（农产品加工及贮藏工程专业论文）薏米多糖结构与理化性质的研究.pdf

摘要 薏米( c o a xl a c h r y m a - j o b i l j v a r f r u m e n t a c e am a k i n o ) 属禾本科植物，是福建省 特有的经济作物之一，具有丰富的营养价值以及特殊的药用保健功效。本项目拟 采用福建仙游产慧米金沙薏米为原料提取薏米多糖，并对其进行分离纯化， 研究薏米多糖的一级结构及性质、薏米多糖的抗氧化活性，为拓展薏米多糖的应 用提供理论依据和基础数据。 ( 1 ) 以金沙薏米为原料，研究薏米多糖的最佳提取工艺。在单因素实验的基 础上，通过正交实验研究了料液比、浸提时间、浸提温度对薏米多糖提取率的影 响。结果显示薏米多糖提取的最佳工艺为：料液比1 ：4 0 ，浸提时间4 h ，浸提温 度9 5 ，在此条件下多糖的提取率可达1 4 4 。 ( 2 ) 以金沙薏米为原料，研究薏米多糖的最佳分离工艺。采用三种方法对粗 多糖进行分离，比较三种方法分离效果，在此基础上，优化出薏米多糖提取液的 脱蛋白动力学方程。结果显示在3 种脱蛋白方法中，酶( 木瓜蛋白酶) 解法对薏 米多糖的蛋白质脱除效果较好，其最佳的工艺参数组合为酶解温度4 0 ，酶解 时的p h 值7 ，酶添加量5 6 8 2 1 x g ；脱蛋白动力学方程为 y = 6 1 4 9 8 7 2 + 5 9 5 5 1 i x 3 2 4 4 2 3 1 x 1 2 - 1 0 3 9 7 7 x 2 2 - 1 8 3 7 0 3 ) ( 3 2 + 1 1 1 6 1 2 x l x 2 ( 3 ) 用水提取薏米粗多糖，经s e v a g 法脱蛋白质，透析后经s e p h a d e x o 7 5 分离后得到一个组分，冷冻干燥后得白色粉末状，经w a t e r s 2 6 9 5 高效液相色谱 仪结果分析为薏米多糖纯品。试验结果表明：薏米多糖为水溶性，易溶于热水， 不溶于乙醇、乙醚、丙酮等有机试剂，热稳定性较好。水溶液p h 值近中性，过 酸或偏碱均会使多糖部分降解。应用w a t e r s 2 9 9 6 检测仪检测薏米多糖纯品，结 果表明薏米多糖纯品中不存在蛋白质，即薏米多糖中多糖为纯多糖。 ( 4 ) 通过对薏米多糖红外光谱指纹区的特征吸收进行解析，结果表明：薏米 多糖含有羧基，是一种酸性多糖；薏米多糖在8 6 7 7 5 c m 。1 处有吸收峰，结合 1 h n m r 谱图结果，表明该多糖为p 一糖苷键构型：1 3 c n m r 谱图结果表明，薏 米多糖具有6 个单糖残基组成重复单元，且具有木糖甲基的特征吸收峰；h p l c 和g c 结果表明：慧米多糖由l 一鼠李糖、l 一阿拉伯糖、d 一葡萄糖、d 一半乳 糖、d 一木糖和d 一甘露糖6 种单糖组成。利用荧光显微镜对薏米多糖颗粒的表 面形貌进行观察，结果显示：颗粒较大，形状似云团状，为不规则图形，表面呈 丝状分布，且存在裂缝。高效液相色谱测定薏米多糖分子量，结果为：薏米多糖 t 的重均分子量为2 9 9 3 ，多分散性为1 0 4 3 7 5 2 ；薏米多糖的比旋光度陋亡= + 1 5 5 0 ( 0 1 5 1 ，h 2 0 ) ；特性粘度 t 1 = o 3 1 3 。 ( 5 ) 利用f e n t o n 体系产生o h 以及采用邻苯三酚自氧化法产生0 2 ，研究 薏米多糖的抗氧化活性。结果表明，在试验范围内，薏米多糖对羟自由基( o h ) 和超氧阴离子自由基( 0 2 。) 具有较强的清除作用，清除能力随多糖浓度的增大 而增大。在浓度相同的情况下，薏米多糖对o h 清除能力比对照组茶多酚强， 但对0 2 。的清除能力却比茶多酚弱。纯化后的薏米多糖对o h 和0 2 的清除能力 都比薏米多糖粗品强。 关键词：薏米，多糖，分离工艺，结构，性质，抗氧化 ab s t r a c t c o i xl a c h r y m a - j o b ik e r n e l ( c o xl a c h r y m a - j o b ic l v a t f r u m e n t a c e am a k i n o ) 。i s as p e c i a le c o n o m i c a lr e s o u r c ei nf u j i a n ，w h i c hh a sr i c hn u t r i t i o na n ds p e c i a lh e a l t l l v a l u e e x t r a c t i o nt e c h n o l o g y ，i s o l a t i o na n dp u r i f i e dt e c h n o l o g y ，l e v e ls t r u c t u r ea n d t h ea n t i o x i d a n t i v ee f f e c to fc o xl a c h r y m a - j o b ik e m e lp o l y s a c c h a r i d ew e r es t u d i e d t h e r e f o r e ，b a s i cd a t af o rd e v e l o p m e n to fc o xl a c h r y m a - j o b ik e m e lp o l y s a c c h a r i d e w e r eo f f e r e d ( 1 ) n l eb e s te x t r a c t i o nt e c h n o l o g yo fs o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ei nj i a s h ac o i x l a c h r y m a - j o b ik e m e lw a ss t u d i e d 0 nt h eb a s i so fs i n g l e f a c t o re x p e r i m e n t s ，t h e o p t i m u me x t r a c t i o nt e c h n o l o g yw a sd e t e r m i n e dt h r o u g ho r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ：t h e s o l i d l i q u i dr a t i o1 ：4 0 ，e x t r a c t i n gt i m e4 h r ，e x t r a c t i n gt e m p e r a t u r e9 5 。c ，t h ee x t r a c t i o n r a t er e a c h e dt o1 4 4 ( 2 ) t h eb e s ti s o l a t i o nt e c h n o l o g yo fs o l u b l ep o l y s a c c h a r i d ei nj i n s h ac o i x l a c h r y m a - j o b ik e r n e lw a ss t u d i e d o nt h eb a s i so ft h ec o m p a r i s o no ft h r e em e t h o d s i t w a sd e t e r m i n e dt h a tt h eo p t i m u mm e t h o dw a se n z y m o l y s i st e c h n i q u e t h eo p t i m u m i s o l a t i o n t e c h n o l o g yt h r o u g hr o t a t i o n a l - r e g r e s s i o ne x p e r i m e n t ：t h ee n z y m o l y s i s t e m p e r a t u r e4 0 。c ，p hv a l u e7 ，t h ee n z y m ec o n c e n t r a t i o n5 6 8 2 弘g t h ed y n a m i c e q u a t i o n ： y = 6 1 4 9 8 7 2 + 5 9 5 5 11 x 3 2 4 4 2 3 1 x 1 2 - 1 0 3 9 7 7 x 2 2 - 1 8 3 7 0 3 ) ( 3 2 + 1 11 6 1 2 x l x 2 ( 3 ) t h ec r u d ep o l y s a c c h a r i d eo fc o xl a c h r y m a - j o b ik e r n e lw a se x t r a c t e di n w a t e r , r e m o v e dp r o t e i n sb ys e v a g sm e t h o d s ，a n dw a si s o l a t e da n dp u r i f i e d b y s e p h a d e x g 7 5 叽i t ep o w d e rs t a t eo b j e c t sw a so b t a i n e da f t e rf r e e z e d r y i n g ，a n dt h e p u r ec o i xl a c h r y m a - j o b ik e r n e lp o l y s a c c h a r i d ew a si d e n t i f i e db yw a t e r s2 6 9 5h p l c t 1 1 er e s u l ts h o w e dt h a tp u r ep o l y s a c c h a r i d ei ss o l u b l ei nw a t e r , i n s o l u b l ei na l c o h 0 1 e t h e r ，a c e t o n ea n do t h e r o r g a n i c s o l v e n t sa n dh a st h e r m a l s t a b i l i t y t h e p o l y s a c c h a r i d el i q u i di sa p p r o x i m a t ep h7 0a n dt h ep o l y s a c c h a r i d ew o u l dd e g r a d a t e u n d e ra c i do ra l k a l ic o n d i t i o n ，t h ec o b ：l a c h r y m a - j o b ik e m e lp o l y s a c c h a r i d ei sa p u r e p o l y s a c c h a r i d ew h i c hd o e s n tc o n t a i np r o t e i n ( 4 ) a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so fi rf i n g e r p r i n tc h a r a c t e r i s t i c sa b s o r p t i o n t h e r e s u l ts h o w e dt h a t t h ec o i x l a c h r y m a - j o b ik e m e lp o l y s a c c h a r i d ei sa l la c i d i c i i i p o l y s a c c h a r i d ec o n t a i n i n g ac a r b o x y l i na d d i t i o n ，t h er e s u l t so f8 6 7 7 5 c m 1 d e p a r t m e n ta b s o r p t i o np e a k a n d1 h n m rs h o w e dt h a tt h e c o n f i g u r a t i o n o f p o l y s a c c h a r i d ei sp g l y c o s i d i c a c c o r d i n gt o1 3 c n m r ，t h ec o i xl a c h r y m a - j o b i k e r n e lp o l y s a c c h a r i d ec o n t a i n ss i xm o n o s a c c h a r i d er e s i d u e s ，a n dh a sc h a r a c t e r i s t i c a b s o r p t i o np e a k so fx y l o s em e t h y l ，h p l ca n dg ca n a l y s i ss h o w e dt h a tg l y c o n e u t r a l s u g a r sc o n s i s to fl r h a m n o s e ，l - a r a b i n o s e ，d - g l u c o s e ，d g a l a c t o s e ，d x y l o s ea n d d m a n n o s e b e s i d e st h e s e ，o b s e r v e ds u r f a c em o r p h o l o g yb yf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ， t h ea n a l y s i ss h o w e dt h a tt h ep a r t i c l et a k e st h es h a p eo fc l o u dc l u s t e r ，w i t ha d i s t r i b u t i o no ff i l a m e n t a r y c o i xl a c h r y m a - j o b ik e r n e lp o l y s a c c h a r i d eh a sam o l e c u l a r w e i g h to f 2 9 9 3 ，陋r = + 1 5 5 。( o 1 5 1 ，h 2 0 ) a n dh 】- o 3 1 3 ( 5 ) t h ee f f e c to ns c a v e n g i n g o ha n d o o fc o i xl a c h r y m a - j o b ik e m e l p o l y s a c c h a r i d ew e r es t u d i e db yf e n t o ns y s t e ma n dp y o r g a l l o la u t o x i d a t i o nm e t h o d r e s p e c t i v e l y ，w h i c hw a sc o m p a r e d 州t l lt h ee f f e c to ft e ap o l y p h e n o l s t h er e s u l t s h o w e dt h a tt h ec o i xl a c h r y m a - j o b ik e r n e lp o l y s a c c h a r i d ec o u l de f f e c t i v e l ys c a v e n g e o ha n d 0 2 i nt h e e x p e r i m e n t a lr a n g e ，a n dt h ep o l y s a c c h a r i d eh a ds t r o n g e r s c a v e n g i n ga b i l i t yo n 。o ha n dl o w e ra b i l i t yo n 0 2 c o m p a r e dw i t ht e ap o l y p h e n o l s m o r e o v e r ，t h ep u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d eh a ds t r o n g e rs c a v e n g i n ga b i l i t yt h a nt h ec r u d e p o l y s a c c h a r i d e k e yw o r d s ：c o l vl a c h r y m a - j o b ik e r n e l ；p o l y s a c c h a r i d e ；i s o l a t e dt e c h n o l o g y ； s t r u c t u r e ；p r o p e r t i e s ；a n t i o x i d a t i o n i v 独创性声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是我个人在导师的指导下，进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外， 论文中不包含其它人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志， 都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本 人承担应有的责任。 学位c 论文作者亲笔签名：庄弗竭 嗍溯舌 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即：学校 有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。一 日期：砂吕。仫 日期：西鲳 f 蛹 讳 ，l = p 孙荡 签荔镒吻 徕汐 榭垆 福建农林大学硕士学位论文薏米多糖结构与理化性质的研究 第一章文献综述 多聚糖，简称多糖，是由1 0 个以上单糖基通过苷键连接而成的。是一类除 了蛋白质和核酸以外的重要生物大分子，是构成生命的基础分子之一。随着分子 生物学的发展，人们逐渐认识到糖及其复合物具有重要的生物活性，已发现多种 中药中含有的多糖具有如抗肿瘤、免疫调节、降血糖、抗病毒、降血脂、抗凝血 等生物活性，这类多糖没有细胞毒性，已经成为当今新药的发展方向之一。到目 前为止，已有3 0 0 多种多糖类化合物从天然产物中被提取出来，其中从中药中获 得的水溶性多糖最为重要。由于多糖多种多样的生物活性功能以及在功能食品和 临床上的广泛应用，使多糖生物资源的开发利用和研究日益活跃，成为天然药物、 生物化学、生命科学的研究热点。 1植物多糖分离纯化的研究现状 1 1植物多糖的分离 1 1 1沉淀 大部分多糖在有机溶剂或高浓度的盐溶液中的溶解度极小，所以可用有机溶 剂或高浓度的盐溶液来沉淀。常用的有机溶剂有乙醇、异丙醇及丙酮，一般加入 三倍体积的有机溶剂。乙醇、异丙醇是f d a 认可的适合于食品级多糖的最佳沉 淀剂。一般而言，低分子醇类可满足大多数多糖的沉淀，在p h 7 0 左右，反复 溶解与醇析，即可得到粗多糖。而利用高浓度的盐溶液沉淀多糖，通常使用的沉 淀剂为( n h 4 ) 2 s 0 4 1 1 。 1 1 2去蛋白 用分级沉淀法得到的多糖，常含有较多的蛋白质、色素等杂质，而据资料表 明，多数情况下，多糖除去蛋白质后活性更强【3 】，因此去除蛋白质是研究多糖活 性的关键步骤。除去蛋白质常用的方法如下： s e v a g 法：将提取液与有机溶剂( 氯仿和正丁醇体积比5 ：1 ) 混合，剧烈振 荡2 0 r a i n ，3 0 0 0 r p m 离心1 5 m i n ，除去沉淀。重复此过程若干次，直至上清液中 无蛋白质被测出。此法条件温和，但效率不高【4 】。 三氟三氯乙烷法：将三氟三氯乙烷加入到多糖溶液中( 1 ：1 ) ，搅拌1 0 m i n ，离 心收集上层水层，再用上述溶剂处理2 次，即得不含蛋白的多糖溶液。此法效率 高，但因溶剂沸点较低，不宜大量应用5 1 。 1 福建农林大学硕士学位论文慧米多糖结构与理化性质的研究 三氯醋酸法：在多糖水溶液中滴加3 三氯醋酸，直至溶液不再混浊为止， 在5 l o 放置过夜，离心除去沉淀，即得不含蛋白的多糖溶液。此法较为强烈， 往往引起某些多糖的降解【6 j 。 盐酸法1 7 】：将多糖水溶液调至p h 值为3 ，放置过夜，离心去沉淀，即得不 含蛋白的多糖溶液。此法脱蛋白率高，但易引起某些多糖的降解。 酶法：用蛋白酶酶解，是常用的从组织中释放出多糖的方法之一。通常选用 专一性低的蛋白酶，以进行广泛的蛋白质水解。常用的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、 木瓜蛋白酶、链蛋白酶等。此法效率高，但易使多糖一蛋白质的复合物分解，造 成某些多糖一蛋白质复合物特有的生理活性降低。一般先用蛋白酶使蛋白质部分 水解解离后，再与s e v a g 法结合效果更好【7 1 。 1 ，1 3 除色素【引 对于植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这类色素大多呈负 性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂d e a e 纤维素或d u o l i t ea 7 来吸附色素；若糖与色素是结合的，易被d e a e 纤维素吸附，不能被水洗脱， 这类色素可进行氧化脱色；以浓氨水( 或n a o h 液) 调至p h 8 0 左右，5 0 以下 滴加h 2 0 2 至浅黄色，保温2 小时：发酵来源的多糖颜色一般较浅；对于动物、 微生物等提取到的多糖也可根据不同情况按上述方法处理。一般情况下，尽量避 免用活性炭处理，因活性会吸附多糖，造成多糖损失。 1 1 4去离子 去离子是为进一步纯化及色谱分析做准备。常用的方法有：透析法、柱离子 交换法和纤维滤器透析法。 透析法【9 j ：是最传统的去离子方法，在透析前要选择一种规格适宜的透析膜 以免样品损失。透析袋是半透性的，允许小分子无机盐通过，但不允许大分子通 过。透析方法不仅能去盐，还可以除去各种小分子物质。 柱离子交换法【l o 】：提取液除蛋白后分别通过阴阳离子交换树脂，也可以用 g 2 5 以达到去离子作用。本法比较简单，但是增大了溶液的体积，影响多糖的 沉淀结果。 纤维滤器透析法【1 0 l ：是根据膜技术而新发展起来的，现在可制造出孔径很小 的膜。以这种方式对大多数样品进行浓缩，速度很快，而且温和，所以即使发生 失活也是很小的。利用不同孔径的膜有可能使大小不同的分子分级。但这个方法 的分辨率要比分子筛层析可能达到的小的多。 2 福建农林大学硕士学位论文 薏米多糖结构与理化性质的研究 1 2植物多糖的纯化 1 2 1分步沉淀法 根据不同多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同溶解度的性质，逐次按比 例由小到大加入这些醇或酮分步沉淀。这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大 的多糖。 1 2 2 金属络合物法【l l 】 根据不同多糖能与各种铜、钡、钙、铅离子形成络合物而沉淀的性质来分离。 对于同时含有游离蛋白和色素的多糖，可通过生成金属络合物的方法同时除去蛋 白和色素，即加入费林试剂生成不溶性的络合物，经分离后用阴离子交换树脂分 解络合物。 1 2 3 盐析法 根据不同多糖在不同浓度的盐溶液中具有不同的溶解度的性质，加入不同盐 析剂使之逐步析出。常用的盐析剂有氯化钠、氯化钾、硫酸铵等，以硫酸铵最佳。 1 2 4季铵盐沉淀法 季铵盐是一种阳离子表面活性剂，如十六烷基三甲基溴化铵、十六烷基氯化 吡啶盐以及碘化n 三甲基壳聚糖季铵盐和壳聚糖羟丙基三甲基氯化铵【1 2 】等。它 们可与酸性多糖阴离子形成不溶于水的沉淀，使其酸性多糖自水相中沉淀，而中 性多糖留在母液中得到分离。 1 2 5 柱层析法 柱层析法可分为两类。一类是只有分子筛作用的一般凝胶柱层析【1 3 】，如 s e p h a d e x 、s e p h a r o s e 、b i o - g e l 等，它是根据多糖分子的大小和形状不同而达到 多糖的纯化；另一类是纤维素阴离子交换剂柱层析1 4 1 ，常用的交换剂是d e a e 纤维素。柱层析法适用于分离各种酸性多糖、中性多糖和粘多糖。通过柱层析， 吸附力不同的多糖被依次分开，同时许多杂质被牢牢吸附于柱上端，从而达到多 糖的纯化。当p h 为6 时，酸性多糖能吸附于交换剂上，而中性多糖不吸附。然 后用p h 值相同、离子强度不同的缓冲液将酸性强弱不同的多糖分别洗脱出来。 1 3 多糖纯度的鉴定 与小分子化合物的纯度标准不同，多糖的纯度只代表某一多糖的相似链长的 平均分布，即多糖纯品实质上是一定分子量范围的均一组分。常用的纯度鉴定方 法有比旋度法、超离心法、高压电泳法及凝胶过滤法四种。前三种的误差较大， 所以必须要两种以上的方法才能肯定其均一性。目前最常用且较易确定方法是第 3 福建农林大学硕士学位论文慧米多糖结构与理化性质的研究 四种，高效液相凝胶色谱法，即h p l c 法【1 5 】。h p l c 法的原理是由于凝胶具有一 定大小的孔径，故不同形状和大小的多糖分子在凝胶柱中移动速度不同。大分子 移动较快，小分子移动较慢，流出液经示差折光检测仪检测，若为一个对称峰， 则表明是均一组分。 1 4多糖分子量的测定 多糖分子量测定是研究多糖性质的一项较为重要的工作，多糖的性质往往跟 它的分子量大小有关。多糖的分子量只代表相似链长的平均配分，因此对其的测 定至今仍是一个复杂的问题，往往不同的方法会得到不同的结果。即使是同一种 多糖，其重均分子量( m w ) 与数均分子量( m n ) 也会相差很大。 测定多糖分子量的方法很多，一般说来，测定高分子化合物分子量的很多物 理方法，也适用于多糖。其中包括蒸汽压渗透及动态渗透法，溶液渗透液法，超 离心法，粘度法，光散射法，高效液相色谱法等。在实验室中，最简便实用的是 凝胶层析法。它是根据在凝胶柱上，不同分子量的多糖与洗脱体积成一定关系的 特性，先用各种已知分子量的多糖制成标准曲线，再由样品的洗脱体积从曲线中 求得分子量。此法需样品量少，操作较简便，但要注意控制流速，否则会产生较 大误差。近年来，已广泛使用高效液相色谱法测定多糖的分子量，该法利用样品 分子与固定相凝胶之间无相互作用，按照分子筛原理分离【1 5 】，所需样品量少，且 测定结果较为精确。 2植物多糖结构研究现状 多糖的结构包括多糖糖链的一级结构和高级结构，高级结构以一级结构为基 础。目前所说的多糖结构，往往是指多糖的一级结构。其中包括糖链的分子量； 多糖的单糖基组成，各种组成单糖的分子数之比；吡喃环或呋喃环形式；各个单 糖残基之间的连接次序；每个糖苷键所取的0 【或d 异头异构形式；每个糖残基 上羟基被取代情况，由此判断分支链的连接位点；糖链和非糖部分连接点的情况。 多糖与蛋白质、核酸等生物大分子相比，结构较为复杂，所包含的信息更为 丰富，因此要分析多糖的结构需要综合运用各种物理学、化学和生物学等方法。 2 1多糖结构研究中的化学方法 2 1 1 酸催化降解 1 6 】 糖链易被稀酸催化水解，使其苷键发生断裂。反应一般在水或稀的醇溶液中 进行，所用的酸为质子酸。无机酸类有盐酸、硫酸和硝酸等，有机酸类有甲酸、 4 福建农林大学硕士学位论文慧米多糖结构与理化性质的研究 乙酸和三氟乙酸等，也可用阳离子交换树脂在加热条件下进行。 2 1 2碱催化降解和p 消除 当苷元部分是由酸、酚以及烯醇基与糖的端基相连接时，这种苷键对碱性试 剂有着不同程度的敏感性而易被水解。多糖苷键的碱水解常伴有还原性末端糖基 的p 一消除反应，这往往是碱性降解的开始。在结构鉴定中，碱水解通常被用来区 别糖链和肽链的连接。在温和条件下，采用稀碱水解可以由糖蛋白分离得到完整 的糖链或糖肽，避免在酸水解时丢失某些糖基。 2 1 3氧化降解 在多糖结构的研究中，氧化降解有三种方法，分别为高碘酸氧化、s m i t h 降 解、b a r r y 降解。高碘酸氧化是指高碘酸选择性地断裂糖分子中连二羟基或连三 羟基处，生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。此法必须在控制的条件下进行，否则 容易发生超氧化反应。s m i t h 降解是防止高碘酸氧化发生超氧化反应的方法， b a r r y 降解则是应用于高度分支的多糖以及难以氧化的糖链结构的测定。 2 1 4 甲基化反应【1 5 】 测定寡糖、多糖以及配糖体中糖链的各种单糖残基的连接方式，甲基化分析 是必不可少的方法。它的基本原理是：先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全 部甲基化，进而将多糖水解，水解物中羟基所在的位置，即为原来单糖残基的连 接点。同时根据不同甲基化单糖的比例可以推测出这种连接键型在多糖重复结构 中的比例。 2 1 5酶催化降解【1 6 】 相对于多糖的酸、碱催化水解，酶的催化水解多糖具有条件温和和酶促反应 专一性的特点。酶水解多糖可以获知苷键的构型，且保持苷元结构不发生变化， 甚至可以使部分的苷键得到次级苷或者低聚糖，从而得到苷元与糖，或糖与糖之 间的连接方式等信息。 2 2 多糖结构的仪器分析法 2 2 1 紫外分析法( u 多糖是由1 0 个以上单糖通过糖苷键连接而成的聚糖，其结构比蛋白质和核 酸的结构更为复杂，可以说是最复杂的生物大分子。从化学观点看，结构的复杂 性给寡糖链的结构测定和化学合成带来了较大困难，但是解剖多糖的低级和空间 结构，对于明确多糖的生物学功能具有重要的意义。可利用在2 6 0 n m 、2 8 0 n m 处 观察有无吸收光谱来判断多糖中是否有蛋白质、多肽及核酸。 5 福建农林大学硕士学位论文慧米多糖结构与理化性质的研究 2 2 2红外光谱法( i r ) 和拉曼( r a m a n ) 光谱 红外光谱仪为分析多糖结构非常得力的工具。人们经常以多糖的特征吸收峰 来鉴定多糖。如8 4 0 c m d 吸收峰可以判别0 【糖苷键的存在，8 9 0 c m 。1 吸收峰来判 别b 一糖苷键的存在。毗喃糖苷在1 1 0 0 , - 1 0 1 0 c m 1 间应有3 个强吸收峰，而呋喃 糖苷在相应区域只有2 个峰；另外，8 1 0 、8 7 0 c m d 是甘露糖的吸收峰，1 2 6 0 与 1 7 3 0 c m 。是酯基或0 乙酰基的特征吸收峰；酯的吸收峰在1 7 4 0 c m ，羧酸离子 吸收峰在1 6 0 0 c m 一，1 4 1 4 c m ；酰胺的吸收峰在1 6 5 0 c m 一，1 5 5 0 c m 1 附近出现振 动吸收。 拉曼光谱的使用范围和作用与红外光谱相似。但具有前者所没有的长处，如 可直接用固体样品测定且吸收峰较光滑等特点【1 8 】【1 9 1 。 2 2 3 气相色谱法( g c ) 和高效液相色谱法( h p l c ) 气相色谱法( g c ) 是一种以气体为流动相，以固定吸附剂或涂渍有固定液的固 体担体为固定相的柱色谱分离技术。高效液相色谱( h p l c ) 是在2 0 世纪6 0 年 代末，以经典柱色谱法为基础，引入了气相色谱法的理论和实验方法，流动相改 为高压输送，采用高效固定相及在线检测手段发展而成的一种高效快速的分离分 析技术【1 6 1 。气相色谱法( g c ) 和高效液相色谱法( h p l c ) 主要用于单糖和甲基化单 糖的分离和鉴定。对于g c 而言，需要进行样品的衍生化，而h p l c 则可直接进 样。 2 2 4 质谱法( m s ) 利用m s 法研究糖类始于上世纪5 0 年代末。由于m s 法在糖链结构分析中 具有快速灵敏，样品用量少、结构信息直观的特点而得到越来越广泛的应用。近 年来各种软电离技术的诞生，如快原子轰击质谱( f a b m s ) 、电喷雾质谱 ( e s i m s ) 、基质辅助激光解析离子化质谱( m a l d i m s ) 等使糖结构分析的研究取 得了日新月异的发展【2 0 】【2 l 】。 2 2 5核磁共振法( n m r ) 核磁共振( n m r ) 引入糖化学研究始于2 0 世纪7 0 年代，它对于多糖结构 的研究鉴定起了决定性的作用。如糖类的化学组成，糖苷建的构型，糖环的构象， 糖残基的排列顺序，糖苷建的键合位置等。用n m r 技术研究糖链结构的优点是 不破坏样品。糖链的结构特征通过化学位移，偶合常数，积分面积，n o e 及迟 豫时间等参数表达。 核磁共振氢谱( 1 hn m r ) 主要解决多糖结构中糖苷键的构型问题。多糖的 6 福建农林大学硕士学位论文薏米多糖结构与理化性质的研究 质子信号6 一般都集中在4 0 5 5 内，一般为难解析的堆积质子信号，c l 上的 质子信号在4 8 5 5 范围内，易于解析，其它c 2 - - c 6 上的质子信号集中在4 0 - - 4 8 之间，且峰重叠、交叉，不易分辨，难解析。核磁共振氢碳谱( 1 3 cn m r ) 的化学位移较1 hn m r 谱的范围宽的多，分辨率好，不但能确定各种碳的位置， 而且能区别分子的构型、构象、糖链中苷键的连接位置，也可以确定糖环的类型。 碳谱还可以根据峰的相对高度定量测定多糖中不同残基的比例 2 2 1 。 2 2 6电泳技术 毛细管电泳( c e ) 是近几年发展起来的一种糖类分析法，它以快速、高效、 高分辨率和样品用量少等优点，越来越受到糖化学家的重视。c e 在多糖结构研 究中主要用来测定多糖的分子质量、多糖的组成分析、纯度鉴定、结构归属及单 糖残基差向异构体的分离等，与多糖的降解方法联用，通过确定多糖降解片段的 结构并根据结构优化原理还能实现多糖的结构分析。c e m s 联用可以对细胞水 平的极微量多糖进行精确分析。但c e 方法分析结果的重显性较差，在进样方法 和定量分析方面需要在技术上进一步提高【2 3 1 。 十二烷磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳聚偏氟乙烯薄膜电迁移技术 ( s d s p a g e p v d f ) 是最新发展起来的一种专门用于糖蛋白结构分析的技术。 s d s p a g e - p v d f 可以把电泳凝胶上的糖蛋白基本上定量地转移到聚氟乙烯薄 膜上，在此膜上可直接进行酸水解，然后进行氨基酸和糖组成分析；也可以在此 膜上进行降解、各种蛋白酶、糖肽酶苷酶水解，以及把p v d f 膜直接置于蛋白质 气相序列仪或质谱化上时行序列分析，从而获得p m o l 级糖蛋白肽链和糖链结构 以及糖肽连接方式【2 4 】。 2 3 生物学方法 多糖的生物学方法研究主要在于酶学方法和免疫学方法。 2 3 1酶学方法 酶促反应具有高度的专一性，且副产物少，是糖链结构分析的一种重要手段。 利用a 糖苷酶和b 糖苷酶对多糖底物的催化反应，可用于确认多糖链中糖苷键 类型。也可用酶解的方法来分析糖肽连接方式。虽然酶解的高度专一性和放射性 标记方法的引入使得这种方法十分有效并广为采用，但此法最大的缺陷在于酶解 结束后，需要很多次地进行分离和确定产物的流体动力学体积。为了解决这一问 题而诞生了试剂阵列分析方法1 2 5 1 。它将酶解方法的操作简化为只要将纯化的多糖 样品等分为几个试样，再将每个试样与某种精确设定的外切糖苷酶混合物保温酶 7 福建农林火学顶上学位论文 慧米多糖结构与理化性质的研究 解，这种特定酶混合物称为试剂阵列。合并每次酶水解的产物，再对产物库进行 一次凝胶渗透色谱分离，把分离图谱与计算机数据库中的图谱进行对照即可确定 结构。根据这一原理，商品化的糖序列仪已经被生产出来。 2 3 2免疫学方法 抗原和抗体会相互结合，一定结构的多糖( 寡糖) 会抑制抗原抗体的结合，不 同的糖( 半抗原) 有不同的抑制常数。当某种未知结构的糖链对抗原和抗体的结合 产生了抑制，通过测定其抑制常数再与己知结构的糖链相比较，有相近抑制常数 的多糖，其结构也相似。免疫学方法即利用免疫法分析糖链结构的方法【2 6 1 。 3 植物多糖生物活性的研究现状 3 1多糖的免疫调节、抗肿瘤功能 大量的药理和临床研究表明，植物多糖是一种免疫调节剂，它具有抑制肿瘤 生长、激活免疫细胞、改善机体免疫功能的作用。柴胡多糖、紫松果菊多糖等能 激活体内的巨噬细胞功能，进而抗肿瘤；女贞子多糖、商陆多糖等能增强细胞免 疫功能；波叶大黄多糖、板蓝根多糖等对体液免疫有促进作用。人参多糖对实验 性小鼠肿瘤有明显的抑制作用，能显著增强腹腔巨噬细胞的吞噬功能，激活网状 内皮系统。枸杞多糖能增强正常小鼠的t 细胞介导的免疫反应及自然杀伤细胞 ( n k 细胞) 的活性。此外，海带及藻类多糖也具有增强免疫、抗肿瘤的作用【2 7 】【2 8 1 。 3 2多糖的降血脂、降血糖功能 近年来许多人研究了植物多糖降血糖的功能。彭红等人研究发现南瓜多糖能 提高动物对高糖的耐受力，且与胰岛素有很好的协同作用，它对正常动物血糖的 影响不明显【2 9 1 。百合多糖降血糖能修复b 胰岛细胞、增强分泌胰岛素功能和降 低肾上皮质激素分泌，以及促进肝脏中血糖转化为糖原的联合作用，从而使血糖 降低，对治疗糖尿病有显著的效果【3 0 。 姚思宇等人研究了虫草多糖降血脂的动物实验，结果表明虫草多糖能明显降 低高脂大鼠的血清胆固醇、甘油三酯含量，同时能升高高脂血症患者高密度脂蛋 白与低密度脂蛋白比值【3 1 1 。枸杞多糖对实验性高脂血大鼠的血脂有明显影响，可 显著降低血清胆固醇、甘油三酯含量，而对高密度脂蛋白有升高作用【3 1 1 。现已发 现的具有降血脂活性的多糖有海带多糖、褐藻多糖、甘蔗多糖、硫酸软骨素、灵 芝多糖、茶叶多糖、紫菜多糖、波叶大黄多糖、魔芋多糖、耳叶牛皮消多糖、尧 多糖等【3 2 】【3 3 】。 8 福建农林大学硕士学位论文薏米多糖结构与理化性质的研究 3 3多糖的抗病毒、抗细菌、抗炎功能 张斌【3 4 】等研究发现，红藻中提取的红藻多糖在细胞水平上明显抑制牛免疫缺 陷病毒b i v 的生长，具有开发a i d s 药物的前景。经证实红藻多糖是多糖的衍生 物硫酸化多糖。徐天雄【3 5 】等报道云芝糖肽具有明显的抗乙型肝炎病毒作用。中华 猕猴桃多糖具有较强的抗细菌感染的作用t 3 6 】。c o s t u ss p i c a t u s 多糖能抑制毛细血 管通透性的提高，激活噬菌作用，从而发挥抗炎症活性【3 7 1 。t i b e t a nm u s h r o o m 试 验证明，具有抑制肉芽肿组织的形成的作用，从而减轻炎症反应 3 8 】。 3 4多糖的清除自由基、抗氧化功能 近年来的研究表明，许多疾病的发生发展与自由基有密切关系。自由基是生 物体中生化反应的普遍中间介质或称非特异性调节剂，在正常生理情况下活性氧 的产生与清除可维持在一个有利无害的极低水平，但在衰老、应激和疾病的情况 下却发生活性氧对重要生物分子的损伤 3 9 】。当人体内的自由基产生过多或清除过 慢，就会攻击各种细胞、器官并使之受到损伤，加速机体的衰老过程并诱发各种 疾病。羟自由基( o h ) 和超氧阴离子自由基( 0 2 - ) 是生物体内主要的活性氧 自由基，由它所引起的体内脂质过氧化是人类疾病发生和衰老的重要原因。 陈群等人研究发现人参多糖具有抗衰老作用；黄芪多糖可明显降低大鼠血浆 中过氧化脂质的含量，并可使脾脂褐素颗粒分布和凝集力随黄芪多糖的剂量增加 而减少，显示黄芪多糖具有抗衰老作用；枸杞多糖可以提高小鼠心、肝、肺组织 超氧化物岐化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 、总抗氧化能力( t a o c ) 活性，因而具 有延缓衰老活性【2 8 】；芦荟多糖有清除体内0 2 、o h 及h 2 0 2 的自由基功能，间 接的达到抗衰老作用【3 9 】；天麻对肝和肾组织中m d a 含量的抑制率最高，分别为 1 4 5 和1 3 6 【4 0 】；马齿苋多糖有清除体内0 2 - 和o h 自由基功能【4 。 4 薏米的营养保健功能及开发应用 薏米( c o i xl a c h r y m a - j o b i l j v a r f r u m e n t a c e am a k i n o ) 属禾本科植物，又名薏苡 仁或薏仁米，俗称“药王米”、“回回米”、“六谷米”等。薏米主产于中国 3 3 0 n 以南的广大地区。河北、陕西、河南、湖北、湖南、广西等省( 自治区) 产量较多。薏米的籽实、根、茎、叶都可以为人类所利用，其营养价值和药用价 值都是其它植物所不能比的，在禾本科植物中独占鳌头，因此，被誉为“世界禾 本科植物之王 1 4 2 。卫生部现已将薏米列为既是食品又是药品的品种名单，其保 健美容功效同冬菇、灵芝相比毫不逊色。近年来随着保健食品的风行，薏米正日 9 福建农林大学硕士学位论文 慧米多糖结构与理化性质的研究 益成为人们理想的健康营养食品。因此，开发薏米产品具有明显的社会效益和经 济效益。 4 1 薏米的营养保健功能 据报道，薏米是一种营养平衡的谷物。它含有蛋白质1 4 ，脂肪5 ，碳 水化合物6 5 ，粗纤维3 ，钙0 0 7 ，磷0 2 4 2 ，铁0 0 0 1 ，这些成分 的含量均大大超过稻米，所含蛋白质远比米、面高，而且还含有人体所需的亮氨 酸、精氨酸、赖氨酸、酪氨酸等必需氨基酸及矿物质【4 3 】。薏米中含有药用价值很 高的薏八醇及p 丫，两种谷甾醇，这些特殊成分，也就是薏米具有防癌作用的奥 秘所在1 4 4 1 。正常健康人常食薏米食品，既可化湿利尿，又使身体轻捷，还可减少 患癌的几率。 4 2薏米营养保健成分的研究进展 薏米含有多种营养成分，而且易消化吸收，对于老人、产妇、儿童、久病体 虚、病后恢复期患者都是比较好的滋补食物。徐梓辉 4 5 】等利用四氧嘧啶选择性破 坏胰岛1 3 细胞建立糖尿病小鼠模型，结果发现薏米多糖可能有抑制肝糖原分解、 肌糖原酵解，抑制糖异生作用，从而达到使血糖水平降低的目的。薏米淀粉糊比 较稳定，凝沉速度缓慢，较难凝沉，因此不象其他淀粉类制品那样容易老化【4 6 】。 薏米的不饱和脂肪酸含量也较高，还含