（材料学专业论文）聚乙二醇及其衍生物改性聚氨酯表面的血液相容性研究.pdf

武汉理工大学硕士学位论文 中文摘要 本论文是通过化学接枝的方法，用聚乙二醇及其衍生物对聚氨酯表面进行修 饰，研究改性前后聚氨酯表面的血液相容性。通过采用不同种类和分子量的聚乙 二醇及其衍生物对聚氨酯膜进行表面接枝改性，研究了聚乙二醇链的不同端基、 分子量、接枝密度及链段取向对改性后表面抗蛋白质吸附能力的影响。 对不同分子量聚乙二醇( p e g ) 和单甲氧基聚7 - - 醇( m p e g ) 接枝后表面的 研究表明，随着聚7 , - - 酵或单甲氧基聚7 _ , - - 醇分子量的增加，接枝后的表面抗蛋 白质( 纤维蛋白原和人血清白蛋白) 吸附的能力均先下降而后上升，其中分子量 为4 0 0 、2 0 0 0 的聚乙二醇和3 5 0 、2 0 0 0 的单甲氧基聚乙二醇改性的蛋白质吸附量 相对较低。可见，表面接枝聚乙二醇链段的长度和接枝密度均对蛋白质吸附有重 要影响。 在逐步混合接枝单苄氧基聚7 , - - 醇p e g ) 和p e g 或m p e g 的研究中发现， 虽然两步混合接枝后所得表面的接枝密度均高于单纯用单苄氧基聚乙二醇改性 1 2 h 后的表面，但其表面的亲水性却均有所下降，且蛋白质吸附量均明显提高。 在进一步研究b p e g 接枝时间对所得表面的亲水性和蛋白质吸附量的影响中也 发现，随着接枝时间的不断增加，亲水性和蛋白质吸附量均呈现先降低而后上升 的变化趋势。这可能是由于接枝密度引起单苄氧基聚乙二醇链段在水环境中的空 间取向造成的。 此外，通过聚乙二醇末端的活性官能团，负载上具有特殊功能的氨基酸制备 特殊的生物活性表面是本论文的一个主要创新点。将醛基末端的聚乙二醇接枝在 聚氨酯表面，通过醛基和氨基的反应将氨基酸固定在表面上，使其能选择性的吸 附纤维蛋白溶解酶原。在蛋白质吸附和溶解血栓能力的测试中发现，该生物活性 表面不仅具有较好的抗蛋白质吸附能力，而且具有很强的溶解初生血栓的能力。 这种表面的双重功能是由聚7 , - - 醇和末端负载的氨基酸的共同作用所决定的。 本论文的研究对后续的生物医用材料血液相容性的理论研究和应用开发具 有一定的借鉴意义，希望能将成功的想法推广到各种生物医用材料的表面，解决 生物医用材料一直悬而未解的血液相容性难题，并在实际应用中有所突破。 关键词：聚氨酯，聚乙二醇，接枝改性，血液相容性，抗凝血性，溶解血栓 武汉理工大学硕士学位论文 a b s tt a c t ht h i ss t u d y , t h es e f a c e so fp o l y u r e t h a n ef i l m sw e f em o t t l e db yp o l y ( e t h y l e n e g l y c 0 1 ) ( p e o ) a n dp e g - d e r i v a t i v e s ，a n db l o o dc o m p a t i b i l i t yo fr e s u l t i n gs u r f a c e s w a si n v e s t i g a t e d v a r i o u sp e ga n dp e g - d e r i v a t i v e sw e r eg r a f t e dt op o l y u r e t h a n e s u r f a c e sb yc o v a l e n tb o n d s t h ee f f e c to ff a c t o r si n c l u d i n ge n d - g r o u p ，m o l e c u l a r w e i g h t , g r a f gd e m i 哆, o r i e n t a t i o n so fp e g d e r i v a t i v e so np r o t e i na d s o r p t i o nt o m o d i f i e ds u r f a c e sw e r es t u d i e d i tw a so b s e r v e dt h a tt h ep r o t e i n a d s o r p t i o n o fp e ga n d m o n o m e t h y l p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ) ( m p e g ) m o d i f i e ds u r f a c e si n c r e a s e da f t e rad e c r e a s i n gw i t ht h e m o l e c u l a rw e i g h to fp e go rm p e gi n c r e a s i n g p e g ( m n - - 4 0 0 , 2 0 0 0 ) - g r a f t e da n d m p e g ( m n = 3 5 0 ，2 0 0 0 ) - g r a f t e ds u r f a c e sp o s s e s s e dl o w e rv a l u eo fp r o t e i na d s o r p t i o n t h a nt h a to fo t h e rs u r f a c e s i tm e 锄st h a tt h ep r o t e i na d s o r p t i o ni sg r e a t l yi n f l u e n c e d b yg r a nd e n s i t ya n dc h a i nl e n g t ho f p e go rm p e g b o t hm o n o b e n z y l o x yp o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( b p e g ) w i 血p e go rb p e gw i t h m p e gm o d i f i e ds u r f a c e sw e a c h i e v e db yf i l l i n gb a c kt h ep e ga n dm p e gt ob p e g g r a f t e dt h es u r f a c e s a l t h o u g ht h i sk i n do fs u r f a c e sp o s s e s s e dh i g h e rg r a f td e n s i t yt h a n t h es i l r f a c e sm o d i f i e db yb p e go n l yf o r1 2 h ，i ts h o w sh i g h e rw a t e rc o n t a c ta n g l ea n d p m t e i na d s o r p t i o n w ef t l r t h e rs t u d i e dt h ee f f e c to f r e a c t i o nt i m eo nh y d r o p h i l i c i t ya n d p r o t e i na d s o r p t i o no fb p e gm o d i f i e ds u r f a c e t h eh y d r o p h i l i c i t ya n dp r o t e i n a d s o r p t i o ni n c r e a s e da f t e rd e c r e a s i n gt oam i n i n l u n lv a l u ew i t ht h er e a c t i o nt i m e i n c 舢e a n o t h e ri m p o r t a n ti n n o v a t i v ep o i n ti no u rr e s e a r c hi st op r e p a r eab i o a e t i v e s u r f a c eb yc o n j u g a t i n gas p e c i a la m i n oa c i dw h i c hi sh i g l l l y 删t i v et op l a s m i n o g e n t h r o u o iap e g s p a c e r i nt h i ss y s t e m ，p e gc o u l ds u p p r e s st h en o n - s p e c i f i cp r o t e i n a d s o r p t i o nw h i l et h ea m i n oa c i dc o u l db i n dp l a s m i n o g e nt od e g r a d ef i b r i ni na n e v o l v i n gc l o t i ti sh o p e dt h a to u tr e s e a r c hw i l lb e n e f i tt ot h er e s e a r c h e r sw h oa r ew o r k i n gi n t h ef i e l do f b l o o dc o m p a t i b l em a t e r i a l s ，a n dw ea l s oh o p et h a tt h i ss u c c e s s f u li d e ac a n b ea p p l i e dt oo t l l e rb i o m a t e r i a l ss u r f a c e k e yw o r d s ：p o l y u r e t h a n e ；p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ；b l o o d - c o m p a t i b i l i t y ；a n t i t h r o m b l l s ； p l a s m ac l o tl y s i s 此页若属实请申请人及导师签名。 独创性声明 本人声明，所星交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢 的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果， 也不包含为获得武汉理工大学或其它教育机构的学位或证书而使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：b 、3 主鏖日期 关于论文使用授权的说明 本人完全了解武汉理工大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅； 学校可以公布论文的全部内容，可以采用影印、缩印或其他复制 手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 研究生签 注：请将 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 生物医用材料 1 1 1 生物医用材料 第1 章绪论 生物材料的使用，最早可追溯到2 0 0 0 多年前古代中国人和罗马人采用黄金 在齿科修复中的应用上，但对于生物材料的定义直到2 0 世纪才给出来，1 9 8 2 年 w i l l i a m s 在 p r o g r e s si nb i o m e d i c a le n g i n e e r i n g 一书中指出，任何用于 治疗、修复或替代活体组织、器官或增进其功能的天然的或合成的材料都属于生 物医用材料“3 。生物材料是一种植入活体或与活体相接触的材料，因此与其它材 料相比生物医用材料有着以下基本特点啪： ( 1 ) 生物材料必须具有无毒性( n o n - t o x i c i t y ) ，不会引起溶血、免疫反应 和炎症反应等。 ( 2 ) 生物材料必须要有基本的功能性( f u n c t i o n a l i t y ) ，才能作为受损器官 或组织的替代物或修补物。 ( 3 ) 生物材料必须具备可消毒性( s t e r i l i z a b i l i t y ) ，可以用压力锅、臭氧、 射线等方法进行消毒。 ( 4 ) 材料必须具备很好的血液相容性( b l o o d c o m p a t i b i l i t y ) 。 ( 5 ) 要有足够的强度，如抗压、抗弯强度，并且要易于手术移植。 另外，对于某些先进生物医用材料而言，还必须具备可降解性( d e g r a d a b i l i t y ) 。 在物质文化高度发展的今天，生物医用材料的应用日益广泛起来，到目前为 止，各种各样的生物医用产品已达1 8 0 0 多种。表1 1 为目前主要研究和应用的生物 医用材料及应用领域。 由表1 - 1 可知，生物医用材料按材料质地主要分为生物医用金属材料( 含合 金) 、生物医用高分子材料、生物医用陶瓷材料和生物衍生材料脚。其中生物医 用高分子材料在生物医用材料中起着非常重要的作用。 1 1 2 生物医用高分子材料 生物医用高分子材料，顾名思义，即以医用为目的的高分子材料。和其它生 物材料相比，生物医用高分子材料有两个比较显著的优点：其一，容易加工成型， 使用范围广泛，既可以作为软组织材料，又可以作为硬组织材料；其二，生物体 组织、细胞、体液有形成份等均为天然高分子，因此，生物医用高分子材料在各 项性能上均与生物体组织比较接近，这使生物医用高分子材料制成的人工器官长 武汉理工大学硕士学位论文 表卜1 生物医用材料及其应用领域“1 m a t e r i a lc l a s s m a t e r i a i a p p l i c a t i o n s m e t a l sa n da l l o y ss t e e l t i t a n i u m g o l da l l o y s s i l v e r c e r a m i c sa n dg l a s s e sc a l c i u mp h o s p h a t e b i o a c t i v eg l a s s p o r t e l a i n f r a c t u r ec o r r e c t i o n ，b o n e a r t i c u l a rr e p l a c e m e n t d e n t a lr e p l a c e m e n t , p a c e - m a k e r s ，e n c y s t e m d e n t a li m p l a n t s a n t i b a c t e r i a l b o n er e g e n e r a t i o n b o n er e p l a c e m e n t d e n t u r e s p o l y m e r sp o l y e t h y l e n e a r t i e u l a rr e p l a c e m e n t p o l y p r o p y l e n e s u t u r em a t e r i a l s l d o l y t e t r a f l u o r o e t h y l e n e v a s c u l a rg r a f t s p o l y e s t e r v a s c u l a rg r a f t s ，r e s o r b a b l es y s t e m s p o l y u r e t h a r i e s b l o o dc o n t a c td e v i c e s p o l y v i n y lc h l o r i d e t u b e sa n db a g s p o l y m e t h y l m e t h a e r y l a t ei n t r a o c u l a rl e n s e s p o l y a c r y l a t ed e l l t a l i m p l a n t s s i l i c o ns o f tt i s s u er e p l a c e m e n t , o p h t h a l m o l o g y h y d r o g e l so p h t h a l m o l o g y 久的作为人体器官的替代物成为可能。随着生活水平和科技实力的不断提高和进 步，天然生物医用高分子材料已远远不能满足飞速发展的社会需求。为此，合成 生物医用高分子材料便迅速发展起来，其大体经历了自发应用和有目的分子设计 两个阶段。第一阶段始于1 9 3 7 年用工业甲基丙稀酸甲酯制造义齿的牙床。当时， 在医学上的自发应用中所用到的高分子材料都是工业上已有的现成材料：第二阶 段始于1 9 5 3 年医用级有机硅橡胶的出现，及随后发展起来的聚羟基乙酸酯合成 以及四种不同抗凝血聚( 醚一氨) 酯心血管材料，从此便进入了以高分子材料工 程研究为基础的发展时期。 迄今为止，生物医用高分子材料在人工器官、医药以及医疗器件等方面的研 究与临床应用己取得了令人瞩目的成果。用于人工器官的高分子材料除了不能作 为大脑神经胃肠分泌腺的制备材料外，其它各种器官都可用它代替。此外高分 子生物材料还用于医疗器件包括导管，注射筒，输液袋，缝合线等器具医用 粘合剂，诊断用固定化生理活性物质，固定化酶以及生物传感器等如表卜1 所 示) 在生物医用材料中，有一类材料是应用于与血液相接触部位，习惯上称为血 液相接触性生物材料。经过长期的研究发现，对于生物医用高分子材料而言，聚 氨酯材料是最为优秀的血液相接触材料之一。如表卜i 所示，其主要应用于血液 接触性器件上。 2 武汉理工大学硕士学位论文 1 1 3 生物医用聚氨酯材料 目前，生物医用高分子材料的研究和开发已成为推动现代医学进步和提高临 床水平的重要领域。与人体血液环境相接触的血液相容性材料始终是研究的焦 点。聚氨酯材料具有优异的韧性、弹性、耐磨性能和较好的微生物稳定性、生物 相容性及抗凝血性等，是研究最为广泛的抗凝血医用高分子材料之一。1 9 6 7 年， b o r e t o r 和p i e t r c e 等“首次成功地将这类嵌段聚醚聚氨酯弹性体植入狗体内。此 后，人们研究开发了大量的嵌段聚氨酯生物医用材料，并形成了一系列具有实用 价值的商品化聚氨酯生物医用材料( 见表1 2 ) 。 表1 - 2 目前市场上具有实用价值的商品化聚氨酯生物医用材料蜘 注：m d i ：4 ，47 一二苯基甲烷二异氰酸酯：岫i ：4 ，4 一二环己基甲烷二异氰 酸酯：p t m g ：聚丁二醇：e n ：7 , _ - - 胺；1 ，4 一b d ：1 ，4 - 丁二醇：l ，2 一p n ：1 ， 2 一丙二胺；l y c r a ：商品名，聚醚型聚氨酯，适合制造与血液相接触的生物医学 植入体 作为一种生物医用高分子材料，聚氨酯材料已突破了天然胶乳医用制品固有 的“蛋白质过敏”和“致癌物亚硝胺析出”两大难题“3 ，大大拓宽了其在生物医 用领域的应用范围。近4 0 年来，人们对嵌段聚氨酯进行了各种改良、修饰，并 在此基础上发展，形成了多种类型的抗凝血聚氨酯材料。如今，聚氨酯材料已被 广泛应用到制造体内外各种器官，以及用于介入及其他手术中的各种导管及医 用材料的表面涂层，特别是在制造植入人体的各种医疗用品如人工心脏瓣膜、人 武汉理工大学硕士学位论文 工血管等方面有巨大应用价值，但是传统的聚氨酯材料的抗凝血性能仍达不到绝 对血液相容的要求，为此在解决生物医用聚氨酯材料的血液相容性难题上，全世 界相关领域研究者一直在做着自己不懈的努力。 1 2 生物相容性 生物相容性是生物医用材料与人体之间相互作用产生各种复杂的生物、物 理、化学反应的一种概念。生物相容性是生物医用材料要求中最关键的性质，它 主要包括力学相容性、组织相容性和血液相容性。力学相容性指的是材料的力学 性能与生物体的力学性能相互匹配的程度；组织相容性指的是材料与生物体组织 及体液接触后不引起细胞的突变、畸变、癌变以及排异反应；血液相容性指的是 指生物医用材料与血液接触时，不引起凝血及血小板黏附和凝聚，没有破坏血液 中有形成分的溶血现象。 1 2 1 血液相容性 8 1 图1 - 1 材料表面血栓的形成与溶解过程 血液相容性是生物医用材料的一个十分重要的性质。理解血液相容性是研究 血液相接触性材料的一项非常重要的内容。通常血液接触到生物材料后，血浆蛋 白质首先被吸附在材料表面上，材料与这些蛋白质的相互作用使这些分子构象发 生变化，进一步导致表面附近血液中各有形成分相互作用：一方面触发以凝血因 4 武汉理工大学硕士学位论文 子活化为起点的内源性凝固反应，使血浆中的凝血酶原变成凝血酶，纤维蛋白原 变成纤维蛋白，并附着于材料表面上形成稳定的纤维蛋白多聚体，随后稳定的纤 维蛋白多聚体包绕血小板及其它血细胞形成坚固的血凝块；另一方面则以血浆蛋 白质的非特异性吸附为起点的外源性凝血反应，首先蛋白质吸附行为诱发血小 板、红血球等细胞有形成分黏附于吸附有多层蛋白质的材料表面上，随后被黏附 的血小板发生聚集、释放、收缩并与其它有形成分形成血小板血栓。另外，黏附 于材料表面蛋白质层上的红血球发生变形、破坏了溶血系统，无法抑制凝血过程 导致材料表面的凝血过程不断进行下去。以上所有因素交织在一起形成血栓及凝 血现象的过程如上图卜1 所示。 1 2 2 蛋白质吸附 研究认为。，血浆蛋白质的吸附是血液与生物材料之间相互作用时最先发 生的异体反应。并且该最初的异体反应会引发后续的一系列变化，最终导致诱导 性表面血栓的形成，如图1 - 2 所示“。为此，在过去的几十年里，许多研究者已 在阻止血液与生物材料间产生的蛋白质吸附以提高生物材料血液相容性上投入 了大量的精力，并在理论上取得了很大的进步。 国国 图1 _ 2 生物材料表面与血液相互作用示意图 血浆蛋白质在生物医用材料表面吸附行为的研究目前主要有两种方法，一是 目标蛋白质的吸附研究；二是整个血液蛋白质的吸附研究。其中前一种最为常用。 在生物医用材料表面进行稀释溶液( 缓冲溶液或血浆) 中单种蛋白质的吸附 试验是模仿经典的l a n g m u i r 理论，该理论最初源于气一固吸附。在l a n g m u i r 模 型中，有两个假定：1 固相表面是均匀同质的；2 整个吸附过程是可逆的，并且 是单种蛋白质独自进行的。基于这些假定，单个蛋白质的吸附行为用l a n g m u i r i s o t h e r m 可表示为： 口：生 1 + _ j c 5 武汉理工大学硕士学位论文 式中： 0 ：蛋白质的覆盖面积( o 一1 0 0 ) ； c ：单个蛋白质在溶液中的浓度； k ：蛋白质吸附过程的平衡常数( 反映蛋白质与表面间的亲和能力) 由式1 1 可知，蛋白质在固体表面上的吸附量在同一温度下只与该蛋白质在 溶液中的浓度有关，蛋白质浓度在很小的范围内在，蛋白质在固体表面的吸附量 随蛋白质浓度的增大而呈线性增长，并且该等温线会在某一浓度处到达一最高 点，然后随着浓度的增加形成一平台，因为此时所有的表面己被蛋白质单分子层 覆盖完全( 即0 = 1 0 0 ) 。 在血浆或多种蛋白质共存的体系中，蛋白质问存在竞争吸附行为，该竞争吸 附是一个复杂而连续的过程。所有蛋白质在固相表面的竞争吸附导致蛋白质的解 吸附和置换吸附过程。最开始吸附的蛋白质趋向于发生依赖于时间的构象转变， 或者被其它对表面具有更高亲和力的蛋白质所置换下来。这种复杂且依赖于时间 的蛋白质置换被称为v r o m a n 效应，v r o m a n “”曾在多种表面上观测到此现象， 但是，其确切的机理仍然不明确，并且对表面性质的依赖性也是不得而知。 目前，对蛋白质吸附的许多研究主要集中在纤维蛋白原和白蛋白各种吸附 上。纤维蛋白原吸附的重要性源于其在表面诱导血栓形成过程中的重要作用。在 血液凝结过程中，纤维蛋白原起着很重要的作用，它被凝血酶所分解并且最终转 变成为血纤维蛋白凝块“，并且，纤维蛋白原能与血小板和白细胞相互作用，吸 附在表面上的纤维蛋白原能调节或控制血小板的黏附。白蛋白的重要性源于其在 血浆中的含量远远高于其它任何一种蛋白质。另外，吸附在表面上的白蛋白可用 于改善生物医用材料表面的血液相容性。因为白蛋白己被发现对血小板和其它血 细胞没有任何反应“”，吸附于生物材料表面的白蛋白可视为给表面镶上了一种生 物相容性极好的修饰层，有利于血液相容性的提高。可见纤维蛋白原和人血清白 蛋白在生物材料表面的吸附行为研究对评价生物材料的血液相容性具有重要的 意义。 1 2 3 血栓溶解【8 】 材料表面与血液接触后，经过一序列酶促联凝血反应后凝结成块，形成血栓。 但是在生物体内，凝血过程只是其中一个方面，还存在与之相对的另一方面 血栓的溶解过程即纤维蛋白凝块降解过程。纤溶系统是维持人体生理功能所必需 的，当该系统功能亢进时易发生出血现象，功能下降时则导致血栓形成，因此其 具有重要的生理病理意义。纤溶系统的整个过程中最关键的是要把血液中的纤溶 酶原激活转化为纤溶酶。纤溶酶原转化为纤溶酶有三种途径：内激活法、外激活 6 武汉理工大学硕士学位论文 法和药物激活法，如图卜3 所示。( 注：x n a 为活性纤维蛋白质稳定因子；p k 为 前激肽释放酶；t p a 为组织型纤溶酶原激活物；u p a 为尿激酶型纤溶酶原激活 物；+ 为促进激活) 。 内激活 a 纤溶酶原 组织损伤链激酶 图卜3 纤溶酶原转化为纤溶酶示意图 纤溶酶 纤溶酶是一种丝氨酸蛋白质酶，能水解碱性氨基酸羧基端形成的肽键，在纤 溶作用中，其主要是使纤维蛋白或纤维蛋白原水解成一序列的片段如图1 - 4 所 示，纤维蛋白和纤维蛋白原被纤溶酶水解生成的a ，b ，c ，d ，e 等片段成为纤维 蛋白降解产物( f i b r i nd e g r a d a t i o np r o d u c t s ，f d p ) ，其中片段x ，y 阻止纤维 蛋白的聚合与交联；片段d ，e 则是凝血酶的竞争性抑制剂，由此可知f d p 具有 抗凝血作用。 图1 - 4 纤维蛋白( 原) 降解过程示意图 基于纤溶酶的这一重要作用，若在材料表面形成血栓的同时引入纤溶酶，也 可达到溶解初期形成的血栓的目的。如m c c l u n g 等人的有关研究表明8 一氨基端 自由的赖氨酸对血纤维蛋白溶酶原( p l g ) 有特殊的高亲合力【1 6 】，并且固定的p l g 在t - p a 的作用下迅速转变成纤溶酶具有溶解血块的能力旧。因此，人们可以通 过表面改性等方法在生物材料表面固定带有特殊的活性物质( 如：赖氨酸) 可达 到使生物医用材料具有溶解初期血栓的目的。 7 武汉理工大学硕士学位论文 1 3 生物医用高分子材料的表面改性 1 3 1 表面改性的意义和方法 研究者在长期的研究中发现许多力学相容性和组织相容性均较好的生物医 用高分子材料的血液相容性都未能达到与血液绝对的相容。大多数合成材料作为 异体移植到生物体内，特别是作为异体与血液相接触时，材料表面上还是可能出 现血栓及凝血现象。为了解决这一难题，国内外研究者对此领域展开了大量的研 究，合成出了许多新材料，同时也探索出了许多新的对原有生物医用材料进行处 理的方法，其中对组织相容性和力学相容性均较好的生物医用材料进行表面改性 是一种被普遍采用的方法。该法通过改变材料表面的物理和化学性质来提高其表 面的抗凝血性，达到增强生物医用材料表面血液相容性的目的。 目前，常用于生物医用材料表面改性的方法有物理法，表面等离子处理法和 化学法。物理法简单可行，但其作用力有限；表面等离子处理法操作易行，效果 较好，但其重复性稳定性还存在问题，并且过程机理尚不明了；化学法作用力强 久有效，路线清晰可控，是化学研究者最为常用的方法。在过去的研究中，研究 者通过这些改性方法合成出了以下五种公认的理想抗凝血表面： 1 带有负电荷表面 正常人体血管壁内皮细胞的e 电位值为一8 1 31 1 1 v ，血液中的红细胞，白细胞 及血小板等均带负电荷，因此其与带有负电荷表面相互作用时不易发生粘附。高 分子材料表面电荷的正负由其功能团类型决定，利用这一点，可以进行特定的设 计使材料表面带上负电荷，从而减少血栓的形成。 2 伪内膜形成表面 对材料表面进行伪饰，如血管内皮化，白蛋白钝化及磷脂类表面等。血管内 皮细胞对于抗凝血起了很重要的作用，可以认为是一种完美的血液相容性表面。 因此研究者在人工血管表面覆盖内皮细胞来改善其血液相容性。由于材料对白蛋 白吸附后不易粘附血小板，则可在表现覆盖一层白蛋白来对材料进行伪饰，称为 白蛋白钝化。此外还可以在人工材料表面引入磷脂酰胆碱为极性头端来模拟红细 胞膜的血液相容性。 3 亲疏水性表面 表面的亲水性及自由能对血液成分的吸附、变性等有密切联系。提高材料表 面的亲水性，使表面自由能降低到接近血管内膜的表面自由能值可取得抗血栓性 能。具体操作中可以通过在材料表面接枝亲水性强的化合物来实现。 4 微相分离结构表面 聚合物的微相分离结构对血液相容性具有促进作用。具有微相分离结构的聚 8 武汉理工大学硕士学位论文 合物在表面形成不同的亲疏水微区，亲疏水性不同的蛋白质会选择性的吸附在不 同的微区，这种特定的蛋白质吸附层结构不会激活血小板表面的糖蛋白质，血小 板的异体识别能力无法实现，从而阻碍凝血发生。 5 抗凝血生物活性表面 在聚合物表面引入生物活性物质，可抑制血液与外源材料的相互作用，并促 进特定的生理过程。其中，应用最为广泛的是肝素类抗凝血剂。另外还可将具有 纤溶作用的生物活性物质( 如：纤维蛋白质溶酶、尿激酶、链激酶等) 固定到材 料表面，能起到增强表面血液相容性的作用。 除了上面提到的改性物质外，常用于生物医用材料表面改性的聚合物主要有 聚丙烯酸酯、多糖、仿生磷脂、聚乙二醇等“目，其中聚乙二醇( p e g 或p e o ) 是 一种公认的理想抗凝血物质。 1 3 2 聚乙二醇及其衍生物 聚乙二醇( p e g ) 或聚氧乙烯醚( p e o ) 由于其特殊的亲水和柔性，被认为是 阻止蛋白质的非特异性吸附和细胞粘附的最有效亲水性高分子。利用不同接枝方 法及在材料表面接枝不同形态的聚乙二醇而降低蛋白质和血小板在表面的吸附， 大大提高材料的血液相容性的研究已有大量的文献报道“”1 。h a n 口1 1 在p u 表面 直接接枝p e g 后，对改性表面进行纤维蛋白原和白蛋白吸附试验，结果表明，改 性后的表面均没有检测到明显的蛋白质吸附。同样l e e 【船1 在p e g 改性p u 后表面 的蛋白质吸附和血小板黏附试验中得出，分子量小于1 0 ，0 0 0 的p e 6 改性的表面 具有明显的抗蛋白质吸附和血小板黏附，并且血小板黏附随着p e g 聚合度的增加 而逐渐减小，且当聚合度增加到8 0 时效果最好，几乎观察不到血小板黏附。j o m 等人嘲以及e f r e m o v a 等人利用不同的接枝方法及在材料的表面接枝不同形态 的聚乙二醇从而降低蛋白质和血小板在表面的吸附，可以大大提高材料的血液相 容性。c h e n 慨踟分别采用一步法和表面接枝法改性p d m s 表面，得到了富集p e g 的p d m s 表面。改性后的两种表面均能有效地阻抗血浆蛋白质的非特异性吸附， 其中在浓度为l m g m l 纤维蛋白原缓冲溶液中未改性p d m s 表面的纤维蛋白原吸 附量为5 8 0 n g c m 2 ，而一步法和表面接枝改性的p d m s 的吸附量分别降至7 0 n g c m 2 和4 0 n g c m 2 。计剑、封麟先等采用十八烷基聚氧乙烯接枝到聚合物表面的方法， 在利用聚氧乙烯实现对非特异性作用阻抗的同时，通过末端的十八烷基原位诱导 白蛋白在生物体表面的组装，从而进一步抑制非特异性蛋白质在表面的吸附踟 具有更加重要的意义。 至今为止，虽然聚乙二醇的改性研究已有几十年的历史，但是研究者对聚乙 二醇改性材料表面改善其血液相容性抗凝血机理仍不十分清楚，研究仍在进行之 中，目前已提出了多种理论，如亲水性理论、熵变理论，排斥性体积理论啪侧、 9 武汉理工大学硕士学位论文 覆盖控制理论、维持正常构想假说m 1 等等。亲水性理论指出接枝到基材表面的 p e o 长链具有很强的亲水性，长链上能结合许多水分子，血液环境下生物大分子 ( 血浆蛋白质等) 与p e o 长链的作用主要表现水分子与水分子之间的相互作用， 因而具有较好的抗凝血性；熵变理论和排斥性体积理论嘲认为血液环境下p e o 长链伸展开来( 如图卜5 所示) ，当生物大分子靠近基材表面的过程中会压缩伸 展的p e o 长链使长链体系的熵变小于零，导致体系吉布斯自由能增加而变得不稳 定，体系会恢复原来能量低的状态，使生物分子远离基材表面；另外在长链的高 速运动效应下，p e o 链段形成一片排斥性区域，绝大部分生物大分子被拒绝在此 区域之外，有效的排斥了生物大分子，起到了抗凝血目的：覆盖控制理论认为血 浆蛋白质在材料表面的吸附由p e o 改性后材料表面所形成的微相结构控制，亲疏 水性不同的蛋白质会选择性的吸附在不同的微区，这种特定的蛋白质吸附层结构 不会激活血小板表面的糖蛋白质，血小板的异体识别能力无法实现，从而阻碍凝 血发生。维持正常构想假说指出血液接触性材料表面的结构应能维持血液中的生 物大分子的正常构象不发生变化，否则就会因生物大分子( 蛋白质，血小板，细 胞等) 构象的改变而使其的性质发生较大变化，导致各种蛋白质和血小板吸附在 材料表面而后产生局部凝血现象，而p e o 表面亲水性好，柔顺性高，对生物大分 子呈现一种惰性状态，在相互的作用过程中能够维持生物大分子原有的构想不发 生本质变化，不易被生物分子视为异物，能有效起到抗凝血的作用。但这些理论 或多或少的都存在例外的现象不能解释。在p e o 抗凝血效果和机理的各种研究中 人们还发现p e o 的抗蛋白质吸附效果与p e o 在材料表面的接枝密度陋蚓、p e o 分 子量”、接枝后表面的形貌等因素有关”。所有这些影响因素均是本课题 将要探讨的问题。 图卜5 水相下改性后材料表面聚乙二醇链段分布示意图 l o 武汉理工大学硕士学位论文 1 4 本课题立题的目的和意义： 根据世界经济合作发展组织o e c d 统计，目前心血管疾病的死亡率居于人类各 种死亡原因的首位，全世界每年约有5 0 0 万人死于此疾病，并且全球每年用于心 血管疾病诊断、预防和治疗的费用高达9 0 0 0 亿美元。同样国内对此方面的需求也 在不断飞速发展，表卜3 为近些年国内血液相接触性主要器件的供需情况。 表卜32 0 0 0 年以来国内血液相接触性器件的供需情况 为此，在抗凝血生物医用材料需求量不断增长的今天，本课题通过表面改性 的方法以提高生物医用聚氨酯材料表面血液相容性的研究则具有十分重要的意 义。 本课题通过化学接枝改性的方法结合多种理想抗凝血表面之长，首先在聚氨 酯表面化学接枝上各种不同的聚l - - 醇及其衍生物，形成钝化表面层，并通过水 接触角、蛋白质吸附、接枝密度、原子力显微技术等方法在影响抗凝血功能的因 素( 如聚乙二醇的分子量、端基种类、接枝密度及链段取向等) 方面做出具体研 究；其次，本课题在原有抗凝血功能性表面的基础上合成出了既具抗凝血功能又 具洛解血栓功能的双功能性表面，显著地提高了生物医用聚氨酯材料表面的血液 相容性。 1 5 本课题的研究内容及设计思路： i 聚乙二醇类钝化抗凝血性表面的合成与性能表征 p e o 的抗蛋白质吸附效果与p e o 在材料表面的接枝密度、p e o 分子量、接枝 后表面的形貌等因素有关，作者先将p u 膜表面一n c o 化，然后在相同条件下接枝 合成单聚7 = - - 醇改性表面和混合型聚l - - 醇改性表面。通过水接触角、蛋白质吸 附、接枝密度、原子力显微技术等测试重点考察不同端基、不同分子量、不同的 接枝密度以及不同的表面形貌对改性后表面蛋白质吸附的影响。 2 “抗凝血一溶解血栓”双重功能性表面的合成和性能表征 采用醛基保护法在聚氨酯表面合成出一种以聚乙二醇作“间隔臂”( s p a c e r ) ， 武汉理工大学硕士学位论文 以特殊功能小分子为末端的生物活性表面。通过水接触角、蛋白质吸附、溶解血 栓能力等测试实验对其“抗凝血一溶解血栓”双重功能进行研究。 整个实验过程于图1 - 6 所示： 合成p u j 1 分别从红外、水接触角、蛋白质 l 吸附、原子力显微测试进行分析 图1 - 6 本课题研究内容示意简图 武汉理工大学硕士学位论文 第2 章聚乙二醇及其衍生物改性聚氨酯后表面的 抗蛋白吸附研究 2 1 引言 聚乙二醇及其衍生物是一种理想的抗凝血性物质“2 蜘，用其改善生物医用材 料表面生物相容性的研究已有几十年的历史了，此方面的研究主要集中在聚乙二 醇及其衍生物接枝密度和接枝后表面形貌对生物相容性影响的研究上，并且由于 聚合物表面结构的局限性，表面接枝密度和接枝后表面形貌的研究大多是在无机 材料如金、硅、钛等表面上进行胁埘，而在高分子材料表面研究相对较少。 本章将通过化学接枝的方法将聚7 , - - 醇及其衍生物接枝到在聚氨酯膜表面， 在其表面形成一种亲水性钝化表面以提高聚氨酯材料表面的血液相容性。通过水 接触角、蛋白质吸附、接枝密度、原子力显微摄像等测试重点考察聚7 , - - 醇醇链 段的不同端基、分子量、接枝密度以及链段取向和形貌对改性后表面抗蛋白质吸 附能力的影响。 2 2 实验部分 、 2 2 1 实验原料及仪器 本实验主要药品如表2 - 1 所示： 表2 - 1 主要实验药品列表 武汉理工大学硕士学位论文 注：m p e g s ，单甲氧基聚乙二醇序列。其它常用试剂均由天津博迪化工有限公司。 本实验主要仪器如表2 - 2 所示： 表2 - 2 主要实验仪器列表 注：其它常用仪器未列出。 2 2 2 样品制备 2 2 2 1 聚氨酯膜的制各 ( 1 ) 聚氨酯弹性体的合成咖 称取5 克的p t m o 于三口烧瓶中，并加入5 m l 甲苯，然后搅拌加热到1 1 0 ， 蒸出其中的溶剂( 甲苯和水) ，然后让整个装置在干燥的n ：气流中冷却。迅速加 入2 5 m l 干燥的n ，n - 二甲基甲酰胺( d 岍) 并搅拌均匀，加热至6 0 6 5 后，将 2 5 m l 含4 0 克m d i 的干燥d m f 溶液迅速加到三口烧瓶中，并加入3 滴二丁基二 月桂酸锡，继续通入干燥的n ：密封反应。在6 0 6 5 下反应1 5 h 后，用滴管缓 缓加入0 9 克( 0 o l m 0 1 ) 的1 ，4 一丁二醇到反应体系中，然后把温度上升到8 0 8 5 ，控温反应3 5 小时。反应结束并冷却后，将三口烧瓶中的反应液沿着 玻璃棒倒入预先准备好的盛有蒸馏水( 1 0 0 0 m l ) 的大烧杯中，边倒边快速搅拌， 最后得到白色的粘状物缠绕在玻璃棒上，将其取下，放入真空干燥箱中在4 0 * ( 2 下抽真空干燥一周即可。 1 4 武汉理工大学硕士学位论文 ( 2 ) 商品化聚氨酯的纯化 将聚氨酯胶粒装进s o x h l e t 提取器中，利用甲苯( 或甲醇、乙醇等) 作纯化 剂加热回流4 8 h 除去工业添加剂，取出后加热至8 0 ( 甲醇、乙醇只需加热至 4 0 - 5 0 c 即可) 真空干燥2 4 h 除去溶剂即可备用。 ( 3 ) 聚氨酯的成膜 称取3 9 干燥好的聚氨酯( 自己合成的或商品化的) ，用机械搅拌将其溶解于 3 0 - 4 0 r a ln ，n - 二甲基甲酰胺中，静止封闭放置1 5 m i n ，待气泡完全消失后将溶液 倒入1 个直径约为1 2 c m 的玻璃培养皿中，待溶液均匀铺满整个皿底后置于干燥 箱内，保持水平。加热6 5 c ，待溶剂挥发后放入真空干燥箱，6 5 c 减压干燥处 理2 4 h 即可。干燥后取下膜用打孔器敲成固定面积圆形膜片( 直径约为0 7 c m ， 厚度约为0 3 m ) 备用。 2 2 2 2 单组分聚乙二醇及其衍生物表面改性聚氨酯样品制备嘲 将p u 膜片放入7 5 4 ，4 一二苯基甲烷二异氰酸酯( m d i ) 的甲苯溶液中，搅 拌并加热至5 0 c 后通入n ：保护，用注射器将2 5 催化剂三乙胺( t e a ) 加进反应 体系，混合均匀后密封反应6 0 1 2 0 m i n ，取出并用干燥的甲苯洗涤数次。随后将 一n c o 官能化的膜分别放入5 聚乙二醇( m j = 4 0 0 ，6 0 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0 ) 或单甲氧基聚乙 二醇( m = 3 5 0 ，7 5 0 ，1 1 0 0 ，2 0 0 0 ) 的甲苯溶液中，搅拌下加热至4 0 c ，通入n 。保护， 密封反应2 4 h ，后用甲苯洗涤并浸泡，2 d 后洗涤干净摊开真空干燥除去甲苯即可。 2 2 2 3 混合组分聚7 - - 醇及其衍生物表面改性聚氨酯样品制各 p u 接枝m d i 实验过程同2 2 2 2 样品制备。 将p u m d i 膜放入单苄氡基聚7 - - 醇- 7 5 0 的干燥甲苯溶液中，通入n 。保护， 搅拌下加热4 0 。c 反应1 2 h ，取出后用干燥甲苯洗净，放入相同浓度的聚乙二醇 ( m = 4 0 0 ，6 0 0 ，1 0 0 0 ，2 0 0 0 ) 或单甲氧基聚乙二醇( m = 3 5 0 ，7 5 0 ，1 1 0 0 ，2 0 0 0 ) 的甲苯 溶液反应体系中，相同条件下反应1 2 h 后用甲苯洗涤并浸泡，2 天后洗涤干净摊 开真空干燥除去甲苯即可。 2 2 3 测试与表征 2 2 3 1 傅立叶衰减全反射红外光谱测试 将干燥的未处理的聚氨酯膜、异氰酸化的聚氨酯膜和聚乙二醇改性的聚氨酯 膜分别进行傅立叶衰减全反射红外光谱分析。红外光谱仪由武汉理工大学分析与 测试中心提供( t h e r m on i c o l e t ，u s ) 。( 数据见2 3 2 2 ) 3 2 3 2 接枝密度测试 本课题接枝密度采用微滴定法来加以测试，通过直接测试异氰酸根在单位面 积上的物质的量来间接反映各步聚l _ -