（物理化学专业论文）分析试剂与生物大分子相互作用的研究.pdf

摘要 摘要 本文以分析试剂茜素红、酸性铬兰k 作为蛋白质探针，酚藏花红为d n a 探针，研究了它们的相互作用，结果如下： 1 在p h = 2 6 8 的缓冲溶液中，茜素红( a r ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 发生 了相互作用，研究表明二者主要靠静电作用力结合，且它们的结合符合 p e s a v e n t o 提出的相分配模型根据相分配模型我们推导了有机小分子在 蛋白质微相和水相中的分配比d 的计算公式，并通过吸光度a 、分配比 d 、表观结合常数k 和热力学参数a g 、a h 、a s 来讨论了系列浓度下的 阴离子型表面活性剂十二烷基硫酸钠( s d s ) 对该体系的影响，认为s d s 主要通过静电作用力和疏水作用力影响a r 与b s a 的相互作用。 2 分别在酸、碱条件下研究了酸性铬兰k ( a c b k ) 与牛血清白蛋白( b s a ) 结合的光度性质，籍此探讨了不同体系环境下a c b k 与b s a 相互作用 ， 的机理差异。( 研究表明在p h = 3 7 8 的条件下b s a 使a c b k 的吸光度降 低且九。红移，p h = 9 9 1 条件下b s a 使a c b k 的 。蓝移。分光光度 法和平衡透析法皆表明结合反应符合p e s a v e n t o 提出的相分配模型。此 外，通过表观结合常数k 、热力学参数g 、h 、s 的计算以及对 a c b k 酸碱平衡式、b s a 构象的分析，认为在p h 3 7 8 条件下a c b k 与 b s a 主要以静电作用力结合，在p h = 9 9 1 条件下二者主要以疏水作用力 结台。1 3 在p h = 7 0 0 的b r i t t o n r o b i n s o n 缓冲液中。酚藏花红( p s ) 与d n a 能形 成一种非电活性的超分子复合物。用循环伏安法对体系进行了研究，发 现p s 主要以阳离子形式吸附在裸银电极表面。在实验条件下，p s 有一 对峰形良好的氧化还原峰。d n a 的加入对其氧化还原式量电位e 的影响 不大，但随d n a 浓度的增大，峰电流i p 下降，其中氧化峰的下降值i p a 与d n a 的浓度在一定范围内( 0 5 0 8 0 0 r a g l ) 呈线性关系。此外，本 文还对p s 与d n a 相互作用的机理进行了初步探讨，认为二者主要以静 电作用力结合。 关键词茜素红，酸性铬兰k ，酚藏花红，d n a ，牛血清白蛋白，十二烷基 ，、7 硫酸钠，分光光度法，平衡透析法，i 循环伏安法，裸银电极少舀 摘要 s t u d i e sa b o u tt h ei n t e r a c t i o n s b e t w e e nt h e a n a l y t i c a lr e a g e n t s a n d t h eb i o m a c r o m o l e c u l e s a b s t r a c t a l i z a r i nr e d ( a r ) a n da c i dc h r o m eb l u ek ( a c b k ) a r e s u p p o s e d a sp r o b e s o fp r o t e i n p h a n o s a f r a n i n eo s ) i ss u p p o s e da sp r o b eo fn u c l e i ca c i d a l lo ft h e m a r ea n a l y t i c a lr e a g e n t s n l ei n t e r a c t i o n sb e t w e e nt h ea n a l y t i c a lr e a g e n t sa n dt h e b i o m a c r o m o l e c u l e sh a v eb e e ns t u d i e d i ti ss h o w e dt h a t ： 1 t h ei n t e r a c t i o no fa l i z a r i nr e d ( a r ) a n db o v i n es e r u ma l b u m i n ( b s a ) i s i n v e s t i g a t e d i nt h eb u f f e rs o l u t i o n sa t p h 2 6 8 i t i sc o n s i d e r e dt h a tt h e t o m b i n a t i o no fa ra n db s ai sd u et ot h ee l e c l r o s t a t i cf o r c ea n dt h e p h a s e d i s t r i b u t i o nm o d e l ”i st h ep r o p e rd e s c r i p t i o no ft h ei n t e r a c t i o nb e l t w e e na r a n db s a a c c o r d i n gt ot h ea s s u m p t i o no f p e s a v e n t o ，t h ed i s t r i b u t i o nr a t i od o fa r b e t w e e n p r o t e i np h a s e a n d “w a t e rp h a s e ”i so b t a i n e d i ti ss t u d i e d t h a tt h ee f f e c t i o no fs o d i u m d o d e c y ls u l p h a t e ( s d s ) a t d i f i e r e n t c o n c e n t r a t i o n so nt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e na ra n db s ai sm a i n l yd u et ot h e e l e c t r o s t a t i cf o r c ea n d h y d r o p h o b i cf o r c eb yd i s c u s s i n gt h er e l a t ep a r a m e t e r s s u c ha s a ，d ，k ，a g a h a n d a s 2 s p e c t r o p h o t o m e t r i cc h a r a c t e r so f t h e i n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ep r o t e i na n da c i d c h r o m eb l u ek ( a c b k ) h a v eb e e ns t u d i e di na c i d i ca n db a s i cs o l u t i o n s t h e i n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fb s aa n da c b ki nd i f f e r e n tm i c r o e n v i r o n m e n t b e c a u s eo ft h ec h a n g eo f p h v a l u e sh a sb e e nd i s c u s s e d t e n t a t i v e l y p r o t e i nc a n c o m b i n ew i ma c b kt or e d u c et h ea b s o r p t i v i t yo f a c b ka tp h3 7 8a n dm a k e t h e m a xr e d u c e3 l n mb u tm a k et h e m “r e d u c e2 0 n ma tp h 9 9 1 t h e i n ；t e r a c t i o ni ss t u d i e db yu s i n gt w om e t h o d s ，s p e c t r o p h o t o m e l t i cm e t h o da n d e q u i l i b r i u md i a l y s i sm e t h o d ，w i t hr e l e v a n tc o m p a r i s o n ，ni sp r o v e dt h a tt h e i n t e r a c t i o ni si na c c o r dw i t hm o d e l o f p h a s ed i s t r i b u t i o n m o r e o v e r , a c c o r d m g t ot h ec a l c u l a t i o n so fa ，d ，k ，aq h ，asa n dt h ec o n f i g u r a t i o n so f a c b ka n db s aa td i f f e r e n tp hc o n d i t i o n s ，t h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nb s aa n d a ri sm a i n l yd u et ot h ee l e c t r o s t a t i cf o r c ea tp h 3 7 8a n d h y d r o p h o b i c f o r c ea t p h 9 9 1 摘要 3 t h ei n t e r a c t i o no fp h e n o s a f r a n i n ef p s ) w i t hd n ah a sb e e ns t u d i e di nt h e b r i t t o n - r o b i n s o n ( b r ) b u f f e r s o l u t i o n a t p h 7 ，0 0 o nt h en a k e ds i l v e r e l e c t r o d eb yc y c l i cv o l t a m m e t r y a d d i n gd n a i n t ot h ep ss o l u t i o nr e s u l t e di n t h ed e c r e a s eo f p e a kc u r r e n tw i t h o u tt h ec h a n g eo fe q u i l i b r i u mp e a kp o t e n t i a l ， w h i c hi n d i c a t e dt h a ta l le l e c t r o c h e m i c a li n a c t i v ec o m p l e xw a sf o r m e d t h e i p a o fp sd e c r e a s e d p r o p o r t i o n a l l y t ot h ed n ac o n c e n t r a t i o n sf i o mo 5 0t o 8 0 0 m e g l m o r e o v e r , t h ei n t e r a c t i o nm e c h a n i s mo fp sa n dd n ah a sb e e n d i s c u s s e d t e n t a t i v e l y k e y w o r d sa l i z a r i nr e d ，a c i dc h r o m eb l u e k ，p h e n o s a f i a n i n e ，d n a ，b o v i n es e r u m a l b u m i n ，s d s ，s p e c t r o p h o t o m e t r i cm e t h o d ，e q u i l i b r i u md i a l y s i sm e t h o d ， c y c l i cv o l t a m m e t r y , n a k e ds i l v e re l e c t r o d e 第一章绪论 第一章绪论 1 前言 生命过程是自然界无数物理和化学过程长期演变进化的结果，生命现象 是比化学运动更高级的运动，但它的基础仍然是物理变化和化学变化。随 着人类对自身以及赖以生存的自然环境的关注，通过物理、化学方法对生命 行为的探讨亦日益广泛、深刻。 生物大分子包括：蛋白质、核酸、脂、酶和多糖等，其中蛋白质、核酸 分子是主要的生物大分子。 蛋白质( p r o t e i n ) 是生物体中最重要的太分子之一 1 。它在重量上占细 胞干重的一半以上。肌肉、皮肤、血液和毛发等的重要成分是蛋白质，蛋白 质几乎参与所有的生命活动过程。酶是生物体代谢变化的催化剂，其主要成 分就是蛋白质。还有许多激素和细胞生长分裂的调节因子是蛋白质，细胞表 面和内部各种受体也是蛋白质。 核酸是生物体的重要组成物质，它包含了遗传信息，并参与这些信息在 细胞内的表达，从而促成并控制代谢过程。由于核酸介入了生物的生长、发 育及繁殖等生命活动，且与致癌等生理病变密切相关，所以研究核酸，尤其 是d n a 的结构与功能的关系，有利于人们从分子水平上了解生命现象的本 质。 体系环境能影响溶液中分子表面基团的带电状态和基团极性，以此改变 分子的水合能力；此外，体系环境还影响蛋白质等生物大分子的空间构象， 从而对生物大分子与其探针的结合产生深远的影响。我们研究和利用体系环 境这一因素，可以控制生物大分子与探针的结合，提高分析的灵敏度和选择 性。 分析试剂是一类重要的生物大分子探针，近十多年来相关的研究十分活 跃。为了更好地研究二者的相互作用，并进一步认识生物大分子的结构、性 质和行为，我们有必要先从总体上了解生物大分子探针的研究现状。 2 蛋白质探针 2 1 金属离子 第一章绪论 2 1 1 单一金属离子 单一金属离子中以稀土离子作为探针的研究较多。杨频介绍了t b ( i i i ) 、 e u ( h i ) 与蛋白类生物大分子的相互作用 2 。利用t b ( u 0 、e u ( i i i ) 荧光敏 化现象进行计量化学方面的研究，测定t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 与生物大分子结合 的解离常数，确定竞争离子与生物大分子结合的解离常数；以t b ( i i i ) 、e u ( i l i ) 作为荧光探针，研究生物大分子中金属离子结合部位的结构类型，如 用e u ( i i i ) 的7 f o 一5 d o 跃迁为探针研究生物大分子的多重金属离子结合部 位。张保林研究t b ( i i i ) 、e u ( i i i ) 与b s a 相互作用的机理表明，其结合 部位分布在b s a 的亲水性表面，参与配位的基团只有谷氨酸，天冬氨酸残 基侧链中的1 3 、y c o o - 辛n 肽键中的c = o 基 3 。李晓晶在模拟生理条件下研 究了稀土离子与b s a 的相互作用，表明t b ( i i i ) 与b s a 形成1 ：2 配合物； 用平衡透析法确定p r ( i ) 与b s a 存在两类结合【4 】。稀土金属离子除了与 b s a 相互作用之外，还与其它蛋白质作用。杨斌盛用紫外差谱研究指出e u 3 + 可占据人血清脱铁转换蛋白的2 个金属离子结合部位，优先占据脱铁转换蛋 白的c 端结合部位【5 1 ；研究e u 3 + 、t b 3 + 与伴清蛋白的相互作用，指出镧系金 属离子会优先占据伴清蛋白n 端的结合部位嘲。梁宏用平衡透析法研究了l a ( 1 l i ) 与b s a 或h s a 的结合平衡，通过s c a t e h a r d 图分析可知，l a ( i i i ) 在h s a 上有两个强结合部位和8 个弱结合部位，l a ( i i i ) 在b s a 上有两个 强结合部位和6 个弱结合部位，其中一个强结合部位的配位原子可能全部是 氧原子j 。 除稀土金属离子作为蛋白质的探针外，人们还研究了其它金属离子作为 蛋白质的探针。周永洽、梁宏进行了一系列的研究工作，他们指出：n i ( i i ) - h s a 和n i ( ) b s a 的1 ：l 体系内均各有2 个强偶合的金属中心，其电荷 转移谱带( l m c t ) 是一种新型减色效应，且这一效应符合生色基跃迁偶极 矩间的偶极一偶极相互作用机理f 8 】；c u ( ) b s a 和n i ( i i ) - b s a 配合物结 构随b s a 浓度增大，以五配位的四方锥构型转变成四配位的四方平面构型 吲，而在p h 4 0 5 3 时，n i ( i i ) b s a 只存在四方平面构型，c u ( i i ) 、n i ( i i ) 结合位置均在白蛋白的n 端的肽段上，与a s p l 的c t - n h 2 、h i q 的咪唑基n 及两个去质子肽氮配位，c u ( i i ) 与h s a 的第五结合基团是a s p 。的羧基【l o 】， 2 第一章绪论 并证实b s a 中的a s p l 的羧基氧参与了同c u ( i i ) 、n i ( i i ) 的配位【。3 ：n i 2 + 与h s a 、b s a 相互作用可诱导h s a 或b s a 发生从对n i 2 + 有较弱亲和力至较 强亲和力构象态的缓慢变化 “l ：在生理条件下，钴离子与h s a 、或与b s a 的1 ：1 配合物可能有包含羧基和a n h 2 基的结合配位环境，取六配位的八面 体构型时，金属离子以c o ( i i ) 和c o ( i i i ) 两种氧化态存在【1 2 j ，当达到等 离子点时l ：l 的c o ( i i ) h s a 配合物时，其金属离子中心随着浓度增大发 生“八面体一四方锥一四方平面”的构型变化【1 3 ；周永洽等研究h s a 、b s a 中锌离子中心，认为配位数近似为4 ，可能与4 个氮原子配位，基本排除胱 氨酸硫原子参与配位的可能性【1 4 】；研究f e ( 1 i d 、c u ( ) 与h s a 的相互作 用，指出i c e ( 1 i d 对荧光猝灭是由于f e ( i i i ) 与h a s 的色氨酸吲】垛氮结合， 形成了不发荧光的复合物所致，人血清白蛋白与c u ( i i ) 有两类结合部位【1 5 1 。 张朝平指出a g ( i ) c u ( ) 离子与b s a 分子中的端基氨基酸残基上的氮 和羧基上的氧均可能存在直接的键合作用，形成灵敏度很高的棕黄色络合物 【1 6 】。黄仲贤根据软硬酸碱理论，认为z n ( ) 、c d ( ) 、h g ( i i ) 、c u ( i i ) 、 a g ( i ) 等易与含有大量巯基的金属硫蛋白结合，这一功能可能会在生物体 的重金属解毒方面起一定的作用【1 7 1 。安方在研究氧钒( i v ) 离子与g 肌动 蛋白的相互作用后指出，在一个g _ 肌动蛋白分子上有一个、v 0 2 + 的强结合部 位和几个弱结合位点，他认为v 0 2 + 与m f + 相似，可能结合在强结合部位上 i 】8 1 。 2 1 2 金属配合物 某些染料分子能与金属离子配位而形成金属配合物型蛋白质探针。染料 分子如邻苯二酚紫、邻苯三酚红、铬天青s 、铬天青b 等以邻近的基团与金 属离子配位，所形成的金属配合物借助染料分子中大都具有的带负电荷的基 团，可与蛋白质依靠静电作用力结合，或者利用染料分子中的疏水基团以疏 水作用力与蛋白质结合，从而产生光学性质方面的变化，以此来测定蛋白质 的浓度以及探讨蛋白质的高级结构。 f u j a t a y 研究了h s a 与邻磺酸基苯基荧光酮一u ( v i ) 酉2 合物的相互作用， 根据热动力学参数指出两者的相互作用是疏水反应1 1 9 】。f u j a t ay 亦利用3 ，4 ， 5 ，6 四氯羧基苯基荧光酮m n ( i i ) 配合物与蛋白质发生相互作用，发现金 第一章绪论 属配合物产生可观的红移，籍此来测定蛋白质，其灵敏度和选择性取决于染 料、金属离子本身，而蛋白质与金属离子配合物的反应能力与蛋白质的等电 点有关【2 0 】。 魏永巨研究了蛋白质与f e ( i i i ) 铬天青s 配合物的相互作用，发现f e ( i i i ) 铬天青s 的吸收光谱中的最大吸收波长为5 7 0 r i m ，而蛋白质与f e ( i i i ) 铬天青s 三元配合物的最大吸收峰波长为6 6 0 r i m ，认为这是因为b s a 侧链 上的质子化氨基与f e ( i ) 铬天青s 配合物的磺酸基、羧基发生了静电作 用而缔合，使配合物i i 电子体系j i 一跃迁的能级间隔显著变小，所以引起 了较大幅度的红移【2 ”。 2 2 有机分子 纵观有机分子型蛋白质探针的研究工作，从有机分子型蛋白质探针的用 途来看，人们对药物和分析试剂研究得较多。 2 2 i 药物 以药物作为蛋白质探针的研究，常采用荧光分析法。常规的荧光分析方 法由于受到拉曼峰和散射光的背景干扰，往往影响到检测的灵敏度和选择 性，因此，一些新的荧光分析方法和分析技术应运而生，如稀土荧光探针法、 光化学荧光法、电解荧光法、激光荧光法、导数荧光法、时间分辨荧光法、 全反射三维荧光法、偏振荧光光谱法、荧光免疫测定法、荧光反应速率法、 荧光成像技术、荧光光纤传感器、能量转移荧光分析、分子有序组合体微环 境荧光分析技术等 z 2 1 。 血清白蛋白是血浆中含量最丰富的重要载体蛋白，它能和许多内源性和 外源性物质结合，如人血清白蛋白( h a s ) 是人体中的药物输送蛋白，药物 进入血液后，药物先要和血清白蛋白结合，然后再被运输到身体的各个部位 2 3 1 。张保林指出牛血清白蛋白( b s a ) 和人血清白蛋白( h a s ) 的空间结构 由三个结构域组成，每个结构域由两个亚结构域以槽口相对的方式形成圆筒 状结构，几乎所有的疏水性氨基酸残基都分布在圆筒的内部，构成疏水腔口4 1 。 c a r t e rkc 等也指出在h s a 分子上存在着疏水部位，蛋白质与药物之间可通 过疏水作用在这类部位结合【2 5 】。 抗菌素药物与白蛋白的相互作用研究较热。抗菌素药物主要有：( 1 ) 喹 第一章绪论 诺酮类抗菌素。马贵斌指出喹诺酮类药物氟畈酸的分子内有氨基与羧基，可 能与赖氨酸的氨基以共价键结合脚1 。通过计算热力学参数认为吡哌酸、氟哌 酸主要依靠疏水作用力与i g g 发生作用，而与h a s 则主要依靠静电引力发生 作用2 ”。他还研究了喹诺酮类药物氟哌酸、萘啶酸对h s a 的荧光猝灭现象， 认为药物与氨基酸残基的相互作用使酪氨酸与色氨酸间发生能量转移，两者 靠疏水作用力结台删。徐岩利用保泰松、布洛芬作为血清自蛋白分子标定结 合位置的标记物来研究萘啶酸在b s a 上的结合位置【2 9 1 。张晓威认为环丙沙 星与b s a 的相互作用为单一的动态猝灭过程p o ；商志才研究了该反应的同 步荧光光谱后，认为环丙沙星使色氨酸所处环境的疏水性增加，使b s a 的 构象发生变化，两者之间的结合力主要是疏水作用力p ”。( 2 ) 蒽环抗菌素。 卢继新研究了阿霉素与b s a 、h s a 的相互作用，指出阿霉素与b s a 之间的 作用力主要为疏水作用力，而与h s a 之间的作用力主要为范德华力，血液 中的金属离子与药物竞争与h a s 的结合，从而减少了自蛋白与药物的结合 力，缩短了药物在血浆中的储留时间，增加了药物的最大作用强度【3 2 j 。 此外，还有一些其它药物作为蛋白质探针。治疗心血管病的药物盐酸川 芎嗪可能结合在b s a 的疏水腔中【3 3 】。降血压药物多沙唑嗪与b s a 的相互作 用力主要为疏水作用力1 3 4 。水杨酸在p h = 9 ，5 0 的含k c ! 的硼砂缓冲溶液中 与h s a 发生了结台，形成了不发射荧光的复合物【3 5 l 。 2 2 2 分析试剂 b r a d f o r d 在用考马斯亮蓝g 2 5 0 ( c b b g - 2 5 0 ) 测定蛋白质时发现，不同 蛋白质对c b b g 2 5 0 的响应程度不同，这种现象就促使人们想进一步弄清楚 有机小分子与蛋白质的反应机理，并对实验现象作出合理的解释m j 。 染料是常见的分析试剂，蛋白质的临床分析中研究最多、应用最广、操 作较为简便的分子光谱法就是基于染料与蛋白质的相互作用而建立起来的。 该法通常为测定白蛋白的方法，这是因为自蛋白含有碱性氨基酸残基，在酸 性条件下带正电荷，具有与阴离子染料结合的能力，而白蛋白以外的其它蛋 白缺乏这种性质。在对自蛋白，尤其是血清白蛋白和尿蛋白的测定中，染料 结合法更为有效。 常见的染料有以下几种：( 1 ) 酸性三苯甲烷类染料，如溴甲酚绿、溴甲 第一章绪论 酚紫、考马斯亮蓝( 3 - 2 5 0 、铬天青s “j ( i i i ) ；( 2 ) 酸性贴吨类染料，如邻 苯三酚红一钼( v i ) ，藻红等；( 3 ) 羟基蒽醌类化合物，如茜素红等；( 4 ) 变 色酸双偶氮化合物，如偶氮肿i i i 等【3 ”。 以酸性三苯甲烷系染料作为分析试剂来探讨与蛋白质的相互作用的研 究较多。s a i ty 研究了十种有关铬天青s 的染料与h s a 的相互作用，发现含 羧基的染料与h s a 作用后其吸收光谱发生红移，但荧光强度无变化，而铬 花青r 与h s a 作用后的荧光强度增强，作者认为这与羧基的离子化以及染 料的平面性有判3 8 】。慈云祥利用铬花青r 与h s a 相互作用形成配合物，体 系荧光激发峰为3 0 8 n m ，荧光发射峰为4 2 3 n m ，最佳酸度为4 4 ，其荧光配 合物配合比( h a s ：e c r ) 为1 ：4 1 3 9 。马春琪进一步研究了蛋白质与铬天青s 的相互作用，认为铬天青s 优先与b s a 上的色氨酸结合，然后与酪氨酸结 合，在结合模型上，认为在b s a 等电点前两者以静电引力相结合，等电点 后以疏水作用力结合，反应符合相分配模型1 4 0 。s a k a i 等在研究了p h 为l 的条件下酸性绿3 与蛋白质的相互作用后，指出两者形成了一种有色配合物， 最大吸收峰在6 4 0 n m ，他用分光光度法测定了尿蛋白，同时还研究了酸性绿 5 、酸性绿9 、食用绿3 、酸性蓝9 。但结果都不如酸性绿3 准确1 4 ”。s u z u k i y 研究了溴甲酚绿与蛋白质的相互作用，指出可利用6 2 0 n m 处的最太吸收峰来 分析血清中的全部蛋白质，加入甲醇，可提高血清球蛋白与溴甲酚绿的反应 活性f 4 2 】。魏永巨研究溴甲酚绿与b s a 的相互作用，指出在酸性环境中b s a 由于肽链上的氨基酸残基质子化而带净正电荷，可与带负电荷形式的溴甲酚 绿以静电引力结合，此外两者之间也有一定的疏水作用力【4 3 1 。百里酚蓝在 p m 4 环境下，其吸收光谱在4 3 0 n m 、5 4 5 n m 处有两个吸收峰，与b s a 相互 、 作用后，4 4 0 n m 处峰的吸光度增加，5 4 5 n m 处的吸光度减小，在蛋白质测定 方面该法优于溴甲酚绿法洲。w e n zi 研究荧光素与蛋白质的相互作用，发 现体系的荧光激发波长为3 6 5 n m 、发射波长为4 0 0 m 【4 5 。朱铿研究了荧光黄 与蛋白质的相互作用，指出两者主要借疏水作用结合，荧光黄在水相和蛋白 质微相中进行分配，反应符合相分配模型。 偶氮类染料也可作为蛋白质探针【4 6 。p e s a v e n t o 研究了在p h l 4 范围内 b s a 可与1 四唑基偶氮2 羟基萘3 ，6 一二磺酸发生相互作用，其吸收光谱发 6 第一章绪论 生了变化【4 7 1 。李娜指出在p h = 4 的环境中蛋白质全部质子化，并且分子呈伸 展状态，与含有磺酸基的偶氮胂i i i 依靠静电引力结合，偶氮肿i i i 与b s a 的 结合符合s c a t h a r d 模型 4 9 l 。朱铿认为偶氮磺( i i d 、溴偶氮磺( i i i ) 与b s a 的结合是静电引力与疏水作用力共同作用的结果【4 9 ；他还研究了p h 2 4 的 条件下酸性铬蓝k 与b s a 的相互作用，发现在b s a 上有两类不同的结合部 位【5 0 】。 此外，还有其它一些分析试剂作为蛋白质探针。冯喜增研究了吖啶橙与 b s a 之间的相互作用，指出这是单一的静态猝灭过程【s 1 。庄稼研究了羟基蒽 醌类化合物茜素红s 与b s a 之间的相互作用实验中固定茜素红s ( a r s ) 的浓度，改变体系中缓冲溶液的酸度，观察相应的吸收光谱变化，发现随着 溶液p h 值的升高，4 2 0 n m 处的吸收峰逐渐红移，其等吸收波长为 4 3 【5 2 l ，说明a r s 的羟基逐步离解。当固定a r s 的浓度及缓冲溶液的 p h 值，逐渐增大b s a 的浓度，4 2 0 r i m 处的吸收峰逐渐减小，而5 3 0 n m 处的 吸收峰值渐渐升高，这表明，己质子化的蛋白质与阴离子染料发生了结合反 应，这种结合明显与a r s 在水溶液中的质子化又不完全相同，因为a r s b s a 的等吸收波长( 为4 5 8 n m ) 与试剂的等吸收波长相比，红移了2 8 r i m 。此外， 他们认为该结合符合相分配模型。m i l l e r 研究了荧光探针k 3 5 与血清白蛋白 的相互作用，认为k 3 5 对血清白蛋白上的i 类、i i 类结合位置标记物很灵敏， k 3 5 在水溶液中呈微弱甚至无荧光，在加入血清白蛋白后荧光大增口”。李东 辉用荧光各向异性法研究四磺基铝酞菁与b s a 的相互作用，发现体系的荧 光激发波长为3 5 8 n m ，发射波长为6 8 5 n m ，认为b s a 对光敏剂四磺基铝酞 菁有较强的结合能力，提出血清白蛋白对酞菁类光敏剂可起到储存和转运的 作用酬。郭荣等以分子有序组合体中的胶束模拟体系中的球形蛋白，研究了 生物染色剂亚甲蓝( m b ) 和牛血清白蛋白( b s a ) 在模拟体系中的相互作 用，结果表明，在s d s 胶束体系中，m b 主要以单体形式与b s a 相结合， m b 与b s a 的相互作用主要为静电作用和氢键作用【5 5 1 。魏永巨等在研究b s a 与甲基橙( m o ) 的结合反应时发现，随n a c i 浓度的增大，染色反应灵敏度 降低，这是由于共存离子对染料和蛋白质电荷的屏蔽作用以及阴离子对蛋白 质正电荷部位的竞争结合作用所致，并推断，即使在实验中不加入n a c i ，由 第一章绪论 于加入缓冲溶液而引入的离子也会对m o 与b s a 的结合反应产生很大的影 响【56 1 。 3 核酸探针 3 1 金属离子 3 1 1 单一金属离子 金属离子型核酸探针中以稀土金属离子较多，杨频 2 1 、慈云祥【5 7 、y a n g jh 【5 8 l 、黄承志【5 9 】、m c n gjx 【删等人用稀土金属离子作为d n a 、r n a 的荧光 探针进行了这方面的研究。 其次，还有一些非稀土金属离子作为核酸的探针。l c c o m t es 等人研究 了m f + 、吡哌酸与d n a 之间的相互作用，指出m 9 2 + 通过d n a 的磷酸二酯 基和氨基对与其发生作用陋”。花尔并研究了a 型的均聚双链核糖核酸p o l y ( i ：c ) 与c d 2 + 的相互作用，认为c d ：+ 的存在对双股螺旋起到了稳定作用，这 可能和c d 2 + 与磷酸根之间的静电作用有关6 2 】。 3 1 2 金属配合物 金属离子配合物，尤其是过渡金属配合物是一类重要的核酸探针。这类 化合物主要有两种作用：( 1 ) 设计成人工核酸酶，从而实现对d n a 链上某 些位点的特异性剪切。( 2 ) 设计成性能优良的抗肿瘤药物或抗病毒药剂。 具有四面体结构的铜配合物k 5 1 、八面体结构的过渡金属( 如r u 、r h 、 c o 等) 配合物与d n a 相互作用的研究一直受到人们的关注。许多r u 配合 物具有发光性能，且热力学稳定性好，成为一种有效的光物理和光化学探针 【“矧。 r o d r i g u e z 等利用循环伏安法和电化学发光方法研究了 o s ( b p y ) 3 ”与 小牛胸腺d n a 之间的作用，发现其氧化形式 o s ( b p y ) 3 2 + 与d n a 的作用 很必要强烈【6 8 】。t h o r p 等则对 r u ( b p y ) 3 2 + 电催化氧化d n a 的机理及其溶 剂效应等进行了详细的研究 6 9 - 7 ”，我国在这方面也有涉猎。l i 等利用旋转圆 盘电极，研究了金电极上 c o ( p h e n ) 2 t a t p 与d n a 的作用，并根据扩散控 制和电化学控制下得到的各种参数，对它们的作用模式进行了讨谢硎。 利用金属配合物来识别核酸分子并研究二者的电荷转移也是研究的热点 之一【7 3 - 7 4 。d n a 双螺旋结构可看作是在磷酸根骨架下由许多具有丰富电子的 8 第一章绪论 杂环层层堆积而形成的大7 c 电子体系，这个体系给电荷转移提供了方便 7 5 - 7 6 1 ， 即d n a 碱基对的层层堆积形成了电荷转移的通道。过渡金属( r u 、o s 、r h 、 n i 、c o 等) 与一些平面配体( 如邻二氮菲、2 ，2 i 联吡啶等) 形成的配合物可 用于讨论与核酸的相互作用，并研究电荷转移情况f 7 7 。8 0 】。这类大的平面配体 的芳香环很容易与d n a 的大兀体系形成牢固的缔合物，其缔合常数往往大于 1 0 7 m o l 。 s i - 8 4 】。这些配合物同时还具有独特的光物理性质，当用可见光激发 时，它们容易实现金属离子一配体问的电荷转移，使它们电子激发态转移到配 体上 睁1 0 2 。虽然在有机溶剂中这些金属配合物具有良好的发光性能，但在水 溶液中却很容易由于杂氮菲上的氮原子与水溶液之间的质子传递而导致荧光 猝灭i 州，但d n a 的大7 【电子体系可以使这种猝灭得以幸免。因此利用其发 光强度可以描述金属配合物周围环境的疏水特性 8 5 - 8 6 】，并且很容易实现它们 与d n a 之间的平衡常数、反应自由能、反应熵、键合位及d n a 的结构特征 等许多参数的测定 s t 】。 3 2 有机分子 3 2 1 药物 研究药物分子与核酸的相互作用，可了解药物的药理和毒性。药物分子 的药理作用涉及的是药物小分子( 主体) 对生物大分子( 客体) 特定部位的 识别作用以及对整个大分子构象产生的影响，研究二者的相互作用情况是开 发出合理、高效的药物的基础。 一些多环芳香族小分子物质，分子体积小，并具有一定的平面性，他们 可以嵌入到d n a 分子双螺旋结构的碱基对中。具有电化学活性的药物小分 子可以作为研究电极表面d n a 分子杂交与否的探针，用于观察与d n a 碱基 对的嵌入作用。 结构复杂的药物分子对核酸分子特殊位点的识别是多个功能基团共同作 用的结果。多个动能基团的同时出现，可能会使原来单个基团对核酸的识别 性质发生改变，这增加了新药设计的难度，而从了解、模拟天然分子的结构 出发，可以在很大程度上提高药物分子设计的准确度，因此对天然抗菌素主 体分子识别核酸的研究在药物分子设计中占有一席之地。( 1 ) 含有蒽醌环的 抗菌素。亚德里亚霉素( d x o r u b i c i n , d x b ) 及其类似物对小鼠的b 1 6 黑素 9 第一章绪论 瘤的t c 值( 服药组与对照组的生命延长个体数量的比值) 可达1 2 5 【踮】。具有 平面结构的蒽醌基团对d n a 的优先识别位点是螺旋小沟中的g p c c p g 序 列。通过对蒽醌基团的修饰，可降低对细胞的毒性，但对d n a 的识别能力并 不降低。( 2 ) 糖蛋白抗菌素。博来霉素( b l e o m y c i n ，b l m ) 是一种研究较多 的糖蛋白抗菌素，它对d n a 分子的识别以沟内结合为主。b l m 分子可分为 c 端( d n a 识别区) 、n - 端( d n a 断裂区) 和糖残基区三部分1 8 9 。n 端螯 合金属离子后，b l m 断裂d n a 的能力增强，且由原来的对d n a 富含a t 片 段的优先识别变为对富含g c 片段的优先识别唧l 。若对b l m 各区进行修饰， 可获得对d n a 分子有更高识别能力的主体分子，且使利用手性识别d n a 成 为可能【9 “。( 3 ) 含有多烯炔( e n e d i y n e ，e d ) 基团的天然抗菌素。这类抗菌 素包括n e o c a r z i n o s t a i n ( n c s ) 、d y n e m i c i n ( d y n ) 、e s p e r a m i c i n s ( e s p ) 等 岍】。e d 分子包括d n a 识别区、生物活性区( 多烯炔环) 、活性激发区三部 分。识别区决定了主体分子对d n a 识别能力的特异性。如n c s 对碱基识别 的优先位点为胸腺嘧啶( t ) ，而d y n 的则是d n a 螺旋小沟中的嘌呤碱1 8 8 。 e d 菌素在激发基团作用下，多烯炔环发生b e r g m a n 芳环化，产生的双自由基 可与d n a 发生反应。主体分子作用点周围的因素( 空间位阻、自由基的猝 灭等) 对e d 药效的影响很大。 抗癌药物也有较多的研究。刘盛料叫等人进行了石墨电极上d n a 与米 托葸醌( m x ) 嵌入作用的电化学研究，发现具有电化学活性的平面分子米托 葸醌( m x ) 能嵌入到d n a 分子的双螺旋结构中。m a e d a 等人利用d n a 与 米帕林( g u i n a c r i n e ) 之间的相互作用，提出了一种离子通道机制，在d n a 修饰的金电极上，由于d n a 磷酸基的负电性，与f e ( c n ) 6 4 f e ( c n ) 6 4 f e ( c n ) 6 的电荷之间发生静电排斥，使得其峰电流减小，但加入米帕林 以后，f e ( c n ) 6 4 - 、f e ( c n ) 6 3 。的峰电流明显增加叫1 。w a r i n g 研究了修 饰d n a 的问题，即一些抗癌药物与d n a 的作用，结合电化学方法，可以为 药物的体外筛选提供一种很好的方法【9 5 】。 3 2 2 分析试剂 染料是最常见的分析试剂，它与核酸的相互作用成为核酸研究中较为重 要的课题。由于核酸分子有末端磷酸，并且许多连接核苷上具有较低p k 值 1 0 第一章绪论 ( p k = 1 5 ) 的磷酸残基，当溶液的p h 值高于4 时，这些磷酸残基将全部解 离，使核酸呈多阴离子状态，因此具有与某些阳离子染料结合的能力 9 。染 料结合法测定核酸具有简便、快速、灵敏、准确的特点，但蛋白质对体系的 测定干扰严重，若有蛋白质存在，需采取适当的方法预先除去 9 7 。 y a r m o l u ksm 合成了系列单次甲基花青染料，并以此作为探针研究了与 具有天然活性的核酸的相互作用，发现花青3 、花青6 与核酸作用，荧光强 度增大到3 5 0 。1 5 5 0 倍，而花青4 与核酸作用，有极大的s t o k e s 位移( 1 5 4 n m ) ， 他指出合成含亚甲基氧苯并噻唑残基的花青染料有可能成为用于研究与核酸 相互作用的新型染料【9 8 1 。赵发琼等用循环伏安法、分光光度法和交流阻抗等 方法，研究了具有电活性的染料亚甲蓝( m b ) 与d n a 的相互作用胂j 。研究 表明，阴离子、阳离子和非离子表面活性剂均可通过疏水和静电作用与固定 在电极表面的d n a 分子结合来改变电极表面d n a 的状态，进而影响电活性 小分子m b 的电化学行为。其中非离子表面活性剂与d n a 的结合较弱，它 主要通过改变溶液的性质( 如粘度、极性和介电常数等) 影响d n a 的构象， 从而导致m b 电化学参数的微弱变化。表面活性剂疏水链的长短及极性头基 的大小也会对作用过程有一定的影响，郑洪合成了一种新型红外阴离子染料， 并对其水溶液及阳离子表面活性剂c t a b 存在下的荧光光谱进行了研究1 1 ”】。 结果表明，低浓度的c t a b 与该染料形成的离子缔合物而使阴离子染料的荧 光强度降低，当c t a b 的浓度进一步加大时，其胶束的预聚集促使该染料形 成非荧光二聚体，导致荧光急剧猝灭。当c t a b 浓度大于临界浓度时，染料 二聚体解离，染料单体增溶于胶团中形成高量子产率的荧光体且最大发射波 红移。该染料在c t a b 的分子形成胶柬前的预聚集过程中所形成的弱荧光二 聚体可作为双螺旋d n a 的荧光探针。 此外还有其它的分析试剂作为核酸探针。b h a t t a c h a r g a 等利用含蒽基的荧 光探针研究表面活性剂与d n a 的相互作用，指出阳离子型表面活性剂和赫 可以诱导d n a 构象转变，使得结合在d n a 上的荧光探针被释放出来，而且 表面活性剂的加入会导致d n a 热熔温度的升高【1 0 2 。z h uqz 研究了 p h = 3 4 - 4 0 条件下h y p o c r e l l i na 与核酸的相互作用，发现二者的相互作用会 使体系的荧光强度增强 伸2 1 。 第一章绪论 4 展望 综上所述，人们对于生物大分子及其探针的研究，己取得很大的成果， 但也有许多需