（发酵工程专业论文）固定化乙醇脱氢酶制备技术及性能研究.pdf

m 哪国咖胁啡撕舢唧e - y 179 9 2 3 1 i m m o b i l i z e da l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h ) at h e s i ss u b m i t t e dt o s h a a n x iu n i v e r s i t yo fs c i e n c ea n dt e c h n o l o g y i np a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e m e n tf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g b y l il i w e i t h e s i ss u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rm a og e n n i a n m a y , 2 0 1 0 固定化乙醇脱氢酶制备技术及性能研究 摘要 乙醇脱氢酶是种重要的生物催化剂，可有效的催化伯醇与醛之间的可逆反 应，已被广泛应用于食品、化工、医疗等行业。然而游离酶的稳定性差，易失活， 不能重复使用等，通过固定化技术来克服乙醇脱氢酶应用局限成为酶工程领域研 究的热点。 本论文选用壳聚糖、海藻酸钠、明胶、复合硅胶、明胶海藻酸钠对乙醇脱氢 酶进行固定化，以固定化酶的酶活力、活力回收率、相对活力为指标，得到固定 化乙醇脱氢酶的最佳制备工艺。以载体的包埋率、偶联率、半衰期等为指标选择 出最适合固定乙醇脱氢酶的材料，并对固定化乙醇脱氢酶的酶学性质进行研究。 结果如下所示： 以壳聚糖为载体工艺条件是：壳聚糖的粘度是0 0 1 3 p a s ，n a o h 浓度 0 8 m o l l ，成形时间1 5 h ，戊二醛浓度6 ，交联时间2 h ，固定4 5 h 。壳聚糖载 体固定率为6 7 15 ，偶联率为9 2 5 6 ，固定化酶的半衰期为8 8 17 m i n ，连续使 用十次后固定化酶的剩余活力为31 18 。 以海藻酸钠为载体的工艺条件是：戊二醛浓度o 5 ，海藻酸钠浓度3 ，海 藻酸钠与酶液的比例1 ：1 ，固定化时间l h ，c a c l ，浓度3 ，交联硬化时间1 h 。 海藻酸钠载体的固定率为7 6 6 4 ，偶联率为6 0 ，固定化酶的半衰期2 7 3 m i n 。 以明胶为载体工艺条件是：明胶浓度15 ，戊二醛浓度4 ，交联时间2 h ， 1 9 明胶颗粒加酶量l m l ，固定化时间2 5 h 。明胶对乙醇脱氡酶的固定率为5 0 3 3 ， 偶联率为5 2 4 7 ，固定化酶的半衰期2 6 3 5 m i n ，载体使用十次后仍能保持较大的 活| 生，剩余活力为5 2 8 9 。 用壳聚糖和硅胶固定乙醇脱氢酶工艺条件是：3 9 壳聚糖溶于5 0 m l1 的甲 酸溶液中，硅胶3 9 ，涂敷4 h ，戊二醛浓度1 ，交联l h ，l g 载体与l m l 酶液混 合，固定2 h 。复合硅胶对乙醇脱氢酶的固定率为4 7 5 3 ，偶联率为3 2 9 6 ，固定 化酶的半衰期为1 8 2 4 m i n ，连续使用十次后固定化酶的剩余活力为2 8 3 1 。 用明胶、海藻酸钠固定乙醇脱氢酶工艺条件是：明胶浓度2 ，海藻酸钠浓 度6 ，等量混匀，放置3 0 m i n ，戊二醛浓度o 5 ，c a c l 2 浓度5 ，交联l h 。 明胶一海藻酸钠的固定率为4 1 9 4 ，偶联率为6 1 5 4 ，固定化酶的半衰期为 3 0 3 m i n ，连续使用十次后固定化酶的剩余活力为2 0 0 8 。 综合各个因素得到，最适的固定乙醇脱氢酶的材料为壳聚糖。对壳聚糖固定 化乙醇脱氢酶的酶学性质研究，结果显示：固定化酶的k m 值略大约游离酶的 k m ，固定化酶的最适反应温度有所提高，最适p h 也向酸i 生环境偏移，耐高温、 耐酸性有所提高。金属离子n 矿、c a 2 + 、m 9 2 + 、2 0 + 促进了酶促反应的进行，k + 、 c u 2 + 建l n 定化酶酶活力影响不大，f e 3 + 却抑制了酶促反应的进行。 关键词：乙醇脱氢酶，载体，固定化技术，酶活力，酶学性质 i n v e s t i 譬：a t i o no np n , fx a t i o na n dp r o p e r t i e sf fi m m o b i l i z e d l n v e s t i o no nr e o a r a t i o na n dr o o e r t i e so li m m o b i l i z e d a l c o h o ld e h y d r o g e n a s eo 如聊 a b s t r a c t a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d 岣i sak i n d o fi m p o r t a n tb i o c a t a l y s t , i tc a ne f f e c t i v e l y c a t a l y z er e v e r s i b l er e a c t i o nb e t w e e nc a r b i n o la n da l d e h y d e a n dc a nb ew i d e l yu s e di n f o o d , c h e m i c a l ，m e d i c a li n d u s t r i e s ，e c t h o w e v e r , f r e ea d hh a v es o m ed e f e c t s f o r e x a m p l e ，p o o rs t a b i l i t y , n o n r e u s ea n dd e a c t i v a t i o n ，e c t u n d e rt h e s ec i r c u m s t a n c e s ， i m m o b i l i z a t i o ni sar e s e a r c hh o t s p o tt oo v e r c o m et h el i m i t a t i o n so fa d hi ne n z y m e e n g i n e e r i n gf i e l d i nt h i sp a p e r , w ec h o o s e dc h i t o s a n , s o d i u ma l g i n a t e ，g e l a t i n , c o m p o u n ds i l i c o na n d g e l a t i n - s o d i u ma l g i n a t ea sc a r t i e r g e tt h eb e s tp r e p a r a t i o np r o c e s so f i m m o b i l i z e da d h a c c o r d i n gt oa c t i v i t yo fi m m o b i l i z a t i o n r e c o v e r ya n dr e l a t i v ea c t i v i t y g e tt h em o s t s u i t a b c a r t i e ra c c o r d i n gt oe m b e d d i n g , c a r r i e r c o u p l i n gr a t i oa n dh a l f - l i f e ，a n dt os t u d y o f t h ep r o p e r t i e so f i m m o b i l i z e da d h t h er e s u l t ss h o w ： w h e nc h o o s ec h i t o s a na sc a r t i e r , t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o i l sa r e ：t h e v i s c o s i t yo fc h i t o s a no f0 0 1 3p a , n a o hc o n c e n t r a t i o no f0 8 m o l l f o r m i n gt i m eo f 1 5 h ，西u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no f6 ，c r o s s l i n k i n gt i m eo f4 5 ha n di m m o b i l i z e d t i m eo f2 h c h i t o s a ni m m o b i l i z ea d h t h ei m m o b i l i z e dr a t eo f6 7 15 c o u p l er a t i oo f 9 2 5 6 t h eh a l f - l i f eo fi m m o b i l i z a t i o no f8 8 17 m i na n dr e m a i n i n ga c t i v i t yo f31 18 a f t e rc o n t i n u o u su s ef o rt e nt i m e s w h e nc h o o s ea l g i n a t ea sc a r d e r , t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sa r e ： g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no f0 5 ，s o d i u ma l g i n a t ec o n c e n t r a t i o no f3 s o d i u m a l g i n a t ea n de n z y m er a t i oo f1 ：1 ，i m m o b i l i z e dt i m eo flh ，c a c l 2c o n c e n t r a t i o no f3 ， c r o s s l i n k i n g h a r d e n i n gt i m eo flh s o d i u ma l g i n a t e si m m o b i l i z ea d h i m m o b i l i z e d r a t eo f 7 6 6 4 c o u p l i n gr a t i oo f 6 0 a n dh a l f - l i f eo f i m m o b i l i z a t i o no f 2 7 3r a i n w h e nc h o o s eg e l a t i na sc a r r i e r , t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a lc o n d i t i o n sa r e ：g e l a t i n c o n c e n t r a t i o no f15 ，g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no f4 ，c r o s s l i n k i n gt i m eo f2 h , g e l a t i na n de n z y m er a t i oo f1 ：1 - i m m o b i l i z e dt i m eo f2 5h g e l a t i ni m m o b i l i z ea d h , t h ei m m o b i l i z e dr a t eo f5 0 3 3 ，c o u p l er a t i oo f5 2 4 7 t h eh a l f - l i f eo fi m m o b i l i z a t i o n o f 2 6 3 5 m i na n dr e m a i n i n ga c t i v i t yo f 2 6 3 5 a f t e rc o n t i n u o u su s ef o rt e nt i m e s w h e nc h o o s ec h i t o s a na n ds i l i c ag e la sc a r t i e r , t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n sa le ：p u t3 9c h i t o s a ni n t o5 0 m l1 f o r m i ca c i d ，s i l i c ag e lo f 3 9 , c o a t i n gt i m e o f4 h , g i u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no f1 c r o s s l i n k i n gt i m eo flh , l gc a r r i e ra n dim l e n z y m em i x t u r e ，i m m o b i l i z e dt i m eo f2 h c o m p o u n ds i l i c o ni m m o b i l i z e da d h , t h e i m m o b i l i z e dm t eo f4 7 5 3 ，c o u p l er a t i oo f3 2 9 6 ，t h eh a l f - l i f eo fi m m o b i l i z a t i o no f 18 2 4 m i na n dr e m a i n i n g a c t i v i t yo f 2 8 31 a f t e rc o n t i n u o u su s ef o rt e nt i m e s w h e nc h o o s eg e l a t i na n ds o d i u ma l g i n a t ea sc a r r i e r , t h eo p t i m u mt e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n sa l e ：g e l a t i nc o n c e n t r a t i o no f2 ，s o d i u ma l g i n a t ec o n c e n t r a t i o no f6 ， e q u i v a l e n tt om i x t u r ea n dp l a c e d3 0 m i n , g l u t a r a l d e h y d ec o n c e n t r a t i o no 5 e a c h c o n c e n t r a t i o no f5 c r o s s l i n k i n gt i m eo flh g e l a t i n s o d i u ma l g i n a t ei m m o b i l i z e d a d h , t h ei m m o b i l i z e dr a t eo f41 4 9 ，c o u p l er a t i oo f61 5 4 ，t h eh a l f - l i f eo f i m m o b i l i z a t i o no f 3 0 3 r a i na n dr e m a i n i n g a c t i v i t yo f 2 0 0 8 a f t e rc o n t i n u o u su s ef o rt e n t i m e s t h em o s ts u i t a b l ec a r r i e ri sc h i t o s a nf o ri m m o b i l i z e da d h a c c o r d i n gt ov a r i e t yo f f a c t o r s r e s u l t so fs t u d yo ft h ep r o p e r t i e so fi m m o b i l i z e da d hs h o wt h a ti m m o b i l i z e d a d hr e a c t sm o r ee a s i l yw i t hs u b s t r a t et h a nt h ef le ea d h , i t so p t i m u mt e m p e r a t u r eh a s i n c r e a s e d , i t sp hh a so f f s e r e dt ot h ea c i d i ce n v i r o n m e n t , a n di t sr e s i s t a n c eo fh i e , h t e m p e r y a t u r ea n da c i dh a sa l s oi n c r e a s e d i o n so f n a + , c a 2 + m 9 2 + a n dz n 2 + c a np r o m o t o e n z y m a t i ca c t i v a t e w h i l ek 十a n dc u ? h a v el i t t l ee f f e c t , a n df + h a sn a g e t i v ee f f e c to n e n z y m a t i ca c t i v a t e k e yw o r d s ：a l c o h o l d e h y d r o g e n a s e ，c a r r i e r , i m m o b i l i z a t i o n ，e n z y m a t i ca c t i v a t i o n , e n z y m a t i cp r o p e r t i e s l v 目录 j 萄要i a b s t r a c t i i i 目j 衰i 1 绪论1 1 1 乙醇脱氢酶概述l 1 1 1a d h 的来源与种类1 1 1 2 乙醇脱氢酶的结构与性能1 1 1 。3 乙醇脱氢酶的功能与应用3 1 2 酶固定化技术简介4 1 2 1 酶的固定化方法与原理4 1 2 2 固定化载体材料的研究进展5 1 2 3 评价酶固定化效果的指标7 1 2 4 酶固定化技术的应用研究进展7 1 3 课题研究的目的和意义1 0 1 4 主要研究内容1 1 2 壳聚糖固定乙醇脱氢酶工艺研究1 2 2 1 材料与设备1 2 2 1 1 药品与试剂1 2 2 1 2 仪器与设备1 2 2 2 试验方法1 3 2 2 1 乙醇脱氧酶的提取及测定1 3 2 2 2 固定化乙醇脱氢酶的酶活力测定1 4 2 2 3 壳聚糖固定乙醇脱氢酶的制备方法1 4 2 2 4 壳聚糖固定乙醇脱氧酶条件的研究1 5 2 2 5 乙醇脱氧酶固定化效果评价指标1 5 2 3 结果与讨论1 6 2 3 1 壳聚糖固定乙醇脱氢酶条件的确定1 6 2 3 2 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶效果的评价2 0 2 4 小结2 l 3 海藻酸钠固定化乙醇脱氧酶工艺研究2 3 3 1 材料与设备2 3 3 1 1 药品与试剂2 3 3 1 2 仪器与设备2 3 3 2 试验方法2 3 3 2 1 海藻酸钙固定乙醇脱氢酶的制备2 3 3 2 2 海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶艺条件的确定2 3 3 3 结果与讨论2 4 3 3 1 海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶最佳固定化条件2 4 3 3 2 海藻酸钙固定化乙醇脱氢酶性能评价2 8 3 4 j 、结2 9 4 明胶固定化乙醇脱氢酶工艺研究3 1 4 1 材料与设备31 4 1 1 药品与试剂3l 4 1 2 仪器与设备31 4 2 试验方法31 4 2 1 明胶固定乙醇脱氢酶的制备3 l 4 2 2 明胶固定化乙醇脱氢酶条件的确定3 l 4 3 结果与讨论3 2 4 3 1 明胶固定化乙醇脱氢酶条件选择3 2 4 3 2 明胶固定化乙醇脱氢酶效果评价指标3 5 4 4 j 、结3 6 5 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶制备工艺研究3 8 5 1 材料与设备3 8 5 1 1 药品与试剂3 8 5 1 2 仪器与设备3 8 5 2 试验方法3 8 5 2 1 复合硅胶固定乙醇脱氢酶的制备3 8 5 2 2 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶条件的确定3 9 5 3 结果与讨论3 9 5 3 1 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶最佳固定化条件3 9 5 3 2 复合硅胶固定化乙醇脱氢酶效果评价4 4 5 4 ，j 、结4 5 6 明胶海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶制备工艺研究4 6 6 1 材料与设备4 6 6 1 1 药品与试剂4 6 6 1 2 仪器与设备4 6 6 2 试验方法4 6 6 2 1 明胶海藻酸钠固定乙醇脱氧酶的制备4 6 6 2 2 明胶海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶条件的确定4 7 6 3 结果与讨论4 7 6 3 1 明胶海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶条件确定4 7 6 3 2 明胶海藻酸钠固定化乙醇脱氢酶的固定化效果评价5 1 6 4 小结5 2 7 最适材料的选择5 3 7 1 固定化乙醇脱氢酶活力的比较5 3 7 2 载体固定率的比较5 3 7 3 偶联率的比较5 4 7 4 半衰期的比较5 4 7 5 使用寿命比较5 5 7 6l 砉论5 5 7 7 小结5 5 8 壳聚糖载体固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究5 6 8 1 材料与设备5 6 8 1 1 药品与试剂5 6 8 1 2 仪器与设备5 6 8 2 试验方法5 6 8 2 1 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究5 6 8 3 结果与讨论5 7 8 3 1 壳聚糖固定化乙醇脱氢酶酶学性质研究5 7 8 4 小结6 1 9 结论与展望6 2 9 1 课题结论6 2 9 2 课题展望6 3 致谢6 4 攻读硕士学位期| b j 发表的学术论文7 0 原创性声明7 l i 舌f 定化乙醇脱氧酶制各技术及性能研究 l 绪论 1 1 乙醇脱氢酶概述 乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，简称a d h ) 是一种含z n 酶类的胞内酶，是生 物体内重要的氧化还原催化剂之一，作用于c h o h 基团，以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 ( n i c o t i n a m i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e ，n a d + ，称为辅酶i ) 为辅酶，催化伯醇和醛之间 的可逆反应。 1 1 1a d h 的来源与种类 乙醇脱氢酶广泛存在于自然界中，目前已在人类、动物、植物、微生物、真核生物 以及原核生物中发现。不同来源的乙醇脱氢酶在结构上也有较大的差别，按肽链长度分 为长链、中链、短链乙醇脱氢酶，肽链所含的氨基酸残基数约为6 0 0 - - 7 5 0 、3 5 0 、2 5 0 m 。 长链或以吡咯喹啉醌为辅酶的铁激活剂的乙醇脱氢酶以酵母的a d h i v 、运动单胞菌 来源的a d h1 1 为代表。中链脱氢酶是以马肝a d h 和酵母a d h 为代表。短链脱氢酶是 以果蝇a d h 和短乳杆菌来源r 。专一性a d h 为代表1 2 】。 人类的乙醇脱氢酶为四聚体，分子量为3 5 k d a ，由2 0 多种同工酶组成( a d h s ) 【，1 ， 现已发现至少五种结构基因编码的人体a d h ( a d h l 、a d h 2 、a d h 3 、a d h 4 、a d h 5 ) 。 根据酶促动力学特征，将a d h 分为三类：i 类a d h s 同工酶由基冈a d h l 、a d h 2 、a d h 3 分别编码产生，对乙醇代谢起主要作用。其中，a d h 3 由y 二聚体组成 4 1 ；i i 类a d h s 同 工酶a d h 4 是一种新的分子形式兀a d h ，已证实不能氧化甲醇。i i i 类a d h s 同j 丁：酶a d h 5 是以好a d h 的形式存在，对乙醇代谢的作用不大，只是氧化如芳香族醇等的长链醇，人 体a d h 以氧化型的n a d + 为辅酶，位于细胞的胞浆内【5 】。 肝a d h ( l i v e ra l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，l a d h ) 为二聚体蛋白，马肝a d h 同工酶能 使多种醛还原成相应的醇。l a d h 能作用的底物范围较广泛，对直链醇、支链醇以及环 醇等多种醇类都具有活性。l a d h 氧化反应的最适p h 为8 8 ，还原反应最适的p h 为7 3 ， 最适反应温度为3 5 1 6 一i 。 酵母醇脱氢酶( y e a s ta l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，y a d h ) 为四聚体，分子量为1 4 5 k d a 。 酵母y a d h 有3 种同工酶：y a d h 1 、y a d h 2 、y a d h 3 。y a d h 1 是在厌氧发酵时才 表达；y a d h 2 为细胞质组成成分，为葡萄糖所抑制；y a d h 3 则发现于线粒体中，在 成长的酵母细胞中y a d h 1 占了酵母y a d h 活性的主要部分。y a d h 1 和y a d h 3 的动 力学性质相似，y a d h 2 对乙醇和乙醛的底物专一性较高，且米氏常数较低。y a d h 的 底物专一性限于不分支的a 醇，对于侧链有分支的醇其催化效率降低。目自订为i ：，乙醇 是y a d h 最好的底物，y a d h 对甲醇催化活性很小，但烯丙醇和苯丙烯醇也是y a d h 极好的底物。 1 1 2 乙醇脱氢酶的结构与性能 陕西科技人学硕 ：学位论文 y a d h 每个亚基都由两个结构域组成，辅酶结合结构域和催化活性结构域。辅酶结 合结构域为多肽折叠结构，能通过氨基酸残基上的官能团与辅酶之阳j 形成氧键而结合。 催化活性结构域结合的催化活性z n 2 + 能与许多底物相结合，由于辅酶与酶的结合使蛋白 质的构象发生变化，形成非常狭窄的底物结合腔袋，催化活性z n 2 + 位于腔袋的底部。酵 母醇脱氢酶结构图见图1 1 【一】。 s e r - 1 9 8 p h e 2 4 3 g l y 0 2 2 4 s e 卜2 6 9 a s p 2 2 卜： 8 e r - 2 7 1 l e u 一2 0 3 8 e r - 3 1 7 i i e - 3 1 8 a l a - 2 9 6 t h r - 1 4 1 m e t - 2 9 4 t r p 5 7 t 一翳 图1 1 醇脱氢酶活性位点结构图 f i g 1 - 1t h es c h e m a t i co ft h ea c t i v es i t eo fad h 酵母乙醇脱氢酶氧化是一种序列随机反应机理酵母反应过程，如图2 1 所示， e a 队b 尝e p q 喾e p 中q 譬e + p 基b 图i 2 酵母醇脱氢酶酶促催化反应机理 f i g 1 2k i n e t i cm e c h a n i s mo f a d h c a t a l y z e dr e a c t i o n 酶随机的与辅酶或底物结合，反应得到n a d h 以及与z n 2 十结合的醛或酮，然后醛或 酮解离，最后n a d h 解离，醛或酮还原过程的序列是有序的。该反应过程实质的化学反 2 同定化乙醇脱氡酶制需技术及忭能研究 应是氢化物迁移，形式上是迁移一个带负电荷的氢原子，这是这个反应的主要限速步骤。 1 1 3 乙醇脱氢酶的功能与应用 基于a d h 可有效的催化伯醇与醛之间的可逆反应这一特性，a d h 已被广泛的应用 各个行业。目前已在生物传感器、化学工业、食品及医疗等多个方面取得显著效果。 在生物传感器方面，m i h a e l an i c u l e s c u 等利用醌类血红蛋白a d h 与其它化合物组成 的复合体系所制备的传感器可自动灵活的对白酒进行分析，对白酒发酵可进行实时监控 【旺1 。施清照、程琼研制将a d h 及n a d + 均固定在人造丝网上，以键合型n b a 修饰浸蜡 石墨电极为基体电极所制备的电流型生物传感器，在+ 0 3 v 处，乙醇在a d h 的作用下产 生还原型烟酰胺腺瞟呤二核苷酸( n a d h ) ，通过测量n a d h 在酶催化反应自，j 后的浓度 变化，最终达到测定乙醇浓度的目的 13 1 。这种传感器多用于某些临床的诊断及一些饮料 中乙醇含量的检测。 随着全球经济的发展，能源问题日益紧缺，温室效应日趋严重，国内外不少科学家 着力于研究利用大气中的c 0 2 通过化学或生物的方法使其转化为甲醇，不但可以解决温 室效戍问题还能解决能源问题。黄淑芳、姜忠义等用s 0 1 g e l 法固定a d h 得到高效的固 定化酶，并研究了固定化a d h 酶促反应的米氏常数，为后期工作研究能顺利进行奠定 良好基础f 1 4 1 。 在乙醇生产中，a d h 也发挥着较大的作用，通过产生a d h 的菌株进行乙醇的生产。 生物法生产乙醇与有机合成法相比污染较少，操作更简单，因此不少学者对产a d h 的 菌株进行基因改造，以其得到高转化率的乙醇生产菌株。陆r 降、韦宇拓等对利用葡萄糖、 木糖生产酒精的菌株进行基凶改造，从而降低生产成本，提高生产效率s ，。 在食品工业上，果实在采摘后在贮存过程中，因无氧呼吸会产生乙醇，从而危害果 实的贮存，a d h 能够有效的催化乙醇转化为乙醛，可以消耗无氧呼吸产生的乙醇，已达 到增长果实贮存时间一6 1 。众所周知，柿子中含有较多的单宁，在生产柿饼时需进行脱涩 处理。张海生、陈锦屏的研究中发现单宁的聚合是在a d h 的作用下完成，乙醇在a d h 的作用下转化为乙醛，乙醛与单宁聚合形成不溶性树脂络合物，使涩味消失【1 7 】。 在医学渗断上，研究发现不少肝、胃疾患与a d h 相关，检测血清中a d h 的活性是 诊断某些肝病的重要指标之一【博七o l 。在解酒药研制中，a d h 活性也作为一项重要的检测 指标。有嵝解酒药是对体内的a d h 具有诱导作用，可提高生物体内a d h 的活性；有些 是直接将酶作为解酒药应用予生物。陈廷伟、祁弘等所申请的专利中是将a d h 制备成 口服液或将产a d h 的菌株用于酸奶、果茶生产制备保肝饮料，饮酒时服用，a d h 在胃 粘膜形成保护层，阻止乙醇进入血液，从而起到保护肝脏的目的 2 1 l 。 在生物工程方面，a d h 也受到不少学者的关注。t o k u m i t s uo m 等从几种蘑菇中提 取到高活性的a d h ，并将其应用于生产酒精饮料。在动物试验中，结果表明，此a d h 陕两科技大学硕一 ：学位论文 发酵生产的酒精饮料既具有抗癌、抗血栓功能。这说明a d h 在人和动物健康方面具有 很高的丌发应用价值1 2 2 1 。 1 2 酶固定化技术简介 酶作为一种生物催化剂可高效的催化反应的进行，而且反应条件较为温和，副反应 少等，这些优点使酶得以广泛应用，但游离酶反应后无法回收，生产成本高，随着反应 时间的延长，反应速度降低等缺点也限制了酶的应用，而固定化技术可以很好的解决这 一难题，固定化酶可以反复多次的使用、降低生产成本、极易与底物分开、反应条件易 于控制、可实现连续化、自动化生产、更适合实现多酶反应。 1 9 1 6 年美国科学家n e l s o n 和g r i f f i n 最先发现了酶的固定化现象 2 3 1 。直到2 0 世纪5 0 年代，酶固定化技术的研究才真正得以有效地开展。1 9 5 3 年，德国科学家g r u b h o f e r 和 s c h l e i t h 将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等 与该载体结合制备固定化酶f 2 4 j 。到2 0 世纪6 0 年代，固定化技术得以迅猛发展。1 9 6 9 年 日本千烟一郎利用固定化氨基酰胺酶生产l 氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首 例 2 5 1 。在1 9 7 1 年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶( i m m o b i l i z e d e n z y m e ) 这个名称。 所谓固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续的进行反应，反应后 的酶可以回收重复使用。 1 2 1 酶的固定化方法与原理 酶的固定化方法主要有吸附法、包埋法、共价键结合法和交联法四种。以下介绍各 种固定化方法的原理。 ( 1 ) 吸附法 吸附法是利用载体表面的某些性质，将酶吸附于载体表面的固定化方法。这种方法 简单、经济，载体类型多，吸附过程使酶进一步纯化继而将酶固定化的目的，且使用后 载体可活化再生。吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 物理吸附法主要是通过疏水键、氢键、7 【电子亲和力等作用束制备固定化酶。离子 交换吸附法是在适宜的p h 和离子强度条件下，通过利用酶的侧链解离基团和离子交换 剂的相互作用而使酶得以固定的方法。 ( 2 ) 包埋法 包埋法是将酶物理化的包埋在多聚物内的一种方法。反应条件温和，制备成本便宜， 制备方法简便。包埋法分为凝胶包埋法、微囊化法和脂质体包埋法。 凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中。微囊法是将酶包埋于具有半透性聚合物 膜的微囊内，主要有界面聚合法、分相法、流体干燥法、流膜法。 界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜，使酶包埋于半 4 同定化乙醇脱氢酶制备技术及件能研究 透膜微囊中。脂质体包埋即大分子络合法。分相法是利用某些高聚物在水相和有机相的 界面上溶解性极低而形成膜从而将酶包埋的方法。液体干燥法是将一种不溶于水且沸点 比水低聚合物，与酶液混合，乳化二次后低温真空干燥。脂质体包埋是采用双层脂质体 形成极细颗粒包埋酶。 ( 3 ) 共价键结合法 共价键结合法是通过酶分子的非活性基团与载体表面的活泼基团之间发生化学反应 而形成共价键的连接法。常用的共价键结合方法有：重氮化法、烷基化和芳基化法、与 戊二醛的反应、钛螯合法、硫醇二硫化物的互换反应和四组分缩合法。 ( 4 ) 交联法 利用双功能或多功能试剂，使酶分子之间或酶蛋白与其它惰性蛋白之f b j 发生交联， 凝聚成网状结构，对酶进行固定。戊二醛是应用最广泛的双功能试剂。 不同的固定化方法各有特点，表1 1 列出几种方法的优缺点。 表1 1 同定化酶方法的比较 t a b 1 1c o m p a r i s o no nt h em e t h o do fi m m o b i l i z e de n z y m e 吸附法制备简单，成本低，能回收再生，但结合差，在受到离子强度、p h 值变化影 响后，酶会从载体上游离下来。包埋法不适合大分子底物。包埋法、共价法、交联法三 种方法虽结合力强，但不能回收再生。 随着固定化技术的不断发展，人们发现单一的固定化方法不能满足人们的需求，不 少研究学者将二种或三种固定方法共同使用，这样制备得的固定化酶固定化率高，酶活 力较高。 1 2 2 固定化载体材料的研究进展 固定化技术核心问题是载体材料的制备，载体材料的物理化学性质在很大程度上决 定着固定化酶的活力。载体材料需要符合以下几个条件：固定化过程中不引起酶变性； 对酸碱有一定的耐受性；有一定的机械强度；有一定的疏松网状结构，颗粒均匀；共价 结合是具有可活化的基团；有一定的亲水性和良好的稳定性；有耐受酶和微生物细胞的 能力；价廉易用；低毒性。 陕两科技人学坝i ：学位论文 在酶的固定化过程中作用的水不溶性固体支持物为载体或基质。固定化载体种类很 多，其来源、结构和性质各不相同，酶固定化对载体材料具有很高的要求。各种不同方 法的载体材料如表1 2 所示。 表i 2 常用的i 古| 定化载体 1 a b 1 2c a r r i e ro fi m m o b i l i z a t i o n 方法载体材料