（环境科学专业论文）菲降解中度嗜盐菌群降解特性及萘双加氧酶基因表达的研究.pdf

内蒙古大学硕士学位论文 菲降解中度嗜盐菌群 降解特性及萘双加氧酶基因表达的研究 摘要 多环芳烃( p a h s ) 是一类重要的难降解有机物，常常存在于盐环境中，而中 度嗜盐菌是一类营养要求简单、适宜盐度宽且高的极端环境微生物。因此，研 究具有降解p a h s 功能的中度嗜盐微生物对治理高盐环境中的p a h s 污染具有 重要的理论意义和应用前景。 本研究从胜利油田盐碱土中富集到1 0 盐度下能够降解菲的中度嗜盐菌 群，研究了盐度、p h 值和温度条件对降解过程和降解效果的影响，菌群可在 0 1 - - 1 0 盐度下1 0 天内将培养液中4 0 0 m g l 的菲降解完全，在1 5 - - - ，2 0 盐度下对菲仍有一定的降解。 利用分子生物学技术对菌群降解菲的关键功能基因一萘双加氧酶基因的 多样性进行了解析，发现菌群中存在着四种萘双加氧酶基因的序列，在 g e n b a n k 进行b l a s m 比对，找到与3 1 个克隆子的相似度最高的基因由一些假 单胞菌、雷尔氏菌组成，菌群降解作用的细菌可能就是由此类细菌构成。 建立了一种以萘双加氧酶基因和对临定量的方法，对p h 、温度、盐度及初 始菲浓度对基因量及表达量的影响进行了的考查，解析其与降解过程之间的内 在联系。 关键词：多环芳烃；生物降解；中度嗜盐菌；萘双加氧酶基因；定量p c r 内蒙古大学硕士学位论文 b i o d e g r a d a t l o no fp h e n a n t h r e n eb y a h a l o p h i l i cb a c t e l u a lc o n s o r t i u ma n d e x p r e s s i o no fn a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s eg e n e s a bs t r a c t t h ed e g r a d a t i o no f p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) b yb a c t e r i ah a s b e e nw i d e l ys t u d i e d p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) a r ea ni m p o r t a n t c l a s so f r e f r a c t o r yo r g a n i c s ，a n do f t e np r e s e n ti nt h eh y p e r s a l i n ee n v i r o n m e n t s t h e m o d e r a t e l yh a l o p h i l i cb a c t e r i aa r eac l a s so fe x t r e m em i c r o o r g a n i s m sw h i c hc a nb e s u i t a b l e f o raw i d ea n dh i g h s a l i n i t ya n dh a v el o wn u t r i t i o n a lr e q u i r e m e n t s t h e r e f o r e ，t os t u d yt h em o d e r a t e l yh a l o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m sc a p a b l eo fd e g r a d i n g p a h sh a si m p o r t a n tt h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c ea n da p p l i c a t i o np r o s p e c t st op a h s p o l l u t i o nc o n t r o li nh y p e r s a l i n ee n v i r o n m e n t s ab a c t e r i a lc o n s o r t i u md e g r a d i n gp h e n a n t h r e n ew a se n r i c h e da t3 0 0 ca t s a l i n i t y o f10 w i t hi n i t i a l p h e n a n t h r e n e c o n c e n t r a t i o no f4 0 0 m g l t h e c o n s o r t i u mc o u l dd e g r a d ep h e n a n t h r e n ea ts a l i n i t i e sr a n g i n gf r o mo 1 t o2 0 i no u rr e s e a r c ht h et e c h n o l o g yo fm o l e c u l a rb i o l o g ya n dm o l e c u l a re c o l o g y w a sf i r s tu t i l i z e di ns t u d y i n gd e g r a d a t i o np r o c e s so fp a h s d e g r a d a t i o nm o d e r a t e l y h a l o p h i l i cb a c t e r i ai nh y p e r s a l i n ee n v i r o n m e n t s t h et h ed i v e r s i t yo ft h ek e y 内蒙古大学硕士学位论文 f u n c t i o n a lg e n e s ( n a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s e ) o ft h em o d e r a t eh a l o p h i l i cb a c t e r i a l c o n s o r t i u mw a s r e s e a r c h e d s e q u e n c i n go f t h ec l o n e dn a h a cf r a g m e n t ss h o w e dt h a t d i f f e r e n ts u k e so fg e n e sw e r ep r e s e n ti nt h ec o n s o r t i u mp o p u l a t i o n s m a n yo ft h e n a h a cg e n ef r a g m e n ts e q u e n c e sf e l li n t o s p e c i e sw h i c ha r ed i s t i n c tf r o mt h e r e f e r e n c en a t h p h r e n ed i o x y g e n a s eg e n es e q u e n c e s t h e p u r p o s eo ft h i ss t u d yi st op r o v i d en e wi d e a sa n dt h e o r e t i c a ls u p p o r tf o r d e v e l o pb i o r e m e d i a t i o nt e c h n o l o g yt op a h sp o l l u t i o ni nh y p e r s a l i n ee n v i r o n m e n t s ， a sw e l la sp r o v i d en e ws t r a i n sa n dg e n e s k e y w o r d s ：p h e n a n t h r e n e ；b i o d e g r a d a t i o n ；h a l o p h i l i cb a c t e r i a lc o n s o r t i u m ； n a p h t h a l e n e d i o x y g e n a s eg e n e s ；r e a l - t i m ep c r i i i 内蒙古大学硕士学位论文 目录 摘要一i a b s t r a c t i i 符号说明v i 第一章引言1 1 1 研究背景与意义一1 1 1 1 多环芳烃的来源与性质l 1 1 2 多环芳烃的污染的治理3 1 2 多环芳烃降解细菌的研究进展5 1 2 1 多环芳烃细菌的好氧代谢途径一5 1 2 2 多环芳烃降解相关功能基因的研究进展一7 1 2 3 嗜盐细菌降解石油及芳香族化合物的研究进展一9 1 2 4 实时荧光定量p c r 技术在环境微生物研究中的应用1 1 1 3 本论文的研究目的及研究内容”1 6 1 3 1 研究目的1 6 1 3 2 研究内容1 6 第二章菲降解嗜盐菌群的富集及其对菲的降解特性1 9 2 1 材料与方法”1 9 2 1 1 试验材料和仪器1 9 2 1 2 菲降解嗜盐菌群的富集1 9 2 2 结果与讨论“2 0 2 2 1 菲降解菌群的富集2 0 2 2 2 微量酵母粉对菲降解的作用2 1 2 2 3 不同菲初始浓度下菌群对菲的降解效果2 1 2 2 4p h 对菌群降解菲过程的影响2 2 2 2 5 温度对菌群降解菲的影响2 2 2 2 6 盐度对降解的影响2 3 第三章菌群萘双加氧酶基因多样性的研究2 5 3 1 材料与方法2 5 内蒙古大学硕士学位论文 3 1 1 试验材料和仪器2 5 3 1 2 菌群萘双加氧酶基因的聚合酶链式反应2 6 3 1 3 萘双加氧酶基因p c r 产物的纯化2 8 3 1 4 纯化后的p c r 产物的克隆一2 9 3 1 5 萘双加氧酶基因的测序结果分析方法3l 3 2 结果与讨论31 3 2 1 菌群萘双加氧酶基因的聚合酶链式反应3 l 3 2 2 萘双加氧酶基因的系统发育分析3 2 3 3 本章小结3 3 第四章菌群萘双加氧酶基因表达量的研究3 4 4 1 材料与方法3 4 4 1 1 试验材料和仪器3 4 4 1 2 标准品质粒的构建3 4 4 1 3t z o l 法提取菌液样品的r n a 3 6 4 1 4 总r n a 的反转录3 6 4 1 5 实时荧光定量p c r ”3 7 4 2 结果与讨论3 8 4 2 1 萘双加氧酶基因定量方法的建立3 8 4 2 2 降解过程中萘双加氧酶基因及其表达量的动态变化4 6 4 2 3 菲初始浓度对萘双加氧酶基因及表达的影响4 6 4 2 4 p h 对萘双加氧酶基因及表达的影响“4 7 4 2 5 温度对萘双加氧酶基因及表达的影响4 8 4 2 6 盐度对萘双加氧酶基因及表达的影响4 8 4 3 本章小结5 2 第五章结论与展望5 3 5 1 结论”5 3 5 2 展望“5 4 参考文献5 5 致谢5 9 攻读硕士学位期间发表文章情况6 0 v 内蒙古大学硕士学位论文 p a h s p c r s s d m s s d m y h p l c d 匝 d n a c d n a r n a r p m r e a l - t i m ep c r c t g p g n b p e b e d t a t r i s d d h 2 0 t e t 址 a m p l z p t g x g a l i u - p c r d e p c 符号说明 p o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s 多环芳烃 p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 聚合酶链式反应 s e as a l td e f i n e dm e d i u m 海盐培养基 含酵母粉的海盐培养基 h i 曲p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y 高效液相色谱 n n d i m e t h y l f o r m a m i d e 二甲基甲酰胺 d e o c y r i b o n u c l e i ca c i d 脱氧核糖核酸 c o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a r i b o n u c l e i ca c i d 核糖核酸 r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e 每分钟转速 p c r 实时荧光定量 t h r e s h o l dc y c l e 荧光信号到达阈值时的循环数 革兰氏阳性细菌 革兰氏阴性细菌 b a s ep a i r 碱基对 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙锭 e t h y l e n ed i a m i n e t e r t r a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 t r i s h y d r o x y m e t h y la m i n o m e t h a n e 三羟甲基氨基甲烷 两次蒸馏水 t d s h c le d t ab u f f e r t r i sa c e t a t ee d t ab u f f e r a m p i c i l l i n 氨苄青霉素 g a l a c t o s i d a s eg e n eo fe c o l i 大肠杆菌半乳糖苷酶基因 i s o p r o p y l p d - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e 异丙基一p d 一硫代半乳糖苷 5 溴_ 4 氯3 吲哚p d 半乳糖苷 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r 反转录聚合酶链式反应 d i e t h y p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 v i 第一章引言 1 1 1 多环芳烃的来源与性质 第一章引言 1 1 研究背景与意义 多环芳烃p a h s 是指两个或两个以上的苯环以线性排列、弯接或簇聚方式构成的一类碳氢 化合物【l - 3 l 。p a t - i s 的来源可分为天然和人为两种。环境中p a i l s 的天然来源包括陆地和水生生 物的合成、森林和草原火灾、石油渗漏，火山爆发等，在这些过程中均会产生p a h s 。人类活 动是环境中多环芳烃的主要来源，大多来自化学工业、交通运输和日常生活等方面，如：煤、 石油、木材及有机高分子化合物在不完全燃烧时都能产生多环芳烃，世界范围内每年约有 4 3 ，0 0 0 1 1 屯p a h s 释放到大气q ，f 4 1 。大气中的p a h s 主要来源于煤和石油的燃烧，其生成量同燃烧 设备和燃烧温度等因素有关。这类化合物产生于有机分子的热分解和再结合过程，有机分子 材料经5 0 0 8 0 0 的高温不完全燃烧或在1 0 0 3 0 0 低温下再结合，都会使p a h s 积累。 p a i l s 广泛分布于大气、水体、淤泥和土壤中。柴油机和汽油机的排气中，以及煤油厂、煤气 厂、煤焦油加工厂等排放的废气中都有。汽车、飞机等交通运输工具排放的废气中也存在。 这些污染物进入大气环境后，绝大部分通过沉降进入土壤，污染土壤环境。我国的p a h s 污染 主要体现在土壤、大气、江河沉积物等方面。2 0 0 1 年冯晓琼等【5 】报道北京城郊土壤中p a i l s 的 浓度高达1 0 4 t g k g ( 土壤q b p a h s 背景值l o 2 0 p g l 【g ) 。2 0 0 6 年王宣等 6 1 对六种典型区域土壤 中多环芳烃检验发现多环芳烃总量浓度均值在5 5 3 8 5 2 x g k g 之间。 有关多环芳烃毒性的研究，已深入到分子生态学领域。人们已经对污染物及代谢产物与 细胞内大分子，包括蛋白、核酸、酶的相互作用进行研究，找出作用的靶位或靶分子，并揭 示其作用机理，从而对在个体、种群或生态系统水平上的影响作出预报。pa h s 已被证实具 有潜在的致畸性、致癌性和遗传毒性，对生态环境和人类健康能够造成很大的危害 7 1 。p a t - i s 在自然条件下很难降解，随着分子量的增加，降解的难度也变大。这些难降解的p a h s 长期滞 留在土壤中，对土壤微生物、植物和动物造成持续毒害，进而损害土壤功能，并可通过食物 链最终富集到人体中，成为潜在的致癌物质。p a h s 对微生物的生长有强抑制作用【8 】。p a h s 因 水溶性差及其稳定的环状结构而不易被生物利用，它们对细胞的破坏作用抑制普通微生物的 生长。因此，如何消除污染环境中的p a h s ，一直是国内外科学家们的研究热点【9 ，l o 】。图1 1 所示 第一章引言 为土壤中存在的几种典型多环芳烃的结构。 酗圆国回 n a p h t h a le n ea n t h r a c e n ep h e n a n t h r e n ep y r e n eb e n z o a p y r e n e c o r o n e n e 图1 1 土壤中存在的几种典型多环芳烃的分子结构 f i g 1 1m o l e c u l a rs t m c t u r eo fs o m et y p i c a lp o l y c y c l i ca r o m a t i ch y d r o c a r b o n s ( p a h s ) i ns o i l 多环芳烃中，菲属于较简单的低分子量p a h ，由三个苯环连接而成。菲不仅在污染环境 中的含量高，对人的呼吸道和皮肤有毒害作用，而且有着与致癌多环芳烃类似的区域结构， 如图1 2 所示，菲具有一个“湾”区和一个k ”区，而这两个结构与多环芳烃的致癌性有着非常 密切的关系。有的学者甚至认为，具有致癌性的多环芳烃都含有菲环的结构，可视为菲的衍 生物。因其独特的化学结构，菲成为p a h s 研究中的模式化合物，许多科学家以菲为模式化合 物来研究多环芳烃的毒性，降解路径、机制，以及影响多环芳烃生物利用率、生物降解潜力 和降解率的各种因素。菲污染的研究不仅有利于污染环境中菲的去除，还可为其它p a h s 污染 的防治提供相关的参考资料。 b a y k 。r e g i o n 图1 2 菲的结构 f i g 1 2t h es t r u c t u r eo f p h e n a n t h r e n e 多环芳烃对人类健康和生态环境的巨大的潜在危害已引起各国环境科学家的极大重视。 1 9 7 9 年，美国环保局( e p a ) 首先公布1 2 9 种优先监测污染物，其中p a h s 有1 6 种。2 0 0 8 年， 美国国家环境保护局se n v i r o n m e n t a lp r o t e c t i o na g e n c y ，u se p a ) 已经将2 8 种p a h s 列入环 境中的优先污染物名单，见表1 1 【1 。我国国家环保局也将7 种p a h s 列入中国环境优先污染 物黑名单【埘。 2 第一章引言 表1 1 u s e p a2 8 种优先多环芳烃【1 1 】 t a b 1 1 p r i o r i t yp a h s a sl i s t e db yu se p a 1 1 2 多环芳烃的污染的治理 目前对多环芳烃污染物土壤的处理方法按性质可分为：物理处理、化学处理、生物处理 ( 即生物修复) 。物理处理包括焚烧法、隔离法和换土法等，化学处理主要有萃取法、土壤洗 涤法以及化学氧化法等。物理和化学的处理方法虽然能够快速有效的净化土壤中的大部分多 环芳烃污染物，但是它们本身固有的一些缺陷却限制了其应用范围。例如，物理方法在去除 污染物的同时亦破坏土壤结构和组分，并且所用的燃料和设备价格昂贵；化学方法虽然可以 3 第一覃引言 获得较好的除油效果，但使用的化学试剂却造成了土壤的二次污染。污染土壤的生物修复是 指利用生物的生命代谢活动减少土壤环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使 污染的土壤环境能够部分或完全地恢复到原始状态的过程。环芳烃的生物修复与其它清洁技 术如焚烧、填埋等相比较，具有二次污染少、价格低等优点，已成为现场去除多环芳烃重要 选择途径【1 3 1 。 生物修复的类型按其使用的生物主体可分为：微生物修复、植物修复及动物修复。由于 微生物在土壤污染物降解过程中发挥主要作用，狭义生物修复就是指微生物修复。细菌和真 菌对污染土壤的微生物修复有着不同的代谢途径。细菌降解多环芳烃，可分别好氧途径和厌 氧途径。许多多环芳烃化合物均能被一种微生物或一个微生物群体全部或部分降解n 4 1 。 目前，研究微生物降解污染物的主要目标包括：1 ) 高效降解菌株的筛选和培育；2 ) 研 究各种微生物降解污染物的酶促反应机理和途径；3 ) 探知有机污染物降解的酶( 系) 及相关基 因( 簇) ；4 ) 研究影响微生物降解污染物的环境因子和其它生物因子；5 ) 利用生物技术手段 构建高效的遗传工程菌株并应用于环境污染物的治理【1 5 】。 人们对单一微生物菌株和混合微生物菌株降解多环芳烃已进行了多年的研究。这期间已 分离出多种具有降解多环芳烃能力的细菌、真菌和藻类。一般来说，多环芳烃的降解速度与 芳香环数目有关，因此低分子量的多环芳烃的降解速度比高分子量的多环芳烃要快得多，人 们对降解低分子量的多环芳烃的微生物的研究也比较深入。 生物修复中引入菌种的成功与生物修复中引入菌种的成功与否与菌株的降解能力及在环 境中的竞争力有关，菌株的生存受到许多因素的影响，生物修复也有它自身的一些限制，比 如清除p a h s 不彻底，一些有毒的降解中间产物的积累，等等。所以，在实际应用中还是要 结合多种手段对污染环境进行综合治理。 利用土壤环境中土著微生物降解p a h s 进行生物修复的可行性在于：土壤微生物作为一 个整体，菌群成员之间的协同作用及群体效应使它们的适应能力强，具有高度的代谢多样性， 这带来的结果是：很多生物有害、难处理有机污染物包括p a l l s 都可以被转化或降解。 p a h s 的污染环境常常伴随着一些较高浓度的盐环境。由于p a h s 主要来源之一是石油及 其副产物，所以p a h s 就会随着石油的突发事故、落地油及含油污水排放等对环境造成严重污 染【1 6 ，1 7 1 。据统计：美i n 3 20 0 0k m 2 的沿海湿地中大约有6 0 的盐碱滩，一旦发生海上石油运 输事故，就会使这些地区受到p a h s 污染【1 8 1 。我国大庆油田、胜利油田和大港油田等石油产区， 油井及冶炼厂附近的盐碱地非常严重，落地油和管道泄漏等也会造成盐碱土壤被p a h s 污染。 4 第一章引言 油田采出水含油和含盐量都比较高( 盐度 3 5 w v ) ，直接排放会造成p a h s 与盐的双重污染【1 9 】。 夏季的暴晒也会使p a h s 污染土壤中的盐度短时间内大幅度增加：还有生物修复p a h s 污染环 境时需要添加氮、磷等营养盐来提高微生物的降解效率，最终也造成盐度升高【1 9 1 。 p a h s 属于难降解物质，相对石油中的其它成分而言，p a h s 在自然环境中的毒性更大， 存在时间更久。虽然，科学家们对微生物降解p a h s 的研究成果非常多，但是多集中于非嗜盐 微生物。资料表吲1 9 】，将非嗜盐的p a i l s 降解菌引入到污染的盐环境中用来去除p a h s 效果很 差。这是因为盐条件下的非嗜盐微生物既要忍受长期的高渗透压又要承受短期的渗透冲击( 夏 日暴晒或雨水冲击等) 。因为高盐( 1 ) 限制了非嗜盐微生物的处理范围：当盐度 3 时，其处 理效率非常低；( 2 ) 降低了非嗜盐微生物的感知性：如当盐度从0 5 升高至2 时，就会严重扰 乱其系统性能、导致灵敏性降低，从而使得降解效率降低。因此，非嗜盐微生物进行环境修 复的方法并不适合被污染的高盐环境【2 0 】。 1 2 多环芳烃降解细菌的研究进展 1 2 1 多环芳烃细菌的好氧代谢途径 自然环境中，经石油和多环芳烃污染的土壤、沉积层、废水中都存在着菲降解细菌。由 于细菌的种类繁多，所以其代谢路径也较为复杂多样。好氧细菌在清除环境p a i l s 污染物中占 据十分重要的地位，凸现其广阔的应用前景，也是科学家对降解p a h s 机制的研究深入的领域， 为利用好氧细菌治理p a h s 污染环境提供了理论依据。 菲的好氧代谢途径主要有水杨酸代谢途径和邻苯二甲酸代谢途径。水杨酸途径中，菲可 被转化成1 羟2 萘甲酸和水杨酸。水杨酸再经水杨醛到邻苯二酚，邻苯二酚在邻位或间位裂 解酶的作用下生成粘康酸半醛或粘康酸，这些中间产物可进一步降解，最终形成二氧化碳和 水( 图1 2 ) 【2 】。在邻苯二甲酸途径中，菲首先代谢成1 羟- 2 萘甲酸，1 羟2 萘甲酸在1 羟2 萘甲酸双加氧酶作用下再次加氧开环生成反式2 羧基苯并丙酮酸，反式2 羧基苯并丙酮酸在 醛缩水合酶的作用下生成2 羧基苯甲醛，2 羧基苯甲醛在脱氢酶作用下生成邻苯二甲酸，而 后进一步氧化开环直至彻底降解为二氧化碳和水【2 】。 5 第一章引言 洲j#o o o hl洲 图1 2 菲的常见好氧代谢途径圈 f i g 1 2p a t h w a y s f o rp h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o nb yb a c t e r i a 除了以上两种较为常见的菲降解途径外，一些细菌中还有其它的代谢途径( 图1 3 ) 。如 s p h i n g o m o n a ss p s t r a i np 2 的菲代谢途径起始于1 ，2 位的双加氧反应，而不是常见的3 ，4 位双 加氧反应【2 】；：e m y c o b a c t e r i u ms p p y r _ i t 2 1 1 中，菲首先在9 ，1 0 位发生双加氧反应，经过两种 不同的代谢途径分别生成菲顺9 ，1 0 - 氢二醇和菲反9 ，1 0 - - 氢二醇。 6 一拶由 第一章引言 图1 3 分枝杆菌p y r - 1 的三条菲好氧代谢途径【2 1 1 f i 9 1 3t h et h r e er o u t so f p h e n a n t h r e n ed e g r a d a t i o ni nm y c o b a c t e r i u ms p s t r a i np y r - 1 1 2 2 多环芳烃降解相关功能基因的研究进展 人们对萘、菲、荧蒽、苊等p a h s 的降解途径都进行了研究，降解过程需要分子氧的存在， 初始化酶对芳环的开环。在反应的第一步，芳环双加氧酶催化氧化作用一般是由好氧细菌进 行的。 通常，p a h 降解基因及其调节基因组成一个或多个基因簇。例如，经典的n a h 基因簇 由2 0 个基因组成，依次为n a h a a a b a c a d b f c e d 基因簇、加办g 删z d 搋厂基因簇和n a h r 调控基因圈。依据p a h 降解基因簇与经典n a h 基因簇之间核苷酸序列同源性高低，可为两 类：( 1 ) “似嬲j z 基因”：主要包括以口m 鲥枷鲥拈f i c e d g 砒们锇职、n d o a b c 、 7 回馥。 茎二兰呈! 童 d o x a b a c a d e f g h i j 和p a h a a a b a c ad b c d e f 。这类基因簇几乎全部来源于假单胞菌 ( p s e u d o m o n a ss p p ) ，且降解基因之间的排列顺序相同，编码的氨基酸序列同源性也大于9 0 。 ( 2 ) “非n a h 基因”：包括n a g a a g h a b a e a d b f 、p h n f e c d a c a d b 、n a r a a a b b 、n i d a b c d 、n i d d b a 和p h d a b c d 。该基因簇来源于不同的细菌物种，降解基因之间的排列顺序不相同、编码的 氨基酸序列同源性非常低【2 3 1 。 l o z a d a 等【2 4 】对巴塔哥尼亚( p a t a g o n i a ) p a h s 污染的海底沉积物有关编码芳香环双加氧 酶基因( a r 皿) 的催化亚基a 亚基进行了克隆分析。总共得到了5 0 0 个克隆子，对其中 的1 9 3 个进行测序，在沉积物中得到8 个不同类型的a r h d 基因。其中5 个类型的氨基 酸序列与以前报道的a r h d 肽段的相似性低于7 0 。它们都包含r i e s k et y p e 簇结合位点， 表明这些基因片段是编码a r h d s 的基因。另外3 个类型的a r h d 基因与之前报道的 n a h a c 1 i k e 基因，p h n a c 1 i k e 基因相似。 不同细菌中p a h s 双加氧酶基因的结构有着明显的差异，表1 2 y u 出了一些常见的p a h s 降 解细菌的双加氧酶基因的多样性。 表1 2p a h s 降解基因的多样性 t a b 1 2t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fp a h s - d e g r a d i n g 菌株位置底物基因 基冈功能 恶臭假单胞菌g 7 n a h 7 萘 n a h a a a b a c a d b f c q e d 编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a s p u t i d ag 7 ) 质粒黝 g 7 枞0 m j u编码下游途径所需蛋白 恶臭假单胞菌9 8 1 6 p w w 6 0 萘、菲n d o a b c编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a s p u t i d a9 8 1 6 )- l 质粒 恶臭假单胞菌9 8 1 6 - 4 p d t g l 萘 n a h a a a b a c a d b f c q e d 编码上游途径所需蛋c a ( p s e u d o m o n a s p u t i d a9 8 1 6 - 4 )质粒 恶臭假单胞菌 n p l - 1 萘n a h a i a 2 a 3 a 4 b f c q e编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a sp u t i d ab s 2 0 2 ) 质粒 施氏假单胞菌a n l o染色体萘 n a h a a a b a c a 棚啊e e d编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a s p u t i d ab s 2 0 2 1 n a h g t h i n l o m k j编码下游途径所需蛋白 恶臭假单胞菌o u s 8 2染色体 萘、菲p a h a a a b a c a d b f c q e d 编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a sp u t i d a0 u s 8 2 ) 铜绿假单胞菌p a k l 染色体p a h a i a 2 a 3 a 4 b f c q e d 编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s ap a k l ) 假单胞菌c 18质粒萘、d o x a b d e f g h i j编码上游途径所需蛋白 ( p s e u d o m o n a ss p c 1 8 ) 罗尔斯通氏菌u 2质粒萘 n a g a a g h a b a c a d b f c q e d 编码上游途径所需蛋白 ( r a l s t o n i as p u 2 )n a g l k l 删编码下游途径所需蛋白 p a h s 降解基因簇编码p a h s 分解途径中所需要的各种代谢酶。在这些基因中，关于编 码起始多环芳烃降解的双加氧酶基因的研究十分深入。1 9 6 5 年，d a v i e s 和e v a n s 首次报道 8 第一苹引言 了土壤中假单胞菌对萘的降解【2 引。s i m o n 等【2 6 】通过对含有质粒的恶臭假单胞菌株和含有质 粒的恶臭假单胞菌一菌株的研究发现在萘的降解途径中，首先发生作用的酶是萘加双氧酶。 这种双加氧酶是由铁氧还蛋白还原酶，铁氧还原蛋白和末端氧化酶构成的电子传递链( 图 1 4 ) 瞄】。其中，编码末端氧化酶( 即r i e s k e 型铁硫蛋白) 的基因高度保守，该蛋白由啦亚基 和p 3 亚基组成。最近，j a k o n c i c 等发现鞘氨醇单胞菌c h y - 1 株( s p h i n g o m o n a ss p ) 之所以能 够降解笨并 a 】芘等高分子量的p a h s ，主要是由于哟亚基的催化活性结构域具有较大的空 间和特殊的拓扑结构。钧亚基由n a h a c 、n a g a c 、p a h a c 、p h n a c 、n i d a 、n a r a 和p h t a l 等基 因编码，与双加氧酶催化功能密切相关，包含一个典型的r i e s k e 2 f e 2 s 结构域和一个单核 f e ( i i ) 催化活性结构域【2 刀。 n a l l ) + n a l l ) h + h + 图1 4 萘双加氧酶酶系 f i g 1 4n a p h t h a l e n ed i o x y g e n a s e 在好氧细菌中，奶亚基被认为是p a h s 降解能力潜在的生物标记【2 8 1 。一般而言，p a h s 降解 基因丰富度与环境中的p a h s 污染程度呈正相关性。因此，利用钧亚基的某些保守序列设计简 并引物进行p c r 扩增可以获得探针，用来筛选p a h s 降解基因或用于检测污染环境中p a h s 降解基因的丰度【2 9 】。 1 2 3 嗜盐细菌降解石油及芳香族化合物的研究进展 由于石油及芳香族化合物污染常常伴随着高盐的环境。研究嗜盐细菌对多环芳烃的降解 机理有很高的理论价值和应用价值。嗜盐微生物属于极端微生物范畴，主要包括嗜盐古菌和 嗜盐细菌。在分类学上，嗜盐古菌主要属于盐杆菌科，嗜盐细菌则广泛分布于细菌域的多个 分枝。由于嗜盐微生物能够在高盐环境中栖息繁殖，因此，利用嗜盐微生物修复污染的天然 9 第一苹引言 盐环境或处理排放的高盐度有机污染物废水，不需要通过稀释、反渗透、离子交换、或者电 渗透等方法降低待处理样品的盐度，具有操作简单和成本低廉等诸多优点【1 6 1 。在一些盐水( 盐 湖、海水) 和盐土( 盐池、盐碱地) 的高盐环境下( 一般大于3 5 w v ) 生长着许多不同类群 的嗜盐微生物。依据嗜盐浓度的不同，嗜盐菌可分为轻度嗜盐菌( s l i g h th a l o p h i l e s ，最适生 长盐浓度为0 2 0 5 m o l l ) 、中度嗜盐菌( m o d e r a t e l yh a l o p h i l e s ，最适生长盐浓度为0 5 2 0 m o l l ) 和极端嗜盐菌( e x t r e m eh a l o p h i l e s ，最适生长盐浓度大于3 m o l l ) 3 0 l 。 由于石油中的p a h s 属于难降解污染物，所以一直成为国内外的研究热点。然而，关于盐环 境q b p a h s 污染物降解的文献报道还很少。p l o t i k o v a 等【3 l 】分离得至i j l 5 株被归类于红球菌属 ( r h o d o c o c c u s ) 、节杆菌属( a r t h r o b a c t e r ) 、芽孢杆菌属( b a c i l l u s ) 和假单胞菌属( p s e u d o m o n a s ) 的中度耐盐微生物。在5 8 n a c i 条件下，这些菌株都能够以萘为唯一碳源和能源进行生长。 其中，4 株假单胞菌( s n l1 、s n 2 1 、s n l 0 1 和( 3 5 1 ) 、红球菌g 1 0 和节杆菌s n l 7 均携带约8 5 k b 质粒。以假单胞菌s n ll 为供体菌株和恶臭假单胞菌b s 3 9 4 为受体菌株进行结合转座，获得的恶 臭假单胞菌3 9 4 s n l1 - t c l 和恶臭假单胞菌3 9 4 s n l1 - t c 2 两株结合菌不但能降解萘和菲，而且 提高了其耐盐能力。 a 1 a w a d h ih 等人口2 】从阿拉伯海湾的潮汐地带富集分别得到了嗜碱石油降解菌和嗜盐石 油降解菌，其中嗜盐石油降解菌株通过1 6 sr d n a 的系统发育分析，发现主要属于m a r i n o b a c t e r ， m i c r o c o c c u s 、d 把纪肠、b a c i l l u s 、o c e a n o b a c i l l u s 、c i t r i c o c c u s 、i s o p t e r i c o l a 和c e l l u l o m o n a s 等属， 大部分单菌都可以以烷烃或芳香族化合物为唯一碳源和能源生长，通过气相色谱( g c ) 检测 发现单菌株对于原油和典型的烃类化合物都有降解。 由于石油中烃成份十分复杂，所以需要富集筛选能降解多种石油烃的嗜盐微生物菌株或 菌群，以便能对突发性石油烃污染的海平面、海岸线和天然盐环境等进行快速、高效的微生物 修复。人们一直在为富集出高盐环境下降解率高的菌群而做了大量的工作，1 9 7 8 年，w a r d 和 b r o c k 从g r e a ts o l a rl a k e 中富集得到了能在盐度高达1 7 2 的含矿物油的培养基上生长的菌群 【3 3 1 。a r u l a z h a g a n 等a t 3 4 1 从不同来源的海水混合物中富集得到了一个中度嗜盐菌群，该菌群在 4 盐度下，4 天内对1 0 0 m g l 菲降解率为7 8 。r i i sv 等人【3