（生物医学工程专业论文）乙醇脱氢酶菌株的选育及其动力学特性研究.pdf

重庆大学硕十学位论文 中文摘要 4 ) a d h 的部分酶学性质研究。将a d h 在不同p h 值的缓冲体系保温相同时 间测定其活性，得到它的氧化乙醇最适p h 值为7 0 。在同一缓冲体系中不同温度 f 对a d h 保温，测定酶活性，结果该a d h 可以耐高温，最适温度为6 0 。c 。金属 离子对a d h 酶活有一定的影响，k + 对a d h 有促进作用，二价金属离子对a d h 有不同程度的抑制作用，但z n ”对a d h 没有影响；a d h 在f e 3 一溶液中极不稳定， 产生沉淀。 关键词：醋酸杆菌，动力学，乙醇脱氢酶，提取，酶学特性 垩瘗查堂堡圭堂垡笙皇 銎壅塑薹 a b s t r a c t a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) i st h ek e ye n z y m eo ft h ep r i m a r ys h o r t c h a i na l c o h o l m e t a b o l i s mi n m a n yo r g a n i s m sw h i c hh a s a t t r a c t e d g r e a t a t t e n t i o nb e c a u s eo fi t s p e c u l i a rc a t a l y s i s a tp r e s e n tr e p o r t sa b o u t t h ea p p l i c a t i o no fa d hi n c r e a s e dg r a d u a l l y h o w e v e rt h ec o m m e r c i a la d hw a so b t a i n e df r o ml i v e r so fa n i m a l sm o s t e l yw h i c hw a s c o s t l y a n dl i m i t e d b ym e i r s o u r s e t h e r e f o r ei ti sa n i m p o r t a n tw a yt os e p a r a t e m i c r o o r g a n i s u mw h i c hh a sh i g ha d ha c t i v i t yt or e a l i z et h es c a l ep r o d u c t i o no fa d h a n dt h ew a yh a sa g o o df o r e g r o u n d 。 i ti s n e c e s s a r y t oi n d u s t r i a l i z et h e a d h - p r o d u c t i o n - s t r a i n t or e a l i z et h es c a l e p r o d u c t i o no f a d h s oe n o u g hk n o w l e d g et ot h eg r o w t ha n ds u b s t r a t - c o n s u m ek i n e t i c f e a t u r e a d h - p r o d u c t i o n s t r a i n i sn e e d e d 。r e s e a r c ho nt h i sr e s p e c tw a ss e l d o m r e p o r t e d i nt h i sa r t i c l eas t r a i no f e t h a n o l c o n s u m i n gb a c t e r i ap r o d u c i n ga d h i d e n t i f i e da s a c e t o b a c t e rw a ss e p a r a t e d t h er e a c t i o nk i n e t i c so f a e e t o b a c t e ra n ds o m eo f t h ea d h b i o c h e m i c a lp r o p e r t i e sw e r es t u d i e d t h er e s e a r c hn o t o n l yp r o v i d e ds o m er e l i a b l e r e f e r e n c ea n dm e s s a g ef o rt h ec o n t i n u o u sc u l t u r et h e n l a r g e s c a l ep r o d u c t i o n o f a e e t o b a c t ez 1 2 7r e s e a r c hb u ta l s of o u n db a s i sf o rt h ef u r t h e rs t u d ya n da p p l i c a t i o no f a c e t o b a c t ez 1 2 7a d h h e r es h o w st h em a i n m e t h o d s ，c o n t e n ta n dc o n c u l s i o no f t h er e s e a r c h 1 ) t h es e l e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no f b a c t e r i ap r o d u c i n ga d h t h eb a c t e r i as a m p l e g o t t e nw a sc u l t u r e di nt h em e d i u m w i t he t h a n o la si t ss o l ec a r b o ns o u r s e s e p a r a t et h e b a c t e r i ab e i n ga b l et ou t i l i z ee t h a n o le f f i c i e n t l yb yg r a d s t r a i n i n gm e t h o d ( t oi n c r e a s e e t h a n o lc o n s i s t e n c eg r a d u a l l yi nt h ec u l t u r em e d i u m ) t h e ni d e n t i f yt h es e p a r a t e d b a c t e r i aa c c o r d i n gt oi t ss h a p ef e a t u r ea n dt h ep h y s i o l o g i c a lb i o c h e m i c a lr e a c t i o nr e s u l t s ， a st h er e s u l tas t r a i no fb a c t e r i aw h i c hc o u l dc o n s u m ee t h a n o le f f i c i e n t l yw a ss e l e c t e d a n di d e n t i f i e da sa c e t o b a c t e r i ti san e ws t r a i no f a c e t o b a c t e rb e c a u s ei t sp h y s i o l o g i c a l a n db i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i cd i d n tm a t c ht ot h a to f a n ye x i t i n gs t r a i no f a c e t o b a c t e r g e n u s t h e r e f o r e i tw a sn a m e da c e t o b a c t e rz 1 2 7i nt h e p r o j e c t t h ee t h a n o lc o n s i s t e n c e a c e t o b a c t e r z l2 7c o u l du t i l i z ew a sl e s st h a n0 6 m o l l t h eo p t i m a le t h a n o lc o n s i s t e n c e f o rt h eg r o w t ho fa c e t o b a c t e r z l 2 7w a s0 4 m o t l 2 ) r e a c t i o nk i n e t i c so f a c e t o b a c t e rz 1 2 7 t h em e c h a n i s mo f e e l lg r o w t hw a ss t u d i e d w i t hm o n o dm o d e lb a s e do nt h e t h e o r y o fb i o c h e m i c a lr e a c t i o nk i n e t i c s t h e i i i 里鏖叁堂耍堂丝堡兰 墨皇塑鐾 b i o d y n a m i cf o r m u l aw a sf o r m e d t od e s c r i b et h ec o n s u n l ec o u r s eo fe t h a n 0 1 i ta c c o r d e d w i t ht h es u b s t r a t 。c o n s u m em o d e lw h i c hi n c l u d e st h ee n d o g e n e s i sm e t a b o l i s m r e l a t e d p a r a m e t e r si nt h et w om o d l ew e r et e s t e d t h ep r o o f - t e s t s h o w e dt b a tt h et w om o d e l f o r m e dc o u l dr e f l e c tt h el a wo f a c e t o b a c t e rz i 2 7g r o w t ha n de t h a n o ld e g r a d a t i o n ， 3 1t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no fa c e t o b a c t e rz 1 2 7a d h f o u rm e t h o d sw e r e e m p l o y e dt o i s o l a t ea d hf r o ma c e t o b a c t e rz 12 7j u s tt of i n db a c t e r i o l y t i cs o l u t i o n c o u l db r e a kc e l le f f i c i e n t l ya n dm a i n t a i na d h a c t i v i t ys i m u l t a n e o u s l ya n dt h u si tw a s s u i t a b l ef o rt h ee x t r a c t i o no f a c e t o b a c t e rz 1 2 7a d h a d hw a s p u r e d5 4 9f o l dw i t ha f i n a ly i e l do f4 8 0 9 b yb a c t e r i o l y t i cs o l u t i o nc r u d ee x t r a c t , ( n h 4 ) 2 s 0 4f r a c t i o n a t i o n s e p h a d e x g l 0 0c h r o m a t o g r a p h yt h em o l e c u l a rw e i g to fa c e t o b a c t e rz 12 7a d hw a s 2 8 0k d aj u d g e db ys d s p a g ew h i c hw a ss i m i l a rt ot h ee n t a m o e b ah i s t o l y t i c a a d h ( 3 1 0k n a ) r e p o r t e d 4 、r e s e a r c ho i lp a r t so fa d h p r o p e r t i e s i n c u b a t ea d h s o l u t i o ni nb u f f e rs y s t e m w i t hd i f f e r e n tp hv a l u ea t3 7 | 。cf o r2 0 r a i nt h e nm e a s u r et h ea c t i v i t y t h eo p t i m u m p h a d ho x i d a t ee t h a n 0 1i s7 0 a n dl n c u b a t ea d hs o l u t i o ni nt h es a m eb u f k r s y s t e ma t d i f f e r e n tt e m p e r a t u r ei u s tt of i n da e e t o b a c t ez 12 7a d hc o u l dt o l e r a n c et h e r m a la n d t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r ew a s6 0 m e t a li o nh a de f f e c to na c e t o b a e t ez 1 2 7a d h a c t i v i t y k a l i u mi o ni n h a n c e da d h a c t i v i t yb u tb i v a l e n tm e t a li o nr e s t r a i n e di t sa c t i v i t y a td i f f e r e n td e g r e e z i n ei o nd i d n ta f f e c ta d h a c t i v i t yj u s tb e c a u s e i tw a sac o f a c t e ro f a d h a d hw a sd e n a t u r e d t e r r i b l yi nf e ”s o l u t i o n k e y w o r d s ：a c e t o b a c t ez 1 2 7 ，k i n e t i c s ，a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，e x t r a c t i o n ， e n z y m e f e a t u r e v 重庆大学硕士学位论文英文缩略词和符号说明 英文缩略词 a d h n a d ( h ) n a d p ( h ) p q q a l d h o d e d t a t e m e d p m s f s d s p a g e 英文缩略词和符号说明 a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u e l e o t i d e p h o s e p h a t e p y r r o l o q u i n o l i n eq u i n o n e a l d e h y d ed e h y d r o g e n a s e o p t i c a ld e n s i t y e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d t e t r a r n e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e p h e n y l m e t h y ls u l f o n y lf l u o r i d e s o d i u m d o d e c y ls u b p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e ld l e c t r o p h o r e s i s 乙醇脱氢酶 烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸 吡咯喹啉醌 乙醛脱氢酶 光密度 乙二胺四乙酸 四甲基乙二胺 苯甲基磺酰氟 十二烷基硫酸钠一聚丙稀酰 胺凝胶电泳 符号说明 c x 一培养液中细胞浓度( g l ) c s 一培养液中细胞浓度( g l ) k s - - 底物半饱和常数( m o l l ) h 一细胞生长速率( g l 。h ) 。 带一乙醇消耗速率( m o l l h ) 。 “一细胞生长比速率( h 。1 ) u n i x 最大比生长速率。 耵一乙醇消耗比速率( h 。1 ) 如，一对基质的总消耗而言的细胞得率，即总的细胞得率。 y 2 z ，s 一对细胞生长所消耗基质而言的细胞得率，可称为最大细胞得率 m 一称为细胞维持系数，其单位为g ( g h ) v i l l 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 1绪论 1 1 引言 乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s ea d h ) 是一类分布广泛的含锌金属酶，以 n a d 4 、n a d p 7 或p q q 为辅酶。a d h 广泛分布于大自然中，在人和哺乳动物的肝 脏、植物组织、及微生物细胞中都有发现。a d h 具有广泛的底物特异性，是许多 有机体中的主要短链醇代谢的关键酶，它的生理作用在于可逆的催化氧化短链醇、 芳香醇等为相应的羧基化合物。在哺乳动物体内，a d h 和乙醛脱氢酶( a l d h ) 构成了乙醇代谢的主要氧化通道，是体内乙醇代谢的主要限速因素【2 】，a d h 主要 催化乙醇生成乙醛，是人和动物各种器官和组织内乙醇的氧化过程中的第一步， 因此在解酒以及防止乙醇引起的肝损伤方面具有重要意义；植物a d h 足其无氧呼 吸的主要酶，乙醇发酵是根系厌氧胁迫时的主要产能途径，a d h 则是关键酶之 【3 j ，因此植物a d h 的主要生理作用是通过巴斯德效应维持较高的熊荷来延长植株 在缺氧条件下的存活时间 4 】，它对植物在缺氧条件下的应激是非常重要的 ”，另外， 其它方面，在番茄果实的成熟和软化以及植物芳香气味的产生过程中，a d h 都发 挥了重要作用【6 。微生物体内，a d h 是主要的短链醇代谢的关键酶，可逆的催化 氧化短链醇、芳香醇等为相应的羧基化合物，在不同的微生物中，其生理作用有 所不同 7 - 9 。 a d h 因其特殊的催化性质，在社会生产和生活的应用目益广泛，主要用作乙醇 生物传感器、化工生产中的优良生物催化剂等。然而现有的商品a d h 大多从动物 肝脏中获得，其资源有限，价格昂贵d o 。我国所用的商品a d h 大多依赖进口，在 一定程度上限制了对a d h 的应用研究。因此，为了拓展a d h 的来源，以可以无限 再生的微生物为资源，从中提取a d i - i 前景是十分广阔的。 筛选产高活性a d h 的微生物，从中提取纯化a d i t ，是实现a d h 大规模生产的 条重要途径。但是要实现a d h 的规模生产，必须使产a d h 的菌株实现工业化生产， 因此需要对产a d i i 菌株的生长及底物消耗的动力学过程进行充分的认识。f j 前国 内外在这方面的研究较为欠缺。 1 2a d h 的国内外现状 早在1 9 8 4 年，人们就知道了马肝a d t l 的三维结构，到日前为止，已经发现了 8 5 种a d h 同工酶，国外对这些a d h 的结构、功能、生化性质及等进行了广泛的 研究，其中部分马肝a d h 、人体a d h 以及少量微生物来源的a d h 同一i ：酶已经实 现了_ _ _ j ：程化【1 1 】。另外因为a d h 潜在j l f 勺应用价值，从微生物中提取a d h 成为科学 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 工作者的研究热点。 1 2 1a d h 的提取纯化 目前从动物肝脏提取纯化a b h 的工艺比较成熟，但其资源有限，再生周期较 氏，因此人们考虑从可以无限再生的微生物中提取a d t t ，降低其生产成本。国外在 这方面做了不少工作，而国内仪有少量报道。 国外科学工作者从超高温好氧古细菌h y p e r t h e r r n o p h i l i ca r c h a e o n 、梭菌属的 c l o s t r i d i u mb e i j e r i n c k i 、古硫细菌a r c h a e o ns u t f o l o b u ss o - 砌t a r i c u s 及它的几种突变 体、假单胞菌p s e u d o m o n a s a e r u g i n o s a 、乳酸菌l a c t o b a c i l l u s b r e v i s 等十余种微生 物中提取a d h 均实现了工程化，这些a d h 的三维结构、亚基组成等研究比较透 彻( 1 ”。另外一些从微生物中提取a d h 的研究正在开展，未实现工程化。a n n a m a r i a g u a 西i a r d i 等【1 2 】以嗜热杆菌b a c i l l u ss t e r o t h e r m o p h i l u s 为出发菌株经离子交换层析、 两次亲和层析电泳纯的a d h ，收率为3 0 ，该a d h 为亚单位3 7 k d a 的四聚体a d h ， 总的分子量为1 5 8k d a ，等电点为4 9 。s u c k - - y o u n g y o o n 等【1 1 从t h r o m o m i c r o b i u m r o s e u m 中纯化出来的a d h 为同型二聚体，其亚单位为4 3k d a ，该a d h 等电点为6 2 ， 最适口h 值1 0 0 。n a l l e l yc a b r e r a 等 1 3 l 用锌离子亲和层析从阿米巴属的e n t a m o e b a h i s t o l y t i c a 和酵母中提取的a d h 均为四聚体，其亚单位分子量分别为3 1 k d a 和3 9 k d a ， 前者以n a d p + 为辅酶而后者以n a d + 为辅酶。 在我国华侨大学的李夏兰等 1 4 - 1 5 1 分别做了不同的酵母菌中a d h 的破碎、提取 研究，探索出几种不同的提取a d h 的方法，其中温和化学渗透法破碎酵母细胞， 能维持a d h 的高活性。廉德君【16 等研究了酵母醇脱氢酶a d hi 的纯化及动力学， 结果可以纯化2 0 0 倍，得到4 7 的收率。 从微生物中提取a d h 的研究在国外取得了一定的成绩，国内的研究起步较晚。 迄今为止，我们知道的微生物有1 0 万余种，而得到开发利用的微生物种数才占到 l 【】”，可见从自然界中筛选产高活性a d h 的微生物并提取a d h 有广阔的发展 空间。 1 2 2 不同来源的a d h 的研究 当前学者们对人和马肝、果蝇、小鼠的a d h 等研究较多，在蛋白质数据库中， 迄今为止已经有2 5 种马肝a d h 同工酶的结构、功能等生化特性的报道，人体a d h 在已有基础上有新的发现。微生物来源的a d h 中，酵母a d h 和一些嗜温菌的报道 较多。 人和动物来源的a d h 人体a d h 为：二聚体蛋白质，具有基因多肽性和多种同工酶形式( a d h s ) ，由2 个分子量各为3 4 k d a 的亚单位组成。现已发现至少有5 种结构基因( a d h 。、a d t i ：、 a d h ”a d h 一、a d h j ) 编码人体a d i i ，即由它们产生8 个多肽距单位( 、1 3 。、p ：、 重庆大学硕j 二学位论文 1 绪论 b 。、y 、y 。、x ) ，再由这些亚单位成对组合成不同的a d ht _ ：- 聚体。 根据蛋白质结构、亲电子性、酶促动力学特征，将a d h 分为三类。i 类a d h s 同工酶由基因a d h l 、a d h 2 、a d h 3 分别编码产生，各种a d h 酶均由a 、0 、v 亚单位中的任何2 个随机组合而成，对乙醇氧化具有很高的亲和力，它较i i 类和 i i i 类a d h s 对乙醇代谢有更火的作用。i i 类a d h s 同工酶是一种新的分子形式 兀一a d h ，已经在人体肝脏中分离，这种同工酶对吡唑的抑制作用彳i 敏感，7 c a d h 由a d h 2 编码，它能特异地氧化脂肪族和芳香族氏链乙醇，它不能氧化甲醇。一a d h 也是一种二聚体，它的同源二聚体形式( 瓤) 也存在于人体肝脏。i i i 类a d h s 同 二酶在淀粉凝胶电泳a d h 活性带只朝正极移动，这些酶被命名为x - a d h ( c h i a d h ) 。) c - a d h 是由a d h 5 产生，它和i 类和i i 类a d h s 分子式相比，目前 已经肯定在生理状态下这些i 类a d h s 同工酶对肝脏乙醇氧化代谢的作用不大， 只是某些长链乙醇如芳香族乙醇是通过x - a d h 来氧化。 】8 人体a d h 以氧化型的n a d 。为辅酶，位于细胞的胞浆内。在肝脏，a d h 主 要分布于中枢周围的肝细胞；在肾脏，a d h 主要分布在小肾上皮；胃肠道中a d h 主要分布在粘膜内。a d h 也分布在大脑组织和小脑的浦肯野细胞内，还具有很高 活性。 a d h 有两个结构域，其中一个是催化区域，它在结构巾十分易变，另一个是 结合核苷酸区域，形成多肽链折叠结构。a d h 只有在结合非蛋白组分( 辅助因子 c o n c m r ) 后才表现出酶的活性，其辅助因子为n a d + 与z n 2 + 。每个a d h 亚单位被 一个几乎全部以疏水残基连接的“口袋”隔开，起催化作用的锌原子连接在口袋 “底部”，另一个锌原子则通过扭曲的半胱氨酸硫原子连接成四面体形式f 1 3 】。 马肝a d h 为二聚体蛋白，对乙醇的最适反应温度为2 5 c ，在p h 为8 6 9 0 范围内。马肝a d h 同：j 二酶能使多种醛还原成相应的醇【l 。 小鼠的i i 类同工酶及其突变体于2 0 0 0 年得到其蛋白质晶体结构，另外对果蝇 a d h 有4 种同工酶发现，它们均以n a d 为辅酶，分别催化环己酮、戊酮、醋酸、 丙酮的还原j 。 微生物来源的m ) h 微生物来源的a d h 中，酵母和一些嗜温细菌a d h 的报道较多，不同微生物来 源的a d h 分子量、催化特性等有所不同。 酵母醇脱氢酶( y e a s ta l c o h o ld e h y d r o g e n a s ey a d h ) ，是一条分子量为1 4 5k d a 的四聚体，每条肽链上结合一个n a d + 和一个z n ”。面包酵母y a d h 有3 种同工酶： y a d h - l 、y a d h 一2 、y a d h - 3 。y a d h 一1 是在厌氧发酵时才表达；y a d h 一2 是绌胞 质组成成分，为葡萄糖所抑制；y a d h 一3 则在线粒体中发现，在成长的酵母细胞巾 y a d h 1 占了酵母y a d h 活性的主要部分。y a d h 1 和y a d h 一3 的动力学性质相似， 永庆入学硕 ：学位论文1 绪论 y a d h 一2 对乙醇和乙醛的底物专一性较高，且米氏常数较低。y a d h 催化图1 1 所示 的氧化还原实验，在自然p h 值下，反应平衡偏向左边。y a d h 的底物专一性限于 不分支的n 一醇，侧链有分支的醇会减小酶活性，降低其催化效率。目前为止， 乙醇是y a d h 最好的底物，y a d h 对甲醇活性很小，但烯丙醇和苯丙烯醇也是 y a d h 极好的底物。举例说明。掘报道y a d h 对甘油、甘油醛、和丙酮醇的催化活 性很差，苯甲醇和苯甲醛更差【2 0 1 。 一+ 哪一鞠+ 糊坩 k 斟1 1y a d h 催化反应 大多数微生物中提取纯化的a d h 为二聚体，但也有一些为四聚体。脚帕l o b u s s o 抛s a d h ( s s a d h ) 第一个中链a d h 家族古细菌酶，它的三维结构已有报道。它 是依赖n a d ( f ) 的氧化还原酶，具有广泛的底物特异性，在高温下较稳定。它的网 聚体由两个典型的二聚体组成，侮个亚单位由两个域构成，辅酶结合域采用罗斯 式( r o s s m a n n ) 折叠，催化反应结构域中结合两个锌离予( 一个起催化作用，另 。个维持结构) 。一条s s a d h 单体折叠与哺乳动物、细菌a d h s 非常相似，主要的 区别在于总体结构的底物口袋的裂缝大小，两个活性位点与起维持结构作用的锌 离子的协调作用不同1 2 ”。 些a d h 以p q q 为辅酶，它们电子传递途径上有差别。许多革兰氏阴性菌能 在好氧条件下含醇的培养基中生长，可以诱导a d h 以及吡咯喹啉醌( p q q ) 的产 生。依赖p q q 的a d h 位于细胞外，而依赖n a d l 的a d h 位于细胞内。依赖p 0 0 的 a d h 可分为两类：醌蛋白类的酶，它传递电子到一系列可溶性的细胞色素c ；血醌 蛋白a d h ，在其多聚肽链的羧基端有一个细胞色素c 的结构域。 p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s aa t c c l 7 9 3 3 在乙醇培养基上生长时，产生一种醌蛋 白乙醇脱氢酶a d h ( q e d h ) 和周质细胞色素c 55 0 c 5 5 0 通过一种未知的膜成分调 节c o 型的细胞色素氧化酶与q e d h 之间的电子传递。q e d h 为p s e u d o m o n s a e r u g i n o s a 在乙醇培养基上诱导产生；以p q q 为辅助因子，该酶被纯化，其酶学性 质与可溶性的醌蛋白甲醇脱氢酶( q m d h ) 相似。它是亚基6 0 k d a 的同型二聚体。 植物来源的a d h 己醇脱氢酶是植物组织中较为普遍存在的酶，在种子中含量较高，尤其在吸 账的种子或幼苗中有较高活性。现在，已从马铃薯、豌豆种子、玉米、小麦、番 茄等多种植物组织中分离纯化了乙醇脱氢酶，其生物化学及分子生物学特性的研 4 重庆大学硕+ 学位论文 l 绪论 究取得了初步的成绩拉“。 u k a z uo l u o h a 等【2 4 研究了洋芋块茎的储存条件对其中a d h 活性的影响，他提 取了3 种不同的a d h 同工酶，分予量分别为6 0 k d a 、7 0k d a 、5 8k d a 。j i ms p e i r s 等【2 5 1 对2 种番茄a d h 同工酶进行了报道，其中a d h l 的表达受发育程度的调控， 只在花粉、种子、小枝芽中发现；a d h 2 在低氧分压和成熟时果皮中有所累积。a d h 2 在发育中对几种主要的香味和果实成熟时芳香化合物的产生有重要作用。j o a q u i n j 等 2 6 】从橄榄果的果皮组织中提取了3 种a d h 同工酶，它们都以己醛为底物，其中 一种以n a d + 为辅酶，对己醛的k m 为2 1 m m ，另外两种以n a d p 为辅酶，对己 醛的k m 分别为1 9 r a m 、o 0 4 r a m ，这些酶在六碳醇等芳香族化合物的合成中起着 重要的作用。 综上所述，动、植物以及微生物a d h 已从多种原料中分离出来，其特性、结 构、功能及生理意义的研究较多。随着科技的进步和酶工程发展，a d h 的应用研 究逐渐引起人们的高度重视。 1 2 3a d h 的应用 a d t t 由于其特殊的生理作用，被广泛应用于医学分析、工业生产和科学研究等 方面。目前a d h 的应用研究主要集中在以一卜几个方面：1 ) 利用a d h 对乙醇的催 化氧化，制作乙醇生物传感器应用于临床诊断、工业分析等。2 ) 化工生产中，利 用其广泛的底物专一性，合成或修饰许多原材料及中问反应物等。3 ) 根据a d h 是人体内催化乙醇氧化的主要酶之一，丌发新型生物解酒保肝药物。 a d i i 用于乙醇生物传感器 在医药、生物技术、食品工业中乙醇的分析非常重要，特别在白酒_ l ：业中葡 萄糖和乙醇以及其它关键化合物共同决定着白酒的质量、风味，因此实时、选择 性的监控很有必要。目前，分析乙醇浓度的方法通常为蒸馏法、气相色谱法等， 蒸馏法费时费力，操作复杂；气相色谱法不能实时跟踪2 ”。近年来，以生物电极 为传感器分析乙醇浓度的研究表明，它具有选择性好、微型化、灵敏度高、测量 简便、快速等优点，因而，受到科学工作者的重视，各种酶电极应用而生 2 8 。已 有的分析乙醇的生物传感器用到的酶有氧化还原酶、乙醇氧化酶、依赖n a d + 的 a d h 、依赖p q q 的a d h 。 吕跃钢等 2 9 】进行了酵母乙醇脱氢酶制作电极的研究，他们应用碳糊固定破壁 的酵母粉( 含a d h ) 和n a d l 制作电极，避免了纯化a d h 的过程，节约成本。用该 电极分析乙醇选择性较好，甲醇、叔丁醇、异戊醇的干扰分别为1 2 、2 o 、3 4 ，醋酸和葡萄糖不干扰乙醇的测定。 m a s a o g 等p ”1 报道了将a d h 、n a d + 均固定在p t 为基底的p v c 膜上的非介体型乙醇传 感器。施清照等 3 u 报道了电流型乙醇生物传感器的研制与应用。该传感器以健合 重庆大学硕士学位论文 1 绪沦 型耐尔蓝a ( n b a ) 修饰浸蜡石墨电极为基体电极，将乙醇脱氢酶及n a d + 固定在人 造丝网上，成为一种无试剂的乙醇生物传感器。在p h 8 8 的t r i s h c l 介质中，该传 感器的响应电流与乙醇浓度在0 1 0 1 0 n m a o l l 范围内有良好的线性关系，响应时 间为3 0 s ；用该传感器测定了人血清中乙醇的含量，结果满意。 a l e x a n d r o sc h 等 3 2 】在填充床反应器的生物传感器上填充依赖n a d + 的脱氢酶， 通过分光光度和荧光光度法在3 4 0 r i m 波长下监控n a d h 的生成而达到分析底物浓 度的目的，n a d h 氧化产生的电流在安培计上显示。 多数乙醇和葡萄糖生物传感器以氧化酶或依赖n a d + 的脱氢酶为基石：f 制作。但 这些酶普遍稳定性较低，氧化酶对样品中不同的氧浓度较敏感，依赖n a d + 的脱氧 酶涉及到辅酶的再生。依赖p q q 的脱氢酶是一个较好的选择，凶为它们催化电子 从底物向电子接受体传递，而不是向氧传递，从而可以设计样品中不受对氧浓度 影响的一些底物的传感器，因此以它为基础的生物传感器的构建较容易。 j u l i j ar a z u m i e n e 等【3 3 j 以二络铁基苯酚( f p ) 为依赖p q q 的葡萄糖脱氢酶 ( g d h ) 、a d h 与碳极之间的电子传递体，对葡萄糖、乙醇生物传感器电极进行 修正，修正后的碳电极灵敏度增高、稳定性较好。m i h a e l an i c u l e s c u 等1 2 8 搬道了一 种新的乙醇传感器的构造、最优化应用条件，该传感器基于醌类血红蛋白a d h 与 其它化合物组成的复合体系，优化后的传感器可以灵活自动地进行白酒分析，实 时监控白酒发酵过程。 自从g u i l b a u l ta n d n a n j o 在1 9 7 5 年制造了第一个安培计乙醇传感器 2 ”，已经有 许多乙醇生物传感器的报道，国内外对乙醇脱氢酶电极的研究取得一定成就。但 是纯度较高的乙醇脱氢酶成本较高，一般所报道的乙醇传感器的寿命相对短，主 要因为酶本身的稳定性差，还有设备的结构限制，如测定体系中需要添j j i n a d + 等， 这些困难都有待研究人员去克服。 a d h 用于化工生产 a d h 具有广泛的底物特异性，催化短链醇的氧化与羧基化合物如乙醛、酮的还 原，因此它可以在化工中用作优良的生物催化剂合成或修饰许多原材料、中间产 物以及手性化合物。微生物来源的a d h 因其在化工合成中潜在的应用价值而成为研 究热点 1 】。但它的稳定性较差，在实际应用中受到限制。固定化是提高酶的稳定性 一个有效的方法，许多有机无机物被用作维持酶活性的材料。 d o n g h w a n g c h e n 等人f 3 4 】用磁微球作为酶载体包被酵母乙醇脱氯酶( y a d h ) ， 研究 y a d h 的磁微球制作方法及其对2 一丁酮的还原动力学特性。磁微球的包被 率为1 0 0 ，经磁微球包裹的y a d h 可维持6 2 的活性，在2 h i l l 可再利用1 3 次，稳 定性较未包被前大大增强。他们还用水a o t 异辛烷形成的水一油微乳滴作为有机 媒介，成功将y a d h 匿 定于f e 3 0 4 毫微粒中【3 5 ，观察了结合态的y a d h 在有机媒介 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 中的催化特征，在7 5 。c 时，残留酶活5 日5 6 ，稳定性提高1 0 倍。 温度是影响酶稳定性的一个重要因素，科学家们设法筛选耐高温的菌株，以 期从中提取耐高温的a d h 。来自t h r o m o m i c r o b i u mr o s e u m 的a d h ，主要氧化a 一醇， 对乙醇、n 一丙醇、巴豆醇表现出底物专r 一陛；以乙醇为底物时反应速率最大， k m 为2 4 2 m m ，该a d h 在高温下稳定，这一点在化工合成中非常有利。嗜热杆菌 b a c i l l u ss t e r o t h e r m o p h i l u s 中的a d h 稳定性较好，在6 0 。c 时，对乙醇、三碳到五碳 的a 一醇、b 醇以及烯丙醇、苯丙稀醇、苯甲醇等一些芳香醇都有很高的催化 活性，对相应的醛、酮催化活性相对低，对乙醛的催化活性最高，对苯甲醛的催 化活性仅次于乙醛。它还可以抗多种变性剂，耐8 5 高温，是一种可以作为化工 生产的优良催化剂 1 2 】。 a d h 用于解酒 目前，酗酒和酒精中毒已成为一个严重的公共卫生问题。虽然适量饮酒有利 于身体健康，但急性大量饮酒可引起恶心、呕吐等不良反应，严重者失去知觉甚 至死亡。长期饮洒还可引起肝损伤、脑损伤等疾病，严重影响人们的身心健康f 3 。 因此，研究开发有效的解酒产品受到各国政府和人民的普遍重视。 乙醇在人体内由消化道吸收，大约7 5 9 8 的乙醇在肝脏中分解，剩下的 小部分经l 肾脏和肺脏排出。在肝脏中，促进乙醇代谢的两种主要酶是a d h 与乙醛 脱氢酶( a l d h ) ，这两种酶由于基因多态性，存在者明显的种族差异。与白种人 相比，东方人( 中国、日本人) 体内的非典型a d h 表现出高催化活性，而氧化乙 醛的a l d h 2 异常或缺失者所占比例较大，因此，东方人彳i 能迅速代谢由乙醇代谢 产生的乙醛，造成乙醇的不耐受现象 3 7 - 3 8 。所以丌发高活性的a d h 与a l d h 可 以作为解酒药研究的一个重要方向。国内外在这方面的报道较少。 c a r m e nl i z a n o 口9 等应用电穿孔技术将a d h 与a l d h 联合包埋于人的红细胞中 ( a d h a l d h r b c s ) ，做体外消耗乙醇研究，人的a d h - - a l d h r b c s 包埋 体在体温条件下相对稳定，可以降低血中乙醇浓度，揭示了用人的红细胞做载体 包埋a d h a u ) h 的体内研究的可能性。随后他们用同样的方法做了小鼠的红细 胞体内包埋研究，对急性乙醇中毒小鼠进行a d h a l d h r b c s 处理 4 0 1 。结果表 明，小鼠血中乙醇浓度较对照组低4 3 ，其乙醇消除量高达0 3 9m l m i n ，较对照组 高0 1 9 m l m i n ，因此包被a d h + a l d h 的红细胞可以作为潜在的载体系统清除由于 过量饮酒引起体内高浓度的乙醇。 在我闺，a d h 用于解酒的报道较少。农科院的陈廷伟等 4 1 坡明出种含醇脱氢 酶解酒防醉保肝饮料。他们选用一种产乙醇脱氢酶活性较强的乳酸菌，可由此制 成酸奶、果茶饮料或从中提取a d h 制成口服液，饮酒时服用使其在胃壁形成粘膜 保护层，乙醇在酶的作用下部分消耗，这样可以阻止乙醇迅速进入血液伤及肝脏。 重庆人学硕士学位论文 1 绪论 对a d t t 的应用研究除了以上三大方而，还有其它特殊的应用。最近t o k u m i t s u o m 等4 2 1 发现几种蘑菇中含有高活性的a d h ，将其用于酒精饮料的发酵生产。蘑 菇中含有丰富的纤维素、蛋白质、维生素等，还可以抗癌症和血栓，实验结果表 明用蘑菇发酵生产的酒精饮料具有抗癌症和血栓活性，乙醇含量可与酵母发酵相 比。 总之，利用