（发酵工程专业论文）非水相脂肪酶催化合成糖酯的研究.pdf

天津科技大学硕士论文 摘要 本文根据非水相酶学的理论，对有机相和无溶剂体系中脂肪酶催化合成糖 酯进行了研究。 通过对不同来源的5 种脂肪酶分解橄榄油和合成脂肪酸酯的比较，选出了 合成脂肪酸酯活力较高的3 种脂肪酶，通过比较不同介质中这3 种脂肪酶的合 成活力后，得出这三种酶在有机相中活力最高，从操作稳定性角度出发，选出 催化酯合成效果最好的脂肪酶c a l 。 通过对c a l 脂肪酶分别在8 种不同的有机溶剂中催化合成蔗糖月桂酸酯的 研究，得出适于酶促合成糖酯反应的最佳溶剂为叔丁醇，用量为5 m l 。同时对 如温度、底物摩尔比、p h 值、加酶量、初始水活度、分子筛添加量、摇床转速 等进行了研究，得出最佳反应条件为：4 5 、糖酸摩尔比1 ：3 、p i - 7 5 、加酶 量5 0 m g 、初始水活度o 7 5 、分子筛1g 、转速1 5 0 r m i n ，反应3 2 h 后月桂酸转 化率达6 9 。 通过向无溶剂体系中添加不同的水合盐离子对，控制酶促反应过程中的水 含量，得出n a 4 p z 0 7 ( 1 0 o ) h i o 效果最好，用量为o 6 2 6 8 9 底物。同时研究了 其他反应条件，结果如下：温度5 0 。c 、底物摩尔比1 ：5 ( 糖酸) 、初始水活度 o 7 5 、p h 7 5 、加酶量2 0 0 m g 、转速2 0 0 r r a i n ，反应3 2 h 月桂酸转化率达3 7 2 。 通过薄层层析和高效液相色谱对反应产物进行了分析，初步定性为蔗糖月 桂酸单酯，进一步利用红外光谱分析，结果显示：1 7 3 9 c m 。处有强烈吸收峰， 是酯的特征峰，证明为蔗糖酯。 关键词：脂肪酶；糖酯；非水相；酯化 摘要 a b s t r a c t i nt h i s p a p e r ，w ea t t e m p t e dt os y n t h e s i z es u g a re s t e r s o ff a t t ya c i d s u s i n g i m m o b i l i z e dl i p a s ei no r g a n i cs o l v e n t sa n ds o l v e n t f r e es y s t e mm e d i a ，a c c o r d i n gt o n o n a q u e o u se n z y m o l o g y c o m p a r e d t h ea c t i v i t i e so f5s o r t so f l i p a s e sf r o md i f f e r e n ts o u r c ei ns y n t h e s i s o f f a t t ya c i de s t e r sa n dh y d r o l y s i so f o l i v eo i l ，3s o r t so f l i p a s e sa r eb e t t e r c o m p a r e d t h e s t a b i l i t y a n dt h ea c t i v i t i e so f3s o r t so fl i p a s e si nd i f f e r e n t m e d i a , o r g a n i c s o l v e n t sa n dc a l l i p a s ea r e b e s t u s i n gc a ll i p a s e ，s u c r o s e l a u r a t ee s t e r sw e r es y n t h e s i z e di nt h e8s o r t so f d i f f e r e n t s o l v e n t s ，t h e b e s ts o l v e n tw a s t e r t b u t a n o l ，d o s a g e o fs o l v e n t5m 1 t e m p e r a t u r e ，m o l a rr a t i oo f s u g a r t oa c i d ，p h ，i n i t i a lw a t e r a c t i v i t y ，d o s a g eo f l i p a s e ， m o l e c u l a rs i e v ea n dr o t a t i o ns p e e dw e r ei n v e s t i g a t e d ，t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa s f o l l o w s ：4 5 、s u g a r t oa c i d1 ：3 、p h 7 5 、i n i t i a lw a t e ra c t i v i t y0 7 5 、d o s a g eo f l i p a s e 5 0 m g 、1g m o l e c u l a rs i e v e 、r o t a t i o n s p e e d 15 0 r m i n ，a f t e rr e a c t i o nf o r3 2 h c o n v e r s i o no f l a u f i cc a nr e a c h6 9 t h r o u g ha d d i n gd i f f e r e n ts a l th y d r a t ep a i r st or e a c t i o nt oc o n t r o lw a t e rc o n t e n t i n s o l v e n t f r e e s y s t e m ，c a ll i p a s e c a r lm a i n t a i n h i g h e ra c t i v i t y , d o s a g e o f n a 4 p 2 0 7 ( 10 0 ) h 2 0i s0 6 1 2 6 8 9s u b s t r a t e s e l s er e a c t i o nc o n d k i o n sw e r ea l s o s t u d i e s ，a s f o l l o w s ：5 0 。c 、s u g a r t oa c i d1 ：5 、p h 7 5 、i n i t i a l w a t e r a c t i v i t y o 7 5 、d o s a g e o f l i p a s e2 0 0 m g 、r o t a t i o ns p e e d2 0 0 r m i n ，a f t e rr e a c t i o nf o r3 2 h ，c o n v e r s i o no fl a u r i c c a nr e a c h6 9 r e a c t i o np r o d u c t sw e r eq u a l i t a t i v e l y a n a l y z e dt h r o u g ht l ca n dh p l c ；w e p r e l i m i n a r yc o n s i d e ri t s u c r o s em o n o l a u r a t e ，w ei a e n t i f yi t b yi rf a r t h e r ，r e s u l t s s h o wt h a tt h e r ei sas t r o n ga b s o r bp e a ki n17 3 9 一c n lp l a c et h a ti ti sa c h a r a c t e rd e a k o f e s t e r s ，i tp r o v e ds u c r o s ee s t e r s k e yw o r d s ：l i p a s e ；s u g a r e s t e r s ；n o n a q u e o u sm e d i a ；e s t e r i f t c a t i o n i i 丕竖型垄盔堂婴生堂垡丝苎一 1 、前言 1 1 生物催化及脂肪酶的应用 生物催化( b i o c a t a l y s i s ) 是指利用酶或有机体( 细胞、细胞器等) 作为催化剂实 现化学转化的过程，又称生物转化( b i o t r a n s f o r m a t i o n ) 。酶是由活细胞产：生的， 其主要成分为蛋白质，是各种生物化学反应的生物催化剂，具有很高的催化效 率。酶可降低反应活化能，以加快反应速率。酶的催化作用受温度、酶浓度、 d h 值、激活剂、酶抑制剂等条件的影响。由于酶催化所具有的优点，促进了生 物催化剂应用领域的快速发展。酶工程是基于生物技术学科的发展而开发的应 用技术，利用生物催化剂酶的催化特性，解决酶在医药、化工、轻工、食品、 能源和环境工程方面的应用技术1 2 j 。酶工程将在生物技术的发展中，逐步融 合或取代某些领域，发挥越来越重要的作用。 脂肪酶( 1 i p a s e ，e c 3 ，1 1 3 ，甘油酯水解酶) 是分解脂肪的酶，它是一类特殊的 酯键水解酶，永解发生的部位是油脂的酯键。脂肪酶的另一个重要特征是他们 只能在异相系统，即在油( 或脂) 一水的界面上作用，对均匀分散的或水溶性底物不 作用，因此，脂肪酶也可以说是专门在异相系统，或水不溶系统的油( 脂) 水界 面上水鹪酯的酶。由于微生物脂肪酶种类多，具有比动植物酶广的作用p h 、作 用温度范围以及对底物的专一性类型，又便于进行工业生产和获得高纯度制剂， 再加上微生物脂肪酶在酶理论研究及实际应用中的重要性，他们在研究和应用 上的进展相当迅速。 表1 1 几种典型的商业化脂肪酶【3 】 脂肪酶来源生物技术应用供应商 c a n d i d a r u g o s a c d n d i d aa n t a r c t i c a a b t h e r m o m y c e sl a n u g i n o s u s r h i z o m u o o rm i e h e i b u r h o l d e r i ac e p a c i a p s e u d o m o n a s a l e a l i g e n e s p s e u d o m o n a sm e n d o c i n a c h r o m o h a c t e r i u mv & c o s u m 有机合成：。m 。a 。n h o 。, b i m i ，o 。f a l t 。a k l d y 。s ，t 8 g , 。8 。o ：e y h m r 。i n ，g s e f i g 。 有机合成b o e h r i n g e rm a n n h e i m ，n o v on o r d is k 洗涤剂添加剂n o v on o r d is k ，b o e h r i n g e rm a n n h e i m 食品加工 n o v on o r d i s k ，b i o c a t a l y s t a a m a n o 有机合成a m a n o ，f l u k a ，g o e h r ib n g e rm a n n h e i m 洗涤剂添加剂g e n e n c o r 洗涤剂添加剂g e n e n o c o r 有机合成a s a h i ，b i o c a t l y s t s 1 前自 1 2 非水介质中船肪酶催化研究进展 1 2 1 非水介质酶学的一般概况 j 9 8 4 年美国k l i b a n o v ，a m 。1 4 在s c i e n c e 上发表了篇关于酶在有机介质 中催化条件和特点的综述。他们在仅含微量水的有机介质( m i c r o a q u e o u sm e d i a ) 中成功地利用酶促反应合成了酯、肽、手性醇等许多有机化合物。他明确指出， 只要条件合适，酶可以在非生物体系的疏水介质中催化天然或非天然的疏水性 底物和产物的转化，酶不仅可以在水与有机溶剂互溶体系，也可以在水与有机 溶剂组成的双液相体系，甚至在仅含微量水或几乎无水的有机溶剂或无溶剂体 系中表现出催化活性。这无疑是对酶只能在水溶液中起作用这一传统酶学思想 的一个挑战。通常把仅含微量水或几乎无水的有机溶剂或无溶剂中进行的酶催 化反应理解为宏观上的非水相，而微观上是微水相反应1 5 】【6 】【7 】。 在非水介质中，由于酶处于种与水极不相同的环境，不可避免地导致酶 存在状态与酶结构的改变，在水相中建立起来的酶反应动力学及反应机制都不 能直接应用于非水介质中。用于酶催化的非水介质主要包括： ( 1 ) 水有机溶剂两相体系 水一有机溶剂两褶体系( b i p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指出水褶和非极 性有机溶剂相组成的分相反应体系，酶溶解于水相中，底物和产物溶解于有机 相中。有机相一般为亲脂的溶剂，如烷烃、醚和氯代烷烃等，这样可使酶与有 机溶剂在空间上相分离，以保证酶处在有利的水环境中，而不直接与有机溶剂 相接触。水一有机溶剂两相体系己成功用于强疏水性底物如甾体、脂类和烯烃类 的生物转化，在两相体系中已成功地运用微生物催化烯烃不对称环氧化，珊瑚 诺卡氏菌( n o c a r d i ac o r a l l i n a ) 生物转化烯烃产生的环氧化物及时转移到有机相 中，可使环氧化物对微生物的毒性降到最低程度【s i 。 ( 2 ) 水不互溶有机溶剂单相体系 单相有机溶剂体系( m o n o p h a s i co r g a n i cs o l u t i o n ) 是指用水不互溶的育机溶 剂驳代所有的溶剂水( 9 8 ) ，形成固相酶分散在有机溶剂中的单相体系。酶处 于这种体系中，其表面必须有残余的结构水，才能保证酶的催化活性。般有 机溶剂中含有小于2 的微量水。常用的水不互溶性有机溶剂有烷烃类、醚、 芳香族化合物、卤代烃等，它们的l g p 较大。固定化酶在有机溶刻中具有催化 活性是酶的一项重要特性，在过去十多年的研究中，已证明这种体系是可行、 可靠和多用途的p j 。 ( 3 ) 水互溶有机溶剂单相体系 单相水一有机溶剂体系( m o n o p h a s i ca q u e o u s o r g a n i cs o l u t i o n ) 是指由水和与 水互溶的有机溶剂组成的反应体系，酶、底物、产物均能溶解于该体系中。常 用的有机溶剂有二甲基亚砜( d m s o ) 、二甲基甲酰胺( d m e ) 、四氢呋喃( t h f ) 、 丙酮和低级醇等。这种反应体系主要是用于亲脂性底物的生物转化，否则这类 2 天津科技大学硕j j 学位跄文 底物在单一水溶液中溶解度很低，反应速度也很慢。 ( 4 ) 反胶束体系 反胶束体系( r e v e r s em i c e i l e ) 是表面活性剂与少量水存在的有机浴剂体系。 表面活性剂分子是由疏水性尾部和亲水性头部两部分组成，在含水有机溶剂中， 它们的疏水性基团与有机溶剂接触，而亲水性头部形成极性内核，从而组成一 个反相胶束，水分子聚集在反相胶束内核中形成“小水池”，里面容纳了酶分 子，这样酶被限制在含水的微环境中，而底物和产物可以自由进出胶束。反相 胶束中的酶催化反应一般可用于辅酶再生、消旋体拆分、肽和氨基酸合成和高 分子材料合成。e g g e r s 【lo f 运用b j a l i g u a t 3 3 6 一环己醇为反胶束体系，建克了膜 反应器中反相胶束酶法合成色氨酸的生产工艺。 ( 5 ) 超临界流体体系 超临界气体( s u p e r c r i t i c a lg a s e s ) o n 一- - 氧化碳、氟里昂c f 3 h ，烷烃类f 甲烷、 乙烯、丙烷) 或无机化合物( s f 6 ，n 2 0 ) 等部可以作为酶催化亲脂性底物的溶剂 1 l j ， 酶在这些溶剂中就像在亲脂性有机溶剂中一样稳定。超临界气体对多数酶都能 适用，酶催化的酯化、转酯、醇解、水解、羟化和脱氢等反应都可以在此体系 中进行，佴研究最多的是水解酶的催化反应。这种溶剂体系最大的优点是无毒、 低粘度、产物易于分离。超临界气体的粘度介于气体与液体之问，其扩散性比 一般溶剂高1 2 个数量级。超临界气体在临界点附近的温度或压力有一点微小 的变化都会导致底物和产物溶解度的极大变化，因而很容易调控超临界气体中 酶催化反应的特性，如反应速蠢和选择性“。该体系的缺点是需要有能耐受儿 十个兆帕的高压容器，并且减压时易于使酶失活。此外，有些超临界流体如二 氧化碳可能会与酶分子表面的活泼基团发生反应而引起酶活性的礁失。 f 6 ) 固相合成 同相合成即无溶剂体系的反应。该体系不需加入有机溶剂，而是在熔 融状态下直接以底物作为反应介质，酶直接作用于底物。然而，到目前为止， 对于无溶剂体系中酶促反应的研究还报道很少。在食品、医药等行、止，有时对 产物纯度的要求很高，为避免溶剂残留或由溶剂带入有害杂质，可采用无溶剂 体系进行反应。如t c h a t t e r j e e 和d k d b h a t a c h a r y y a l l 3 1 用脂肪酶在无溶剂体系 f 合成萜烯酯，保持了其天然风昧，产品绝对的绿色，这是在溶剂相中反应所 达不到的，而且无溶剂法节省成本、分离纯化步骤相对简单。 非水相酶学的发展极大的促进了酶在有机合成中的应用。到目前为止，根 据报道【l ，能在有机溶剂中催化反应的酶以有十多种，它们是：脂肪酶、酯酶、 蛋白酶、过氧化氢酶、多酚氧化酶、a t p 酶、胆固醇氧化酶、细胞色素氧化酶 等。但研究最多的还是脂肪酶。这些酶的使用的形式也从简单的游离酶到固定 化酶、化学修饰酶、蛋白质工程酶和抗体酶。 脂肪酶在有机相中可催化的酶催反应有：酯合成、酯交换、肽合成、酯聚 前言 合、酰化等f 见表1 ，2 ) 。其中有些己广泛的应用于精细化1 ，医药、食品、新材 料的研制与生产中。目前进行成功地工业生产的有； 脂肪酶催化棕榈油与 硬脂酸的酯交换反应生产可可脂已于1 9 8 9 年在日本工业化生产。 u n i c h e n l ai n t e m a t i o n a l 公司生j 妊做润肤剂用的棕榈酸三酯。 2 - ( 4 氧苯氧) 丙酸的光学拆分已用于百公斤规模的除草剂苯氧丙酸的生产等。 表1 2 脂肪酶在非水相中制备有机物质的重要应用 1 2 2 非水介质中脂肪酶的结构 按照热力学预测，球状蛋白的结构在水溶液中是稳定的，在疏水环境中是 不稳定的。但在有机环境中还能表现出催化活性这一事实说明：酶的结构至少 是酶的活性部位的结构与水溶液中的结构相同，这是研究有机相中酶催化的最 基本问题。众所周知，酶作为蛋白质，它在水溶液中以具有一定构象的三级结 构状念存在。这种结构和构象是酶发挥催化功能所必需的“紧密”( c o m p a c t l 而又有“柔性”( f l e x i b i l i l y ) 懈口”，紧密状态主要取决于蛋白质分子内的氢 键，溶液中水分子与蛋白质分子之间所形成的氢键使蛋白质分子内氢键受到一 定程度的破坏，蛋白质结构变得松散，呈种“开启”( u n l o c k i n g ) 状态。这种 “紧密”和“开启”两种状态处于一种可动的( b r e a t h i n g ) 平衡中，表现出一定 的柔性( 图11 ) 。 灭津科技大学硕士学位论文 蛋白质分子内氢睦 蛋臼质分子间氢建 表示氢键 图i 1蛋白质分子内氢键和分子间氢键 酶分子在水溶液中以其紧密的空间结构和定的柔性发挥催化功能 2 “。 z a k s “刈认为，酶悬浮于含微量水( 小于1 ) 的体系中时，与蛋白质分子形成分子 间氢键的水分子极少，蛋白质分予内氢键起主导作用，导致蛋白质结构变得“刚 硬”( r i g i d i t y ) ，活动的自由度变小，限制了疏水环境下的蛋白质构象向热力学稳 定状态转化，能维持着和水溶液中同样的结构与构象，不变性还能表现出催化 活性。 米赫毛霉( m u c o rm i e h e i ) 脂肪酶是目前对其结构研究比较多和较清楚的真 菌脂肪酶之一。作为一个典型脂肪酶的代表，x 衍射结晶学的研究表明：m u c o ， m i e h e i 脂肪酶的二级结构主链是由九股的b 一中心折叠系统和五股a 一螺旋所组 成。所有的。一f 3 连接都是右手螺旋。这就产生了由在一边f 3 一中心折叠和一系 列“一螺旋以及片断形成的一个复杂的蛋白质结构。总的来说，a 螺旋由于受 到自身与b 一折叠的连接，结果也平行于b 一折叠股的方向。它的催化活性是以 s e t 为主与a s p 、h i s 组成的三分子催化中心进行的。但是这个中心却埋在一段 螺旋结构的“盖子”下面。“盖子”的疏水基团与这个三分子的疏水区域相结 合。这个带有t r p 的盖子是具有两亲性的，t r p 疏水表面与催化中心的疏水区 域相结合，暴露出的另一亲水端则面向外，与水分子以氢键作用连接 2 6 1 。 脂肪酶的催化特性在于：在油水界面上其催化活力最大，这早在19 5 8 年被 s a r d a 和d e s n n e i v “发现。所谓的界面被认为是两个彼此分离的完全不刷的相 差，在分子水平上相当于两个临接的有序分子层，一个比较亲水，一个比较疏 水。界面形成可提高脂肪酶活性的理论解释为：所有脂肪酶的一级结构都相似， 包括重要区域h i s g l y z s e r g l y 和y g l y h i s s e r w g l y ( 这里x 、y 、z 、w 表示基因氨基酸残基) ；活性部位的丝氨酸残基被a 一螺旋掩盖，当脂肪酶与界面 接触时a 一螺旋打开，这导致脂肪酶通过在丝氨酸周围创造一亲电区域，暴露疏 水残基，增加与脂类底物的亲和力并保持催化过程中过渡中间产物稳定。 1 2 3 非水介质中的酶学性质 酶在有机溶剂中能够保持其整体结构及活性中心结构的完整，因此它能发 挥催化功能。但是有机溶剂在很大程度上也会影响酶的稳定性和底物特异性。 前言 出于有机溶剂的存在，改变了疏水相互作用的精细平衡，从而影响到酶的结合 部位，而且有机溶剂也会改变底物存在状态。斟此酶和底物相结合的自由能就 会受到影响，而这些至少会部分地影响到有机溶剂中酶的底物特异性、立体选 择性、区域选择性和化学键选择性等酶学性质。 ( 1 l 热力学稳定性 脂肪酶在许多催化反应中表现出较水要高的稳定性，如脂肪酶在苯中催化 酯交换反应中，酶活力在2 0 一7 0 温度范围内随温度的升高而增加，7 0 。c 条件 下反应七次( 9 6 h 次) 后，仍傈持了6 0 的酶活力，表1 3 列出了一些酶在有机溶 剂中的热力学稳定性凹。k l i b a n o v ”1 认为酶稳定性的提高是由于缺少水，限制 了由水引起的酶分子中的天冬酰胺、谷氨酰胺的脱氨基作用和天冬氨酸处肽键 的水解以及二硫键的破坏，使蛋白质失活全过程难以进行。水是酶失活必须的 因素，酶的热失活需要其本身具有高度的柔性。但在有机溶剂中酶的不溶性使 酶分子构象的刚性大大增强。所以在高温下酶在有机溶剂中也能保持适当的折 叠，热稳定性大为提高的同时活性中心还类似其在水中。 表1 3 非水和水介质中酶的稳定性 天津科技大学硕士学位论义 ( 2 ) 底物特异性( s u b s t r a t es p e c i f i c i t y ) 与水溶液中的酶催化一样，酶在有机溶剂中对底物的化学结构和立体结构 均有严格的选择性。例如青霉脂肪酶在正己烷中催化2 辛醇与不同链长的脂肪 酸进行酯化反应时，该酶对短链脂肪酸具有较强的特异性，这与它催化甘油三 酯水解反应时的脂肪酸特异性相同，但由于酶与底物的结合能取决于酶与底物 复合物的结合能和酶、底物及溶剂相互作用能的差，因此，酶与底物的结合受 到溶剂的影晌。其原因是酶在水溶液中，酶与底物的结合主要是疏水作用，而 在有机溶剂中，底物与酶之间的疏水作用已不重要。酶能够利用它与底物结合 的自由能来加速反应，总的结合能的变化是酶与底物之间的结合能和酶与水分 子之间的结合能的差值。因此介质改变时，酶的底物专一性( k c a t k m ) 和催化效 率会发生改变。另一方面，底物在反应介质与酶活性中心之间分配的变化也是 影响酶的底物专一性及其催化效率的因素之一，而底物和介质的疏水性直接影 响底物在两者之间的分配 2 9 1 。猪胰脂肪酶催化月桂酸与月桂醇的酯合成反应 时，在非极性强的十二烷( 1 9 p = 6 6 ；l g p ，溶剂的极性参数，其中：p 是指某种 溶剂在辛醇和水混合体系中的分配系数) 中酶的催化活性仅是苯( 1 9 p = 2 ) 中酶催 化活性的一半，这是因为疏水性底物在介质与酶活性中心之间的分配比例不同， 十二烷与苯相比，底物更倾向于分配在十二烷中i 3 0 】。 ( 3 ) 化学键选择性( c h e m o s e l e c t i v i t y ) 化学键的选择性也是非水介质中酶催化的一个显著特点。黑曲霉 叫s p e r g i l l u sn i n g e r ) n 旨肪酶催化6 氨基一1 一己醇的酰化反应时，羟基的酰化占绝对 优势，这种选择性与传统的化学催化完全相反。这样就可以在不需基团保护的 情况下合成氨基醇的酯。例如图1 2 中化合物与丁酸三氯化乙酯的酰化反应在 叔丁醇中和在1 ，2 二氯乙烷中的酰化程度不同| ：3 i 】。在假单胞菌属( p s e u d o m d n 日s 印) 脂肪酶的催化下，羟基更容易被酰化。在同样的溶剂中米赫毛霉( m u c o ， m e i h e ) 脂肪酶则更容易使氨基酰化，它对氨基与羟基的选择性差18 倍，并且 酶的化学键选择性与氧键参数有关，m u c o rm e i h e r 脂肪酶催化羟基酰化时形成 氢键的倾向强，而对于氨基酰化则刚好相反。为了实现对酶底物复合物中问体 的进攻，亲核基团应该不易形成氢键，由于羟基基团易于形成氢键，因此不利 于亲核进攻，氨基不易形成氢键，有利于亲核进攻，进行催化反应【3 2 l 。 h 2 n 八吖o h h 图1 2 验证脂肪酶化学键选择性的化合物结构 r 4 l 对映体选择性( e n a n t i o s e l e c t i v i t y ) 酶的立体选择性是指酶识别外消旋化合物中某种构象对映体的能力，这种 选择性是山两种对映体的非对映异构体的自由能差别造成的。有机溶剂中酶对 底物的对映体选择性是随介质的亲( 疏1 水性的变化而发生改变。如在环己烷中 脂肪酶的选择性e 值大于8 ，而在乙氰仅略高于1 。曹淑桂等认为l j “，脂肪酶 的选择性( e 值) 与溶剂的介电篇数、及偶极矩有较好的相关性。溶剂的介电常 数、及偶极矩越大，酶的对映体选择性越差。并用不同溶剂对脂肪酶催化辛酸 与外消旋2 辛醇酯化反应动力学进行了研究，提出“口袋”模型柬解释时映体 选择性，认为脂肪酶内供亲核基团结台的位点，存在大小不同的两个“口袋”。 2 辛醇的r 型异构体以图l3 左边所示的方式与酶结台，其己基占据较大的口 袋，甲基占据较小的口袋。这种结合方式使2 辛醇的羟基能够顺利地进攻酰基 一酶中间体上的羰基。如果s 型异构体以相同方式与酶结合，则其羟基将远离酶 分子上的撰基而使亲核反应无法进行。为了使亲核进攻能顺利进行，s 异构体 必须以图 3 右边所示的方式与酰基酶中间体结合，可以看出己基在结台进小 口袋时遇到较大的空间障碍。因此2 。辛醇的r 型异构体较s 型异构体容易与酶 结合，从而具有较大的反应活性。 图1 3 脂肪酶立体选择性的大小不同的“口袋”学说 ( 5 ) 位置选择性( r e g i o s e l e c t l v i t y ) 有机溶剂中的酶催化还具有位置选择性( r e g i o s e l e c v j l y ) ，即酶能够选择性 地催化底物中某个区域的基团发生反应。k l i b a n o v i ”j 用猪胰脂肪酶在无水吡啶 中催化各种脂肪酸( c 2 ，c 4 ，c 8 ，c 1 2 ) f 匀三氯乙酷与单糖的酯交换反应，实现 了葡萄糖1 位羟基的选择性酰化。当然不同柬源的脂肪酶催化上述反应时，选 择性酰化羟基的位置不同。因此，选择合适的酶，能够实现糖类、二元醇和类 固醇的选择性酰化以制备具有特殊生理活性的糖酯和类固醇酯。目日口对于酶 在非水介质中的位置选择性研究得比较少。r u b i o n 3 5 1 报道了葱头假单胞菌 ( p s e u d o m o n a sc e p a c i a ) 脂肪酶催化图j4 所示的醑交换反应的速率v i 与v 2 晰 、 ，删 尸一 人， 0 4 e ha 一一霪hq 一 蕊。 乒 o m，g弋乏 燕， 墨笙型苎奎竺竺! 竺竺笙苎 一 显著不同，反应的位置选择性因子( k c a t k m ) 1 ( k c a t k m ) 2 与溶剂的疏水性常数 1 0 有较好的相关性。 为了解释这种现象，没想脂肪酶的活性中心附近有一个疏水裂缝，催化过 程中如果底物a 的辛基进入这个疏水口袋，那么丁酰基团就位于催化中心，形 成产物b ，如果丁酰基团位于疏水性口袋中彤成产物c 。由于在疏水介质中，从 热力学分析，辛基基团不易迸入此疏水口袋，因此易生成产物c ，而在亲水性 溶剂中则相反。 h c b h l7 h o 纩、 o 。电，7 o x - 7 c 8 h 1 7 c 反应介质对酶位置选择性的影响 ( 6 ) p h 记忆与p h 忘记 有机溶剂中的酶能够“记忆”它冻于或丙酮沉定前所在缓冲液中的p h 值。 z a k s 【3 6 】等称这种现象为“p h 记忆”( p h i m p 血t i n g ) 。他们在研究脂肪酶催化三 丁酸甘油酯与正庚醇的转酯反应中发现，酶的反应速度与其冻干前水溶液的p h 密切相关，反应的最适p h 接近于水溶液中的最适p h 。他们认为在缓冲液中酶 的解离状态取决于环境因素，而在有机溶剂中不存在发生质子化或去质予化的 条件，当酶分子从水溶液转移到有机溶剂中时，它保持了原有的离子化状态， 环境因素不能改变酶的这种解离状态，或者说酶在缓冲液中所处的p h 状态仍 被保持在有机溶剂中。利用酶的p h 记忆特性可以控制有机相中酶催化的最适 p h 。，众多的研究也表明【3 7 】【3 8 】【3 9 】：有机相中酶最适p h 与水相中酶催化的最适 p h 是一致的。这样在有机溶剂中酶分子表面的必需水，在特定的p h 和离子强 度下，酶分子活性中心周围的基团处于最佳的离子化状态，有利于酶活性的表 现。最近，v a l i v e r t y 例和l o h m e i e r - v o g e 4 1j 分别用缓冲液中磷原予的核磁共振 谱的变化和利用分子探针技术，可以检测酶从缓冲液中冻干或有机溶剂沉淀 后，转入微水有机溶剂中的p h 值。酶可以保持原缓冲液中的p h 的“记忆”， 从而维系原缓冲液中构象。 b a c k w o o d 【4 7 j 在研究有机溶剂中酶的解离状态时，发现存微水有机溶剂中 疏水性的酸或碱与它们相应的盐所组成的混合物，可以作为有机相缓冲液 o r g a n i cp h a s eh 1 f f e r ) ，它们以中性和离子对形式能够充分溶于有机相，而不能 9 翠 队 。 一 炊 前； 进入水或其它极性溶液，这两种存在形式 匀比例控制着有机相中酶的解离状态， 使酶完全忘记( f o r g e t ) 干燥前它所处的水溶液的p h ，即于燥前缓冲液的p h 值对 微水有机溶剂中的酶活性几乎没有什么影响。 f 7 l 系统含水量 在有机溶剂中酶的催化活性与反应系统的含水量密切相关。系统含水量包 括与酶水合的结合水、溶于有机溶剂中的自由水以及固定载体和其它杂质的结 合水。与酶结合的水量是影响酶的活性、稳定性以及专一性的决定因素。要成 功地应用非水介质中的酶催化反应，控制酶结合的水量和水在酶分子中的位置 是关键。在基本无水的有机溶剂中，水对于酶催化活性构象的获得与保持是必 须的。大量的研究表明 4 3 i ：在有机溶剂中，酶的催化活性与反应系统的含水量 有着密切的联系。水直接或间接参与维持蛋白质结构的氢键、疏水作用和范德 华力。a l e k e r y l 4 4 j 研究了3 种不相关的酶在不同的有机溶剂中的酶反应，发现在 溶解度限制范围内，酶活都随着有机溶剂中水含量的增加而提高，且达到最大 酶活所需的水量，疏水溶剂比亲水溶剂少( 见图】5 ) 。 i b ；a ；熏岛；r 影瓣 ( m m i m i n ) ；。f i i 1 0 0 t ； t ， o d o i r j ， ： b c t j a ? “声 警。 图1 5 有机溶剂中酶活性与含水量的关系 a ：酵母醇氧化酶：( a ) 乙醚( b ) 乙酸丁酯( c ) 乙酸乙酯( d ) n - 辛醇( e ) 叔戊醇( 0 2 - - r 酵 b ：蘑茹多酚氧化酶：( a ) l 酸己酯( b ) n 一辛醇( c ) 乙酸已酯( d ) l - 丁醇( e ) 叔戊醇 c ：马肝醇脱氢酶：( a ) 二氯甲烷( b ) 异丙醚( c ) 乙酸j 酯( d ) 乙酸甲酯( e ) 四氢呋喃( f ) 乙腈 r u p l y l j a 和f i n n e y ，j l 用u v 、i r 、n m r 、e s r 、r a m a d s c 等方法 详细研究了溶菌酶在水合过程中，酶活性与水量之间的关系。最适水量是保证 酶的极性部分水和表现活力所必需的“必需水”( e s s e n t i a lw a t e r ) ，是用于维持 活性构象的柔性所必需的。各种酶因其结构不同，维持酶具有活性构象所需的 必须水量也不同i 4 ”。例如：n 一胰凝乳蛋白酶的每个分子需要十个水分子力能活 化。少于或高于其必需水的含量都会造成酶构象的变化，而影响酶的催化活性 4 9 o 对于水在酶分子上的结合过程和结合水量，r u p i e y ，j a 等删详细地研究了 0 天津科技大学坝 学位论文 溶菌酶在水合过程中酶活性与酶含水量间的关系。当结合水量在0 - 7 ( 重量) 范 围时，每一酶分子周围有o 6 0 个水分子，这些水分子大部分在蛋白质侧链，可 离子化残基。即首先是羧基脱质子，其次是氨基质子化。这种状态下蛋白质活 动的自由度非常小，没观察到活性。当含水量在7 - 2 5 ( 重量) 范围时，每个酶 分子周围有6 0 2 2 0 个水分子。含水量在7 左右时，侧链残基离子化后，水分 子在其它极性部位形成簇( c l u s t e r ) ；含水量在2 5 时肽键的n h 被水合，局部 介电常数升高，同时蛋白质分子的活动自由度急剧增大，但蛋白质结构摹本不 变，构象基本相同，酶显示活性；当含水量在2 5 3 8 范围时，每个酶分子周 围有2 2 0 3 0 0 个水分子，肽键羧基为主的极性部位完全水合，酶活性随着含水 量增加而增加。这是因为水和酶分子之间形成多个氢键，水作为分子润滑剂增 大了酶构象的柔性，增加了界面的表面积。然而，太多的水会使酶的活性降低。 当含水量在3 8 以上时，每个酶分子周围有3 0 0 个以卜水分子，整个酶分子f 包 括非极性部位) 被一层单分子水层包围，酶活性是水溶液中的十分之一。其中原 因之一是水分子在活性位点之间形成水束，通过介电屏蔽作用，掩盖了活性位 点的极性；另一个原因是太多的水会使酶积聚成团，导致疏水底物较难进入酶 的活性部位，引起传质阻力。有机溶剂中酶含水量低于最适含水量时酶构象过 于“刚性”而失去催化活性；含水量高于最适水量时，酶结构的柔性过大，酶 的构象将向疏水环境下热力学稳定的状态变化，引起酶结构的改变和失活。只 有在最适水量时蛋白质结构的动力学刚性( k i n e t i cr i g i d i t y ) 哥h 热力学稳定性 ( t h e r m o d y n a m i cs t a b i l i t y ) 之间达到最佳平衡点( 见图1 6 ) ，酶表现出最大活力。 动力学阿叶生热力学不稳定性 图1 6 有机溶剂中酶活性与酶含水量的关系 因此，最适水量是保证酶的极性部位水合，表现活力所必需的。由于水的 高介电性，有机溶剂中少量的必需水能够有效地屏蔽有机溶剂与酶蛋白表面某 点之问的静电相互作用，酶分子构象与结晶状态致，剐与水溶液中酶的结构 类似。只有当溶剂的极性非常强，水的介电能力不足以屏蔽溶剂与酶蛋白分子 酶活性 刖i 之间的静电相互作用，或者溶剂的亲水性大于与水相互作用的蛋白质表面的亲 水性，水脱离蛋白质进入有机溶剂时，酶蛋白分子的结构才会受到溶剂的影响。 当水加入到溶剂酶体系中时，水在溶剂和酶之间分配，与酶紧密键合的结构水 是决定酶活性的关键因素，在有机介质中，只要有少量的水与酶结合，那么酶 就会保持其活性。但是有时在脱水的酶体系中也观察到了酶的活性，这可能是 由于伸展的蛋白质充当了少量天然酶的稳定剂而产生的结果。 系统的含水量与溶剂的亲水性、疏水性密切相关。如假单胞菌属 ( p s e u d o m o n a ss p ) 脂肪酶在环己烷中最适加水量为o 4 ，而在甲苯中为o 8 。 为了排除溶剂对含水量的影响1 。h a i l i n g l 4 1 提出用a w 水活度( t h e r m o d y n a m i c a c t l v 时o f w a t e r ) 来代替水浓度来描述水对有机相中酶促反应的影响，从而解决 了这一问题。水活度( a w ) 定义为系统中水的逸度与纯水逸度之比，水的逸度在 理想条件下用水的蒸气压代替，因此a w 可以用体系中的水的蒸气压与同样条 件下纯水蒸气压之比表示。 a w 叫wx w x w = 水的摩尔比，v 。：活度系数 对于极性小的溶剂，不依赖于组成，因此a w 可以确定为在相同温度下 的水的摩尔比。对极性大的溶剂，活度系数t 。可以用溶剂水混台物的气液平 衡方法计算。 a w - y 。p d p oy w = a 。i x 。 y 。：气相中的水的摩尔比例， p t ：总的压力 p n ：相同温度下水的饱和蒸气压 x 。：液相中水的摩尔比例 h a i l i n g 5 0 l 在物理化学所定义的标准状态下得出以下规律： 利用水活度 能准确描述水解反应的平衡位置，只要水活度不变，反应平衡就基本保持不变。 当 有机相中 酶的最适水活度r 即酶活力达到最高时的水活度) 与酶量无关，而对于系统含水 量则随酶量的增加而增加； 在含有不同底物的各种有机溶剂中，酶的最适 水活度都在0 5 5 左右，即酶最适水活度与溶剂的极性、底物的性质及浓度无关。 水活度可由反应体系中水的蒸气压除以在相同条件下纯水的蒸气压而测得，在 不同有机溶剂中获得恒定的水活度至少可通过如下三种方式； 用个饱和赫水溶液分别预平衡底物溶液和酶制剂。 c 2 ，向反应体系中直接加一种水合盐。 向每一溶剂中加入不同量的水。 灭津科技人学硕。t + 学位论文 反应系统的含水量除了影响酶的催化活性以外，还影响着酶的选择性。 k i t a g u i c h i 等口l 】报道了在系统含水量在很窄的范围内( o 一0 1 2 5 v v ) 时，随着水量 的增加，酶的催化活性和对应选择性都有所提高，他们认为是由于水量的微小 增加使刚性很强的酶构象增加了柔韧性和可移动性，从而提高了酶的催化活力 和对应选择性。 ( 8 ) 有机溶剂 酶活性和溶剂属性的定量关系模型 有机溶剂对酶催化活力的影响是非水酶学所要阐明的另一重要因素，溶剂 不但直接或间接地影响酶的活力和稳定性，而且也能够改变酶的特异性( 包括底 物特异性、立体选择性、前手性选择性等) 。通常有机溶剂通过与水、酶、底物 和产物的相互作用来影响酶的这些性质( 见图1 7 ) 。 ；痧甍 水化怠 ”j j 。 0 霉渺；。 ? 。警；嚣犀 r 。 - 厩锄 削 彬；渤d ； 擞嫩，k 图1 7 脂肪酶在有机溶剂中的反应体系 l a a n e 等1 52 j 用溶剂的极性参数l g p ( p 为某溶剂在正辛醇和水双体体系中的 分配系数) 描述了溶剂的极性与酶活性的关系。 有机溶剂对酶催化活性的影响主要有两种方式：一是溶剂夺取维持酶活性 构象的必需水，从而导致酶的失活1 5 3 。l a a n e 等酬用溶剂的极性参数l g p 描述 了溶剂极性与酶催化活性的关系，并总结出：酶在l g p 2 的极性溶剂中催化活 性较低；2 l g p 4 的非极性溶剂中催化活力 较高。另一种影响的方式是溶剂通过对底物或产物扩散的影响而控制酶活性 5 5 1o 大量实验表明：通过改变溶剂可以调节酶的活性和选择性，改变酶的动力 学特征和稳定性。k l i b a a a o v l 5 6 l 首次称这种方法为：溶剂工程( s o l v e n t e n g i n e e r i n g ) ， 并认为有可能成为蛋白质工程的种辅助方法，在生物催化剂的开发和利用中 起着重要的作用。 c 2 ，溶剂对底物和产物的影响 溶剂能直接或间接地与底物和产物相互作用，影响酶的活力。溶剂能改变 酶分子必需水层中底物或产物的浓度，而底物必须渗入必需水层，产物必须移 o 卿 爨 _ 一嘛 前言 出此水层，才能使反应进行下去。y a n g 等【57 j 对这种影响进行了较为深入的研 究，他们发现溶剂对底物和产物的影响主要体现在底物和产物的溶剂化上，这 科t 溶剂化作用会直接影响到反应的动力学和热力学平衡。例如脂肪酶在十二烷 ( 1 9 p = 6 6 ) 中的活力只达到苯( 1 9 p = f 2 ) 中酶活力的5 75 ，酶在2 o l g p 3 5 范围 内的溶