（物理化学专业论文）葡萄糖和油脂酸败产物检测传感反应机理研究.pdf

摘要 蕊要 电化学传感器是指感应( 或响应) 生物、化学量，并按一定规律将其转化成电信号 输出的器件或装置，它一直是电分析科学中一个非常活跃的研究前沿。用葡萄糖传感器 测定人体血糖是电化学传感器最重要的应用之一基于纳米表面的葡萄糖传感器是目前 的研究热点和发展方向，本文采用循环伏安，交流阻抗等手段研究了纳米铂修饰电极上 葡萄糖氧化的电子转移反应。 食用油脂在贮藏过程中，由于氧化酸败作用使其丧失风味、营养价值降低，缩短了 货架寿命，并且造成有毒物质的蓄积。因此从油品的安全储存及营养与卫生的角度出发， 有必要对油脂酸败进行深入细致的研究目前是用烦琐的气相色谱和质谱联用进行测 试，而采用简便易行的电化学检测是一种新的思路，本文用调和油和花生油模拟油脂酸 败过程，尝试检测酸败体系的电导和氧化还原性能，为检测油脂质量的电化学传感器的 研发积累信息。 对玻碳电极和铂电极进行不同形式的修饰，制备不同的传感电极，对葡萄糖在 这些电极上的酶催化氧化进行循环伏安测试，结果证明，加入媒介质后，借助于媒介质 的氧化还原峰对葡萄糖的氧化进行观察，电流响应明显，媒介质能够促使电子传递，降 低工作电位，可以排除其它活性物质的干扰；同时修饰纳米铂和葡萄糖氧化酶的工作电 极比其他修饰电极体系所产生的电流大原因是纳米铂有良好的生物相容性、良好的电 子传导能力，并且能够提供更大的表面积、表面反应活性高、表面活性中心多、催化效 率高等特性对不同反应体系的机理进行了初步探讨 对各种电极在空白体系、k 3 f e ( c n ) 6 溶液、葡萄糖溶液中阻抗行为进彳亍了研究。 在不同电压时对葡萄糖溶液进行交流阻抗测试，结果表明葡萄糖氧化存在一个电阻最小 的电位，郾媒介质氧化峰电位，电压控制在此电位时，电极反应所受阻力小，有利于化 学反应的进行。不同浓度的葡萄糖溶液的交流阻抗测试结果表明，随着葡萄糖浓度的增 加，n 1 弹l i s t 图中半圆的直径变大，说明探针矿郇：嘲州嗑电极表面的电子转移过程受 到严重的限制，主要是因为结合到修饰电极表面发生反应的葡萄糖数量增加，使得氧化 还原对田印踟6 p 电极表面电子转移阻力变大一方面增大了矿即：n 瑚柞在通过膜 时的阻力，另一方面，也使呼哟喇) 】排向电极表面扩敖的有效截面积进一步变小。与 前面循环伏安测试结果一致 以花生油和调和油为倒，模拟油脂酸败实验，初步测试了酸败体系的一些参数， 河北师范大学理学硕士学位论文 发现自然酸败体系和模拟酸败体系的电导率均增大，且电导率随酸败产物的浓度的增大 而增加，电导率的变化可给出初步的定性判断。初步讨论了油脂酸败机理，并结合文献 分析和油脂酸败实验提出了鉴别合格食用油的一些方法和防止油脂酸败的一些建议。由 于油脂酸败过程复杂、酸败产物种类繁多，酸败产物的气质色谱图有待于进一步分析， 适合于电化学氧化还原分析的酸败产物的选择有待于进一步探讨。 关键词：葡萄糖氧化酶；纳米铂修饰电极；循环伏安；交流阻抗；油脂酸败； a b s t r a c t e l e e m 劐h e m i e a lb i o s e 耽s o ri sak i n do fe q u i p m e n tw h i c h 啪i n d u c eb i o l o g y 、c h e m i s t r y p a r a m e t e r 锄dt r a n s f o r ms i s m la t s o m el a w s i ti s8 1 1a c t i v ef i e l do fe l c e t r o a n a l y t i a m e a s a m gb l o o ds u g a rb yg l u c o s es t m s o ri 8 姐i m p o r t a n ta p p l i c a t i o no fe l e c t r o c h e m i s t r y 8 日t l s o l r og l u c o s es e n s o r b a s e do nn a n o p a r l i e l ei st h ed e v e l o p m e n td i r e c t i nt h i sp a p 既i ie l e c t r o n l r a m f e rr e s c t i o l lo nd i f f e r td e e t r o d e sh a v eb e e nt 髂锄b ye y e l i ev o l t a m m e t r y ( c v ) a n d e l e e l r o e l a e m i e a li m p e d a n c es p e a r o s 唧y ( e i s ) d i i n gt h ep , = i o do fs t o r e , o x i d a t i o nd e c a ym a d ec d i b l eo i l 妇t h ef l a v o r , r e d u c et l a o v a l u eo f n u t r i t i o n , 矗k ，帆t l a ce d i b l o1 , e , i o aa n da 加柚】l 眦p o i 暑o n o t t l s 瓤由s 咖盹i t s 埘瞄s 锄y 幻d o s l , l ys t u d yt l a ed e c a yo fo i l i ns o m er e s p e c t ss c l la ss a t e8 f o r m a ln o u r i s l m a e n ta n d l a y g i 锄e i ti st e s t e db yg a sc l n o m a t o g r a p l a ya n dm a 鹅s p e c t r o s c o p y ( c , c - m s ) n o s v oc l a e e k i n g b y o l c a z o d a e m i s t r y t e e l m i q u o i s a i i c w i d e a i n t h i s p 獬t l a e p r o e e s s o f o i l , t c c a y h a v e b e e n s i m u l a t e d c o n d u e 纽c ea n do x i d a t i o nc a p a b i l i t yo ft l a i s 町s t e mh a v eb e e nt e s t e d lt h er c s t t l t 8 l a ya f o u n d a t i o nf o rt l a ef i l l t i l e rs t u d yo f an e wt y p eo f d a 曲d 墟衄i s 白【y 靶咀s o c g c a n d p l a t i m m a e l e c t r o d e i s m o d i f i e d b y d i f f e r e l l t w a y s t h e o x i d a t i o n o f g l u c o s e o nt h e s ee l e c t r o d e sh a v eb e e nt e s t e db ye y e l i ev o l t n m m e t r y i fm e d i a t o rw 勰a d d e di n t ot h e s o l u t i o n , t h ec u n 脚tr e s p o l mw a f ti n c r e a s i 蟮b e c a u s eo f t l a ei l p p e l l l a n c eo f o x i d a t i o nle a k , e o r r 唧o n d i n gs i g m ai sq 萄t s i l yt ob ed f v e d lt h e e l e c t r o d em o d i f i e db yn a l l o l n e t e rp tn n d 窖l u o x i d a s oi sb e t t e rt h a nt l a ee l e e t r o d o m o d i f i e db y8 1 u c o s oo x i d a s ea l o n e n 锄m n 耽盯p t w i t l ag o o db i o e a p a b i l i t y , 鲥a b i l i t yf o ro l e e t r o ne o l x l u c t i o n , 丘鹋商匝卸蛔蒯co fw i d e s u r f i 琳a r e a , h i 垂s t l l 把r f i e i a l 嘲蒯a c t i v i t ya n dm o l es u p e r f i c i a la e t i v ec a l t e fs h o w sh i 曲 e a 倒l y t i ca c t i v i t y t h om e c l l a n i s mo f d i f f e r a a ts y s t e m sl l a v eb d m d i s e m s o d t l a ee l e e t r o d a c m i e a lb 平e d 锄s p e c t r o s c o p yo f8 t u c o s co x i d a t i o nn td i f f o r t v o l t a 静h a v eb e e nt e s t e d w h e nt h ev o l t a g ei 8e o l m - o l o d 破m e d i a t o r so x i d a t i o nv o l t a g e , l c a c l j o l l 髓s i s 咖i st l a cm i l l i m l 1 l 也t h ei m p e d n n e cs p e e l r o s e o p yo fd i f f e r e n tg l w o s e o o n c a 吐n 岖咄h a v ob e e nc o m p a r e d w i t ht h oi 1 1 e t c a s e m a l to fg t u c o s ce o n e t r a f i o n , t l a c m m a b e ro fg l l l c o s cm o l o e u l a r sc o n t a c t e dw i t ht 3 1 u e o o x i d 雠h a sb e e ni n c r e a s e d w h e l l f e ( c l q ) 6 3 4 4 - w e n ta c r o s st h ef i l m , a c t i v ed i f f u s i o n 脚鼬b e 咖es m a l l , t h er e a c t i o nr e s i s t m e e i n c r e a s e d , n n dl - i 则j o n 豫s i ：m m o fg l u c , 瑚o x i d a t i o nd e c r e a s e d t h ee l sr e s u l t s 鼬 h i 河北师范大学理学硕士学位论文 c o n s i s t e n t 谢l hc vm e a s t n e m e n t 4 , t h eo i ld e c a ye x p e r i m e n th a sb e e ns i m u l a t e du s i n gp e a n u to i la n ds y n c r e t i co i l 鹪 e x a m p l e s s o m ep a r a m e t e r so ft h ed e c a ys y s t e mh a v eb e e nt e s t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e c o n d u c t a n c eo fo i ld e c a ys y s t e mi n c r e a s e d , a n dw i t ht h ei n c r e a s e m e n to fo nd e c a yp r o d u c t s c o n c e n t r a t i o n , s y s t e mc o n d u c t a n c ea l s oi n c r e a s e d t h em e c h a n i s m sh a v eb e e nb r i e f l y d i s c u s s e d s o m es a g g e s t i o n sa b o u t d i s t i n g u i s h m e n ta n ds t o r a g eo fe d i b l eo nh a v eb e e n g i v e n d u et oc o m p l e xo i ld e c a yp r o c e s sa n dv a r i o u sp r o d u c t s , t h er e s u l t sn e e dt ob ef u r t h c r d i s c u s s e d k e yw o r d s ：g l u c o s eo x i d a s e ；e l e c t r o d e m o d i f i e d b yu s n o m e t e r it ；c y c l c v o l t a m m e t r y ( c v ) ；e l e c t r o c h e m i c a li m p e d a n o es p e e t r o s c o p y ( e i s ) ；o 豇 d e c a y ；, i v 学位论文原创性声明 本人所提交的学位论文葡萄糖和油脂酸败产物检测传感反应机理研 究，是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的原创性成果。除文中 已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰 写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 标明。 本声明的法律后果由本人承担。 论文作者( 签名) ： 2 0 0 7 年5 学位论文原创性确认书 学生挂霞所提交的学位论文葡萄糖和油脂酸败产物检测传感反应 机理研究，是在本人的指导下，由其独立进行研究工作所取得的原创性成 果。除文中已经注明引用的内容外，该论文不包含任何其他个人或集体已 经发表或撰写过的研究成果。 指导教师( 签名) ：砂 琶 2 0 0 7 年5 月2 0 日 第一章绪论 第一章绪论 电化学传感器是指感应( 或响应) 生物、化学量，并按一定规律将其转化成电信号 输出的器件或装置，它一直是分析科学中一个非常活跃的研究前沿。用葡萄糖传感器测 定人体血糖是电化学传感器最重要的应用之一。生物传感器研究起源于2 0 世纪的年 代，1 9 6 7 年u p d d 【e 和h i c k s 把葡萄糖氧化m ( g o x ) 固定化膜和氧电极组装在一起，首先 制成了第一种生物电化学传感器，即葡萄糖酶电极【1 1 。食用油脂在贮藏过程中，由于氧 化酸败作用使其丧失风味、营养价值降低，缩短了货架寿命，并且造成有毒物质的蓄积。 因此从油品的安全储存及营养与卫生的角度出发，有必要对油酸氧化酸败进行深入细致 的研究本章综述了生物传摩器的原理及分类、电流型葡萄糖生物传感器、电极上酶的 固定方法及电子媒介体、并简单概括了油脂的基本结构、油脂氧化类型、评价酸败的指 标以及目前的检测方法。 1 1 生物传感器的原理及分类 在生命过程中，人和动物的代谢作用及各种生理现象大都与电流和电势有关，并具 体表现为无论是能量转化、光和作用、呼吸过程还是基因遗传、疾病防治等都伴随着电 子的转移。作为一门研究电子( 或半导体材科) 一离子以及离子一离子导体界面性质变化 过程与机理的科学，现代电化学已把生命中的电化学反应作为其重要的研究内容。同时， 生命科学也把电化学方法作为重要的实验手段，尤其是伴随着近期两个学科在一些相关 基础理论和实验方法方面所取得的进步，把两者结合起来进行研究更显出其优势。 生物传感器是包括两个彼此密切联系的生化和物理换能器的体系，它能将被铡物的 浓度与可测量的电信号关联起来，其原理如1 1 所示i 刎 被测物质通过扩散进入生物敏感膜层，经分子识别发生生化反应后，所产生的信息 被相应的物理换能器转化成与被测物浓度相关的电信号 被测物 生物敏感膜 生物组分 生物，反应物 或物理性质 物理换能 器电极 与被测物浓度 有关的电信号 圈1 1 生物传感器示意图 起生化换能作用的生物敏感膜又称分子识别元件，是生物传感器的关键部分，是传 感器进行选择性检测的基础，其所含组分可以是酶、组织、细菌、酵母、抗体抗原、脂 河北师范大学理学硕士学位论文 质体、类脂质体及受体。生物传感器按其分子识别元件，可分为酶传感器、免疫传感器、 组织传感器、微生物传感器、细胞传感器，如图l - 2 所示1 4 1 。 图l - 2 生物传感器按分子识别元件分类 物理换能器有很多种，其选择需与生物组分所产生的化学或物理性质相匹配，通常 包括电化学、光谱、热、压电及表面声波技术等。生物传感器按物理换能器的不同进行 分类，如图1 - 3 所示。 图1 - 3 生物传感器按物理换能器分类 其中电化学生物传感器又可以分为电流型电化学传感器、电导型电化学传感器、电 位型电化学传感器三种 1 电流型电化学传感器嘲 当在两电极问施加一定的外加电压时，被检测的电活性物质在电极表面就会发生氧 化还原反应，产生一定的氧化还原电流，此电流的大小在一定范围内与待测物质的量呈 2 第一章绪论 线性关系。电流型电化学传感器选择性的好坏常取决于工作电极所选用的材料以及检测 所施加的电压，用于制作工作电极的材料有很多，如铂、金、碳糊、碳纤维等，其中每 一种材料都有各自的优缺点，具体选择哪一种材料视测定对象而定。电流型电化学传感 器是三种电化学传感器中最易实现、研究最多和应用最广的一种，它为微尺寸范围内电 活性物质的测定提供了一种高灵敏度的方法。现在，它已经被广泛应用于核酸片段、神 经递质、人体代谢产物、氨基酸、多肽、糖、炸药、有机污染物等组分的分析。 2 电导型电化学传感器1 5 1 电导型电化学传感器是一种建立在双电层理论上的传感技术，物质的吸附和表面电 荷的改变对双电层结构都会产生明显影响。当两电极放置在电解质溶液中，电撮- 溶液 界面的行为可近似认为是一个平行板电容器，在两个电极上加上一定电压时，溶液中的 离子在电场作用下发生迁移。从而产生电流，丽此电流的大小与溶液的电导率成正比， 电导率与离子浓度、离子所带电荷、温度等因素有关，当离子电荷和温度等参数恒定时， 通过检测溶液的电导率，可以实现对离子浓度的测定。为了避免电极双电层充电，以及 其它与直流电流有关现象的产生，通常采用交流电源测量溶液的电导。从原理上讲，电 导型电化学传感器应该是最灵敏的电化学检测方法，但由于溶液中电导的测量不是特异 性的，通常溶液中都会有其它的离子存在，从而产生很高的背景信号，这就决定了电导 型电化学传感器更多是适用于对迁移速度快的无机离子和某些有机物质进行分析 3 电位型电化学传摩器1 5 1 电位型电化学传感器主要是指离子选择性电极，其核心部件是传感器的离子选择性 敏感膜，敏感膜把待测溶液和电极内充液分隔开，它能对溶液中被测离子进行选择性响 应，从而弓i 起膜电位的变化，当达到平衡时，膜电位的变化与被测离子活度的关系符合 能斯特( n e r n s t ) 方程，即电位差与溶液中待测离子活度的对数在一定范围内呈线性关 系，通过此关系可实现对待测物质的检测。 1 2 葡萄糖传感器 糖尿病是严重危害人民健康的重大疾病之一。其发病率为7 - 1 0 ，全世界约有数亿 人患此病，国内该病群体规模也已超过4 0 0 0 万人，占人口总数的4 左右。它表现为血 3 河北师范大学理学硕士学位论文 液和尿液中葡萄糖含量的异常，通过调控病人体内的葡萄糖代谢可以对糖尿病加以控 制。快速、准确、可靠地检测血糖则是诊断、医治糖尿病的先决条件。迄今为止尚无根 治糖尿病的治疗方法。但糖尿病并非十分可怕，患者只要通过自我保健和合理用药，使 血糖维持在正常的范围内，即可控制病情，大大减少发生并发症的几率，血液葡萄糖含 量是临床给药的一个重要指标，公认的血液葡萄糖含量检测方法由化验师在化验室完 成。将采集到的病人血样经预处理后加入相关化学试剂，待反应完成再用大型生化分析 仪进行检测，所得测试结果准确度高，但检测时间长、需血量大、且操作复杂，不利于 病人自我监护便携式血糖测试仪能够克服上述缺陷，完成血糖浓度快速简便的检测， 以实现病人的血糖自我监测，它将生物传感器技术、微型计算机技术以及微电子技术相 结合，可完成血糖浓度快速简便的检测，而且用血量极少。此外，随着人民生活水平的 不断提高和健康意识、时间意识的增强，人们希望临宋实验室检查日益快捷、准确，最 终能实现家庭自检。 1 2 1 电流型葡萄糖生物传摩器 1 2 1 1 引言 1 9 6 2 年c l a r k 和l y o n s 在纽约自然科学学会的论文集中首次提出了“在化学电极的 敏感膜中加入酶以实现对目标物进行选择性分析”的设想。i l ，d j k c 和h i c k s 于1 9 6 7 年 报道了测定生物组织和溶液中的葡萄糖的第一支酶电极“1 。该电极的闯世标志着生物传 感器的诞生。 在生物传感器中，与电化学基础电极相结合的电化学生物传感器始终占有最重要的 地位，这类传感器又成为生物电极，它发展早，普及快，研究内容丰富血液中的葡萄 糖浓度的测定在医学上有着极其重要的意义。所以生物电极中能简便快速准确测定葡萄 糖浓度的葡萄糖氧化酶电极的研究自第一支葡萄糖氧化酶电极诞生之日起一直为人们 关注的热点。酶电极是一种把酶膜固定在电化学传感器表面构成的最普通的酶基电化学 生物传感器。酶选择性的催化生化反应，生成或消耗一种可被电极测定的物质，当反应 达到稳态时，电活性物质的浓度可以通过电位或电流模式进行测定。 电化学式酶生物传感器把固定化酶和电化学传感器结合在一起，因而具有独特的优 点：1 它既有不溶性酶体系的优点，又具有电化学电极的高灵敏度；2 由于酶的专一性， 使其具有很高的选择性。 4 第一章绪论 1 2 1 2 血糖测试原理 酶电极，由酶膜和电极结合而成。在单片机的控制下，通过检测酶电极对血样响应 电流的大小快速测定血糖浓度。便携式血糖测试仪所用的葡萄糖氧化酶印刷电极如图 1 4 所示阐 图l - 4 葡萄糖氧化酶电极的结构 酶电极的测试原理如下：在印刷电极两端施加o 3 v 的恒定工作电压，当被涌血样滴 在电极的测试区后，电极上的固定化葡萄糖氧化酶与血样中的葡萄糖发生化学反应。经 过一定的滞后期( 约2 0 s ) ，在特定条件下，酶电极的响应电流将与被测血样中葡萄糖浓 度呈线性关系。血糖仪控毒9 器就是通过这一对应关系来计算显示血样葡萄糖浓度值的。 酶电极传感器的性能对于血糖浓度测试精度有着重要影响。基础电极特性、酶的活性、 酶的稳定性、酶膜厚度、酶的固定化和制备、底物浓度、p h 值、温度等都会直接影响酶 电极的工作特性 1 2 1 3 葡萄糖传感器发展的三个阶段 葡萄糖氧化酶电催化研究经历了三个发展阶段，即以氧为中继体的电催化，基于人 造媒介体的电催化和直接电催化 第一代；以氧为中继体的电催化 电极通过检测h 2 0 2 浓度的变化或氧的消耗量来测定底物。但该类葡萄糖酶电极抗 于扰性差，对氧分压有很大的依赖性所以其选择性差，线性范围窄，灵敏度低 为了克服上述葡萄糖酶电极的缺点，科技工作者开始关注第二代电流型葡萄糖酶生 物传感器即介体型酶生物传感器，它是以人造电子媒介体为基础的电催化： 第二代：基于人造中继体的电催化 电子媒介体( 即电子转移媒介体) 指能将酶反应过程中产生的电子从酶的活性中心 转移到电极表面，使电极产生相应电流变化的分予导电体，它促使电子传递，降低工作 电位，可以排除其它活性物质的干扰。目前，人们正在不断努力寻找新的性能优异的电 子媒介体，这有力地推动了介体型葡萄糖氧化酶生物传感器的研究，关于电子媒介体的 5 河北师范大学理学硕士学位论文 介绍详见1 2 3 。 此外，葡萄糖氧化酶易溶于水且性质不稳定，只有通过适当的固定化方法才能使其 在保持活性的前提下处于不易脱落状态同基础电极组装在一起而得以反复使用。所以固 定葡萄糖氧化酶膜是葡萄糖氧化酶生物传感器研究的关键环节1 7 1 2 1 ，关于电极上酶的固 定方法详见1 2 2 第三代：直接电催化 前两种类型的电催化并没有本质的区别，它们都需要中继体作为电子受体( 或供体) 才能完成催化循环，因此属于间接电催化；而直接电催化电极本身就是电子的受体( 或 供体) ，在这里，酶与电极之间直接进行电子交换而完成催化循环。 1 2 1 4 葡萄糖氧化酶 酶作为研究最为深入的生物敏感材料，它与底物的分子识别具有以下特征： 酶是能催化特定分子( 底物) 的化学反应的蛋白质分子它具有高效、特异的催化 功能，其催化过程如下： e + s = e s p + e 在整个过程中，第一个步骤就是酶与底物之间的分子识别。酶催化的特异性充分说 明了酶的极强的分子识别能力。同时，酶还将分子识别与分子转化双重功能有机的结合 起来。 酶这一分子识别系统已被广泛地应用于生物传感器中，这表现在酶在电化学传感 器、光化学传感器和质量敏感传感器中的普遍应用。酶这一分子识别系统对于分子传感 器研究的重要意义在于：第一：由于酶的分子识别功能，酶本身就可以成为分子传感器 的敏感材料，而且为分子传感器中分子识别部分提供了个良好的分子识别模型。第- - ： 利用酶的催化功能，使其成为信号产生的重要组成。可以在分子传感器上引入酶标记， 通过酶的反应产生信号，或使传感器的信号得以间接放大【1 3 1 葡萄糖氧化酶是对n 葡萄糖具有高度专一的催化氧化作用，其主要的两种来源 为黑瞌霉菌( a s p e r g i l l m n i g h ) 和灰绿霉菌( p e n i c i l l i u m g l u o u c u m ) ，葡萄糖氧化酶分 子量为1 5 0 - 1 8 0 k d a 的二聚体，其结构包括5 8 0 4 - 氨基酸残基，f a d 辅因子，卜n 乙酰氨 基葡萄糖残基，3 个甘露耱残基和1 5 2 个溶剂分子，压单元的解离可能只在变性条件下发 生，并伴随着辅酶f a d 的损失。辅酶在氧化还原反应中起重要的作用，氧化还原酶在进 6 第一章绪论 行催化作用的过程中辅酶实际上起到电子和质子中间体的作用，即辅酶n 通过它的氧 化态和还原态的不断循环而实现其功能氧化还原中心f a d 在拓扑学上与其他f a d 键合 蛋白非常相似。 1 2 2 电极上酶的固定化方法 电流型酶传感器的酶限定或附着在转换器即电极上而构成所谓的酶电极，是种化 学修饰电极因此，同常规固定化酶相比，电极上酶的固定化具有这样一些特征；1 固 定化酶是与电极紧密接触的；2 通过适当地控制固定化酶的微环境( 即通过化学修饰电 极表面) 可获得很多要求的性质，如增加的稳定性、高灵敏度、快速的响应、高取样速 率；3 固定酶的电极的尺寸、形状和表面性能方面具有较大的灵活性；4 防止溶液中其 他物质的干扰和对电极表面的玷污等。因此，酶电极制各的关键技术就是酶的固定化， 印在电极表面覆着一层敏感膜。膜的厚度、致密性、均匀度与分子捧列的有序性等因素 对酶电极的性能也有一定的影响。目前，固定方法很多，常用的有吸附法、组合法、共 价键合法、交联法、包埋法等。 吸附法：吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。物理吸附法即将含有酶的溶液 滴在电极表面，溶剂自然挥于。此法简单，操作条件温私，但由于生物分子与固体表面 结合力弱，易泄露或解脱，稳定性差，目前较少使用。离子交换吸附法是选用具有离子 交换性质的载体，在适宜的阴值下，使生物分子与离子交换剂通过离子键结合起来，形 成固定化层。常用这类载体有二乙胺乙基纤维素、阴离子交换树脂等 组合法t 组合法是酶和电极材料简单地混合以制备固定化酶电极的一种方法典型 的是酶碳糊电极。另一种是有机导电盐傲电极材料与酶混合制得的酶电极。此电极制作 简单，电极表面可更新，缺点是电极表面不均匀，重现性差，酶有泄露，用酶量大，电 极不易微型化。改进的方法有先将酶共价固定在甲壳素粉上，然后同碳粉及石蜡油组成 酶碳糊电极 交联法：通过采用双功能团试剂如戊二醛等，在酶分子之间、酶分子与凝胶聚合 物之间交联形成网状结构而使酶固定化的一种方法。由于交联剂对酶有一定的破坏，现 在较少单独使用，经常与其他方法结合使用。 7 河北师范大学理学硬士学位论文 共价键合法：共价键合法实际上是一种表面修饰，基质可以是转换器即电极本身或 另外一种能够在其操作中沉积到电极表面的聚合物材料，即通过共价键将酶直接结合到 电极表面。如马来酸酐共聚物，甲基丙烯酸酸酐共聚物及其衍生物，或其他带有- o h ， n h 2 ，s h ，- c o o h 等功能基团的聚合物材料以薄层的形式沉积到整个电极上。通过单 体或其衍生物共聚合，或者通过与预聚物直接反应，可以将功能性基团加到聚合物上， 酶通过氨基酸残基进行结合。在利用天然材料如甲壳素、丝素蛋白等固定酶时，通常也 是用共价键合法，通过酶的氨基酸残基与其上的酰基共价结合的。共价键合法的优点是 酶结合的牢固，稳定性好。酶固定的稳定性与其他方法相比是最好的是发展方向 凝胶聚合物包埋法：包埋法是将生物组分包埋于高分子三维空间网状结构中，形 成稳定生物组分敏感膜。实际上是酶在凝胶聚合物基体中的物理保留人们已经对许 多种聚合物作为捕集酶的基质进行了全面的研究，如明胶、环糊精、聚苯胺、聚氯乙烯、 及其他许多聚合物以及胶体，利用他们的单体聚合时将酶起包埋其中此法的优点是： 乱可采用温和的实验条件及多种凝胶，聚合物：b 大部分酶可很容易地掺入聚合物膜中， 一般不产生化学修饰；c 由于没有化学变化，对酶活性影响较小；d 膜的孔径和几何形 状较易控制；e 包埋的酶比较牢固，并可结合其他固定化方法如共价键合和交联进一步 改进包埋的稳定性；可固定高浓度的活性生物组分等2 0 世纪8 睥代到9 睥代用于生 物传感器中酶包埋的技术主要是有机聚合物凝胶包埋。但是由于有机凝胶在水中的溶胀 性使得其包埋效果不理想 电化学沉积法：电化学沉积法是制各配合物及一般无机物化学修饰电极的通用方 法。该法要求在进行电化学氧化还原时，能在电极表面产生难溶物薄膜。这种膜在进行 电化学及其它测试时，中心离子和外界离子氧化态的变化不导致膜的破坏。 为适应药物分析、基因检测及生命科学发展的需要，将功能分子以适当方式修饰到 电极上，制备出选择性好、灵敏度高、有一定寿命且可再生的电化学传感器依然是分析 工作者努力探索的课题【1 4 1 。 无机多孔材料具有物理刚性、化学惰性、好的生物兼容性及热稳定性，又具有低温 制备及在水中和有机溶剂中几乎不溶胀等优点 除上述几种方法外，还有利用生物亲合素等方法目前来看，包埋法应用较多，两 种方法结合使用更是发展方向n 1 闫 8 第一章绪论 1 2 3 电子媒介体 电子媒介体( 又称电子转移媒介体，媒介体等) 是指能将酶反应过程中产生的电子从 酶反应中心转移到电极表匾，从而使电极产生相应电流变化的分子导电体。耳前使用的 电子媒介体按分子结构特点和分子量大小可分为有机小分子媒介体和高分子媒介体。有 机小分子媒介体主要包括以下几类：二茂铁及其衍生物、有机染料、醌及其衍生物、四 硫富瓦烯c 兀d 、富勒烯和导电有机盐等；高分子媒介体主要包括变价过渡金属离子螯 合型高分子媒介体、氧化还原型高分子媒介体、单体聚合型高分子媒介体和包络型高分 子媒介体4 种 1 2 3 1 有机小分子媒介体 1 二茂铁及其衍生物 二茂铁及其衍生物之所以能在生物学、医学、微生物学等方面得到广泛应用，这是 由它们结构和性质的特殊性决定的【伟狮首先，二茂铁及其衍生物具有亲油性，使得这， 些化合物毖顺利地通过细胞膜，从而与细胞内的各种酶、删a 、删a 等物质起作用；其次， 二茂铁及其衍生物具有氧化还原可逆性，这特点使其在生物酶的作用下能参与各种代 谢作用；第三，二茂铁及其衍生物的芳香性使得这些化合物能像简单的芳环化合物一样， 容易发生取代反应。但是，它们不同于一般的芳香化合物，二茂铁及其衍生物的夹心结 构使这类分子具有一定的厚度，这特点能阻止二茂铁及其衍生物接近某些酶的活性部 位，因而具有选择性l l 刀；另外，二茂铁及其衍生物的低毒性也是人们对其感兴趣的原因 为了得到性能更加优良的酶电极，出现了双二茂铁衍生物电予媒介体【1 s - 2 0 l 。这类化 合物含有可以与电极表面的某些空轨道交叠的共轭互电子，因而可以被强烈地吸附在基 体电极上，又由于化合物含有2 个电子活性基团，因而可增加修饰电极表面的电子活性 基团的浓度。另外，此类化合物比较容易形成l a 端嘲斑膜，从两为媒介体修饰电极找到 了新的方向。用分子组装技术修饰电极是将能够成膜的电活性物质以单分子层或多分子 层排列固定在电极上，可以制得用其他方法难以得到的薄得多的修饰电极，这类电极的 重现性好，其单分子层修饰电极可以使电子活性二茂铁基充分发挥催化效应。 2 有机染料分子 血红素蛋白分子空间结构庞大，电活性中心不易暴露，同时这些分子在电极上吸附 强烈而造成电极的钝化，因而其在普通电极上的电子转移速率很低，得不到有效的电流 9 河北师范大学理学硕士学位论文 响应。常用的有机染料电子媒介体还有甲苯胺蓝、亚甲基蓝、甲基紫精和中性红等。 以染料分子为电子媒介体的传感器具有的共同特征为：选择性高、灵敏度高、稳定 性好和电流响应快及传感器制备简便等特点【2 l - 2 4 1 。 3 四硫富瓦烯 r i f 的氧化还原可逆性很好，是一种很好的介体物质。以t r f 为媒介体的酶电极具 有许多优异的性能，如灵敏度高、响应速度快、稳定性好以及对固定化酶无毒等特点 嗍水溶液中经历两个单电子氧化步骤，生成1 1 矿和1 渺，其中第一个氧化反 应是可逆的。在酶电极反应中，1 1 矿和1 都能氧化葡萄糖氧化酶中的辅酶f a d h 2 ， 但传感器的工作电位不宜超过+ o 4 、厂，这是因为在该条件下，只有兀矿氧化辅酶f a d h 2 ， 这样的体系比较简单，且由于工作电位低，电活性物质造成的干扰较小。此外，电子媒 介体兀f 的氧化还原活性受磷酸缓冲溶液p 壬i 值的影响，其最佳应用p h i 是7 5 4 金属单质粉末 利用金属粉末作为电子媒介体的报道也已出现泌明。在其他固酶条件相同时，加入 a g 颗粒后的酶电极响应电流约提高了4 0 倍。用泛醌和苯醌作电子媒介体制得的葡萄糖传 感器具有操作电位低、干扰少和响应快等特点 一种具有代表性的微型化葡萄糖传感器的制备方法是在铂丝表面电化学沉积铂黑 和g o o f 臻咖。铂黑微粒具有高度分散性，有很大的表面积，对i l 如有很强的催化活性，同 时对g o d 有很强的吸附能力，这样翩备的葡萄糖传感器有很高的灵敏度和极快的电流响 应( 达l o 傩响应仅需3 s ) 。 l o 3 2 高分子媒介体 高分子媒介体通常是由小分子媒介体与高分子链所带的活性基团进行反应固载生 成的，由于高分子链间的相互缠结或交联从根本上消除了媒介体的扩散流失闯题，保证 了酶传感器具有稳定的响应 i 变价过渡金属离子螯合型高分子媒介体 常用的螯合型高分子媒介体化合物有3 种，即含铁型、含锇型和含钌型 为了加快酶活性中心与电极表面之间的电子传输速度，通常将小分子导电体通过化 l o 第一章绪论 学键键合到具有充分柔性的聚硅烷为主链的高分子载体上，连接主链与小分子媒介体的 链段长度越大，响应电流值越大。即其电子传输能力越强。这是因为硅氧烷聚合物的主 链柔性非常好，并且连在主链上的媒介体有比较大的活动自由度，这就便利了媒介体在 酶与电极之间的扩散，使媒介体与酶活性中心和电极表面接触次数的几率大为提高，从 而提高了电子传递速率 2 氧化还原聚合物型高分子媒介体 将蒽、醌类物质键合到高分子链上形成的氧化还原聚合物是高分子媒介体的又一表 现形式 3 单体聚合型高分子媒介体 单体聚合型高分子媒介体主要是含乙烯基的电活性单体的聚合物，如聚乙烯基二茂 铁、聚乙烯基毗啶、和络离子的聚合物等，这类媒介体带有非常丰富的正电荷，可以同 多种带负电荷的酶分子形成绮合物保证酶分子与媒介体有良好的接触。而由染料分子经 电化学聚合法制得的染料聚合物用作电子媒介体则是最新的研究动向。 t 由染料聚合物修饰电极制备的传感器同单分子层膜修饰的电极相比，具有更高的催 化活性和灵敏度，这是因为它们本身具有较强的导电作用，并呈现三维的立体结构而出 现的体积效应的缘故。 4 包络型高分子媒介体 可应用的阳离子染料有吩嗪、亚甲基蓝、甲苯胺蓝、中性红等。此外还有一种特殊 的媒介体形式酶的媒介体修饰。酶的媒介体修饰是指通过媒介体上的功能基团与酶分 子上的氨基等基团反应，实现媒介体在酶分子上蠹臼固定化，从而使酶与媒介体作用迸行 电子传递。此传感器具有2 个突出优点：( 1 ) 用锇修饰的酶分子更加稳定，不存在媒介体 和酶分子的流失问题；( 2 ) 与用二茂铁修饰的酶分子相比，用锇修饰的酶分子媒介体的 氧化还原动力学更快媒介体在酶分子上的修饰会使酶的生物活性有所下降。但这种修 饰方法可能会使酶电极的微型化变成现实f 3 河北师豇大学理学硬士学位论文 1 3 油脂酸败及检测简介 1 3 1 引言 油脂对于人们的重要意义仅次于粮食，同时也是工业生产十分重要的可再生性原 料。过去人们一直很注重油脂的自氧化和抗氧化的研究，对如何保护和提高油脂的质量 做了大量的工作，但是有关油脂( 深度) 氧化后结构变化、物理化学性能的变化和表征的 研究并不多，涉及油脂的氧化研究主要表现在定性的推测上从2 0 世纪以来，已有许 多研究者从不同的方面对油脂作了分析和研究。如对油脂的氧化、酸败、聚合等作了许 多推测和定性分析，其中以环氧化研究的成果比较突出。2 0 世纪过去了，但有关油脂 氧化机理的系统研究，如定量化和仪器表征的进展不突出。这与天然油脂结构的复杂性 有关。另外难以找到相似的模拟分子，加之对氧化过程的认识和表征方式也存在缺陷， 这些在某种程度上也妨碍了研究的进展。 油脂是由脂肪酸和甘油组成的酚类，它的性质取决于脂肪酸的结构，按结构不同把 脂肪酸分成饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸两大类。天然油脂中大部分都含有一定量的不饱 和脂肪酸，如花生油含3 2 - 7 5 ，豆油含8 0 - 8 8 。因为不饱和脂肪酸中的不饱和结构能 被空气氧化而生成过氧化物。所以脂肪酸的不饱和结构是油脂能被氧化的内在条件，而 空气、光线和油中的杂质对油脂的氧化起促进作用是外部条件圈。 1 3 2 油脂的基本结构 基本组成 3 3 - 3 s 1 植物油主要成分为甘油三脂肪酸醺( 简称甘油三酸脂) ，其示意分子式可表示为： a 如c h x 墓l g h - o o c p , , c h 2 0 0 c r 3 r 1 3 是脂肪链，脂肪酸基r l - 3 c o o - 是体现油类性质的主要部分，不同的油脂其差别 就在于r 1 3 脂肪链，r l 、r 2 、r 3 代表三种可以相同、也可以不同的脂肪链部分。天然油 脂的分子量大约6 9 0 - 9 7 0 ，其中脂肪酸基占总重量的9 4 - 9 6 。因此油脂的物理化学性质， 主要取决分子中所含的脂肪酸及其与甘油连接的方式。除了甘油三酸脂之外，植物油中 还含有一些非脂肪组分，如磷脂、固醇、色素等类物质一般统称为油中的杂质。 天然甘油三酸脂构型特点：脂肪酸中的碳原子总数，最低为六碳酸( 椰子油中， 第一章绪论 g i h i l c o o h ) ，最高为二十四碳酸( 常见于花生油中，c n d - 1 4 7 c o o h ，它们的总数一般为 偶数，此外脂肪酸烃基碳链大都为直链，具有环状或支链结构的脂肪酸极少。碳链的捧 列如： c c c c c 的形式，两键链空间的夹角为1 2 0 。，是一个四面体高碳数脂肪酸的这种直链结构， 使它在油润皮纤维之后，油分子闯互相牵连结合，伸缩性较大，所以使皮纤维之间易滑 动，具有良好的柔韧性。 植物油的主要成分为甘油三酸脂，其分子构型并不捧列在同一个平面上，而是以甘 油基为中心，脂肪酸基向- - - + 不同的轴向伸展出去的线状体，所以在它们之间引入了活 性基之后，就有可能会形成, - r o t 的网状结构自然界的甘油三酸脂，大多数不是由单一 种脂肪酸所构成的简单酯，丽是不同的脂肪酸形成的混合酸酯。它们可能具有许多种不 同的异构体。根据计算，一种含有5 种脂肪酸的植物油，可以存在7 5 种不同构成的甘油三a 酸脂；而如果有1 0 种脂肪酸同时存在的话，就可能5 5 0 种不同的甘油三酸脂类型，这种混 合甘油三酸脂的存在，比之单一的甘油三酸脂，制得的加脂剂含有更复杂的性能。 1 3 3 油脂氧化类型 油脂空气氧化过程可分为两种：一是有酶或细菌介入的氧化，二是有空气参与的空 气氧化。分为自动氧化和光氧化两种。随着技术发展，酶和细菌的氧化问题己可以基本 解决。而自动氧化和光氧化却不易防止，因为反应所需的能阙很低目前油脂氧化酸败 的机理众说纷纭。存在着几种主要的说法，现归纳如下s 油脂酸败发生的原因和变化的机理不同，大体可分为三种类型： i 水解性酸败：由于食品被微生物污染或本身存在有水解酶系，都能使食品中油腊 发生了水解反应，生成甘油和游离脂肪酸游离脂肪酸