（生物医学工程专业论文）几种亚硝基脲电喷雾质谱特征的研究.pdf

a b s t r a c t a b s t r a c t a sa n t i c a n c e rd r u g sc h l o r o e t h y l n i t r o s o u r e a sc a na l k y l a t ed n ab a s e sr e s u l t i n gi n s t r u c t u r a ld a m a g ed n ao rc e l ld e a t h ，t oa c h i e v ea n t i t u m o re f f e c t s b u ta l m o s te v e r y c h l o r o e t h y l n i t r o s o u r e ad r u gm a yl e a dt os e c o n d a r yt u m o r si nt h ec h e m o t h e r a p y p r o c e s s n i t r o s o u r e a sh a v eb e c o m ear e s e a r c hh o t s p o ti nb o t hd o m e s t i ca n do v e r s e a s b e c a u s eo ft h e i rc a r c i n o g e n i c i t ya n da n t i t u m o ra c t i v i t y u n d e rt h e o p t i m i z e d i n s t r u m e n t a l c o n d i t i o n s ，t h em a s s s p e c t r o m e t r i c c h a r a c t e r i s t i c s to fa c n u ，m n u ，e n u ，b c n ua n dm e c c n uw e r ei n v e s t i g a t e db y e l e c t r o s p r a yi o nt r a pm a s ss p e c t r o m e t r yi nam u l t i - s t a g em s f u l ls c a nm o d e t h em a s s s p e c t r aw e r ei n t e r p r e t e da c c o r d i n gt ot h ef r a g m e n t so ft h e s ec o m p o u n d sa n dt h e i r f r a g m e n t a t i o np a t h w a y sw e r ep r o p o s e d t h er e s u l t ss h o wt h em o l e c u l ei o np e a k so f m n u ，e n u ，a c n ua r ep r o t o n a t e dm o l e c u l a rs p e c i e s m + h 】十a n dt h ep r o t o n sl o c a t e i nt h eo x y g e n so fn i t r o s og r o u p s 。i nc o n t r a s t ，t h es t r o n gs o d i u ma d d u c ti o n s m + n a + c a nb eo b t a i n e di ne s i + m ss p e c t r o m e t r yo fb c n ua n dm e c c n u ，w h e r e a st h en a + i o n sl i eb e t w e e nt h ec h l o r i n ea t o m sa n do x y g e n so fn i t r o s og r o u p s t h em a i n f r a g m e n t a t i o np a t h w a y so fa l k y l n i t r o s o u r e a so c c u rb yt h ec l e a v a g eo fn nb o n d si n n n oa n db e t w e e nn ha n dc a r b o n y lg r o u p s h o w e v e r , t h em o l e c u l ei o n so f c h l o r o e t h y l n i t r o s o u r e a sy i e l dt h ec l e a v a g eo fn - cb o n d sb e t w e e nn - - n oa n dc a r b o n y l g r o u p sa tf i r s t t h ep o s i t i v ec h a r g e se i t h e rt r a n s f e rt ot h ep a r to fc h l o r o e t h y lo rt ot h e o t h e r p a r t t h es i t e d i f f e r e n c eo fp o s i t i v e c h a r g e sc a ng i v e b i r t ht od i f f e r e n t f r a g m e n t a t i o nb e h a v i o r s ，m a i n l yi n c l u d i n gt h en e t u r a ll o s so fh c n o ，n h 3 ，h n oa n d c h 3 c n ，r e a r r a n g e m e n ta n dh y d r o g e nt r a n s f e rr e a c t i o n s i na d d i t i o n ，n i t r o s o u r e a s e a s i l yd e c o m p o s ei n t od e n i t r o s a t i o np r o d u c t sa n dt h e s ed e c o m p o s i t i o np r o d u c t a sh a v e t h e i ro w nm a s ss p e c t r o m e t r i cc h a r a c t e r i s t i c s i ne s i - m s ，t h ed i m e r so fm e t h y l u r e a s a n de t h y l u r e a sc a nb ed e t e c t e d 【a c u + h + h a v et w of r a g m e n t a t i o np a t h w a y sb e c a u s e o ft h es i t ed i f f e r e n c eo fp r o t o n m e c c n ua n db c n ua r eh a l i d e sa n df a v o rt ot h e e l i m i n a t i o no fh c l ，l e a d i n gt ot h ef o r m a t i o no fo x a z o l e s m o r e o v e r , f u l lg e o m e t r i cs t r u c t u r eo p t i m i z a t i o n sh a v eb e e nc a r r i e do u tf o ra l lt h e m o l e c u l ea n dp r o d u c ti o n sd u r i n gt h ep r o s so fe s i m sf r a g m e n t a t i o no ff i v e n i t r o s o u r e a su s i n ga bi n i t i om e t h o da tm p 2 6 - 311g ( d ，p ) b a s i ss e t t h em o l e c u l a r s t r u c t u r ep a r a m e t e r sa n de n e r g yp a r a m e t e r sh a v e b e e ne x t r a c t e da n de v a l u a t e df o rt h e i i i a b s t r a c t e l u c i d a t i o no ff r a g m e n t a t i o np a t h w a y so ff i v en i t r o s o u r e a sa n dt h e i rd e c o m p o s i t i o n p r o d u c t s k e y w o r d sn i t r o s o u r e a s ；e s i m s ；f r a g m e n t a t i o nm e c h a n i s m i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特另t i d n 以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 己在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 关于论文使用授权的说明 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 ( 保密的论文在解密后应遵守此规定) 签名：壅! 鲣l 导师签名：日期：z ! 竺星：竺：y 歹 第1 章绪论 1 1 研究背景 第1 章绪论 癌症是一种恶性疾病，发病率高，随着人口的老龄化和环境的污染，癌症的 发病率和死亡率明显增高，是当前危害人类健康的主要疾病之一。据世界卫生组 织( w h o ) 统计，全世界每年有近7 5 0 万人死于癌症，每年新发病例约有1 0 0 0 万人， 我国有关部门统计每年有3 0 万人死于癌症。最新资料表明，癌症的死亡率虽然在 降低，但癌症的治愈率仍不理想。 导致人类癌症的主要原因之一是化学因素，w h o 指出了人类癌症8 0 , - 一9 0 与环境因素有关，其中8 0 以上为化学因素。化学致癌物是指具有诱发肿瘤形成 能力的化学物质。在2 0 世纪后半叶，人类对大量化学物质致癌进行了筛选、鉴定 和评价，并对其作用机理进行了广泛和深入的研究【2 】。目前己对2 0 0 0 多种化学物 质或接触环境的致癌物进行了测定。 化学致癌物可能是遗传毒性的或非遗传毒性的，或者两者兼而有之。遗传毒 性致癌物质的化学活性高，能被代谢成活性中间体，它们可与细胞内大分子和靶 d n a 形成等价加合物。由于形成d n a j j n 合物的能力与诱发实验动物肿瘤的能力 有很好的相关性，故可以认为d n a 是大多数致癌物的首要靶点。遗传毒性致癌 物可将单个烷基或复合的烷基基团转移至i j d n a 碱基的特殊位置上【3 , 4 】。具有致癌 作用的烷化剂及芳香烷化物包括n 硝基化合物、脂肪族环氧化物、黄曲霉素、氮 芥、多环芳烃以及其他矿物燃烧产物等。遗传性致癌物质与d n a 的反应除形成 d n a j h 合物以外，还可以引起d n a 蛋白质交联、d n a d n a 交联、单链断裂、 双链断裂、化学交联和碱基改变等多种损伤。 目前癌症的治疗主要包括放射治疗、外科治疗和药物治疗三大手段。抗癌药 物的不断发现功不可没。根据抗肿瘤药物作用机理的不同可分为烷化剂类、抗代 谢物、天然产物、激素类及拮抗剂等。抗癌药物的研究与开发正经历着历史性的 巨大变化，细胞生物学、分子生物学、基因组学及生物信息学的进步都为抗癌药 的开发提供了新靶点、新思路及新动力。 1 1 1 亚硝基脲类抗癌药物的研究进展 1 9 6 0 年，美国癌症中，t , ( n a t i o n a lc a n c e ri n s t i t u t e ) 的研究者发现n - 甲基- n 一 硝基- n 亚硝基胍( m 州g ) 对l 1 2 1 0 白血病有效【5 1 。化学家在试图改进这一新药的 研究中进一步发现n 甲基一n 一亚硝基g j 录( m n u ) 具有更好的抗颅内植入的l 1 2 1 0 细 胞活性。当m n un 位的甲基被氯乙基基团取代后，其活性的增强，进而人们合 北京丁、l e 大学t 学硕十学何论文 成了多种氯乙基亚硝基脲( c e n u s ) 类衍生物，n 位点的氯乙基是药物发挥化学活 性的主要基团，其物理特性由n 一位的取代基不同而有所差异，基本结构如图1 1 所示。 早￥o nn h ”c 认r 1 | | 一 o 图1 - 1 氯乙基硝基脲( c e n u s ) 的基本结构 f i g 1 - 1t h eb a s i cs t r u c t u r eo f c h l o r o e t h y l n i t r o s o u r e a s ( c e n u s ) c e n u s 是一类作用很强的双功能烷化剂，烷化剂是最早用于治疗恶性肿瘤 的化疗药物【6 ，7 1 ，也是应用最为广泛的一类抗癌药物。烷化剂与d n a 双链的共价 连接可以通过多种途径导致细胞死亡，烷化碱基可以导致异常碱基配对，使 a t g c 的正常互补配对关系改变，在复制时即引进错误的碱基，导致原来正常 的遗传信息发生改变。双功能烷化剂产生分子间连接后，可以阻止d n a 互补双 链在复制时分开，因而阻碍d n a 的正常复制过程，导致有丝分裂不能正常进行， 也易导致d n a 双链发生断裂 8 m 】。 c e n u s 在治疗白血病和各种固体肿瘤，包括脑瘤、恶性黑色素瘤、恶性淋 巴瘤，有较好的疗效【1 3 。16 1 。具有代表性的c e n u s 临床药物主要有卡莫司汀 ( b c n u ) ，洛莫司汀( c c n u ) ，司莫司汀( m e c c n u ) ，福莫司汀( f m ) ，尼莫司汀 ( a c n u ) ，雷莫司汀( m c n u ) 等，上述c e n u s 化合物在具有抗癌活性的同时都具 有较强的骨髓毒性。 1 1 2c e n u s 分解机理的研究 c e n u s 是少数能够通过血脑屏障的抗癌药物之一。与其它抗癌药物不同， c e n u s 在生理条件下能够产生多种活性中间体与敏感的生物大分子反应。由于 c c 1 键的不稳定性，其代谢过程非常复杂。l o w n 等人提出了亚硝基脲可能存在 的三种主要分解途型2 2 1 ，如图1 2 。 r n o i h n c n c h 2 c h 2 c l i | o 。，嘏。邕c l c h ：c h ：+ 而 o-=h，+h；o 胆h “虻比啦忙c 。c 删。 卜：l h “：h ，l l s h + i f tc 茫h c h ，兰gc h h c l 3 c h o 。一 j 。 j 一脯武_ 0 l 骂n o c 唧一：带n o c 邸邺h 一仁oo l c h 2 = c h _ n = n _ 伽2 兰kc h 2 ：旦2 c h 厂4 h h 2 0 图1 2 氯乙基亚硝基n ( c 日q u ) 的三种主要分解机制 f i g 1 - 2t h et h r e em a i nd e c o m p o s i t i o nm e c h a n i s m so fc h l o r o e t h y l n i t r o s o u r e a s ( c e n u ) 2 第1 章绪论 一系列研究表明了途径i 是旺硝基脲在生理条件下分解的主要途径。在p h 值7 4 的生理条件下，亚硝基脲分子很快被降解，分子在氨甲酰胺处分裂为异氰 酸酯和重氮氢氧化物中间体，异氰酸酯能够导致胞内大分子中的氨基基团甲氨酰 化从而使细胞受到损伤，而重氮氢氧化物则是与d n a 作用发挥抗癌活性的主要 物质。r o b e r t 等【2 1 】用氘标记b c n u ，经g c m s 分析推断b c n u 被碱基或核苷酸催 化分解生成氯乙基重氮氢氧化物是反应的限速步骤【2 3 1 。l o w n 课题组对1 4 c 标记的 b c n u 、c c n u 和m e c c n u 在水溶液中分解产物的研究时，发现大量的羟氯乙基 和乙醛出现在亚硝基脲的水解产物中，并提出了氯乙基正离子是一种重要的能够 烷化d n a 的物质【2 4 1 。 在p h 值为5 0 的酸性溶液体系中，氯乙基亚硝基脲的分解可能经历分子内环 化，如途径i i 。这种机制的转移可能是由于途径i 中生成氯乙基重氮氢氧化物的 限速步骤是碱催化的，这种效应在低p h 值时变得比分子内环化作用缓慢。r o b e r t 和m i c h e j d a 等人【2 5 】的研究表明氯乙基亚硝基脲的n o 基团参与分子内的取代反 应，产生了1 ，2 ，3 一氧化二唑啉，该产物能够断裂生成中间体4 ，5 二羟基1 ，2 ，3 氧化二唑，进而生成2 一羟乙基重氮氢氧化物、乙二醇和甘油等主要产物。亚硝基 脲取代分子内离去基团的这种邻基参与作用在亚硝胺的代谢中表现的比较活跃 【2 6 2 7 1 ，对于亚硝基脲，p h7 4 和p h5 0 条件下是两种竞争的机制，邻基参与作用 主要发生在p h5 0 时的反应体系中。 亚硝基脲另外一种可能的分解机制是羰基氧原子参与的分子内环化的过程， 形成分子内五元环结构，该化合物在p h7 2 的水溶液中能够导致乙醛的形成，乙 醛也可通过与d n a 作用导致d n a 股间交联和其他损伤【2 8 1 。c e n u s 不论经过何种 途径代谢，最终都将生成一系列具有反应活性的小分子产物，这些产物与生物大 分子的相互作用决定了亚硝基脲化合物的抗癌作用和毒性。 1 1 3c e n u s 导致d n a 损伤的研究 c e n u s 所导致的烷化加合物是由氯乙基或羟乙基基团在核苷酸位点的简单 取代而形成。w i l l i a m 等人研究了2 氯乙基亚硝基脲与小牛胸腺d n a 作用后的烷 化产物，其中主要包括n 一( 2 羟乙基) 脱氧鸟嘌呤，n7 ( 2 氯乙基) 脱氧鸟嘌呤， n 1 一( 2 羟乙基) 脱氧鸟嘌呤，0 6 ( 2 羟乙基) 脱氧鸟嘌呤，0 6 ( 2 一氯乙基) 脱氧鸟嘌呤， 1 ，2 - ( - - 鸟嘌呤) 乙基( 1 ，2 - b i s g ) 和鸟嘌呤胞嘧啶z 谨( d g d c ) 交联产物 2 弘3 3 】。 在各种d n a 烷化产物中，鸟嘌呤0 6 和n7 位点已经成为研究的热点，其中n 7 位点具有最较强的亲电性，该位点烷化产物的稳定性大大低于非烷基化碱基，并 可通过咪唑环开环和脱嘌呤作用发生分解。随着c e n u 与d n a 作用产物的不断研 究，几种稳定的环化乙基加合物也已经被鉴定，包括3 ，n 4 乙醇基胞嘧啶，l ，n 6 乙醇基腺嘌呤和n 2 ，3 乙醇基鸟嘌呤。尽管亚硝基脲能够以很大比例生成亲电试 剂使d n a 烷化，但近年来人们普遍认为d n a 股间交联的形成是致癌的决定性因 素，因为它能够干扰d n a 的复制与转录，并可能导致基因的移码突变。p a u l a 等 证明了b c n u 与合成的寡核苷酸反应的序列特异性及d n a 股间交联所导致损伤 的共价结构 3 4 , 3 5 。确定了鸟嘌呤的n 1 和胞嘧啶的n 3 位形成股间交联，交联的效率 与单加合物形成的效率成正比，且交联多发生在g c 富集的部位，尤其是含有连 续鸟苷酸的位点，但交联并没有明显的序列特异性。 c e n u s 导致d n a 股间交联的反应主要包括两个步骤：第一步为氯乙基碳正 离子中间体与d n a 一条单链上鸟嘌呤0 6 位点发生反应，形成0 6 - ( 2 一氯乙基1 鸟嘌 呤，该化合物经历分子内重排形成n 1 ，0 6 _ 乙醇基鸟嘌呤加合物；第二步为环化的 c o 键发生断裂，与d n a 另一条互补单链上胞嘧啶n 3 位点发生反应导致n 3 c n 1 g 二元股间加合物的形成【3 6 1 ，如图1 3 。这两步反应中生成单烷基化鸟嘌呤的步骤 较快，而分子内环化最终导致交联的形成过程则持续约1 2 1 6 个小时，是反应的 限速步骤。另外一种股间交联的形式为1 ，2 ( 二鸟嘌呤) 乙基，这种损伤为两个鸟 嘌呤的n 7 位点相连接，研究表明n 7 位点的损伤并不是d n a 股间交联的主要形式。 0 6 烷基鸟嘌呤( 0 6 a g ) 转移酶可以除去第一步反应中生成的0 6 - a g ，从而 防止交联的生成。缺少0 6 - a g 转移酶的细胞称为m e r - 细胞，对亚硝脲类烷化 剂敏感，而m e r + 细胞则对其耐药，这是检测肿瘤的m e r 从而达到一定选择性 化疗的基础 3 7 】。 c h 2 c l o i io 。 c e n u 二舡焉众愈卜邺邸枷t h ? - - - 9c l 釜- 旦江d r 泠o 釜 双区理论【3 8 。4 2 1 的基本观点是化学致癌作用的关键步骤是导致d n a 互补碱对 之间的共价横向交联。双区理论认为0 t 位与p 位之间或位与1 ，位之间的双官能 团对致癌有最重要的贡献。n 一亚硝基化合物的0 【位与p 位之间以及0 t 位与丫位之 间正好与0 2 8 n m 0 3 0 n m 的距离一致。这正是双区理论所指出的最有利位置， 4 隧a 旷昂严h 2 村n 声z 一坫n 县h ：一丈c r i 产。 宁_ of o n h r 如h r n h r v 也三岱n b z 三矗一h ：_ 咀圳a s e f _ o o j r t 图1 4 表明氯乙基亚硝基脲形成五元环活性中间体，并在b 位烷化d n a ， 并进一步代谢最终导致d n a 股间交联( d n a d n ai n t e r s t r a n dc r o s s l i n k s ，i c l ) 的 过程。亚硝基脲能够在体内自发地分解成能够烷化d n a 碱基的活性中间化合物， 在对癌细胞d n a 烷化并起到抗癌作用的同时，亚硝基脲也能够导致正常细胞 d n a 互补碱基对中碱基的横向交联，从而导致难以修复的互补移码突变，通过 互补移码变异转化成逆转录酶基因，产生错误的d n a 在细胞核中潜存，并逐渐 将本身的错误信息逆转录于正常的d n a ，经历潜伏期而导致细胞的癌变【4 1 1 。 综上，虽然人们对几种常见亚硝脲的分解、体外代谢、动物体内的代谢甚至 与d n a 的反应机理都进行了较深入的研究，但由于受当时实验条件的限制，大 多使用气质联用技术。而亚硝基脲类的挥发性都很很差，大多要进行衍生反应， 使反应复杂化，且其质谱多为化学电离( e i ) 质谱，所得结构碎片信息较多，不能 得到完整的分子信息，这些都限制了关于亚硝基脲各种机理的深入研究。而电喷 雾质谱法( e s i m s ) 是一种新发展起来的软电离质谱技术，e s i m s 能直接分析溶 液样品，特别适合分析强极性、难挥发或热不稳定的化合物。本课题组将利用本 实验室先进的实验条件对亚硝脲的分解、体外代谢、动物体内的代谢甚至与d n a 的反应机理进行更深入的研究，探究其抗癌和致癌的异同点，并利用计算机模拟 技术设计出低毒的亚硝基脲类抗癌药物，而本文则主要利用电喷雾质谱研究几种 常见亚硝基脲的质谱裂解特征，为今后关于亚硝基脲各种机理的研究提供一定的 实验基础。 5 北京t 业大学t 学硕十学位论文 1 2 电喷雾离子阱质谱 电喷雾质谱法( e s i m s ) 是一种新发展起来的软电离质谱技术。1 9 6 8 年d o l e 等【4 3 】发现了从一带电毛细管尖端喷射溶液而产生大分子气态离子的可能性，而这 一技术最先被应用于离子迁移光谱仪，直到本世纪8 0 年代中期，f e n n 等【4 4 4 8 】以 d o l e 等的思路为基础，才将电喷雾真正发展为质谱仪的接口。e s i m s 能直接分 析溶液样品，由于它不象电子轰击( e i ) 、化学电离( c i ) 等常规电离技术存在样品 加热汽化的过程，因而特别适合分析强极性、难挥发或热不稳定的化合物。二十 几年来，电喷雾质谱技术取得了迅速的发展，已广泛地应用于化学、化工、材料、 环境、地质、能源、药物、刑侦、生命科学、运动医学等各个领域。同所有的质 谱一样，电喷雾离子阱质谱也是由离子源、质量分析器、检测器和真空系统几部 分组成的，其独特之处在于电喷雾离子源和离子阱质量分析器。图1 。5 为布鲁克 公司的e s q u i r e6 0 0 0 电喷雾离子阱质谱的结构图。 w a s t e l o 稳t r a p 图1 5 电喷雾离子阱质谱的结构图 f i g 1 5 t h es t r u c t u r ed i a g r a mo fe s q u i r e6 0 0 0e s i - m s 电喷雾是近年来出现的一种新的电离方式。它主要应用于液相色谱质谱联 用仪，既作为液相色谱和质谱仪之间的接口装置，同时又是电离装置。其主要部 件是一个多层套管组成的电喷雾喷咀，最内层是液相色谱流出物，外层是喷射气， 喷射气常采用大流量的氮气，其作用是使喷出的液体容易分散成微滴。另外，在 喷嘴的斜前方还有一个补助气喷咀，补助气的作用足使微滴的溶剂快速蒸发。在 微滴蒸发过程中表面电荷密度逐渐增大，当增大到某个临界值时，离子就可以从 表面蒸发出来。离子产生后，借助于喷咀与锥孔之间的电压，穿过取样孔进入分 析器。 6 第1 章绪论 离子阱有一对上下的端电极和一环电极组成，上下端电极面为双曲线的旋转 对称面。三个电极均为双曲线形状，端盖电极施加直流电压或接地，环电极施加 射频电压( r f ) ，通过施加适当电压便形成一个假想的离子“陷阱”。根据r f 电压 的大小，离子阱就可捕获某一质量范围的离子。离子阱可以储存离子，待离子累 积到一定数量后，升高环电极上的r f 电压，离子按质量从高到低的次序依次离 开离子阱，被电子倍增监测器检测。离子阱在全扫描模式下仍然具有较高灵敏度， 目前离子阱分析器已发展到可以分析质荷比高达数干的离子。由于离子可在阱内 贮存一段时间，离子阱质谱仪可实现时间序列的串联质谱，通常状态下可以做到 4 6 级，e s q u i r eh c t 在手动状态下最高可达1 1 级。 1 2 1 电喷雾的基本原理 电喷雾的实验过程【4 9 - 5 1 】可简述为：常压下，分析物的溶液通过一带高电压的 毛细管，在约几千伏的高电场作用下，产生高度带电荷的雾状液滴，它们沿着电 压和压力梯度，经刮削器( s k i m m e r ) 到达质谱仪的质量分析器。在迁移过程中， 液滴由于溶剂蒸发或库仑爆炸而体积逐渐减小；最后产生完全脱溶剂的气相离 子。 电喷雾过程主要包括两个阶段：产生带电液滴和将离子从带电液滴中转移到 气相。溶液被输送至一带高电压的电喷雾毛细管尖端，假设在正电压下，溶液中 的正离子会在表面累积，并沿低场方向被吸出，形成 t a y l o r 锥”【5 1 1 。如果所加 的电场足够高，使静电力超过表面张力时，锥被抽成细丝，经过“发芽”( b u d d i n g ) 过程，产生带正电荷的液滴。随着小液滴的变小，电场强度逐渐加强，过剩的正 电荷克服表面张力形成小液滴，最终从t a y o r 锥体的尖端溅射出来( 见图1 6 ) 。 图1 - 6 电喷雾液滴的形成 f i g 1 - 6d r o p l e tf o r m a t i o na tt h en e e d l et i pw i t h i nt h es p r a yc h a m b e r 7 北京t 业大学t 学硕十学何论文 新形成的液滴开始蒸发，液滴表面的电荷密度开始上升直到不稳定【5 2 1 。大量 的带有大部分不稳定电荷的小液滴释放将会缓解原始液滴表面受到的力【5 3 1 。这个 过程被称为液滴的裂解。液滴自身的裂解过程不断重复将会产生一系列的越来越 小液滴，这些小液滴将会在空间电荷效应的影响下被迫使产生喷雾，最终结果是 产生强的喷雾，随着时间和距离的延长雾滴将会变得越来越细小，这些非常小的 液滴最终产生气相离子。 对于产生气相离子的精确机理目前尚不清楚，目前有两种理论描述此过程。 离子蒸发理论首先由i r i b a r e 和t h o m s o n s 4 提出，他们认为当液滴达到临界尺寸 和临界密度，溶剂化离子就会从液滴表面直接解吸出来。d o l e 等t 5 5 , 5 6 贝, l j 提出了“带 电残渣理论”，认为液滴由于溶剂蒸发或库仑爆炸而体积逐渐减小，最终可能导 致形成仅含单一离子的液滴，随着溶剂的进一步蒸发，可能生成完全脱溶剂的气 态离子，无论是离子蒸发理论还是带电残渣理论都得到了广泛的认同。 1 2 2 碰撞诱导分解技术( c i d ) c i d 技术是从有机质谱中发展而来的，在c i d 中，通过离子与中性分子的碰 撞，能量被有效的转移到了离子上，结果离子由于获得足够的能量而使键断裂， 并发生选择离子的重排反应。在c i d 条件下，键的断裂与重排对解决分子的结构 足相当有益的。在e s i 条件下，产生c i d 谱与e i 条件下产生的谱图有所不同。 在e i 条件下，通常有自由基的阳离子形成，该自由基非常活跃，通常足重 排反应中的先导基。 7 0 e v 低能电子 在e s i 条件下产生的是 m + h 】+ 离子： m + h + 一 m + h 】+ 溶液态 离子蒸发 气态 m + h + 是一种偶电子离子，它的碎片反应首先是由于断裂或重排引起的。 e i 条件下的偶电子碎片规律可以用来解释e s i 的c i d 质谱。c i d 的碎片的生成 受许多因素的影响，如气压、所用气体、离子能、仪器条件等，不同实验的c i d 质谱可能是不同的。c i d 实验至今没有统一的标准条件，因此也就没有建立可 参照的谱库，所以c i d 的识谱目前只能依靠手工。手工识谱需要对碎片产生的 机制有深刻的了解，c i d 反应一般是具有偶电子离子的单分子反应生成碎片。在 第1 章绪论 奇电子分子中识谱所考虑的基本的能来能量关系依然适用，如形成碎户j 葛子的稳 定性、母离子的稳定性、成键有效性等都是应该重点考虑的，分解反应总是朝着 有利于生成另一个偶电子离子和带自由基的断裂基团的方向发展。 有机质谱的一些碎片可用于识谱，如偶电子离子的一般碎片类型为：单键 断裂，同时电荷转移：成环，同时电荷转移；多重断裂，同时伴有电荷转移， 电荷保留，成环碎片；重排，主要是氢重排。 单键断裂，同时电荷转移是所有断裂机制中最简单的一种，即一个键上的双 电子转移到正电荷处。 h d 岔 h 3 c h 2 c o 、 c h 2 c h 3+h20 、 h 反应式中乙醇是质子化的，醇键断裂形成乙烷正碳离子和一个中性水分子， 正电荷从氧离子转移到碳离子上，形成稳定的中性分子( h 2 0 ) 对单键断裂反应 是十分重要的。在识别电喷雾质谱的c i d 谱图中，质子位点的确定是相当重要 的，一般质子化的容易程度取决于化合物的碱性。碎片反应中另一个需要注意的 是离子稳定性，越稳定的离子越容易生存。 成环反应是偶电子离子发生碎片时最容易采取的方式，这是因为丢失了一个 中性的分子基团而促使结构上跟稳定离子的生成，反应机制要求一种完全定向有 序的中间态，使得产物更加稳定地生成。成环反应的一个例子如下 h 3 c o h 3 c o + h n = c h c h 3 在上例中电子从o 转移到形成的一个新键上，新键是在相邻电荷的一个c 位上，而c - n 键上的电子转移到原来的n + 电荷位置上。结果形成了一个环状化 合物，正电荷转移到o + 上，中性分子丢失。通常难以预先判断电子与电荷的转 移，可以用上述偶电子分子离子的经验断裂过程作为参照。 还有一种为多重断裂，在一次碎片反应中有两个以上的键的断裂。电荷可能 从最先的位置移动或在原区域活动。大多数情况下会造成一个中性分子的损失： 开环反应与碎片也会发生。环断裂通常需要断裂2 个以上的键。当为偶电子离子 时，电荷不会转移。 9 北京- r q k 大学t 学硕十学位论文 - i - _ h 2 c = o h + h 2 c - - o + h 2 c = c h 2 审l h h 3 c 一占一g 乙c h 2 h 3 c - o h + h c - i - = c h 2 偶电子碎片反应时氢会发生重排，氢重排反应是碎片反应的产物。通常偶电 子物种的同分异构化包括氢的重排。重排的驱动力来自于形成热力学上更稳定的 离子。这些氢重排反应在偶电子离子碎片反应中起到了非常重要的作用，多键断 裂会发生电荷可能保留也可能移动。下面反应中，前者反应更稳定，这是因为产 物离子h c = c h 2 比h 2 c = 6 h 有更高的稳定性。 一上3 会一h 一h 2 c 伞岂2 _ o hh 3 c 一舀一舀一。一h 一心莨二二一o h 。 hhi 。 i 卜h 2 c = = c h + h 3 c o h 一9 2 _ c 会一h ，h ：古器g 蜗h 亍：乡舀一。一h 叱c c c 一洲 叫卜h 2 c - - - c h 2 + h 2 c = o h 1 3 课题研究目的和内容 氯乙基亚硝基脲作为癌症化疗药物在临床上被广泛的应用，但也会作用于正 常细胞，诱发二次肿瘤，由于其致癌性和抗癌性，亚硝基脲已成为国内外研究的 热点。本课题主要利用电喷雾离子阱质谱研究盐酸尼莫司汀( a c n u h c d 、甲基 亚硝基脲( m n u ) 、乙基亚硝基脲( e n u ) 、卡莫司汀( b c n u ) 和司莫司汀( m e c c n l d 五种亚硝基脲的质谱特征，为探究亚硝基脲的各种机理提供了前提条件。 本文在对毛细管电压、雾化室温度、雾化气流速和干燥气压力质谱条件优化 的基础上，研究了五种亚硝基脲的质谱特征，推测了不同亚硝基脲的裂解机理。 同时还采用了g a u s s i a n a 0 3 和g a u s sv i e w 软件，在m p 2 6 3 l l g ( d ，p ) 基组水平上， 1 0 第1 幸绪论 对亚硝基脲裂解反应中涉及到的分子离子、碎片离子及中性产物进行量子化学计 算，通过全几何优化所得的结构及能量参数从理论上解释了亚硝基脲的不同裂解 机理。 第2 审盐酸尼其司汀电喷雾质谱特征的研究 第2 章盐酸尼莫司汀电喷雾质谱特征的研究 盐酸尼莫司汀( a c n u h c l ) 是一种水溶性亚硝基脲类烷化剂，其主要抗肿瘤 作用的机制与其他亚硝基脲类化合物相似，在生理条件下经过o h 。离子的作用形 成氯乙基重氮氢氧化物和异氰酰胺，异氰酰胺可以通过耗尽还原型谷胱甘肽从而 抑制d n a 修复和使r n a 成熟变化。a c n u 主要用于原发性和继发性脑胶质瘤， 对小细胞肺癌、慢性粒细胞白血病、胃癌及大肠癌等也有一定的疗效。a c n u 优 于其它亚硝脲类抗癌药为：a c n u 为盐酸盐，具有良好的水溶性，同时又具有高 度脂溶性，可通过血脑屏障，浓度为血浆中原药及代谢物的3 0 。动物实验表明 a c n u 具有较好的抗癌活性，同时对小鼠l 1 2 1 0 白血病也有较好的治疗作用。 尼莫司汀和盐酸尼莫司汀的结构如图2 1 。 a c n u a c n u h c l 图2 一l 尼莫司汀和盐酸尼莫司汀的结构 f i g 2 1s t r u c t u r eo f a c n ua n da c n u 。h c i 2 1 实验试剂和仪器 甲醇 盐酸尼莫司汀( a c n u h c l ) 电喷雾离子阱质谱 2 2 质谱条件的优化 n h 2 h c l s i g m a 公司 s i g m a 公司 布鲁克公司e s q u i r e 6 0 0 0 在初步实验中，对电喷雾( e s i ) 和大气压化学电离( a p c i ) 两种离子源进行了考 察，结果发现使用e s i 源盐酸尼莫司汀的灵敏度比较高，因此本实验使用了e s i 源。实验时称取适量盐酸尼莫司汀，用甲醇配制成质量浓度约为5 肛g m l 的待测 溶液。检测方式为e s i m s n 全扫描质谱，注射泵直接进样，样品流速为 4 肛l m i n 。 2 2 1 毛细管电压对电离的影晌 毛细管电压足电离源内的一个重要参数，其值的设定与化合物的分子量大小 以及化合物的电离稳定性有关。在雾化气压力：2 0p s i ，干燥气流速：8 0l m i n ， 北京下、i k 大学t 学硕十学位论文 干燥气温度为3 5 0 的质谱条件下，分别检测毛细管电压为3 0 ，3 2 5 ，3 5 ，3 7 5 ， 4 o ，4 2 5k v 时5 i t g m l 盐酸尼莫司汀的电离情况( 图2 2 ) 。 1 4 0 e + 0 7 1 2 0 e + 0 7 入1 o o e + 0 7 。量8 o o e + 0 6 岩6 o o e + 0 6 4 o o e + 0 6 2 o o e + 0 6 o o o e + o o 33 2 53 53 7 544 2 5 c a p i t l a r yv o l t k v 图2 - 2 毛细管电压对盐酸尼莫司汀电离的影响 f i g 2 - 2e f f e c to fc a p i l l a r yv o l t a g eo ni o n i z a t i o no f a c n u h c l 由上图可以看出，当毛细管电压为3 7 5k v 时，盐酸尼莫司汀的电离效率最 高，所以本节选定毛细管电压的最佳条件为3 7 5k v 。 2 2 2 干燥气温度对电离的影响 干燥气的温度也是影响化合物电离的一项重要参数，过低的温度使样品溶剂 不能完全汽化，而过高的温度又会使热不稳定的物质受热分解。因此本文对干燥 气温度进行了优化，在雾化气压力：2 0 p s i ，干燥气流速：8 0l m i n ，毛细管电压 为3 7 5k v 的质谱条件下，分别检测干燥气温度为2 2 5 ，2 5 0 ，2 7 5 ，3 0 0 ，3 2 5 ， 3 5 0 时5 p g m l 盐酸尼莫司汀的电离情况( 图2 3 ) 。 6 0 0 e + 0 6 5 o o e + 0 6 蚤4 o o e + 0 6 g3 0 0 e + 0 6 闫2 0 0 e + 0 6 1 0 0 e + 0 6 0 0 0 e + 0 0 2 2 5 2 5 0 2 7 53 0 03 2 53 5 0 t e m p e r a t u r eo fd r yg a s 图2 3 干燥气温度对盐酸尼莫司汀电离的影响 f i g 2 - 3e f f e c to fd r yg a st e m p e r a t u r eo ni o n i z a t i o no f a c n u h c l 1 4 第2 章盐酸尼莫司汀电喷雾质谱特征的研究 由上图中可以看出，雾化室温度为3 0 0 时，盐酸尼莫司汀的电离效果最好， 所以本节雾化室温度选定为3 0 0 。 2 2 3 干燥气流速对电离的影响 干燥气的主要作用是吹走多余的溶剂，避免溶剂进入真空系统。如果流速过 低可能会导致溶剂分子不能被完全吹走，而过高的干燥气流速可能会吹走样品分 子而降低了方法的灵敏度。本文在毛细管电压为3 7 5k v ，干燥气温度为3 0 0 ， 雾化气压力：2 0p s i 的质谱条件下，分别检测3 ，4 ，5 ，6 ，7 ，8l r a i n 下5 l t g m l 盐酸尼莫司汀的电离情况( 图2 - 4 ) 。 1 2 0 e + 0 7 1 o o e + 0 7 扫8 o o e + 0 6 罚 g6 0 0 e + 0 6 自4 o o e + 0 6 2 0 0 e + 0 6 o o o e + o o 345678 f l o wr a t eo f d r yg a s l m i n 图2 - 4 干燥气流速对盐酸尼英司汀电离的影响 f i g 2 - 4e f f e c to fd r yg a sr a t eo ni o n i z a t i o no f a c n u 。h c l 结果发现随干燥气流速的增大，盐酸尼莫司汀的分子离子峰的峰强度均增 大，当干燥气流速大于5l m i n 时，其电离效果开始减小，可能是过高的干燥气 流速将样品吹走，从而降低了化合物的电离，所以本节采用干燥气的流速为 5l m i n 。 2 2 4 雾化气压力对电离的影响 雾化气压力的大小对化合物电离也是一个很重要的参数，本节在己经优化质 谱条件的基础上，对雾化气压力进行了优化，由图2 - 5 可以看出当雾化气压力为 1 0p s i 时最佳。 1 5 北京t , i k 大学t 学硕十学位论文 7 o o b + _ 0 6 6 o o e + 0 6 h5 0 0 e + 0 6 至4 0 0 e + 0 6 岂3 0 0 e + 0 6 。2 0 0 e + 0 6 1 o