（生物化学与分子生物学专业论文）内切葡聚糖酶基因克隆、表达、纯化及免疫学鉴定.pdf

独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得沈阳农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 研究生签名： 导师签名： 习蝴 f 队切寸 时f n - j ：y 再局陟日 时间：z 皿秒7 年f 月纱日 关于论文知识产权和使用授权的说明 本论文的知识产权为沈阳农业大学所有。本人完全了解沈阳农业大学有关保留、使 用学位论文的规定，即：学校有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意沈阳农业大学可 以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的内容。 学位论文中的所有内容不经沈阳农业大学授权不得以任何方式擅自对外发表。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生躲可移崛 帆7 年厶，乡日 导师签名：f 也切7 习 时f - j ：如弄，月口日 沈阳农业大学硕士学位论文 摘要 本试验采用r t - p c r 法以黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 菌株总r n a 为模扳克隆内切 葡聚糖酶基因e d n a 序列。p c r 产物直接测序表明e g b 基因全长9 9 9 b p ，g - c 碱基含 量为5 3 9 5 ，以a t g 为起始密码子，t g a 为终止密码子，编码3 3 2 个氨基酸组成的多 肽，与参考内切葡聚糖酶e n g l 基因( g e n e b a n kn o a f 3 3 1 5 1 8 ) 核苷酸同源性为9 8 ， 氨基酸同源性为9 9 0 , 6 。氨基酸序列分析表明该内切葡聚糖酶属于糖基水解酶家族5 。 将该基因扩增至p m d l 9 - ts i m p l e 载体并转化至大肠杆菌j m 1 0 9 中，构建重组质粒 c t b 2 5 6 t - l 和c t b 2 5 6 - t - 2 。其中c t b 2 5 6 t _ 2p c r 扩增出的目的基因成熟编码区与 p c r 产物直接测序结果完全一致。 在上述试验的基础上，通过限制性内切酶e c o r ，仞玩加院成了原核表达载体构建： 将经双酶切鉴定正确的原核融合表达质粒p e t - 2 8 a e g - b 在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中充 分表达；并利用原核表达载体p e t - 2 8 a 上n 端融合组氨酸标签，将e g b 基因表达的目 的蛋白经n i ”- c h e l a t i n g 和h e p a r i n 树脂逐级分离纯化；纯化后的目的蛋白作抗原免疫家 兔，制备多克隆抗体，w e s t e r n b l o t t i n g 检测确定e g b 基因表达的重组蛋白和黑曲霉 ( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 菌株天然蛋白具有相同的抗原显色反应。试验结果如下；( 1 ) k i ：p c r 法克隆的e g - b 基因与已发表黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 编码内切葡聚耱酶e n g l 基因 ( g e n e b a n kn o a f 3 3 1 5 1 8 ) 核苷酸同源性为9 8 ，氨基酸同源性为9 9 ：( 2 ) e g - b 基 因表达的目的蛋白相对分子质量为3 6 5 2 k d a ，蛋白的等电点为4 1 1 5 ；( 3 ) e g b 基因 表达的目的蛋白经多级分离纯化后酶比活力为1 8 0 8 u m g ；( 4 ) e g b 基因表达的重组 蛋白和黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 菌株天然蛋白具有相同的抗原显色反应。以上试验结 果可以得到同一个结论，即编码黑曲霉( a s p e r g i l l u s n i g e r ) 菌株的内切葡聚糖酶基因在 大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) 中得到成功表达。 关键词：内切葡聚糖酶基因；克隆：表达；免疫学鉴定 摘要 a b s t r a c t a g e n ee n c o d i n ge n d o b e t a - 1 ，4 一g l u e a u s ew a sc l o n e df r o mae d n as e q u e n c et h r o u g h r t - p c rb yt h et e m p l a t eo f a s p e r g i l l u s 辔 t o t a lr n a 、们t hs p e c i a lp r i m e r sa n dd e s i g n a t e d a se g b t h ep c r p r o d u c tw a ss e q u e n c e dd i r e c t l y t h eg e n ea n a l y s i ss u g g e s t e dt h a tt h i s f i a g m e n tw a sa b o u t9 9 9 b pi nf u l ll e n g t hc o n t a i n i n gae o m p l e t i v ep r o t e i nr e a d i n gf r a m ew i t h 觚i m t i a t i o na = r 0c o d o na n dat e r m i n a t i o nt g ac o d o na tt h et w oe n d s w h i c he n c o d e da m a t u r ep e p t i d ec o n s i s t i n go f3 3 2a m i n oa c i d s t h eg + cc o n t e n tw a s5 3 9 5 t h en u c l e o t i d e a n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c ee n c o d e db ye g - bs h o w e d9 8 a n d9 9 0h o m o l o g yw i t h t h ee n g lg e n e t h ee g bp r o t e i ns h o w e dh i g hh o m o l o g yw i t ht h ee n z y m e sw h i c h b e l o n gt o t h eg l y c o s y lh y d r o l a s ef a m i l y5 t h ep c r p r o d u c tw a sc l o n e di n t op m d 1 9ts i m p l ev e c t o r , t h e nw a si n t r o d u c c di n t oi s o l a t ee s c h e r i c h i ac o i ij m l 0 9a n dc o n s t r u c t e dr e c o m b i n a n t p l a s m i dc t b 2 5 6 - t - ia n dc t b 2 5 6 - 1 二2 i n t e g r a t e d e g - bt i o mr e c o m b i n a t i o np l a s m i d c t b 2 5 6 - t - 2b ye l c c t r o p h o r c s i sa f k rr e s t r i c t i o ne n z y m e sd i g e s t i o nw a si d e n t i c a l 、析t l lt h e e g - bg e n ew eg o te a r l i e r b a s e do nw h a tm e n t i o n e da b o v e , t h eg e n ee n c o d i n ge n d o - b e t a - 1 4 一g l u c a n s ea e e o m p l i s h e - dp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nc o n s t r u c t i o nb ye c o rl a n dm 以盔r e s t r i c t i o ne n z y m e s ；t h ef u s i o n e x p r e s s i o np l a s m i dp e t - 2 8 a e g bw h i c hw a si d e n t i f i e dr i g h tt r a n s f o r m e dw i t he c o l ij m l 0 9 ；d e p e n do nt h e6 x h i st a go f p e t - 2 8 a , t h ee g - bp r o t e i nw a sp u r i f i e db yn i - c h e l a t i n ga n dh e p - a r i nc h r o m a t o g r a p h y ；t h ep u r i f i e dp r o t e i nw a sa l s ou s e dt oi m m u n o l i z er a b b i tt op r e p a r ep o l y - t l o n a ls e r u m ，a n dt h i sp r o t e i nh a st h es a n l ea n t i g e n i c i t ya st h en a t i v ep r o t e i no f a s p e r g i l l u sn i - g e tt h r o u g hw e s t e r nb l o t t i n g t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a t ：( 1 ) t h eh o m o g e n e i t y o f t h - en u c l e o t i d ea n dd e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c eo f e g bb yr ，r - p c rt oe n g lg e n ee n c o d e di n a s p e r g i l l u sn i g e rp u b l i s h e db yj i o n g ，h e tm ( 2 0 0 1 ) s h o w e d9 8 a n d9 9 ，r e s p e c t i v e l y ；( 2 ) t h - e m o l e c u l a r w e i g h t o f t h e p r o t e i n w 雒3 6 5 2 k d a ，t h e p l w a 9 4 1 1 5 ；( 3 ) t h e e n z y m a t i ca c t i v i t y o f t h ep r o t e i ne x p r e s s e db yc l o n e de g - bw a s18 0 8 u r a gb yc h r o m a t o g r a p h y ；( 4 ) t h ep r o t e i ne x p r e s s e db ye g bh a st h es a l n ea n t i g e n i e i t ya st h en a t m r a lp r o t e i n o n ec o n c l u s i o nc o u l db e a r r i v e df r o ma l lt h ee x p e r i m e n tr e s u l t s ，t h a ti s ：t h ee g - bg c n eh a sb e e ne x p r e s s e ds u c e s s f u l l y i n e c 白疗b l 2 l ( d e 3 ) k e y w o r d s ：e n d o - b e t a - i ，4 - g l u c a n s e ；c l o n e ；e x p r e s s i o n ；i m m u n o l o g ya s s a y 2 沈阳农业大学硕士学位论文 刖磊 纤维素是公认的地球上分布最广、含量最丰富的可再生有机物质资源，利用纤维素 酶实现纤维素转化与利用对解决目前世界能源危机、环境污染等问题具有非常重要的意 义( c o w a r d k e l l yg c ta l ，2 0 0 3 ) 。但目前纤维素酶催化效率较低、生产成本较高，因此影 响了纤维素酶工业化生产和广泛应用( k n a u fm ，m o n i n g z a m a nm ，2 0 0 4 ) 。随着分子生物 学技术发展和应用，通过基因工程等手段探讨纤维素酶遗传特性及酶解作用机制，进而 为构建高效降解纤维素工程菌开辟了新途径。本文综述纤维素酶基因克隆、转录调控以 及表达体系等方面的最新进展。 1 纤维素酶系组成及其水解机制 纤维索酶是能够降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称。一般一个纤维素酶中有十 几到几十个组分，这些组分可分为三类( m e s s n e rr ，k u b i e e k - p r a n zem ，1 9 9 1 ) ：内切葡聚 糖酶( e n d o - i ，4 - 3 - d g h c a n a s e 或l ，4 - 1 ) - d 一u c 百u - e a n o h y d r o l a s o 或c x 酶，e c 3 2 1 4 ， 简称e g ) 、外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶( e x o - l ，4 - p - d g l u c a n a s e s 或c e l l o b i o h y d r a l a s e s 或c l 酶，e c 3 2 1 9 ，简称c b h ) 和b 一葡萄糖苷酶( 1 3 - g l u c o s i d a s e s ，e c 3 2 1 ，2 l ，简称b g ) 。 目前普遍认为纤维素酶水解纤维素是纤维素酶三种组分协同作用的结果( s e h u l e i n m 2 0 0 0 ) ：e g 负责进攻纤维素的非结晶区，随机水解b 1 ，4 - 糖苷建，将长链纤维素分 子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素；c b h 负责从纤维素线状分子非还 原性末端水解切下纤维二糖单位，许多试验表明，c b h 水解纤维素时对纤维素链方向有 选择性，有的c b h 从纤维素链非还原性末端水解释放纤维二糖，有的c b h 从纤维素链 还原末端水解释放纤维二糖( a l d b ase ta l ，1 9 9 5 ) ；b g 则将纤维二糖水解为葡萄糖，使纤 维素完全降解，目前对b o 在纤维素水解过程中的作用已有相当详细的了解 ( b h a t , k m ，a n db h a l s ，1 9 9 7 ) 。由于纤维素多样性及高度复杂性，纤维素水解具体细节还 没有完全研究清楚( w o l f g a n gd ew i l s o ns c t ，1 9 9 9 ) ，纤维素酶系降解机理还有待进一步 研究和探讨。 2 纤维素酶的性质 自然界中细菌、真菌、某些无脊椎动物、甚至是高等植物中都存在纤维素酶，但各 来源分子量差异较大。真菌的内切酶和外切酶分子量一般在2 0 0 k d a - 6 0 0 k d a l 闻( a k i b a se t a l 1 9 9 5 ) ，而细菌的内切酶分子量却高出1 0 0 0 k d a ，i ) - 葡萄糖萤酶分子量较大，均 前言 超过6 0 0 k d a ，有的甚至超过4 0 0 k d a ( h e r i s s a tb e ta l ，1 9 9 8 ) 。一般而言，纤维素酶为胞 外酶，真菌纤维素酶最适p h 大多偏酸性p h 4 - 5 ，近几年，人们陆续筛选到一些嗜碱和耐 碱的细菌，如b a c i l l u s 属中的某些种( i t os 1 9 9 7 ；s i n g hj ，b a t r a n e t a l ，2 0 0 4 ) 。纤维素酶最 适温度范围为4 0 - 6 0 ，但某些b 一葡萄糖营酶最适温度稍离5 5 - - 7 0 c ( y a n t r , l i n c l i 9 9 7 ) 。纤维素酶各组分热稳定性差别较大，一般内切酶热稳定较好，外切酶和b - 葡 萄糖苷酶热稳性较差( r a s m dm h e ta l ，1 9 9 7 ) 。 纤维素酶各个组分大多是糖蛋白，含糖比例很不相同：塘和蛋白质之间结合方式亦 不同：有的通过共价连接，有的是可解离的复合物。a l d b a 等( a k i b a se t a l 。1 9 9 5 ) 用葡 萄糖苷酶处理黑曲霉，表明糖链长度不同的纤维素酶，分子量也不同。可见纤维素酶糖基 化程度不同造成了纤维素酶的多态性( b e r a - m a i l l e tc ，2 0 0 0 ) 。 3 纤维素酶基因克隆 迄今为止约克隆了4 5 0 个组分的纤维素酶基因，主要是内切葡聚糖酶基因和b 一葡萄 糖苷酶基因。纤维素酶合成调节、纤维素酶降解机制和新酶分子构建等研究可通过基因 克隆来实现。 3 1 细菌纤维素酶基因克隆 细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶。由于酶的耐热性在生产中具有实用意 义，所以耐热细菌成为研究热点。k i m 等( 2 0 0 0 ) 克隆了a q u i f e xa e o l i c u sv f 5 编码e g 的 e e l 8 基因，在e c o l ix l i b l u e 中成功表达。碱性纤维素酶是纤维素全酶的一个组分一羧 甲基纤维素酶，属于内切葡聚蓿酶，不含外切葡聚糖酶和b 葡萄糖苷酶，在造纸和洗涤 剂工业中有很大应用潜力，是研究热点之一，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属。o z a k i 等( 1 9 9 5 ) 将b a c i l l u ss p k s m 一6 3 5 产生的原始碱性纤维素酶两末端氨基酸去除，仅保留 a l a 2 2 8 到l e u 5 8 4 的3 5 7 个氨基酸进行克隆表达，纯化后的酶具有更高的比活力 s o l i n g e n 等( 2 0 0 1 ) 从链霉菌中克隆纤维素酶基因，并皿克隆到芽孢杆菌上，于枯草芽孢 杆菌中表达，发酵糨酶液显示较广的p h 适应性。s a n e h e z 等( 1 9 9 6 ) 将嗜碱性芽孢杆菌 n 1 8 6 - 1 纤维素酶基因克隆到p e t - 1 2 a 并在大肠杆菌b l 2 1 中进行表达，获得3 9 k d a 的 蛋白，在p i l l 2 下保持i h 后仍保留7 0 以上的活力，具有极强的耐碱性。n a k a m u r a ( 1 9 9 1 ) 很早就从中性和碱性纤维素酶基因中构建许多嵌合重组纤维素酶，发现一些嵌合酶在碱 性区p h 活性依赖于c 末端区域。结果表明碱性纤维素酶基因保守氨基酸残基主要集中 在同源氨基酸序列c 端区。 4 沈阳农业大学硕士学位论文 3 2 真菌纤维素酶基因克隆 纤维素酶基因克隆研究主要集中在酸性纤维素酶方面。世界纤维素酶市场中2 0 纤 维素酶是来自真菌中木霉属和曲霉属，木霉属是最广泛的纤维素酶产生菌( b h a t m k 2 0 0 0 ) 。由于木霉属真菌能产生大量胞外酸性纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤维 素有较好的酶解活性，近几十年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量研究，其中瑞氏 木霉( t r l c h o d e r m ar e e s e d 纤维素酶基因研究较透彻，克隆了五个编码内切纤维素酶的 基因：e 西l 到e g l 5 ( p e n t i l l a , m e e t a l ，1 9 8 7 ) 、两个编码外切葡聚糖酶的基因：e b h l 和e b h 2 ( c h e n , c m e ta l ，1 9 8 7 ：s h o e m a k e r , s e ta l ，1 9 8 3 ) 、及两个编码1 3 葡萄糖苷酶的基n b g l l 和b 9 1 2 ( b a r n e t t 。c c e ta l ，1 9 9 1 ；t a k a s h i m a , s e ta l ，1 9 9 9 ) ，都在e c o l i 中得到表达，并测定 了这些基因的核苷酸序列。t a k a s h i m a s 等( 1 9 9 9 ) 从里氏木霉中克隆得到的一种新的真 菌b 葡萄糖酶基因b g l 4 和他的类似物b g l 2 ，两者7 3 1 的同源性。有关康宁木霉和绿色木 霉纤维素酶基因研究较少，t h o m a s 等( 1 9 9 8 ) 、w e y 等( 1 9 9 4 ) 利用康宁木霉g - 3 9 高产菌株 克隆了纤维素酶c b hi 基因，并对其序列迸行分析，发现它与里氏木霉c b hi 基因仅在 非编码区有六个碱基的差异，因而可以编码相同的c b hi ；c h e n g 等( 1 9 9 0 ) 、k w o n 等( 1 9 9 9 ) 对绿色木霉h k - 7 5 中编码内切葡聚塘酶e gi 的基因e g ll 进行了克隆和异源表达，发现 这个多肽与里氏木霉e gi 有9 3 8 的同源性。这些研究结果表明( s a l o h e i m om e ta l ，1 9 8 8 ) 木霉属同一种间不同类型纤维素酶基因同源性较低，不同种间同一纤维素酶基因序列具 有相当高的同源性。 3 3 动物内源纤维素酶基因克隆 动物内源纤维素酶分子生物学研究近年来备受关注。最初认为动物自身不含有纤维 素酶，一些动物能消化纤维素的原因：一方面是动物消化系统中存在原生动物，另一方 面其共生的细菌和真菌产生纤维素醛i ( w a t a a a b eh ，t o k u d ag 2 0 0 1 ) 。随着对纤维素酶研究 的深入，w a t a n a b e 等( 1 9 9 8 ) 利用白蚁( r s p e r t a u s ) 内切葡聚糖酶的抗血清对其e d n a 文 库进行免疫筛选，并采用e d n a 末端快速扩增法( r a c e ) 得到白蚁内切葡聚糖酶e d n a ， 证明动物体内存在内源性纤维素酶。到目前为止克隆得到的纤维素酶大多是内切纤维素 酶( s u g i m u r am ，w a t a n b e1 4 , e ta 1 2 0 0 3 ) 。 3 4 植物病原菌纤维素酶基因克隆 纤维素酶广泛存在于植物中已是不争的事实。在植物中。纤维素酶在植物发育( 如 果实成熟、蒂柄脱落等) 不同阶段发挥着水解细胞壁的作用。但植物病原菌纤维素酶对 5 前言 抗病虫害研究具有巨大经济意义，因此成为重要的研究领域。n e l s o n a l t i o w u l 嘴 ( n e l s o n a r n ow u l f f , 2 0 0 6 ) 功表达并纯化t x y l e l l a f a s t i d i o s a 内切纤维素酶x f 8 1 8 基因， 为进一步研究致病机理提供了理论基础。 4 纤维素酶基因合成的调控 细胞水平上研究曲霉和木霉纤维素酶基因合成机制，结果显示( h r m o v z im ，e t a l ，1 9 8 9 ；b a i l e y ，e ta l ，1 9 9 3 ：k u b i c e kcp ，ta l ，1 9 9 3 ；h r m o v t tm ，p e t r , i k o v te ，b i e l ye 1 9 9 1 s a l o h e i m oa ，e ta t , 2 0 0 0 ；a r on ，e ta 1 2 0 0 1 ) 纤维素酶编码基因的表达为转录水平调控。 在t r e e s e i 中，d 葡萄糖抑制纤维素酶基因的表达，原因为碳源代谢产物阻遏蛋白c r e i 抑制纤维素酶基因转录，一些寡糖或纤维二糖( 槐糖) 诱导纤维素酶基因转录。然而 关于纤维素酶编码基因转录机制具体通过哪些因子诱导还不是很清楚。n o e ln m e 等 ( 1 9 9 8 ) 通过定点突变技术在m r _ n a 水平研究转录激活子x l n r 在丝状真菌a s p e r g i l l u s n i g e r 纤维素降解过程中诱导基因表达情况，发现x l n r 在分子水平上调控木聚糖酶和纤 维素酶基因的协同表达，证实了一些木聚糖酶和纤维素酶体系具有进化上相关性的假 设。a l i n d aa h a s p e r 等( 2 0 0 2 ) 从a s p e r g i l l u sn i g e r 中筛选到一个新内切纤维素酶基因 e g j c ，其转录也受x l n r 调控。研究发现该基因产物具有较强的降解木聚糖的生物活性， 这是首次发现纤维素酶具有此功能。 5 纤维素酶基因表达体系研究 大多数克隆的纤维素酶基因能利用自身原有启动子，产生信号肽使表达产物部分或 全部移至e c d 席周质空间，发挥生物活性。但这一体系蛋白表达水平很低，产生的酶多 数不能分泌到胞外，提取也较困难。人们将目光转向了真核表达系统。由于酵母作为一 种传统的工业微生物不产生毒素，产物高度糖基化，经正确加工修饰后可直接将产物分 泌至胞外，且表达水平高，所以酵母表达系统研究较多。如o o d b o l e 等( 1 9 9 9 ) 将z r e e s e ie b b i 在p i c h i a p a s t o r i s 中成功转化并表达。肖壮志等( 2 0 0 1 ) 采用刚果红染色法从t r e e s e i e d n a 文库中筛选至t j e o i i i 基因，转化到酿酒酵母中并成功表达。研究结果显示t r e e s e ie g 在酿酒酵母中表达时，其m r n a 5 端先导序列中可能存在影响该基因表达水平调控序 列。同时( 2 0 0 1 ) 将t r e e s e i 编码的e gi 基因转化到酿酒酵母中，研究发现y - u t r 对e gi 基 因表达具有重要作用。刘北东等( 2 0 0 4 ) 将绿色木霉a s 3 3 7 1 1 编码的e gi 基因转化至酿 酒酵母，采用n o r t h e r n 杂交、刚果红染色和c m c 糖化力法分别对表达产物进行酶活检测， 6 沈阳农业大学硕七学位论文 结果表明c gi 的o r f 为1 3 7 7 b p 编6 q 4 5 9 个氨基酸，该蛋白分泌到胞外发挥生物活性。 h o n g j 等( 2 0 0 1 ) 从黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 中筛选到编码内切葡聚糖酶基因锄gi ，并 将其成功表达至酿酒酵母中，结果表明该酶具有较强地耐高温、抗蛋白酶及表面活性剂 的能力。最近研究报道，甲虫4 i 口w ，础城动物纤维素酶( 2 0 0 5 ) 在昆虫细胞中成功表 达，这为我们深入研究纤维素酶基因表达调控机制提供了新线索。 6 纤维素酶的应用前景 据统计，1 9 9 9 年，世界工业酶的销售量达到1 6 亿美元，而工业酶总供应量的6 0 来 自于欧洲，其余4 0 来自于美国和日本，而且大约7 5 的工业酶是水解酶，其中糖苷水 解酶居第二位( b h a t mk 2 0 0 0 ) 。目前纤维素酶的应用还主要集中在微生物纤维素酶的应 用上。现在纤维素酶已被广泛地应用于食品、酿酒、饲料加工、纺织、洗衣、农业等多 个领域( s h a dk r i s h n a e ta l ，2 0 0 0 ) 。 在食品业中，纤维素酶己经被用在水果和蔬菜汁的提取、谷物的浸泡效率和水分的 吸收，可提高消化性和食品的口感，也可应用于蔬菜果品的贮存和运输：另外，纤维素 酶也被用来增加食品的营养成分，从纤维素废弃物中提取纤维寡糖、葡萄糖和其他可溶 性的糖，以及去除细胞壁以利于有用物质，如酶、多糖和蛋白质的释放等州o z o m uy a s u t a k ee ta 1 2 0 0 3 ) 。 纤维素酶在发酵工业中被广泛地应用于酿酒业、酿造业、及饲料加工工业中( n o z o m u y a s u t a k ee ta 1 2 0 0 3 ) 。在酿酒过程中加入纤维素酶能使原料中含有一定纤维素的谷类、麸 皮、农副产品及填充料等充分利用，增加可发酵性耱，缩短发酵时间，而且酒的口感醇 香，杂醇油含量低；纤维素酶应用于酒精生产中，使大量的农作物秸秆废料和纤维素垃 圾生产酒精必将随着酶工程技术的发胀而成为现实；利用纤维素酶生产单细胞蛋白，可 将纤维素类原料经纤维素酶等水解后用微生物发酵生产单细胞蛋白或直接利用纤维分 解菌。 纤维素酶被成功的应用到纺织和洗衣q v e e o a a l e ee t a l ，2 0 0 0 ；t o d o r n i k o l o vc t a l 2 0 0 0 ；m a p e l a e he ta i ，2 0 0 3 ；l u - s h a nw a n ge ta l ，2 0 0 4 ) 。虽然纤维素酶用在纺织和洗衣业 中的时间只有十几年，但是它们已经成为这个领域中的第三大酶系。生物打磨和生物抛 光是目前纤维素酶在纺织工业中的主要应用。纤维素酶也被用在家庭的洗涤剂中，因为 它们可以增加去污能力，从织物表面除去小的碎纤维，增加织物表面的亮度和光泽。 除此之外，纤维素酶或葡聚糖酶的混合物己被用在造纸、植物和真菌原生质体的制 7 刖西 备中。另外，纤维素酶也被广泛的应用在研究、开发以及农业生产中( b h a tmk b h a t s 1 9 9 7 ) - 随着工业化的快速发展，化石燃料的消耗使能源面临枯竭，同时化石燃料产生的温 室气体。有毒气体便环境污染目益严重，生态平衡遭到破坏，迫切需要一种环境能够承 受、可再生的能源来代替化石燃料。从2 0 世纪8 0 年代，人们就开始以谷物为原料来生产 乙醇用作供氧燃料，乙酵已经被广泛地掺入到汽油中来代替纯汽油使用，其中的体积含 量可达t 0 。最近美国汽车制造商宣布计划生产一种可使用乙醇混合物e 8 5 即8 5 的乙醇 和1 5 的汽油( 体积比) 的汽车( s u n y ，c h e n gjy 2 0 0 2 ) 。因此，利用纤维素酶有效地将 这些纤维素物质转化成葡萄糖等简单糖，然后通过微生物发酵的方法将葡萄糖转变成乙 醇，将具有重大意义。 7 展望 目前纤维素酶还不能适应大规模工业化生产需求，寻找商催化活性、低成本纤维素 酶仍是该领域研究热点；利用定点诱变、分子改造以及基因重排等技术研究纤维素酶滑 控表达机理已经取得一定进展，但由于纤维素酶底物的复杂性，这方面的研究还是重要 方向；尽管很多纤维素酶基因已被克隆表达，但分泌较弱、提取也较困难，酵母分泌表 达体系将是研究热点，随着分子生物技术快速发展。应用基因工程手段构建高效分解纤 维素的“工程菌”指日可待。 8 本试验研究目的和意义 把地球上最丰富的可再生资源纤维素用生物技术手段变为新能源是人类由来已久 的愿望，随着地球石化能源的短缺和枯竭的日趋研究，人们必须把这种愿望变为现实。 纤维素降解是由一系列纤维素酶催化完成的，通过这些酶的调节可以控制其酶解效率。 而内切葡聚糖酶( e n d o 1 ，4 b d g l u e a n a s e ) 是纤维素酶系的重要组成部分，它的商效 表达对提高生产效率起到至关重要的作用。通过研究内切葡聚糖酶( e n d o l ，4 一p d - g h c a n a s e ) 基因克隆与表达对于获得高催化活性工程菌以解决目前能源紧缺具有重要的 现实意义及广阔的市场前景。现阶段，国内尚无关于从黑曲霉中克隆内切葡聚糖酶 ( e n d o 1 ，4 b d g l u c a n a s e ) 基因的报道。因此，本论文目前致力于黑曲霉发酵生产的 关键酶内切葡聚糖酶基因克隆、测序和表达等研究，进而实现其与外切葡聚糖酶和p 葡萄糖苷酶基因重组并在一个强启动子调控下完成基因串联表达，最终获得纤维素高效 8 沈阳农业大学硕士学位论文 降解工程落。 目的在于掌握基因工程技术进行菌种改造，采用廉价的底物大肠杆菌发酵生产内 切葡聚耱酶( e n d o - l ，4 - b d - g l u c a n a s e ) ，提高菌体生产酶表达水平和活力，并得到能 使酶活力显著提高的基因工程菌株，为基因工程方法工业化生产内切葡聚糖酶( c n d o l ， 4 b d g l u g a n a 始) 提供重要的试验依据，并为社会创造巨大的经济效益。 9 第一章内切葡聚糖酶基囡克隆与序列分析 第一章内切葡聚糖酶基因克隆与序列分析 纤维素是公认的地球上数量最丰富的有机物质资源，纤维素酶由于能将纤维原料逐 步降解，多年来一直受到各国的高度重视，被认为是最有应用潜力的酶制剂之一( s c h w - a r z , w h e t a l ，2 0 0 1 ) 。众所周知，自然界中许多生物体可产纤维素酶，包括真菌( t e e d t t 吼a l ，1 9 9 7 ) 、细菌( d o i ，r h e t a l ，1 9 9 8 ) 、植物( o h m i y a , y - m e t a l ，2 0 0 0 ) 和昆虫如白 蚁( i n o u e ，t - ，1 9 9 7 ) 。其中，由于真菌能产生大量胞外纤维素酶，酶系较完全，并且具有 较好的酶解活性，一直以来成为研究重点。 内切葡聚糖酶( e n d o 1 ，4 - b d g l u c a n a s e ，e g ) 是纤维素酶系最主要的成分，它首 先作用纤维素，随机水解纤维素分子内部的1 3 i ，4 糖苷建，将纤维素链打断，对整个 纤维素的降解起着至关重要的作用( t e e r i , t t ，1 9 9 7 ) 。内切葡聚糖酶( e n d o - i ，4 b - d g l u c a n a s e ，e g ) 广泛应用于纺织、印染和洗涤剂等工业中( b l a n c o ，a e t a l ，1 9 9 8 ；k e n d o e ta 1 2 0 0 1 ) 。 内切葡聚糖酶( e n d o - i ，4 - 8 d g l u c a n a s e e o ) 表现了广泛的环境、地域、种类等 分布上的多样性。h i t o m ij 等( 1 9 9 7 ) 克隆了杆菌b a c i l l u ss p k s m 5 2 2 q 6 e g - i v 基因并研 究其水解机制，结果表明该基因o r f 为1 9 1 1 个b p ，编码6 3 6 个氨基酸，属于e 2 家族。j o s e m f e r n a n d e z a b a l o s 等( 1 9 9 2 ) 对橄榄绿链霉菌j m 8 ( s t r e p t o m y e e sh m s t e d i i i m s ) 中e e l a l 编码内切葡聚糖酶基因进行克隆及核苷酸序列分析。b a d ay 等( 2 0 0 5 ) 从暗色 丝孢菌( b e l t r a n i e l l a p o r t o d c e n s i s ) 提取并鉴定了一种新的内切葡聚糖酶，研究证明该酶 在去污剂工业上有很大用途。s u z u k ik 等( 2 0 0 3 ) 从软体动物鲍鱼中提取出内切葡聚褚 酶并进行了e d n a 克隆分析。t a t s u k i m o r i y a 等( 2 0 0 2 ) 对来自米根霉中的内切葡聚糖酶 基因r e e l 、t e e 2 和t e e 3 进行分子克隆，根据催化结构域( c d ) 氨基酸序列分析表明三种内切 酶均属于糖基水解酶家族4 5 ，比较有趣的是r e e 3 基因在其n 末端有两处纤维素结合位点 ( c b d ) ，r e e l 和r e e 2 基因分别只有一处纤维素结合位点( c b d ) 。 目前对内切葡聚糖酶( e n d o l ，4 - 8 一d g l u c a n a s , ，e g ) 的研究主要运用基因克隆、 定点诱变、及蛋白质工程等技术手段( h i m m e l m e e t a l ，1 9 9 9 ；m l r a b i n o v i c he t 扎 2 0 0 2 ) 。因黑曲霉作为多细胞丝状真菌，能分泌完全的纤维素酶系，不产生毒素，糖化 能力强，所以越来越受到工业界的青睐。本章拟用r r p c r 法从黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 菌株中克隆编码内切葡聚糖酶基因( e g b ) ，并对其进行测序分析，为构建基因工程菌 而作基础性准备工作。 1 0 沈阳农业大学硕士学位论文 1 1 试验材料 菌种：黑曲霉( a s p e r g i e u sn i g e r ) 菌株购自中科院微生物研究所；e c o f ic o m p e t e n t c e l l sj l v l l 0 9 由宝生物工程( 大连) 有限公司赠送。 克隆载体：p m d l 9 - ts i m p l e 质粒由宝生物工程( 大连) 有限公司提供。 1 2 试剂与仪器 1 2 1 主要试剂及缓冲液 ( 1 ) 酶及试剂盒 e c o ri 、h 砌国、t a k a r ar n a i s or e a g e n t 、p r i m e s t a r t mh sd n a p o l y m e r a s e 、 t a k a r ah i g hf i d e l i t yp r i m e s c r i p t t mr t - p c rk i t 、t a k a r a a g a r o s eg e ld n ap u r i f i c a t i o n k i tv e r 2 0 、t a k a r ad n a f r a g m e n tp u r i f i c a t i o nk i tv e r 2 0 、t a k a r ad n aa - t a i l i n gk i t 、 t a k a r ad n a l i g a t i o nk i t 、t a k a r am i n i b e s tp l a s m i dp u r i f i c a t i o nk i tv e r 等购自宝生物工程( 大连) 有限公司。 ( 2 ) 常用试剂及缓冲液 s d s 、琼脂糖、t r i s 购于p r o m e g a 公司：n a c i 、e d t a 购自s i g m a ：g l y c e r o l ( 甘油l 购自n a c a l a i ；乙醇、氯仿及异丙酵均为国产分析纯。 p b s ：用8 0 0 m l 去离子水溶解n a c i8 9 ，k c io 2 9 , r 4 a 2 i - i p 0 41 4 2 9 ，k i - i z p 0 40 2 7 9 , 用浓 盐酸调p h 值至7 4 ，然后加入去离子水将溶液定容至l l 。高温高压灭菌后，室温保存。 r n a s e f r e e 水：使用r n a s e f r e e 的玻璃瓶，向超纯水中加入d e p c 至终浓度 o 0 1 ( v v ) ，过夜搅拌，高温高压灭菌。 i mt r i s - h c l ( p h 8 o ) 配制：称量1 2 1 1 9 i r i s 置于l l 烧杯中，加入约8 0 0 m l 去离子 水，充分搅拌溶解。加入p h 8 0h c i 约4 2 l i l l ，将溶液定容至ll 高温高压灭菌。室温 保存。 o 5 me d t a h 8 。o ) 配制：8 0 0 m l 无菌水加入1 8 6 1 9n a 2 e d t a 2 h 2 0 ，充分搅拌用 n a o h 调p h 值至8 0 ，加去离子水定容至l l 。适量小份分装后，高温高压灭菌后室 温保存。 质粒提取试剂： s o l u t i o ni ：imt r i s - h c l ( p h 8 ，o ) 2 5 m l ，o 5 me d t a ( p h 8 0 ) 2 0 n l l ，2 0 g l u c o s e 4 5 m l ，d n 2 0 9 1 0 m l 。高温高压灭菌后，室温保存。使用前每5 0 m ls o l u t i o n i 加入2 m l r n a s e 第一章内切葡聚糖酶基因克隆与序列分析 a ( 2 0 m g m 1 ) 。 2 0 ( w i v ) g l u c o s e ( 1 0 0 m 1 ) ：称取2 0 9g l u c o s e 于1 0 0 m l 烧杯中，加入约8 0 m l 去离子水后搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至1 0 0 m l 。高温高压灭菌后，4 c 保存。 s o l u t i o n l l ：量取1 0 0 , 6s d s5 0 m l 和2 nn a o h5 0 m l 于5 0 0 m l 烧杯中，加无菌水定容 至5 0 0 m l ，充分混匀。室温保存。s d s 易产生气