i t yo fs t r a i nx 5w a s t h eb e s tc a r b o ns o u r c ef o rt h ed f r u c t o s e ，t h eb e s tn i t r o g e ns o u r c ew a sa m m o n i u m o x a l a t e a n dc a p a c i t yo fs t r a i nx 5w a so b s e r v e du n d e rc o n d i t i o n so f2 5 3 5 ，16 h ，p h 7 0 8 0a n d6 i n o c u l u m i nt h i st e s t ，a d d e dt h es c r e e n i n gs t r a i n so f a 5 ，x 5 ，f 3a n df 6i n t oc y a n o b a c t e r i a f e r m e n t a t i o nd e v i c e ，i no r d e rt oc a l t yo u tt h ea l g a er e m o v a lt r e a t m e n t t h er e s u l t s s h o w e dt h a tn i t r o g e nr e m o v a lt h r o u g hm i c r o b i a lt r e a t m e n t ，t h en i t r o g e nc o n t e n to f c y a n o b a c t e r i ai n d e e dd e c l i n e ；g a sc h r o m a t o g r a p h i cn 2c o n t e n ti n c r e a s e d ，u pt o 9 2 2 3 k e yw o r d s ：a m m o n i f i c a t i o nb a c t e r i a ； n i t r i f i c a t i o nb a c t e r i a ；d e n i t r i f i c a t i o n b a c t e r i a ；c y a n o b a c t e r i a ；n i t r o g e nr e m o v e l i i i 第一章前言 1 1 研究背景 1 1 1 巢湖湖泊富营养化形势 第一章前言 随着工业化进程的加快，各类含氮废水不经处理排放入水体中，目前地表水 的富营养化污染以及地下水硝酸盐污染状况十分严重，威胁着饮用水的安全，甚 至危害人类健康。水体富营养化是由于过量的含氮化合物进入水体，打破了水体 的正常的氮素循环，引起一系列环境污染的现象【l 】。富营养化污染发生后，在湖 泊表面形成一层厚厚的湖靛，藻类腐烂后藻体内部的有机氮等物质释放进入水体 中，使水中的氮素含量居高不下【2 】。如何去除这部分氮素也成为治理富营养化污 染的一部分 3 1 。湖泊底泥是湖泊生态系统的重要组成部分，是入湖污染物特别是 营养物的主要蓄积地 4 1 。蓝藻爆发后，藻体经物理、化学及生物作用死亡降解释 放出“三氮 毒物，增加了氮素负荷，是造成湖泊水体富营养化和藻类疯长的营 养盐重要来源之一。 蓝藻藻体腐烂降解过程中，由于水体中的脱氮微生物作用，有机氮从细胞内 释放出来，接着转化为氨氮、硝氮、亚硝氮并进一步转化为含氮气体释放入大气 中。而且蓝藻在降解腐败过程中，释放出一种含氮臭味物质，严重影响了滨湖城 区的生活和居民的健康安全。针对蓝藻自然降解更易引起二次污染，释放内源性 氮磷物质，并引起恶臭的问题，目前已发明大规模打捞技术，并已由人工打捞转 向机械打捞，并结合了藻水分离技术与资源化利用，使打捞所得蓝藻化害为利、 变废为宝。蓝藻打捞不仅能去除水体中的藻体，避免二次污染，同时降低水体中 的氮磷营养元素，使水体达到一个低营养环境，有效控制了水体二次污染。 1 1 2 资源化利用技术 目前，对打捞上来的蓝藻进行资源化利用是蓝藻治理方向上一个重要措施。 蓝藻中含有丰富的营养物质及其他化学成分【5 1 。邵雪玲等 6 1 利用t l c 、g l c 、h p l c 等分析，蓝藻中含有大量的蛋白质、氨基酸、胡萝卜素、软油脂酸等，并研究【刀 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 了产生于细胞外的多糖构成单糖为半乳糖、葡萄糖、鼠李糖、脱氧核糖、木糖、 甘露糖，并含有硫酸基、葡萄糖醛酸、丙酮酸等。并且对蓝藻t r i c h o d e s m i u m t h i e b a u t i i 细胞外多糖进行了抗腹水癌s a r c o m a - 1 8 0 活性( 体内) 和直接阻碍 癌细胞活性( 体外) 的研究，显示出具有一定的抗癌活性和直接阻碍癌细胞活性 【8 】。其他藻类如黑藻不仅能进行水体生物修复，其自身还具有多种有效成份，对 关节炎、肿瘤疾病都有很好的应用价值【9 】。 利用蓝藻自身有机质含量高的特点，结合现代工艺，蓝藻的利用价值也被迅 速发掘。目前国内外发展的蓝藻应用技术主要有以下几个方面： ( 1 ) 蓝藻堆肥技术 堆肥化( c o m p o s t i n g ) 是利用微生物的生理生化作用，在高温下发酵处理堆肥 原料，使其中的有机物腐殖化、矿质化、稳定化和无害化，最终形成腐熟肥料的 过程。 蓝藻中含有大量的蛋白质，可用于发酵合成高效有机肥。在堆肥过程中加入 高效复合微生物菌群对原料进行处理，依靠微生物间的相互协同作用，迅速分解 有机物，并代谢出抗氧化物质，抑制有害微生物的生长繁殖增加堆肥中的含氮量， 可大大提高肥料的腐熟度。高效复合微生物菌群( h i g he f f e c t i v ec o m p l e x m i c r o b i a lc o m m u n i t y ) 是由酵母菌、放线菌、乳酸菌、固氮菌、纤维素分解菌 等多种微生物经特殊方法培养而成的菌群。 ( 2 ) 蓝藻厌氧发酵产气技术 厌氧发酵技术是应用微生物的方法对密闭容器中的有机质进行发酵处理，产 生可利用的沼气的过程。沼气发酵主要理论为三阶段理论，即水解、酸化和甲烷 化阶段。水解阶段大分子有机物经过兼性厌氧菌和发酵性细菌的作用，将发酵原 料中的较大分子成分( 如纤维素等) 水解成可溶于水的有机酸和醇类等；酸化阶段 产氢产乙酸菌将第一阶段生成的有机酸和醇继续分解成简单的有机酸，同时生成 氢气和二氧化碳；甲烷化阶段；产甲烷菌将第二阶段生成的小分子物质转化为甲 烷和二氧化碳气体，即发酵的最终产物沼气。 传统沼气发酵技术主要以秸秆【加】等农业废弃物、禽畜粪便和污水处理厂厌氧 活性污泥以及生活垃圾等为原料，进行发酵产气。 翟志军等【l l 】利用巢湖蓝藻为原料，进行厌氧发酵产沼气研究，接种物与蓝藻 2 第一章前言 体积比为1 ：2 时，产气最佳。在平均温度为2 7 5 c 的发酵环境中发酵5 0d ，蓝藻 t s 产气潜力为3 6 8 2 5m l g ，v s 产气潜力为3 8 3 3 3m l g ，沼气中甲烷的平均含量 为6 3 4 6 ，蓝藻t s 利用率为5 4 0 1 ，v s 利用率为5 8 3 5 。还有不少研究采用蓝 藻与其他原料混合产气的研究，主要考虑原料与蓝藻的混合比例，适当的c n 有 利于提高蓝藻发酵产沼气率。王寿权【1 2 】等利用蓝藻与猪粪分批混合进行发酵研 究，猪粪与蓝藻总固体( t s ) 质量比例在3 ：7 时产气效果最好，在整个反应中， 产沼气潜力分别为1 7 5m l g 、5 4 6m l g 、5 6 0m l g 。 厌氧发酵产沼气率受温度、p h 值、c n 等影响。3 5 条件下利用猪粪为接种 物，当接种质量比为2 0 时，蓝藻发酵产甲烷效果达到最佳【1 3 1 。 ( 3 ) 蓝藻高蛋白产品 国内外关于螺旋藻的研究利用已比较多，螺旋藻中营养物质丰富，可提取各 种高级植物蛋白、藻多糖、藻蓝蛋白、食用色素等。研究表明，蓝藻中也含有大 量藻蓝蛋白，经过脱除藻毒素后可作为高蛋白生产原料，但目前这一技术仍未广 泛应用。 ( 4 ) 蓝藻生物柴油技术 生物柴油技术的出现是伴随着全球能源需要与供给不足而出现的。 石油是一种普遍的非可再生能源，且在不断利用过程中日益匮乏，而且大量 燃烧矿石燃料造成环境污染。为解决能源危机和控制环境污染，世界各国不断研 制生物柴油技术，尤其巴西在生物柴油技术上取得较大成果，生物柴油是一种清 洁的石油替代能源，以油料作物或工程微藻等油料水生植物以及动物油脂、废餐 饮油等为原料制成的液体燃料。生物柴油因其环保、可再生、性能好等优点越来 越受重视。韩庆国等1 4 对水华蓝藻中的丫亚麻酸进行提取并测定含量，蓝藻中含 有一定的不饱和脂肪酸，因此具有生产生物柴油的潜力。但生物柴油生产要求大 量油科物质，成本高，发展一种易得且成本低通过微藻的工业成分分析和元素分 析【1 4 1 ，微藻热解具有含碳量较高，热值跟一般的煤炭相当，燃料潜值高，挥发份 比例较高，含氧量较多，易燃烧等基本性质。这使得微藻成为较有潜力的生物质 能源。 3 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 1 2 废水生物脱氮技术 目前脱氮工艺按原理主要有物理法、化学法和生物法。生物脱氮因其效果好， 成本低，无二次污染等优点，日益受到重视。生物脱氮微生物在环境中广泛存在， 且容易筛选分离【1 5 1 7 1 。经大量实验证实筛选得到的脱氮微生物具有良好的脱氮效 果【1 8 】。脱氮微生物可降低水体中的氮素营养水平，防止富营养化污染的发生，无 论是排入湖泊的废水的生物脱氮，还是蓝藻藻体的脱氮都是刻不容缓的【1 1 】。所以， 发展一种微生物脱氮技术，对缓解湖泊富营养化污染有着积极长远的效益。 生物脱氮技术依靠各种脱氮微生物相互作用对含氮污水进行净化处理，自然 界中存在大量的土著微生物可对污染水体进行净化1 1 9 1 。近年来，很多研究者利用 固定化技术幽- 2 2 、微生态制剂 2 3 2 4 构建脱氮功能菌群，并应用于氮污染水体中， 取得一定成效。而在实验室研究中，根据脱氮微生物的生理特性，发展了废水生 物脱氮技术。目前生物脱氮技术主要有以下几种： 1 2 1 传统生物脱氮技术 传统生物脱氮技术是按照一定的序列顺序，使硝化过程与反硝化过程分别在 两个阶段完成，最终完成脱氮。硝化菌为好氧自养菌，利用氧气为电子受体，将 氨氮转化为硝酸盐氮或亚硝酸盐氮，随后进入下一步厌氧或缺氧反应阶段，即反 硝化过程。反硝化茵将上一阶段生成的硝酸盐氮或亚硝酸盐氮还原为含氮气态物 质释放入大气。由此原理发展起来的脱氮工艺主要有a o 、a 2 o 、u c t 等，这 种工艺的特点是采用分级处理的方式，将硝化过程与反硝化过程分割在不同时间 或空间进行。 1 2 2 新型生物脱氮技术 由于近年来大量研究发现了异养硝化菌与好氧反硝化菌的存在，新的生物脱 氮技术应运而生。新型生物脱氮技术克服了传统生物脱氮原理中硝化自养与反硝 化异养的缺陷，使硝化反硝化对能源与氧气的需求范围变宽，为研发新的脱氮工 艺奠定基础。目前新型生物脱氮工艺主要有：短程硝化反硝化脱氮、厌氧氨氧化、 好氧反硝化技术等。 4 第一章前言 ( 1 ) 短程硝化反硝化脱氮 硝化反应终止于亚硝酸盐阶段，阻止n 0 2 进一步氧化为n 0 3 ，随后进入下 一步反硝化阶段的反应过程称为短程硝化反硝化阶段。 该工艺的关键技术在于控制反应液中n 0 2 。的含量，使其达到累积状态。影 响因素主要为【2 5 硎，p h 值、d o 、游离氨、泥龄等。根据短程硝化反硝化脱氮原 理而设计的工艺有s h a r o n 、o l a n d 、a o 等工艺。 短程硝化反硝化与传统脱氮工艺相比具有降低能耗、节约碳源、污泥产量少、 占地面积少等特点，且对于含氮较高和碳源不足的废水具有很大的应用价值。张 列宇掣2 8 1 研究了3 座人工湿地脱氮机理，为短程硝化反硝化。 ( 2 ) 厌氧氨氧化技术 厌氧氨氧化技术是指在厌氧或缺氧条件下，微生物直接以n 0 3 或n 0 2 为电 子受体，n h 4 + 为电子供体，而将n i - h + 、n 0 3 或n 0 2 转化为气态含氮物质的过程。 这一工艺较传统生物脱氮技术大大缩短了氮循环过程，在能耗、时间方面都有较 大优势。厌氧氨氧化菌子广泛存在于自然界中。且研究者发现自然界中存在可以 将蛋白质水解的厌氧菌，该工艺可以在厌氧条件下直接将有机氮转化为气态含氮 物质，大大提高了工艺效率。 目前厌氧氨氧化工艺主要有a n a m m o x 、s h a r o n a n a l 、n 噍o x 、c a n o n 等工艺。 ( 3 ) 好氧反硝化脱氮 好氧反硝化脱氮是同时硝化反硝化脱氮工艺( s n d ) 的一种，利用好氧反硝 化细菌的生理特性，在有氧条件下，将硝化过程中产生的n 0 3 和n 0 2 转化为气 态含氮物质的过程。该过程可以和好氧硝化过程在同一装置中进行，减少运行费 用和占地面积。 1 3 氮循环菌的概述 生物脱氮过程是一个连续复杂的过程，通过氮循环菌的相互作用，将有机氮 转化为氨氮、硝态氮、亚硝化态氮，最终转变为n ：的形式释放入大气。 生物脱氮按脱氮功能与过程可分为氨化作用、硝化作用与反硝化作用，促进 ， 反应的微生物分别为氨化菌、硝化细菌、反硝化细菌，其各自有着不同的脱氮过 5 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 程与机理。 1 3 1 氨化细菌 生物体中主要的含氮物质为蛋白质，自然界中存在很多微生物可以将蛋白质 分解产生氨，这个有机氮转变为无机氮的过程称为氨化作用。很多细菌、真菌和 放线菌都能分解蛋白质及其含氮衍生物，这些微生物统称为氨化微生物。自然界 中广泛存在的氨化微生物1 2 9 ，它们具有蛋白酶和肽酶，能将蛋白质水解为氨基酸 和氨。大多数氨化微生物为好氧菌，在有氧条件下，氨化菌水解氨基酸产氨；而 有的氨化菌在厌氧条件下，可以将氨基酸还原产氨【3 0 1 。 目前分离的氨化微生物种类繁多，主要有主要有芽孢杆菌属( b a c i l l u ss p ) 【3 l 】、假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 1 3 2 】、缺陷短波单胞菌( b r e v u n d i m o n a s d i mi n u t a ) ， 粪产碱杆菌( a l c a l i g e n e s f a e c a l i s ) ，产气肠杆菌( e n t e r o b a c t e ra e r o g e n e s ) t 1 6 】等细菌； 链格胞属、曲霉属、毛霉属、青霉属、根霉属等真菌和嗜热放线菌等。因细菌具 有生长快、易培养等优点，成为研究最广泛的氨化菌。 氨化细菌的氨化速率受到温度、p h 值及溶解氧的影响。氨化菌所能适应的 p h 值范围较宽，一般在6 5 8 0 范围内，中性或微碱性条件下【3 3 1 ，氨化菌可以 达到较好的氨化效果。氨化菌适应的温度范围为2 5 4 0 ，温度较低氨化作用缓 慢，太高则影响蛋白酶的活性。溶解氧含量的高低也直接影响着好氧氨化作用的 进行。 1 3 2 硝化细菌 硝化细菌能将氨氮转化为硝态氮或亚硝态氮，在氮循环过程中发挥着关键作 用，硝化作用是整个脱氮过程的限制因素。硝化作用过程具体分为两步完成，在 这一过程中起作用的硝化细菌也分为两种，亚硝酸细菌和硝酸细菌。首先，亚硝 酸细菌将n h 4 + 转化为n 0 2 ，这一过程为硝化作用的限速步骤；随后，硝酸细菌 将生成的n 0 2 转化为n 0 3 。，完成硝化过程。具体反应式如下： n h 4 十+ 1 50 2 n 0 2 + 2 矿+ h 2 0 n 0 2 + o 50 2 - n 0 3 。 硝化细菌按营养来源分为两类：自养硝化细菌和异养硝化细菌。通常认为的 6 第一章前言 硝化细菌即自养硝化菌，是生物脱氮过程中的主要硝化菌。 自养硝化细菌利用c 0 2 等无机物质为碳源，氧化n h 4 + ，但不能直接利用有 机碳源。自养硝化细菌虽然在废水脱氮过程中表现出很高的硝化效率，但因其自 身特点 3 4 。3 7 】，在实验室及其他工程中难以分离获得，给自养硝化菌的进一步研究 带来困难。自养硝化细菌的自身特点主要有：生长速率慢，世代周期长；对环境 敏感，适应性弱；菌落小，难以挑取。 虽然异养硝化菌的硝化效果不理想，但与自养硝化细菌相比，在环境中分布 广泛、且生长速度快、对环境适应性强、易获得等优点，使得越来越多的研究转 向研究发现效果较好的异养硝化菌【3 8 捌。 自然界中存在的自养硝化细菌有硝化杆菌属( n i t r o b a c t e rs p ) 4 0 l 、亚硝化 螺菌( n i t r o s o s p i r as p ) 、亚硝化叶菌属( n i t r o s o l o b u ss p ) 【4 1 1 、硝化球菌( n i t r o c o c c u s s p ) 等。关于异养硝化细菌的研究，目前所知的异养硝化菌主要有：芽孢杆菌 ( b a c i l l u ss p ) 【4 2 删、产碱杆菌属( 彳加，j ：；尹，z 嚣s p ) t 4 5 撕】、不动细菌属( 彳c 砌e 幻6 卯册 s p ) 、微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 4 7 1 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) t 4 8 - 5 0 】等。同时 有些异养硝化菌还具有好氧反硝化的作用【5 1 5 3 1 。 影响硝化作用速率的因素主要有c n 、温度、p h 值、溶解氧等因素【5 4 , 1 5 】。 研究表明硝化细菌最适宜生长温度为3 0 c 左右，最适p h 值为7 0 8 5 ；随着c n 的升高，异养硝化菌的硝化活性也大大增强。 1 3 3 反硝化细菌 反硝化细菌是一种异养型厌氧或兼性厌氧菌，能利用硝酸盐氮( n 0 3 - n ) 或 者亚硝酸盐氮( n 0 2 n ) ，将之转化为氮气的形式排放入大气中。传统脱氮理论 认为，在脱氮过程中，必须经过好氧硝化与厌氧或缺氧反硝化两个过程，最终达 到脱氮目的。但随着研究的深入，研究者发现 5 5 - 6 1 】，自然界中存在很多能进行完 全好氧反硝化的微生物菌群，它们利用氧气为电子供体，直接将硝酸盐氮转化为 n 2 ，这大大降低了脱氮的成本。 目前从自然界中分离筛选的好氧反硝化细菌主要有嗜麦芽寡养单胞菌 ( s t e n o t r o p h o m o n a sm a l t o p h i l i a ) 【6 2 1 、芽孢杆菌属( b 缸订，螂s p ) 5 6 , 6 3 - 6 5 】、多萨假单 胞菌( p s e u d o m o n a sm e n d o c i n a ) 6 6 1 、假单胞菌属( p s e u d o m o n a ss p ) 1 6 7 】、粪产碱 7 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 杆菌( a l c a l i g e n e sf a e c a l i s ) t 5 9 1 、农杆菌( a g r o b a c t e r i u ms p ) 【5 7 1 、脱氮副球菌 ( p a r a c o c c u sd e n i t r i f i c a n s ) t 6 8 】等。除了异养反硝化细菌，自然界中仍存在可利用无 机物作为能量来源，将硝酸盐或亚硝酸盐还原为n 2 的自养反硝化细菌。 反硝化细菌的脱氮机理研究表明，反硝化过程主要是通过硝酸盐还原酶【6 9 】 或亚硝酸盐还原酶【6 1 】的催化作用来完成。 影响反硝化细菌反硝化作用的主要因素有：溶解氧浓度( d o ) 、碳源、碳氮 比( c n ) 、温度、p h 值等【7 0 l 。 在不同的溶解氧范围内，反硝化细菌的作用机理也不同。反硝化细菌生长所 需碳源种类主要有甲醇、乙醇、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸钠、乙酸钠等，碳源主要 供给反硝化细菌反应所需的能量。以蔗糖为碳源时，c n 为2 5 时反硝化效果最 好；以甲醇为碳源时，随着c n 的升高，反硝化速率和c o d 去除效果都达到最 佳【7 1 1 。反硝化细菌在中性或微碱性条件下达到最适反应p h ，以挥发性脂肪酸为 碳源，p h 值为7 5 时，反硝化速率较快水平。反硝化细菌适宜温度范围为1 5 3 5 ，当温度低于1 0 * c 时，反硝化速率明显下降【7 2 】。 1 4 本课题研究目的、意义与主要内容 1 4 1 研究目的、意义 目前，巢湖水体的富营养化污染非常严重，并伴随着蓝藻的大量滋生。这不 仅破坏了水生生态系统，而且造成了严重的环境污染。蓝藻死亡分解后所释放出 的多种藻毒素、三氮物质等造成了严重的水体污染，严重威胁着公众的健康及生 态系统中其它生物的生存r 7 3 】。水体底泥中广泛存在能降解各种含氮物质的微生物 菌群，在自然状态下，这种微生物菌群的作用缓慢，且效果不明显。很多研究者， 采用人工配制的微生态制剂以及固定化微生物菌群对自然水体进行原位修复，并 有较好的脱氮效果【2 0 ，2 2 】。 目前，关于打捞上来的蓝藻资源化利用技术研究，主要以产沼气研究居多。 由于蓝藻碳氮比( c n ) 含量较低，合适的c n 对于提高产气率有着非常重要的 影响。很多研究通过投加猪粪、秸秆等外加碳源来提高发酵物的c n 1 2 , 7 4 】。自然 界中存在大量脱氮微生物，利用其脱氮功能，将蓝藻中的氮含量降低，以此提高 8 第一章前言 发酵物的c n 。 从巢湖底泥中筛选具有脱氮作用的脱氮功能菌群，并在实验室驯化培养，既 为湖泊水体的氮素去除提供理论基础，又为打捞后蓝藻的资源化处理，变废为宝， 提供依据，从而达到综合治理的目的，这将是解决当前所面临的环境、能源等问 题的一条有效途径，具有十分重要的现实意义【7 4 1 。在蓝藻资源化产沼气过程中， 由于夹杂大量n 2 而导致甲烷气体纯度低【1 1 】。如果在蓝藻发酵前先进行蓝藻的脱 氮处理，就不仅能在厌氧发酵过程中排除氮素的干扰，而且也能提高沼气中甲烷 的产率 1 4 2 研究主要内容 本文从富营养化污染严重的巢湖底泥中筛选微生物，主要研究内容为氨化细 菌、硝化细菌与反硝化细菌的筛选以及蓝藻脱氮过程应用初探。主要有以下内容： ( 1 ) 从巢湖底泥中筛选具有氨化作用的微生物，并对其生理生化特性、氨化性 能影响因素进行研究。具体研究p h 值、温度、接种量因素对氨化细菌氨化作用 的影响。 ( 2 ) 以巢湖底泥为菌种来源，筛选分离出具有硝化作用的异养菌，并对其生理 生化特性、1 6 s rd n a 序列特征进行分析，并研究了p h 值、温度、接种量、碳 源、氮源对硝化菌氨氮转化特性的影响。 ( 3 ) 采用厌氧培养箱法，以巢湖底泥为菌种来源，筛选分离出具有反硝化作用 的厌氧菌，对其反硝化特性进行初步研究。 ( 4 ) 将筛选所得的氨化细菌、硝化细菌与反硝化细菌按照一定的顺序，接种于 蓝藻发酵装置中，定期取样测定蓝藻中的总氮( t n ) 、氨氮( n h 4 + - n ) 与硝态氮 ( n 0 3 - n ) 的含量；同时反硝化阶段定时取气体样品进气相色谱测定含量。 9 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 2 1 实验材料 第二章实验材料与方法 2 1 1 主要实验试剂 本实验所用生化试剂主要有： 蛋白胨、牛肉膏、葡萄糖、酵母膏、琼脂、可溶性淀粉、乳糖、d 果糖等， 均为分析纯； 盐酸、氨水、醋酸等试剂，均为分析纯； 氯化钠、f e s 0 4 7 h 2 0 、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、m g s 0 4 7 h 2 0 、( n h 4 ) 2 s 0 4 、 c a c l 2 n 2 0 、硝酸钾、柠檬酸钠、e d t a 、碘化钾、碘化汞、氢氧化钾、氢氧化钠、 过硫酸钾、酒石酸钾纳、溴甲酚紫、甲基红、q 萘酚、对二甲基氨基苯磺酸、 氨基苯磺酸等药品，均为分析纯。 2 1 2 菌种来源 存 实验菌种筛选所用土壤采自巢湖湖底o 1 0 c m 底泥沉积物，采样后于4 c 保 2 1 3 培养基 2 1 3 1 氨化细菌培养基配方3 1 】 n a c lo 2 5g l 一，蛋白胨5g l ，k 2 h p 0 40 5g l 一，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1g l 一， m g s 0 4 7 h 200 5g l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h 为7 2 ，1 2 1 3 灭菌2 0m i n 。加入 2 0 的琼脂即成固体培养基，用于菌种的分离纯化。 2 1 3 2 硝化细菌培养基配方 硝化细菌富集培养基：牛肉膏3g l ，蛋白胨1 0g l ，n a c i5g l ，琼脂 2 0g l ，p h7 0 7 2 ，1 2 1 3 灭菌2 0m i l l 。 硝化细菌分离培养基【4 3 】：葡萄糖5g l 1 ，( n i - h ) 2 s 0 40 5g l 1 ，k 2 h p 0 41 0 1 n 第二章实验材料与方法 g l - l ，m g s 0 4 7 h 2 00 3g l ，n a c l0 3g l ，c a c l 2 h 2 00 0 3g - l ，f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 3g l - 1 ，p h7 2 7 4 。加入2 0 的琼脂即成固体培养基，用于菌种的分离纯化。 实验中以( n h 4 ) 2 s 0 4 作为氨氮的来源。 2 1 3 3 反硝化细菌培养基配方 反硝化细菌富集培养基，同2 2 硝化细菌富集培养基配方。 反硝化细菌分离培养基【2 6 】：k n 0 32g - l ，柠檬酸钠5g l ，k 2 h p 0 41g - l 1 k h 2 p 0 41g l 一，m g s 0 40 2g l ，微量盐2 m l ，蛋白胨1 5g l 一，牛肉膏3 g l ，蒸馏水1 0 0 0 m l ，p h7 2 7 4 ，1 2 1 3 c 灭菌2 0m i n 。加入2 0 的琼脂即 成固体培养基，用于菌种的分离纯化。 其中，微量元素构成：1 0 0 0 m l 蒸馏水中溶解5 0 9e d t a ，5gf e s 0 4 7 h 2 0 ， 1 6gc u s 0 4 5 h 2 0 ，5gm n c l 2 4 h 2 0 ( 或4 3gm n s 0 4 h 2 0 ) ，5 0m g ( n h 4 ) 6 m 0 7 0 2 4 4 h 2 0 ，5 0m gh 3 8 0 3 ，1 0m gk i 和5 0m gc o c l 2 6 h 2 0 。 2 2 实验仪器 本实验所用基本实验仪器如表2 1 。 表2 1 实验所用基本仪器设备 t a b l e 2 1e x p e r i m e n ti n s t r u m e n t s 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 2 3 实验方法 2 3 1 总氮、氨氮与硝态氮测定方法 总氮( t n ) 测定方法采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法( g b1 1 8 9 4 8 9 ) 。 氨氮( n h 4 + - n ) n 定方法采用纳氏试剂分光光度法( i - i j5 3 5 2 0 0 9 ) 。 硝酸盐氮( n 0 3 - n ) 的测定采用紫外分光光度法( h j t3 4 6 2 0 0 7 ) 。 2 3 2 脱氮率的测定 将所筛菌株接种到液体富集培养基中，于3 5 。c 、1 4 0 r m i n 的摇床中振荡培 养2 4 h 后，移取10 m l 发酵液转接于脱氮微生物液体培养基中，3 5 c 、1 4 0 r r a i n 下培养4 8 h 。 脱氮率的测定：取一定量的发酵液，分别测定t n 、n h 4 + - n 与n 0 3 - n 的浓 度，根据如下公式计算出所筛菌株的脱氮效果以及转化效果。 1 总氮脱除率计算公式 总氮脱除率采用公式( 2 2 ) 计算： b 。a9 半。( 2 - 2 ) 式中b 为总氮脱除率，d 为初始总氮浓度( m e l ) ，虬为接种所筛菌株培养 后某一时刻总氮浓度( m g l ) 。 2 氨氮生成率与氨氮转化率计算公式 氨氮生成率采用公式( 2 3 ) 计算： c 9 m m o 1 0 0 m o ( 2 3 ) 而氨氮转化率采用公式( 2 - 4 ) 计算： d 9 丝望丝1 0 0 ( 2 - 4 ) m 4 两式中c 为氨氮生成率，d 为氨氮转化率，m o 为初始氨氮浓度( m g l ) ，m 为接种所筛菌株培养后某一时刻氨氮浓度( r a g l ) 。 3 硝态氮转化率计算公式 1 2 第二章实验材料与方法 硝态氮转化率采用公式( 2 5 ) 计算： p 国p e 9 生巴幸1 0 0 10 ( 2 5 ) 式中e 为硝态氮转化率，p o 为初始硝态氮浓度( m g l ) ，p 为接种所筛菌株 培养后某一时刻硝态氮浓度( r a g l ) 。 4 亚硝态氮转化率计算公式 亚硝态氮转化率采用公式( 2 6 ) 计算： 矽9 x ：x o 宰1 0 0 以o ( 2 6 ) 式中w 为亚硝态氮转化率，汤为初始亚硝态氮浓度( r a g l ) ，x 为接种所 筛菌株培养后某一时刻亚硝态氮浓度( r a g l ) 。 2 3 3 生物量的测定方法 生物量测定采用光密度法，即在一定波长下测定细菌的光密度o d 值，本文 采用在6 0 0 r i m 光程下测定o d 6 0 0 值。 将所筛菌种接种于已灭菌的脱氮微生物分离培养基中，在3 5 ，1 4 0r m i n 条件下恒温培养4 8h ，每隔4h 取样，以未接种的培养基作为空白对照，在6 0 0 姗 下检测发酵液的光密度值( o d 6 0 0 ) 。 2 3 4 生长曲线的测定方法 生长曲线的测定方法首先要测定细菌接种至培养基培养中后一段时间内的 o d 6 0 0 变化，以时间为横坐标，以活菌数的对数为纵坐标而得到。生长曲线显示 了细菌生长繁殖的4 个时期，即延缓期( 1 a gp h a s e ) 、对数期( 1 0 9 a r i t h m i cp h a s e ) 、 稳定期( s t a t i o n a r yp h a s e ) 与衰亡期( d e c l i n ep h a s e ) 。在这一过程中，细菌经历 生长，快速生长，稳定生长及快速死亡的过程。 2 3 5 细菌厌氧培养方法 由于厌氧微生物的生长不能代谢氧，且氧分子对微生物机体会产生一定的危 害，所以对厌氧微生物的筛选分离培养时必需处于无氧或缺氧环境下。本实验对 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 反硝化细菌的筛选培养采用的厌氧培养方法主要有两种： 1 夹层培养方法 夹层培养方法是将厌氧细菌固定在两层培养基中间，隔绝外界氧气的进入以 达到厌氧培养的目的。试验方法是首先于无菌平皿中倒一层培养基，待凝固后， 涂布或划线接种所筛微生物，后将冷却至5 0 左右的培养基铺于接种后的平板 上，使细菌隔绝氧气。 2 厌氧培养箱培养法 厌氧培养箱是一种装置有温度控制系统和气体置换系统的密闭大型金属箱。 利用向密闭的厌氧培养箱中混合充氮气以及混合气体，置换培养箱内的空气，而 培养箱内经过处理的钯可作为催化剂催化氢和箱内残余的氧化合成水，使培养箱 空间内处于厌氧状态。 2 3 6 实验数据的分析及处理软件 采用e x c e l 2 0 0 3 及o r i g i nv 8 0 对实验数据进行处理，作图分析。d n a 测序 分析采用d n as t a r 、m a g e4 0 、d n a s p4 0 、p a u p4 0 以及v i s i o 等软件进行处 理并建树。 1 4 第三章氨化细菌的筛选分离、鉴定及其脱氮活性研究 第三章氨化细菌的筛选分离、鉴定及其脱 氮活性研究 蓝藻中含有大量的蛋白质等有机含氮化合物，实行蓝藻脱氮首先应该将有机 氮转化为氨氮。氨化作用是通过氨化细菌胞外蛋白酶的水解作用使含氮有机物转 化为氨基酸，再进入胞内脱氨基产生氨的过程。氨化作用一般发生在好氧条件下， 本实验从巢湖底泥中筛选得到好氧氨化细菌，并对其生理生化特性，氨化特性进 行研究。 3 1 材料与方法 3 1 1 实验材料 本实验筛选菌种来源于巢湖底泥0 1 0 c m 沉积物。 所用试剂药品以及仪器参见第二章表2 1 和2 2 。 3 1 2 氨化细菌的筛选分离 3 1 2 1 菌种的分离纯化 ( 1 ) 氨化细菌的筛选分离 取巢湖底泥沉积物约2 9 ，无菌操作下接种于无菌水中，于3 5 c 、1 4 0 r r a i n 条件下振荡培养3 h ，静置。制备一系列该培养液的稀释液( 1 0 一、1 0 之、1 0 。、1 0 r 4 、 1 0 一、1 0 。6 、1 0 、1 0 ) ，用移液管分别吸取不同梯度的稀释液0 5 m l 于培养皿内， 倒入5 0 左右的氨化细菌固体培养基，轻轻摇动平皿，使之混匀。将凝固的平 板倒置于3 5 恒温培养箱内培养4 8 h 。对菌落形态颜色各异的菌株，进行单菌落 划线挑选，并编号。 ( 2 ) 氨化细菌的纯化 将挑选所得的菌株进行划线分离纯化，经过行多次划线分离，直至得到纯菌 株。对分离得到的纯菌株，进行试管斜面划线，作为保藏菌株，以进行下一步研 究。 1 5 脱氮微生物的筛选及其脱氮性能研究 3 1 2 2 氨化细菌的初筛与复筛 为了检测筛选所得的菌株的氨化性能，将初筛菌接入1 0 0 m l 氨化细菌液体培 养基中，于3 5 、1 4 0 r m i n 条件下摇床培