（皮革化学与工程专业论文）胶原高得率提取法及胶原膜性能的研究.pdf

四川大学硕士学位论文胶原高得率提取法及胶原膜性能的研究皮革化学与工程专业硕士生：付强指导教师：李国英胶原独特的生物活性和可生物降解性使其得到广泛的应用。但现有的从新鲜动物皮中提取胶原的提取率只有5 8 ；以膜形式应用的胶原材料由于其遇水易膨胀变形，吸水性强的缺点在一定程度上限制了其应用。本论文研究从新鲜黄牛皮中高得率提取胶原的方法，对所提取胶原的性能进行表征，并通过共混法改善胶原膜性能。对新鲜动物皮进行适当的预处理是高得率提取胶原的先决条件本文以黄牛鲜皮为原料，通过考察毛脱除情况、测定收缩温度以及显微镜观察纤维结构，对比了肉面包酶、浸碱粒面包酶、过氧化氢这三种不同的预处理方法对毛脱除，以及皮胶原纤维分散的影响。结果表明：肉面包酶和过氧化氢预处理法都无法将绒毛除尽，且前者纤维间质去除较少，过氧化氢除去纤维间质较多，对皮胶原纤维分散程度大；而浸碱粒面包酶法可以在包酶3 6 小时后，轻松将毛全部除尽，同时除去部分纤维间质故选用浸碱粒面包酶作为第一步预处理法，在此基础上，利用过氧化氢对皮胶原纤维具有较强分散作用的性能，采用过氧化氢对经过浸碱粒面包酶处理的皮进行二次处理，结果表明：过氧化氢浓度6 0 ：、p h 值l o 、作用时间4 5 h 时，既能除去大部分纤维间质，又可以适当分散皮胶原纤维，且不会影响胶原的结构。一次预处理和二次预处理皮胶原提取率分别为1 8 和3 0 。这表明预处理对皮胶原纤维的分散程度直接影响胶原的提取率，胶原纤维分散越均匀，胶原提取率越高。所选定的浸碱粒面包酶、过氧化氢二次预处理法处理的黄牛皮，胶原提取率比已有提取方法的提取率提高了两个百分点以上。采用正交实验法确定了胶原的最佳提取条件。结果表明：温度4 c ，酶用四大学硕士学位论丈量0 5 ，作用时间7 2 h ，胶原提取率可达2 8 8 ，且酶用量减少1 o 一1 5 ，提取时间缩短2 4 h 。氨基酸组成分析结果表明：提取得到的胶原含有甘氨酸3 3 2、脯氨酸1 1 9 、羟脯氨酸7 9 ，组氨酸和半胱氨酸含量极少；z e t a 电位滴定法测得其等电点为6 6 2 ；十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其分子量特征：出现两条a 链条带，一条1 3 链条带和一条y 链条带，这与已有方法提取得到的胶原具有相同的分子量特征。差示扫描量热法测定胶原变性温度为3 8 5 ；激光粒度仪测定胶原的平均粒径随温度变化趋势表明，随着温度在一定范围内升高，自聚集性能明显，这种性能在温度为3 2 时最强，超过3 8 5 以后，平均粒径急剧降低，达到6 0 以后，平均粒径不再变化；扫描电子显微镜和透射电子显微镜观察结果表明：胶原呈现明显的网孔状结构。以上分析结果表明，本文提取得到的胶原具有与已有方法提取得到的胶原相似的结构和性能。采用聚乙烯醇( p v a ) 、壳聚糖( c h ) 分别与胶原共混成膜以改善胶原膜性能。对各共混膜进行表面观察、热性能分析、膨胀率测定、吸湿率以及抗张强度和表面接触角测定。结果表明：p v a 与胶原的共混性较差，p v a 的加入不会明显改变胶原纤维的形貌，共混膜中两者出现相分离；而c h 与胶原共混性好，少量c h 的加入就可以使胶原纤维分散膨胀，改变胶原纤维的有序交织结构。各比例的胶原p v a 共混膜和胶原c h 共混膜的膨胀率都降低，稳定性提高，吸湿性和表面亲水性也高于胶原膜，但抗张强度都小于胶原膜。胶原c i - i 共混膜的综合性能优于胶原p v | a 共混膜综合性能。胶原与c h 共混比例为3 ：2 时，与纯胶原膜相比，该共混膜热变性温度基本不变( 1 4 0 ) ，在缓冲液中膨胀率由9 5 1 5 降至6 3 8 0 0 4 0 ，表面接触角由7 4 3 5 。减少到6 6 3 7 。，2 4 小时吸湿率由6 6 提高至1 4 8 ，而抗张强度只略有降低。关键词：胶原皮预处理提取率物理化学性质共混膜m四川大学硕士学位论文s t u d i e so nt l i ee x t r a c t i o nm e t h o do fb o v i n ec o l l a g e nw i t hh i g h l da n dt h ep r o p e r t i e so fb l e n d 矾gc o l l a g e nm e m b r a n el e a t h e rc h e i i l i s t r ya n de n g i n e e r i n gp o s t g r a d u a t e ：f uq i a n gs u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rg u o y i n gl ia b s t r a c tt h ec o l l a g e nh a sb e e nw i d e l yu s e da sm e d i c a lm a t e r i a l sb e c a u s eo fi t sp r o p e r t i e so fb i o a e t i v i t ya n db i o d e g r a d a t i o n h o w e v e rt h ee 】【i s t i ge x u a c t i o ny i e l do fc o l l a g e nf r o m 丘e s hh i d ei so n l y5 - 8 c o l l a g e nm e m b r a n eh a ss o m ed e f i c i e n c i e s s u c ha sh i g hh y d r o s c o p i c i t ya n dd e f o r m a t i o ni nw a t e r , w h i c hm a k ei t sa p p l i c a d o u sr e s t r i c t e d i nt h i ss t u d y , t h em e t h o d so fh i g he x t r a c t i o ny i e l do fc o l l a g e nf r o mf l e s hb o v i n eh i d e sw e r ei n v e s t i g a t e d , t h e nt h ep r o p e r t i e so fo b t a i n e dc o l l a g e nw e r ec h a r a c t e r i z e da n dt h ep r o p e r t i e so f c o l l a g e nm e m b r a n ew e r ei m p r o v e db ym e a n so f b l e n d i n g e x t r a c t i n gc o l l a g e nf r o mf l e s hh i d ea th i g he x t r a c t i o ny i e l do nt h ep r e m i s et h a tt h eh i d es h o u l db ep r e t z e a t e dp r o p e r l y f r e s hb o v i n eh i d ew a sp r e t r e a t e db yt h r e ed i f f e r e n tm e t h o d s ，n a m e l yb e s m e a r i n ge n z y m eo nt h ef l e s hs i d e ，e n z y m eo nt h eg r a i ns i d ea f t e rl i m i n ga n du s i n gh y d r o g e np e r o x i d e r 1 1 始e f f e c t so fd i f f e r e n tp r e t r e a t m e n t0 1 1u n l m i r i n ga n dc o l l a g e nf i b e r sd i s p e r s i o nw e r ec o m p a r e di nv i r u 圯o fs h r i n k a g et e m p e r a t u r ea n dm i c r o s c o p ei n v e s t i g a t i o n 皿er e s u l t si n d i c a t e dt h a tb o t ht h ep r e t r e a t m e n to fb e s m e a r i n ge n z y m eo nt h en e s hs i d ea n dt h ep r e t r e a t m e n to fh y d r o g e np e r o x i d ec o u l d n tr e h l o v ef u z z e s t h ef o r m e rj u s tr e m o v e dal i t t l eb i to fi n t e r f i b r i l l a rs u b s t a n c e , w h e r e a sh y d r o g e np e r o x i d ec o u l dr e m o v em o r ei n r e r f i b r i l l a r四川大学硕士学位论文s u b s t a n c ea n dd i s p e r s ec o l l a g e nf i b e ra tah i g h e rd e g r e e t h ep r e t r e a t m e n to fb e s m e a r i n ge n z y m eo nt h eg r a i ns i d ea f t e rl i m i n gc o u l dr e m o v ea l lt h eh a i re a s i l ya n ds o n i ci n t e r f i b r i l l a rs u b s t a n c ea f t e r3 6h o u r s ，s oi tw a ss e l e c t e da st h ep r e t r e a t m e n tm e t h o d o nt h eb a s i so f t h i sp r e t r e a t m e n tm e t h o d ，t h es e c o n dt r e a t m e n tw a sc a r r i e do u tb yh y d r o g e np e r o x i d e ，t a k i n ga d v a n t a g eo fi t sc a p a c i t yo fd i s p e r s i n gt h ec o l l a g e nf i b e r s t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ta f t e rt h eh i d ew a st r e a t e dw i t h6 0 9 lh y d r o g e np e r o x i d ef o r4 5h o u r sa tp i l l 0 m o s to ft h ei n t e r f i b r i l l a rs u b s t a n c e sw o r er e m o v e da n dc o l l a g e nf i b e r sw o r ed i s p e r s e dp r o p e r l y , a n da tt h e8 a l n et i m et h es t r u c t u r eo fc o f f a g e nw a sn o td e s t r o y e d n 圮e x t r a c t i o ny i e l do fc o l l a g e nf r o mt h eh i d ew h i c hw a st r e a t e dw i t hb e s m e a r i n ge n z y m eo nt h eg r a i ns i d ea f t e rl i m i n gw a s1 8 ，w h e r e a st h eh i d ew h i c hw a st r e a t e dw i t hb e s m e a r i n ge n z y m e0 1 1t h eg r a i ns i d ea f a rl i m i n gf i r s t l ya n dh y d r o g e np e r o x i d et r e a t m e n ts e c o n d l yh a s3 0 c o l l a g e ne x t r a c t i o ny i e l d s ot h ee x t r a c t i o ny i e l do fc o l l a g e nw a si n f l u e n c e dd i r e c t l yb yt h ee x t e n to fc o l l a g e nf i b e r sd i s p e r s i o n t h em o r ec o l l a g e nf i b e r sw e l ed i s p e r s e d ，t h eh i g h e rc o l l a g e ne x t r a c t i o ny i e l dw a so b t a i n e d t h ee x t r a c t i o ny i e l do fc o l l a g e nf r o mt h eh i d ep r e t r e a t e db yt h es e l e c t e dp r e t r e a t m e n tm e t h o dw h i c hb e s m e a r i n ge n z y m eo nt h eg r a i ns i d ea f t e rl i m i n gf i r s t l y , a n dh y d r o g e np e r o x i d et r e a t m e n ts e c o n d l y ,c o u l di n c r e a s et w op e r c e n t a g ep o i n tt h a nt h a to fe x i s t i n ge x t r a c t i o nm e t h o d o p d m a lc o n d i t i o n so fc o l l a g e ne x t r a c t i o nw e r ed e t e r m i n e di nt e r m so fo r t h o g o n a le x p e r i m e n t s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t2 8 8 c o l l a g e ne x t r a c t i o ny i e l dw a so b t a i n e du n d e rt h ec o n d i t i o n so f0 5 e n z y m ef o r7 2h o u r sa t4 c i nc o m p a r i s i o nw i t he x i s t i n gc o l l a g e ne x t r a c t i o nm e t h o d s 。t h ee n z y m ea m o u l l td e c r e a s e d1 - 1 5 ，a n dt h ee x t r a c t i o nt i m es h o r t e n e d2 4h o u r s t h er e s u l t so fa n a l y s e so fo b t a i n e dc o l l a g e nw e r e 髂f o l l o w s ：i tc o n t a i n e d3 3 2 g l y , 1 1 9 p r o ，a n d7 9 h y p ，a n dt h e r ew e l i t t l eh i sa n dc y s ；t h ei s o c l c c t r i cp o i n td e t e r m i n e db yz e t ap o t e n t i a lt i t r a t i o nw a s6 6 2 ；s o d i u md o d e e y l s u l p h a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( s d s p a g e ) d i s p l a y e dt w oub a n d s o n edb a n da n do n eyb a n d ，s h o w i n gt h es a m em o l e c u l a rw e i g h tw i t ht h o s ee x i s t i n gc o l l a g e n ；t h ed e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r ed e t e r m i n e db yd i f f e r e n t i a ls c a n n i n gc a l o r i m e t r y ( d s c ) w a sv四川大学硕士学位论文3 8 5 ：t h ea v e r a g ep a r t i c l es i z eo fc o l l a g e nr 0 a l o n gw i t ht h ei n c r e a s eo ft e m p e r a t u r ei nac e r t a i nr a n g e t h i sd e m o n s t r a t e dt h a ti th a dt h ea b i l i t yt os e l f - a s s e m b l ea n dt h ea b i l i t yw a sa tp e a kw h i l et e m p e r a t u r er o s et o3 2 c t h ea v e r a g es i z ed e c r e a s e dd e e p l ya f t e r3 8 5 a n dh a dn om o r ec h a n g ew h i l et e m p e r a t u r ei n c r e a s et o6 0 t h er e s u l t so fo b s e r v a t i o nb ys c a n n i n ge l e c t r i cm i c r o s c o p e ( s e m ) a n dt r a n s m i s s i o ne l e c t r o nn l i c m s c o p c o e m ) s h o w e dt h a tc o l l a g e na p p e a r e df i b r o u sn e t w o r k sw i t hm e m b r a n o u ss t r u c t u r e s t h ef e a t u r e so fo b t a i n e dc o l l a g e nw e g es i m i l a rt ot h o s eo ft h ec o l l a g e ne x t r a c t e db ye x i s t i n gm e t h o d s t h ef u l l c t i o n so fc o l l a g e nm e m b r a n ew c i ei m p r o v e db yb l e n d i n gc o l l a g e nw i t hp o l 3 n t i n y la l c o h o l ( p v a ) a n dc h i t o s a n ( c h ) r e p e c t i v e l y t h e r m a lp r o p e r t y , s w e l l i n gr a t i o s ，h y d r o s c o p i cp r o p e r t y , t e n s i l es t r e n g t h ，s u r f a c ec o n t a c ta n g l ea n ds u r f a c et o p o g r a p h yo fd i f f e r e n tb l e n dr a t i oc o h a g e n p v aa n dc o l l a g e n c h i t o s a nm e m b r a n e sw e r ea n a l y s e d t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tc o h a g e nw a si m m i s c i b l ew i t hp v a ，t h et o p o g r a p h yo f c o l l a g e nf i b e r sw 哪n o tc h a n g e do b v i o u s l yw h i l el i t t l ep v aw a su s e di nm e m b r a n ea n dp h a s es e p a r a t i o nw a sa p p e a r e d ；w h e r e a sc o l l a g e nw a sm i s c i b l ew i t hc h , a n dt h ec o l l a g e nf i b e r sw e r ed i s p e r s e da n do r d e r e di n t e r w e a v es t r a c m r eo fc o h a g e nf i b e r sw a sc h a n g e d t h es w e l l i n gr a t i o so fa l lc o l l a g e n p v aa n dc o l l a g e n c hm e m b r a n e sw i t hd i f f e r e n tb l e n dr a t i o sr e d u c e d , h y d r o s c o p i cr a t i o sa n dh y d r o p h i l i c i t yi n c r e a s e d ，b u tt h et e n s i l es t r e n g t hr e d u c e d t h ec o m b i n a t i o np r o p e r t yo fc o i l a g e n c hm e m b r a n ew a sb e t t e rt h a nt h a to fc o l l a g e n p v am e m b r a n e a st h eb l e n dr a t i oo fc o h a g e na n dc hw a s3 ：2 ，c o m p a r e dt oc o h a g e nm e m b r a n e ，t h ec o l l a g e n c hm e m b r a n es h o w e dn oo b v i o u sc h a n g ei nd e n a t u r a t i o nt e m p e r a t u r e ( 1 4 0) t h es w e l l i n gr a t i od e c r e a s e df r o m9 5 1 5 t o6 3 8 s u r f a c ec o n t a c ta n g l ed e c r e a s e df t o m7 4 3 5 。t o6 6 3 7 。a n dh y d r o s c o p i cr a t i oa t2 4h o u r si n c r e a s e df r o m6 6 t 01 4 8 w h e r e a st e n s i l es t r e n g t hd e c r e a s e ds l i g h a y k e y w o r d s ：c o l l a g e n , p r e t r e a t m e n to fh i d e ，e x i i a c t i o ny i e l d ,p h y s i c o c h e m l c a l 弭q e r l i 铭b l e n d i n gm 棚1 b m n ev i四川大学硕士学位论文1 刖吾1 1 胶原概述1 1 1 胶原的分布胶原是结缔组织极重要的结构蛋白质，普遍存在于动物的皮、骨头、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，起着支撑器官、保护机体的功能胶原在脊椎动物体内占蛋白质总量2 5 一3 0 ，占腱和骨骼的细胞外蛋白质总量9 0 以上，动物皮中胶原含量达到5 0 以上。1 1 2 胶原的类型及结构尽管动物体大多数组织中都含有胶原，但所含胶原的类型及含量都随动物种类以及组织部位有所变化。目前至少已发现2 0 种不同类型的胶原【l 】，根据胶原的结构形态可将其分为以下几大类：纤维态胶原( i 型，型，型，v 型型) ；与纤维相关的胶原( 型，x i i 型) ；网状结构胶原( i v 型) ；细丝状胶原( 型) ；短链胶原( 型，x 型) ；长链胶原( v i i 型) 脊椎动物组织中含有丰富的纤维态胶原，尤其是i 型胶原和型胶原。i型胶原含有两条相同的n i 链和一条q2 链，记为 a l ( i ) 1 2 a2 。m 型胶原含有三条相同的a 链，记为【al f m ) 1 3 。纤维态胶原的分子为细棒状，长约3 0 0 r i m ，直径1 5 r i m ，相对分子量3 0 0 k d 。胶原分子的每条a 多肽链含有1 0 5 2 个氨基酸残基，相对分子量在1 0 0 k d ，氨基酸序列中有三分之一为甘- x - y 重复单元，其中x 多为脯氨酸。甘氮酸残基数占残基总数的三分之一，而链中色氨酸，蛋氨酸和酪氨酸含量却极少。由于脯氨酸和羟脯氨酸吡咯环的存在，形成了胶原( i t 多肽链特有的左手螺旋构像。每条d 链两端都存在一段非螺旋端肽，三条a 链相互缠绕形成三股螺旋结构的胶原分子后，这些非螺旋端肽仍然存在，它们对于纤维态胶原分子自组装起到了重要作用：在这些非螺旋端肽中存在着赖氨酰和羟赖氨酰，当两条胶原分子链平行排列时，不同分子链上的赖氨酰和羟赖氨酰发生醛胺交联反应；赖氨酰氧化酶催化赖氨酸和羟赖氨酸上的e 氨基，生成醛赖氨酸和羟醛赖氨酸，相邻分子链上的醛赖氨酸和羟醛赖氨酸将发生醛酵缩合反应，形成醛赖氨酸交联【刁以上两种交联反应使胶原分子逐步聚集，形成胶原微纤维，最终在体内形成胶原纤维结构。四川大学硕士学位论文1 1 3 胶原的生物学性能胶原具有独特的生物学性能 3 - 6 。其具有较低的抗原性，研究表明：胶原分子有多个不同的抗原部位，其主要的抗原部位处于分子两端的非螺旋区域，将非螺旋区去除后，胶原的抗原性将显著降低。这一性能使从动物体中提取的去除了非螺旋区的胶原具有很好的生物相容性。胶原具有促进细胞存活和生长的性能，是结缔组织的主要成份，是器官和组织必不可少的构造骨架。研究发现上皮和内皮细胞常出现在胶原表面和胶原基质内胶原作为细胞生长的依附和支架物，能诱导多种细胞的增殖、黏附。胶原可以诱导血小板聚集，最终产生血栓，实现快速止血。1 1 4 胶原的生理作用胶原的生理作用主要表现在其与动物体内多种组织和器官的功能之间有着密切的关系【7 卸。各型胶原在组织中的分布和功能各异，i 型胶原在自然界含量最多，其在组织中主要起着支架作用，广泛的分布于皮肤、血管和包膜中。i型和型胶原是皮肤胶原的主要组成部分。型胶原只分布在软骨和玻璃体中，与x 型胶原共同构成软骨基质，起到促进软骨细胞分化的作用。型胶原主要存在于基底膜中，与v 型胶原共同构成基膜。i 型胶原是骨力学性能的决定因素，在肌腱和韧带与骨的结合处也发挥着重要作用。型胶原赋予软骨组织特殊的力学性能。胶原作为一种自身抗原在类风湿性关节炎的发病机制中起着重要作用。心脏中的纤维态胶原网状结构是心脏维持其正常结构的重要组成部分。胶原在肺中的沉积和降解速度之间的平衡状态，对于维持肺的正常结构和功能具有十分关键的作用，一旦这种平衡状态被打破，将造成肺纤维化。肾脏、肾小球和肾小管的基底膜中含有型胶原，其与不同类型的肾脏疾病、糖尿病、各种类型肾炎之间有着较为密切的关系。肝脏基质中胶原在质和量的方面发生变化将导致肝纤维化或肝硬化。1 2 胶原提取虽然胶原存在于各种动物组织中，但目前胶原的主要来源仍然是各种动物皮n 1 2 1 ，而从牛皮中提取的胶原更是得到广泛应用。虽然从不同动物皮中提取胶原的报道较多，有些动物皮提取工艺也较为成熟，但它们都存在提取率较低2四川大学硕士学位论文的问题。所选取的动物皮本身胶原含量低会降低胶原提取率；对原料皮预处理不当，即使选用胶原含量较高的动物皮，胶原得率也不会提高。我国有丰富的黄牛皮资源，黄牛皮中富含胶原，然而目前成规模的从黄牛皮中提取胶原仍然比较困难，其原因是未经适当预处理的黄牛皮胶原提取率低，只有5 8 ；而采用高活性酶进行提取，酶价格较贵，提取成本太高。所以，研究如何经济、快速、高得率的从黄牛皮中提取胶原将具有重要意义。从黄牛皮中提取胶原，首先要除去皮板上的毛。成熟的黄牛皮脱毛法在制革工业中已广泛应用，主要是采用硫化物碱性条件下将毛溶毁。虽然其脱毛效果优良，并能适度松散皮胶原纤维，但不适合直接用于提取胶原的黄牛皮预处理过程。制革中为保证成革质量，要求脱毛过程应尽量保持粒面完整、同时对整张皮作用均匀。而用于提取胶原的黄牛皮只需有效将毛除尽，在不破坏胶原结构的前提下，尽量分散皮胶原纤维以使胶原提取率尽可能高。目前尚没有此类研究的报道，因此，用于高得率从黄牛皮中提取胶原的毛脱除方法的研究具有重要意义。虽然制革中的脱毛方法不适合直接用于黄牛皮提取胶原的预处理过程，但脱毛原理仍然可被借鉴。目前从动物皮中提取胶原蛋白及其水解物的方法主要有酸法、碱法、酶法、酸酶结合法以及碱酶结合法【l 列。各方法根据控制条件的不同，所得到的胶原蛋白产物可分为胶原、明胶和水解胶原蛋白。虽然胶原、明胶及水解胶原蛋白具有同源性，但它们在结构和性能上却有很大差异：胶原保持了其本身的三股螺旋结构，相对分子量为3 0 万，而明胶己不具有完整的三股螺旋结构，其相对分子量分布从几万到1 0 万，水解胶原蛋白则是多肽的混合物，其相对分子量分布从几千到几万。结构上的不同造成了它们性能上的差异，其中最为显著的差异是胶原能促进细胞粘附和生长，具有显著的生物活性。而明胶和水解胶原蛋白已不具有促进细胞生长的能力，它们不具有生物活性【1 4 1 。目前，碱法处理动物皮主要用于工业上生产明胶。而酸法和酶法多用来进行胶原的提取。采用有机酸浸泡动物组织，可以将末产生交联的胶原分子完整提取出来。因组织中大部分的胶原分子之间或与其他物质之间都有交联键生成，酸法提取胶原提取率较低。酶法提取胶原所使用的酶主要为蛋白酶类，包括胰酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶等。采用酶法提取，只要提取条件合适，可以得到纯度较高、分子量相对集中、三股螺旋结构未被破坏的胶原。3四川大学硕士学位论文1 3 胶原应用从各种动物组织中提取出的胶原，其保持了在动物体内的天然结构，三股螺旋未被破坏。研究证明，胶原有着特殊的生物学性质，如低抗原性、在体内易被吸收、促进细胞粘附与增殖、促进血小板凝结等。胶原易加工成型，各种形态的胶原材料在烧伤、眼角膜疾病、牙周疾病、组织修复、刨面止血、药物载体等生物医学领域有着广泛的应用【1 5 洲。其中以膜的形式应用的胶原材料占有较大比例。如可吸收的胶原膜用于引导牙周组织再生术治疗牙周病，其对成纤维细胞具有较高的诱导性、可抑制上皮移动、生物相容性好并能与组织结合，保持在组织中的位置稳定 2 5 1 。在眼科疾病中用于眼角膜的治疗，将胶原固定在聚乙烯醇材料上制成人造角膜支架，再把上皮细胞植入支架内，用于支撑角膜复层上皮 2 6 2 r l 。用于修复外围神经组织的胶原膜，通过在其中植入活的s c h w a n n细胞，可以修复相对较大的缺口。作为生物支架的胶原膜除了具有优良的生物相容性外，还有适合细胞生长的孔径，使营养细胞大分子易于通过，并且在移植前可先塑型，移植过程能保持适当的机械强度，具有作为细胞生长模板的稳定性 2 s - 3 0 1 。单一或多层膜状胶原药物载体被植入体内，可以通过控制胶原材料的生物降解速度实现药物缓释的目的，针对不同部位植入含有药物的胶原载体，还可以实现药物的定向释放，提高药物的治疗效果口m 扪。1 4 胶原膜性能改善1 4 1 胶原膜性能缺陷胶原易加工成型，可制成各种形式的材料，如膜，海绵，支架，凝胶等，其中关于胶原膜的应用报道较多，其在生物医学等领域的应用较广在生物医学领域应用中，胶原膜除了具有弱抗原性、生物相容性、生物可降解性、组织可吸收性外，还有以下性能：亲水性强、抗张强度高、透水透气性好：活性官能团多，可以进行适度交联改性，可通过控制其交联程度，间接控制胶原膜的生物降解速度蚓；可以与其它生物活性组分一起使用，具有协同效应；与一些药物相互作用等。但胶原膜也存在缺点，主要是胶原膜遇水易膨胀变形、吸水性强。对胶原膜改性以克服其性能缺陷，同时进一步提高膜吸湿性、表面亲水性对于扩大胶原膜应用范围具有重要意义，如改性胶原膜用于果蔬保鲜【3 5 】，较高的吸湿性可抑制水份蒸发，延长果蔬保鲜期；而改性胶原膜表4四川大学硕士学位论文面亲水性增加，可以提高膜对组织的粘附性 3 e - j 。目前用于改善胶原膜性能的方法主要有交联法和共混法。1 4 2 交联法改善胶原膜性能交联法按照其实现的方法又分为化学交联法和物理交联法。化学交联法使用适当的化学交联剂与胶原分子多肽链上的特定基团反应，在胶原分子链内部或者分子链之间引入交联键，以改善胶原膜性能。目前用于交联胶原膜的化学交联剂较多，主要有戊二醛、二亚胺类、n 一羟基琥珀酰亚胺、二苯基磷酸盐、酚类i ”删等。大量的研究结果表明，化学交联法可以明显提高胶原膜的机械性能及稳定性。但这些化学交联剂的引入常产生细胞毒性、抑制细胞生长、降低细胞的黏附能力，在一定程度上限制了胶原膜应用。用于交联胶原膜的物理方法主要有紫外线照射和热脱氢法。它们都可以提高胶原膜的稳定性，并且不会引入外源性有毒物质，但交联的程度较低，而且会部分破坏胶原结构【4 1 】。1 4 3 共混法改善胶原膜性能将胶原和其它物理、化学性质不同的合成或天然高分子物质共混成膜，可以改善胶原膜材料的性能，制备出胶原膜材料所不具有的许多特性的材料，扩大胶原材料的应用范围，同时不会引入外源性有毒物质，影响胶原膜应用。用于与胶原共混的合成高分子物质分为两类，一类是不可生物降解的合成高分子物质，如聚氨酯、聚酰胺和丁烯酸酯等，另一类是可生物降解的合成高分子物质，如聚乙烯醇、聚乳酸、聚乙醇酸等。不可生物降解的合成高分子在体内不能生物降解，限制了这类高分子与胶原共混材料的应用。可生物降解的高分子与胶原共混材料越来越为人们所重视，报道较多的是聚乙烯醇与胶原的共混材料。聚乙烯醇为多羟基聚合物，其与胶原之间可以产生氢键交联，这是二者共混改善胶原材料的基础。目前，聚乙烯醇与胶原共混材料多以海绵的形式应用于组织工程支架材料和药物缓释系统( 4 2 - 4 3 】。通常报道的以膜形式应用的聚乙烯醇与胶原共混材料中的胶原多是相对分子量较小的胶原降解物一明胶，此种共混材料多用在可降解塑料、包装材料等领域 4 4 - 4 6 j 而采用聚乙烯醇与具有生物活性的胶原共混改性的报道不多。5四川大学硕士学位论文用于与胶原共混制备生物医学材料的天然高分子主要有壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素等。这些属于多糖类的天然高分子具有生物活性、生物可降解性，并且来源较为广泛。它们与胶原共混材料多用于可吸收外科手术缝线、药物载体、止血材料、组织修复再生引导支架等。近年来，在这些天然多糖与纯胶原共混材料中，研究较多的是胶原与壳聚糖共混。壳聚糖是甲壳素的脱乙酰产物，甲壳素在自然界中含量极其丰富。壳聚糖具有多种生理活性功能，且无毒副作用：可以降低胆固醇、抑制脂肪吸收、抑制血压升高、提高机体免疫力、改进小肠代谢功能等 4 r 1 其广泛应用于食品和医药等领域。壳聚糖与胶原在分子水平上具有较好的共混性，二者之间会产生静电吸引作用和较强的氢键交联作用 4 8 - 5 0 l 。壳聚糖与胶原共混材料主要制成海绵状应用于生物医学领域，如止血材料、组织工程复合支架材料等【5 l 鄙】。制成膜状的胶原，壳聚糖共混材料报道相对较少，在人工肝脏、药物缓释等领域有所应用【5 4 铡。1 5 本论文的主要研究工作本论文的研究内容主要由三个部分构成：( 1 ) 原料皮预处理以黄牛鲜皮为原料，考察不同一次预处理方法对毛脱除及皮胶原纤维分散的影响。在选定一次预处理法基础上，对原料皮进行二次预处理以加强纤维问质去除，进一步分散皮胶原纤维。对比一次预处理和二次预处理法对胶原提取率的影响。选定一种可以从新鲜黄牛皮中高得率提取胶原的预处理方法。( 2 ) 胶原提取条件的优化及胶原性能表征在选定黄牛鲜皮预处理法的基础上，确定最佳的胶原提取条件通过氨基酸分析，等电点分析，电泳分析，热性能分析以及电子显微镜观测等手段表征所提取胶原的性能。( 3 ) 共混法改善胶原膜的性能将所提取的胶原与聚乙烯醇、壳聚糖分别共混成膜，通过对各共混膜微观结构、机械性能、膨胀性能、热稳定性、吸湿性、表面亲水性能进行测定分析，确定最佳的共混成膜条件，以有效改善胶原膜性能。6四川大学硕士学位论文2 原料皮预处理黄牛皮分为毛被和皮板两个部分。在显微镜下观察皮层的纵切面，其分为三层：上层( 最薄) 为表皮层；中层( 最厚) 为真皮层；下层为皮下组织层。表皮层主要含有角蛋白和类粘蛋白。真皮层主要由胶原纤维、弹性纤维等成份构成。此外，真皮中还含有血管、汗腺、脂腺、毛囊、肌肉、脂肪细胞等非纤维成份。皮下组织层含有大量的脂肪组织。从组成上看，新鲜黄牛皮中总蛋白占干重的3 0 3 5 ，而胶原又占总蛋白的8 0 8 5 在进行胶原提取前，首先要除去原料皮上的非胶原成份：毛、表皮、皮下组织以及真皮层中的非胶原成份。除去非胶原成份的同时，应尽量使原料皮中编织紧密的胶原纤维均匀分散，又要减少对胶原结构的破坏。适当的预处理方法将为高得率提取胶原打下基础。2 1 试验部分2 1 1 主要材料、试剂及仪器主要材料、试剂：新鲜黄牛皮市场购得1 3 9 8 中性蛋白酶a r无锡酶制剂厂j f c工业品市场购得n a 2 s 粉末工业品市场购得3 0 双氧水a r成都科龙化工试剂厂羟脯氨酸( h y p )b r成都长征化学试剂厂氯胺ta r成都科龙化工试剂厂对二甲氨基苯甲醛a r成都科龙化工试剂厂高氯酸a r成都科龙化工试剂厂主要仪器：不锈钢转鼓冷冻切片机r j n g f r i g o c u t 2 8 0 0 n光学显微镜o l y m p u s b i - i - 2凯氏定氮仪b u c h i k - 4 3 77德国日本瑞士四川大学硕士学位论文精密p h 计p h s - - 3 ch g 收缩温度记录仪分光光度计u v 7 5 1 - - c d电子天平y p n 型鼓风干燥箱d h g - - 9 0 7 0 a上海精密科学仪器有限公司成都桦明实业有限公司上海分析仪器厂上海精密科学仪器有限公司上海一恒科技有限公司2 1 2 试验步骤2 1 2 1 一次预处理沿黄牛皮背脊线一侧相近部位取1 0x1 0 c m 的皮块用于预处理试验。( 1 ) 肉面包酶预处理：酶糊的配制：室温下将1 3 9 8 中性蛋白酶用水溶解，使酶活力为2 0 0 u m l ，米糠调成糊状，n a o h 溶液调p h 为8 ，待用。皮样常温下转鼓中浸水脱脂后，充分水洗，取出控水。将己配好的酶糊均匀涂于皮的肉面，室温( 2 7 ) 放置，每隔1 6 h 检查毛松动情况，4 8 h 后，利用刮刀手工除毛。显微镜观察皮胶原纤维分散情况，并测定皮收缩温度。( 2 ) 浸碱粒面包酶预处理酶糊的配制：同肉面包酶预处理法中酶糊配制皮样常温下转鼓中进行浸水脱脂处理，于p h = 1 2 、水1 0 0 、o 5 n a 2 s 液中浸碱处理6 0 分钟，盐酸调p h = 8 。充分水洗后，控水。将酶糊均匀涂于粒面，室温( 2 7 ) 放置，每隔1 2 h 检查毛松动情况，3 6 h 后利用刮刀手工除毛。显微镜观察皮胶原纤维分散情况，并测定皮收缩温度。( 3 ) 过氧化氢预处理皮样常温下转鼓中进行浸水脱脂处理。转鼓中，采用8 0 9 l 过氧化氢于p h = 1 3 、水1 0 0 条件下处理皮，每隔2 h 检查毛脱除情况，6 h 后取出显微镜观察皮胶原纤维分散情况，并测定皮收缩温度。2 1 2 2 二次预处理对经浸碱粒面包酶一次蓣处理的黄牛皮，采用过氧化氢进行二次处理。分8四川大学硕士学位论文别考察过氧化氢浓度、作用p h 值、作用时间对皮预处理效果的影响。( 1 ) 过氧化氢浓度对皮预处理效果的影响经浸碱粒面包酶一次预处理的皮块，常温下，p h = 1 0 ，水2 0 0 ，过氧化氢浓度分别为0 9 l 、2 0 9 l 、4 0 9 a 、6 0 9 1 、8 0 9 a 、1 0 0 e d l 处理7 5 h 。测定各皮样收缩温度，废液总氮含量，显微镜观察皮胶原纤维分散情况。( 2 ) 过氧化氢作用时间对皮预处理效果的影响经浸碱粒面包酶一次预处理的皮块，常温下，p h = 1 0 ，水2 0 0 ，6 0 9 n 过氧化氢作用。分别测定作用1 5 h 、3 h 、4 5 h 、6 h 、7 5 h 时皮样收缩温度，废液总氮含量，显微镜观察皮胶原纤维分散情况。( 3 ) 过氧化氢作用时p h4 j l * f 皮预处理效果的影响经浸碱粒面包酶一次预处理的皮块，常温下，水2 0 0 ，6 0 9 a 过氧化氢分别在p h 值为6 、