（植物病理学专业论文）油菜菌核病菌不同菌株生物学特性比较及抗病性鉴定方法研究.pdf

摘要 采集四川雅安、乐山、绵阳、绵竹、宜宾和成都6 个区域的油菜菌核病菌核，经纯化、 鉴定为核盘菌( s c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u m ) ，并培养在p d a 培养基上保存备用。 对不同菌株的生物学特性比较表明，在不同温度处理下，菌丝生长速度最快的是绵竹， 最慢的是乐山；菌丝形成菌核最快的是绵阳，最慢的是宜宾。菌丝生长速度快的菌株，形 成菌核也快；而形成菌核快的，其生长速度不一定快。在不同p h 处理下，雅安分离的核 盘菌耐酸性较强，绵阳的耐碱性较强，而绵竹的耐酸、碱性能力都比较强。菌核与菌丝的 活性是不一致的，菌核活性最强的是雅安，而菌丝活性最强的是绵竹。来源于6 个区域的 核盘菌的致病力无明显分化。6 个菌株菌丝生长的最适温度为2 5 ，最适温度范围为2 0 - - 2 5 ；菌丝形成菌核的最适温度是2 5 ，最适温度范围是2 0 一3 0 ；菌丝生长最适 p h 范围为p h 4 - - p h 7 , 最适培养基是麦麸培养基，其次是p d a 培养基。 在室内药效试验中，甲基托布津对核盘菌菌丝生长的抑制效果最佳，e c 5 0 为4 6 ，其 次是福美双。多菌灵、百菌清和大生m 一4 5 的抑制效果均不理想。 采用已报道的7 种油菜菌核病抗性鉴定方法，在同条件下对两个感病和两个抗病品 种进行鉴定，比较这些鉴定方法。结果表明：草酸浸根( 叶) 法用于白菜型油菜鉴定效果 不好；不同生育期的油菜对菌核病抗性有差异，抗性鉴定应该以花期鉴定为主，苗期鉴定 为辅；在花期以麦粒叶腋接种、琼脂块叶腋接种和牙签茎干接种这3 种方式做抗性鉴定， 结果表明接种后发病程度依次为牙签 麦粒 琼脂块：3 种花期接种方法与大田接种鉴定的 结果呈显著正相关( r 0 8 0 0 0 ) ，这3 种方法均能有效反映抗、感品种的差异，其中花期牙 签茎干接种法与大田接种鉴定法相关性达极显著水平( r = o 9 1 4 0 ) 。根据抗性鉴定方法比 较的结果，选用花期牙签茎于接种法，以中油8 2 1 为对照，对四川农业大学油菜研究中心 g 1 自交系的4 4 份油菜育种材料进行鉴定、筛选，得到1 2 份高抗材料，其中有5 份材料的 抗性极显著高于对照，抗病率r r o 5 5 。 油菜苗期酶活性测定试验表明，油菜植株未接种核盘菌，p o d 酶与s o d 酶( 1 8 小时 内测定值) 与品种抗性呈正相关；油菜植株接种核盘菌后，s o d 酶与p a l 酶活性与品种 抗性呈正相关，且抗病品种的s o d 酶和p a l 酶活性上升得更快、更高。油菜防御酶活性 在核盘菌接种前、后的变化是有区别的，抗( 耐) 菌核病品种未接种时的健株防御酶活性较 高，是油菜抗菌核病的生理生化机制之一。 关键词：油菜；菌核病；核盘菌；生物学特性；抗性鉴定：酶活性 a b s t r a c t s c l e r o t i aw a sc o l l e c t e df r o mt h ei n f e c t e ds t e mo f b r a s s i c an a p o b r a s s i c ai ns u b u r b so fy a a n ，l e s h a n ，m i a n y a n g ，m i a n z h u ，y i b i na n dc h e n g d uo f s i c h u a np r o v i n c e t h e yw e r es c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u mb yp u r i f i c a t i o na n di d e n t i f i c a t i o n ，a n db e e nr e s e r v e db yc u l t i v a t i o no np d a m e d i u m c o m p a r i s o no fb i o n o m i c sa m o n gt h es t r a i n so f s s c l e r o t o r i u mf r o md i f f e r e n td i s t r i c t sw a s m a d e t h er e m i t si n d i c a t e dt h a tt h eh y p h ao ft h es t r a i nm i a n z h ug r e wt h ef a s t e s ta n dt h o s eo f l e s h a nw e r em u c hs l o w e ra tt h ed i f f e r e n tt e m p e r a t u r e t h es 仃a i l lm i a n y a n gp r o d u c e ds c l e r o t i a q u i c k l ya n ds t r a i ny i b i nw e r et h em o s ts l o w t h ef a s t e rg r o w t ho fh y p h aw a sa n dt h em o r e q u i c k l ys c l e r o t i af o r m e d ，h o w e v e r ，t h ec o n v e r s ew a sn o ts os u r e i nd i f f e r e n tp ht r e a t m e n t s ， s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u mf o ry a a nw a sa c i dt o l e r a n c e ，f o rm i a n y a n gw a sa l k a l it o l e r a n c e ，a n df o r m i a n z h uw a ss 仃o n g l yt o l e r a n tt ot h ea c i da n da l k a l i t h ep a t h o g e n i c i t yo fs c l e r o t i n i a s c l e r o t i o r u mc o l l e c t e df r o ms i xd i s t r i c t sh a dn o to b v i o u sd i f f e r e n t i a t i o n t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r e so fh y p h ag r o w t ha n ds c l e r o t i af o r m e dw e r e2 5 c ，a n do p t i m u mt e m p e r a t u r er a n g e o fh y p h ag r o w t hw a s2 0 c 2 5 c ，f o r m i n gs c l e r o t i u mw a s2 0 c - 3 0 c t h eo p t i m u mp hr a n g eo f h y p h ag r o w t hw a sp h 4 一p h 7 ，t h em o r es u i t a b l em e d i u mf o rt h eh y p h a lg r o w t hw a sw h e a tb r a n m e d i u m ，n e x tw a sp d a t h ef u n g i c i d et e s ti nt h el a bi n d i c a t e dt h a tt o p s i n mw a sm o s te f f i c i a n t et oi n h i b i th y p h a g r o w t h ，t h ee c s ow a s4 6 ，t h en e x tw a sf e m a s a n t h ee f f e c to fc a r b e n d a z o l ，c h l o r o r t h a l o n i lo r d a s h e n gm 一4 5w a sn o ts og o o d t h es e v e nm e t h o d sr e p o s e df o ri d e n t i f i c a t i o no fr e s i s t a n c et os c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u mw e r e c o m p a r e dw i t ht w os u s c e p t i b l ea n dt w or e s i s t a n tr a p e s e e dv a r i e t i e su n d e rt h es a m ec o n d i t i o n s t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h em e t h o do fd i p p i n gr o o t ( o rl e a f ) i n t oo x a l i ca c i ds o l u t i o nw a sn o t s u i t a b l ef o rr e s i s t a n c ei d e n t i f i c a t i o no fb r a s s i c ar a p al i ts u g g e s t e dt h a tt h er e s i s t a n c e i d e n t i f i c a t i o nb ed o n ed u r i n gf l o w e r i n gp e r i o da n ds e e d l i n gi d e n t i f i c a t i o nw a su s e do n l ya s s u p p l e m e n tm e t h o db e c a u s et h er e s i s t a n c et o s c l e r o t i o r u mw a sd i f f e r e n ta tt h ed i f f e r e n tg r o w t h s t a g e s i nt h r e ei n o c u l a t i o nm e t h o d so fi n o c u l a t i n gi n f e c t e dw h e a tg r a i nt o l e a fa x i l ，m y c e l i u m a g a rd i s kt ol e a fa x i la n di n f e c t e dt o o t h p i c kt os t e m ，t h ed i s e a s es e v e r i t yi nt h ev a r i e t i e st e s t e d w e r et o o t h p i c k s w h e a tg r a i n s a g a rd i s k s t h er e s u l t so ft h et h r e em e t h o d sw e r es i g n i f i c a n t l y i i c o r r e l a t e dw i t hf i e l di n o c u l a t i o ni d e n t i f i c a t i o n ( r o 8 0 0 ) t h et h r e em e t h o d sd u r i n gf l o w e r i n g p e r i o dc o u l dw e l lr e a c tv a r i e t i e s r e s i s t a n c ea n ds u s c e p t i b i l i t y e s p e c i a l l y , t h ec o r r e l a t i o nb e t w e e n t o o t h p i c ki n o c u l a t i o na n df i e l di n o c u l a t i o nw a sh i g h l ys i g n i f i c a n t ( r = 0 914 0 ) a c c o r d i n gt ot h e r e s u l t sa b o v e ，4 4b r e e d i n gm a t e r i a l sw h i c hw e r ep r o v i d e db yt h er a p e s e e dr e s e a r c hc e n t e ro f s i c h u a na g r i c u l t u r eu n i v e r s i t y , w e r et e s t e dw i t ht h et o o t h p i c km e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h e r ew e r e12h i g hr e s i s t a n tm a t e r i a l s ，o fw h i c ht h er e s i s t a n c eo f5m a t e r i a l sw a sm u c hh i g h e r t h a nc o n t r o lv a r i e t y , t h er e s i s t a n tr a t e sw e r ea l la b o v eo 5 5 t h ed e t e r m i n a t i o no fe n z y m a t i ca c t i v i t ys h o w e dt h a tp o da n ds o d ( i n18h o u r s ) w e r e p o s i t i v ec o r r e l a t i o nw i t hv a r i e t yr e s i s t a n c ei nn o ti n n o c u l a t i o nr a p e s ，h o w e v e r , w h i l er a p e sw e r e i n n o c u l a t i o n ，s o da n dp a lo ft h ev a r i e t i e sw e r er e l a t e dp o s i t i v e l yt ot h er e s i s t a n c e ，a n dt h e e n z y m a t i ca c t i v i t yo fr e s i s t a n tv a r i e t yr i s e dm u c hf a s t e ra n dh i g h e r t h ea c t i v i t yo fd e f e n s i v e e n z y m e sw a sq u i t e d i f f e r e n tb e t w e e ni n n o c u l a t i o na n dn o ti n o c u l a t i o nr a p e s t h er e s u l t s s u g g e s t e d i tw a so n eo ft h ep h y s i o l o g ya n db i o c h e m i s t r ym e c h a n i s m so fr a p e s e e dv a r i e t y r e s i s t a n c et o s c l e r o t i o r u m k e yw o r d s ：r a p e ( b r a s s i c ac a m p e s t r i sl ) ；s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ；r e s i s t a n c ei d e n t i f i c a t i o n ； e n z y m a t i ca c t i v i t y i i i 论文独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行研究工作所取 得的成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，学位论文中不包 含其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得四川农业大学 或其它教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所 做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 口8 年月z 名日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解四川农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意四川农业大学可以用不同方式在不同媒体 上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 研究生签名： 铷驰 d 书年 0 8 年 月 莎月 多舀 歹岛 1 月i j 吾 1 1 油菜菌核病概述 菌核病( s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m ) 是一种世界性分布的顽固性植物病害 1 ，2 1 。 1 8 3 7 年l i b e r t 首次报道了菌核病f 3 j 。该病菌寄主范围广，分布广泛。据统计，可 以使分布于温带和亚热带的7 5 科2 7 8 属4 0 8 种及4 2 个变种或亚种的植物致病 4 】， 其中以草本植物居多。菌核病在我国各地均有发生，我国报道的核盘菌自然寄主 有3 6 科2 1 4 种植物，油菜是其主要危害的作物之一。菌核病病原菌为核盘菌 s c l e r o t i n i as c l e r o t i o r u m 仁i b ) d eb a r y ，在分类地位上属子囊菌亚门、盘菌纲、柔 膜菌目、核盘菌科、核盘菌属【5 1 。 油菜是重要的油料作物，主要分布在亚洲、北美洲和欧洲，其生长期间经常 受到病虫的危害，其中8 0 是由病原真菌引起的【6 】。虽然1 8 3 7 年l i b e r t 首次报 道了菌核病菌【3 】，但最早记载该菌侵染油菜是1 9 1 5 年s h a wfjw 在印度吲，我 国朱凤美1 9 3 2 年也发表了该病的首篇报道文章【引。油菜菌核病( 俗称白秆、空 杆、烂杆、霉蔸等) 在我国居油菜三大病害之首，为害油菜的损失约占总病害损 失的8 0 左右【9 】。该病一般年份均有发生，雨水多的年份更为严重，给我国油菜 生产造成巨大损失，一般年份发病率为1 0 3 0 ，严重年份达5 0 【1 0 1 甚至8 0 以上【l l 】。油菜感病后可减产1 0 0 旷7 0 左右，含油量降低l 5 【1 2 】。在长江流域 油菜主产区，该病每年发病面积4 7 0 x 1 0 4 h m 2 ，直接经济损失数亿元【1 3 】。 1 2 油菜菌核病研究现状 1 2 1 核盘茵生物学特性研究 子囊孢子，菌丝体，菌核是核盘菌生育周期的三个主要形态特征。菌丝生长 发育和菌核形成需要的最适温度为2 0 ，最适相对湿度在8 5 以上。予囊孢子 萌发的最适温度为5 i o * c 。菌核在土壤中能存活1 年以上，在3 4 月间油菜盛花 期以菌丝形式萌发，直接感染油菜，也可以形成子囊盘。子囊孢子成熟后从子囊 盘中弹出，借气流传播，飘落到凋零的花瓣上或者叶腋处。孢子在合适的条件下 以芽管形式萌发，侵入植物体，使植物受侵部位的细胞和组织坏死，形成水渍状 病斑并腐烂，接触到腐烂部位的其它植株也会被感染，最后在病斑形成部位( 如 茎杆中) 形成黑色菌核以越冬或越夏。目前国内外学者对油菜菌核病菌的生物学 特性研究较多，但是对不同菌株之间的生物学特性比较还较少。 1 2 2 核盘菌致病机理研究 核盘菌侵染植物时会分泌一种草酸毒素，该代谢物与病菌的侵染方式和致病 性有关1 4 】，是菌核病致病的一个重要因子【15 1 。吴纯仁等发现病菌分泌草酸毒素 对寄主细胞有直接毒害作用，并且发现油菜感染菌核病后，体内草酸的含量会明 显升高1 6 】。草酸可从多个方面导致病症的发生和扩展【1 7 1 。草酸降低了寄主的p h 值，有利于降解酶类( 纤维素酶、半纤维素酶、多聚半乳糖醛酸酶、磷酸酶等) 活 性的积加，从而破坏组织，加快菌丝的入侵【l 引。b a t e r m a n 研究发现草酸离子能 够鳌合细胞壁中的c a 2 + ，破坏细胞壁的结构，阻断细胞中的一些依赖于c a 2 + 的 信号传导和防卫反应【1 9 】。 油菜对草酸的抗性同对核盘菌的抗性是高度一致的，因此运用草酸可以鉴定 材料对菌核病的抗性并且可通过草酸鉴定方法选育累积抗毒素基因，进而可以培 育抗病品种例。刘良宏等通过两轮草酸筛选，得到4 9 棵抗草酸小苗，从中又筛 选出9 棵抗核盘菌的小苗【2 1 1 。 目前有很多文献报道过核盘菌的侵染过程 2 2 1 ，但对侵染植物的组织病理学报 道很少。吴纯仁等发现，油菜菌核病菌能从寄主表皮直接侵入，还可以由气孔沿 着保卫细胞内侧间接侵入表皮细胞，可能此处的细胞壁薄或存在较大的细胞间隙 2 3 1 。病菌侵入前能形成菌丝顶端膨大的单胞附着胞和多细胞组成的复合侵染垫两 种侵染结构。蓝海燕等在2 0 0 0 年发现，子囊孢子借助寄主表面的水分萌发长出 芽管，在芽管生长过程中与寄主表面接触处附近形成大量液泡，进而芽管端形成 “钩状并肿大，从而引发附着胞形成；真菌在附着胞形成后的入侵是靠产生巨 大膨压实现的，并产生一种微小的侵入栓，借此巨大压力机械地穿透角质层及表 皮细胞壁；真菌一旦突破角质层及表皮细胞后，很快以分枝生长，遍布表皮及叶 肉细胞。对于其它类型的真菌，还能通过植物体表的一些自然开口如气孔，创伤 等途径侵入寄主体内。 研究发现，核盘菌在孢子萌发和菌丝侵入过程中，可分泌多种降解植物细胞 壁的酶类，如纤维素酶、半纤维素酶、果胶降解酶类、酣酶和蛋白酶等，这些降 解酶类促使寄主组织的迅速瓦解，在杀死寄主过程中发挥了重要作用【2 4 】。吴纯仁 等在1 9 8 9 年研究发现菌核病菌在不同品种油菜植株体内扩展速度不同，可能是 2 受病菌和寄主多方面因子所决定的。病原菌侵染植物使植物感病的机制还包括机 械侵入。 1 2 3 油菜菌核病抗病性鉴定方法研究进展 吴纯仁等在1 9 9 1 年的研究表明：自然气候条件下接种鉴定，不同年份间发 病程度不同，只有在病原菌、气候、寄主三者适宜发病，且发病充分的条件下， 鉴定结果才能真正地代表植株本身的抗、感水平。而大田人工辅助控制接种，如 在油菜盛花期将带菌麦粒均匀洒播于油菜植株各部位，塑料棚覆盖，洒水保湿， 不同品种感病程度存在显著差异，两年的鉴定结果极显著相关，并与田间自然气 候条件下发病充分年份( 1 9 8 9 ) 的鉴定结果极显著相关。花期离体或活体叶片菌丝 体接种和限期接种法能显著区分不同品种( 系) 的抗感水平。苗期菌丝体悬浮液接 种和试管苗接种法适于早期育种世代进行大规模筛选，且都与自然条件下发病充 分年份的田间鉴定结果显著相关。 蒋立希等在1 9 9 5 年比较了四种菌核病接种方法，即带菌丝麦粒刺伤口和无 伤口接种方法与琼脂菌丝块捆绑刺伤口和不刺伤口法，发现伤口接种和无伤口接 种致病能力无显著差异，带菌丝麦粒法接种比琼脂菌丝块法接种平均致病力强， 且品种间差异显著 2 5 1 。 孙超才在1 9 9 5 年在田间采用捣碎菌丝体( 抽苔期) 接种、黑麦粒始花期( e a r l y f l o w e r i n g ) 接种和实验室草酸浸根，田间鉴定与实验室鉴定之间存在显著相关性， 草酸浸根法和黑麦粒接种法虽然是在油菜不同生育阶段鉴定油菜的抗( 耐) 病性， 但其筛效果是一致的，相关性达极显著水平。 刘澄清等在1 9 9 1 年进行了苗期、花期人工接种鉴定和几种鉴定方法的相关 性分析，发现同一品种及其组配的杂种，其苗期、花期耐病性强弱表现是连续的 和一致的，相关性显著2 6 1 。草酸对油菜叶片、愈伤组织、游离细胞和原生质体具 有直接的毒害作用，不同感病程度的油菜品种( 系) 对草酸的敏感性不同，这种组 织和细胞水平上毒素敏感性表达可用于抗( 耐) 病性筛选。 刘胜毅等在1 9 9 7 、1 9 9 8 年研究了油菜抗感菌核病品种对草酸的吸收转运差 异及其抗性机理，并用草酸浸根、浸叶筛选抗菌核病材料，效果明显。将草酸加 入培养基处理愈伤组织，获得耐毒素愈伤组织，进一步分化出抗病小植株。刘胜 毅在1 9 9 9 年采用温室病圃、草酸浸根、离体叶草酸浸柄、离体叶菌丝体接种和 3 大田自然侵染鉴定油菜对菌核病的抗性，发现抗病性变异主要由加性和显性基因 控制，除离体叶菌丝接种方法仅检测到显性方差外，其它几种鉴定方法所检测的 病情指数加性方差和显性方差均极显著，其中温室病圃鉴定的加性方差，遗传力 较低，并主张苗期鉴定与花期鉴定相结合。苗期草酸浸根和花期温室自然侵染( 土 壤埋菌核，花期保湿) 鉴定可能为最佳的组合模式，这两种方法本身具有很高的 重复性。 1 2 4 核盘菌的多样性研究 不同寄主或地域来源的核盘菌菌株在生物学特性上存在一定的差异，在进 化、遗传等方面存在多样性，但在致病力或寄主上还没有发现规律性分化【2 7 1 。 m i l l e r 等在19 8 9 年用s - m o p ( 氧化补骨脂素) 和紫外线诱变获得不产菌核突变株 s l 1 ，仍能浸染8 个寄主【2 引。k o h n 等在1 9 9 1 年将分离的6 3 个菌株划分为3 2 个m c g s ( m y c e l i a l i nc o m p a t i b i l i t yg r o u p s ) ，但未见有关致病力的进一步报赳2 9 1 。 刘勇等在1 9 9 5 年对分离自油菜叶病斑的单孢菌系转代培养，发现致病力发生变 化；来自4 个不同地区的油菜菌核病菌构建1 5 个单孢菌系，在油菜品种上的致 病力明显不同；同一来源的1 0 个子囊孢子间也存在明显的致病力差异，菌株间 的致病力差异能长期稳定地存在 3 0 1 。李国庆等在1 9 9 6 年对来源于1 8 种寄主植物 上的7 4 个菌株的致病力作了测定，发现7 4 个菌株在致病性能上没有质的区别， 即拥有共同的寄主，但在致病力上有较细微的强弱分化，他认为致病力的分化与 菌株的生长速度有关【3 l 】。 w o n ga n dw i l l e t s 在1 9 7 5 年发现核盘菌种内菌株间的可溶性蛋白质和多种酶 的同工酶基本一致【3 2 】。e r a m p a i l i a n dk o h n 在1 9 9 5 年比较了核盘菌不同菌株中的 果胶降解酶酶谱，发现有多样性，酯酶同工酶的多样性也有较多报道【3 引。李国庆 等在1 9 9 7 年将不同来源的5 0 个菌株按萌发习性分为5 类，认为核盘菌菌核萌发 习性存在明显的多样性，并具有遗传稳定性【3 4 1 。王崇仁在1 9 8 8 年发现我国南、 北方核盘菌菌株的可溶性蛋白带型有显著差异。李国庆在1 9 9 7 年分析了我国南 北方菌株，认为核盘菌的菌核中可溶性蛋白比较稳定，而酯酶同工酶、过氧化物 酶同工酶、过氧化氢酶同工酶和淀粉酶同工酶在谱型或活性上有一定的分化【3 5 1 。 k o h n 等在1 9 9 0 年、1 9 9 1 年从两块不同的油菜田分离得到的6 3 个菌株划分 为3 2 个菌丝亲和群( m y c e l i a l i nc o m p a t i b i l i t yg r o u p s ，m c g s ) ，最大的两个群分别 4 包括1 9 和9 个菌株【2 9 1 。用3 个分子标记对6 3 个菌株的分析表明，每一个m c g s 在遗传上是一致的，其中一个来自s s c l e r o t i o r u m 核d n a 的随机片段( 约4 5 k b ) ， s o u t h e r n 杂交显示每一个m c g 都有独特的指纹图谱。这些说明大田中的核盘菌 在遗传上是异质的，且不同的基因型其保守性随无性繁殖或同宗配合的有性繁殖 而增强。k o h n 等在1 9 9 8 年以核糖体d n a ( r d n a ) 军i ：i 线粒体d n a ( m t d n a ) 为探针 分析核盘菌2 1 个菌株总d n a 的限制性片段长度多态眭( r f l p ) ，发现核盘菌菌 株间的r d n a 差异非常小，但在m t d n a 上，5 8 个菌株出现6 种类型。这表明核 盘菌的d n a 有些区域是比较稳定的，而另一些区域存在较大的变化。李国庆在 1 9 9 9 年分析了核盘菌不同菌株的r a p d 图谱，发现它们之间存在一定的差异 3 6 1 ， s t e u d m u n 等在1 9 9 8 年也报道了类似的结果【3 7 】。核盘菌的核型存在较大的差异， k o h n 在1 9 9 9 年发现在5 9 种核盘菌菌株中存在2 4 种核型。 1 3 油菜菌核病的防治现状 核盘菌产生的菌核抗逆性极强，且田间的菌核可以在相当长的时间内( 5 0 d ) 萌发并形成有效的接种体 3 8 1 ；油菜花期植株高大繁茂，药剂很难达到植株下部； 菌核病在不同地区、不同年份间发病差异大，甚至在同一地区的不同田块病情也 不相同，迄今为止，尚无准确、简便的预测预报方法。上述原因给油菜菌核病的 防治带来了极大困难。 1 - 3 1 化学防治油菜菌核病 化学防治是当前防治菌核病的主要措施，但目前生产上使用的化学农药防治 此病的效果不太理想【3 9 】。对该病的防治过去主要是使用苯并咪唑杀菌剂或不同作 用机制的杀菌剂与之复配的药剂，1 9 9 6 年石志琦和潘以楼等检测到江苏省存在 油菜菌核病菌田间抗药性菌株【4 0 “1 1 。目前生产上防治该病用得最多的杀菌剂是 多菌灵 4 2 1 ，但自2 0 世纪8 0 年代以来，国内外相继报道了核盘菌的多茵灵抗药性 问题，个别地区甚至出现化学防治失败的现象【4 3 1 。 苯并咪唑类杀菌剂与病原真菌微管蛋白结合，抑制微管功能。对许多病原真 菌的抗性检测发现b 微管蛋白基因的点突变引起苯并咪唑结合位点氨基酸的改 变，导致抗药性的产生。近年来研究发现植物病原真菌微管蛋白基因单核苷酸突 变，是病原真菌产生抗苯并咪唑类杀菌剂的主要机制，田间抗药性菌株的突变位 点一般位于1 9 8 或2 0 0 位氨基酸。这些突变同样表现对乙霉威和n 苯氨基甲酸 酯类杀菌剂的敏感性阻】。 1 3 2 生物防治油菜菌核病 随着近年来环境污染和农药残留加重，病原菌抗( 耐) 药性增强等问题愈来 愈引起人们的关注，公众对无公害食品的需求量日益上升，化学农药已不宜长期 和大量使用。采取摘除“三叶”( 老叶、病叶、黄叶) 4 5 】、轮作、无花瓣育种等 农业措施虽然在一定程度上降低此病的发作强度，但也不能达到彻底控制的目 的，于是人们逐渐把目光投向了生物防治。目前已报道至少4 5 种真菌和两种细 菌( 假单胞杆菌、芽胞杆菌) 对核盘菌有拮抗作用4 6 4 7 4 引，其中粘帚霉( g l i o c l a d i u m s p p ) 4 9 5 0 1 、木霉( 乃f 如d d 毋朋口点印) 【5 1 】、盾壳霉( c m i n i t a n s ) 、镰孢菌( f u s a r i u m s p p ) 5 2 】、曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 酬对核盘菌具有较强的生物防治潜能。根据 报道，上述菌株的生防能力大多体现在控制条件下的室内试验，且还处于不断的 研究中，与生产上的大规模应用还有很大的差距；从生防菌株到生防制剂的过程 中，生产、运输、保存环节的技术手段还不够成熟；生防制剂应用到大田生产中， 受环境影响大，防治效果不够稳定：生防制剂施入土壤后，在定殖扩展之前有一 个萌发的过程，延缓了对病原物的作用时间。综上所述，大田生产中采用生物防 治油菜菌核病不太理想。 1 3 3 抗病育种防治油菜菌核病 1 3 3 1 油菜抗菌核病遗传研究 尽管对油菜菌核病免疫的油菜品种还没有发现，但是油菜品种或种质的抗性 变异是广泛存在的。抗感品种杂交研究、过氧化物酶及抗病斑扩展速率的研究【5 4 】 表明抗性可以遗传，由多基因控制，广义遗传力在4 0 - - 7 0 。d i c k s o nm h 在 甘蓝和花椰菜抗性遗传研究中的结果为，抗性受隐性基因控制，其遗传力分别为 h = 0 8 2 和o 5 8 。 陈玉卿等在1 9 9 3 年对芸苔属油菜种质资源抗( 耐) 菌核病的鉴定结果表明， 抗菌核病基因主要存在于b 和c 基因组上。陈爱武1 9 9 7 年在甘蓝型油菜的个 f 2 群体中，找到了3 个与苗期叶片抗病性有关的r a p d 标记，并认为甘蓝型油 菜的抗菌核病是由多基因控制，且基因间有加性效应。黄永菊等在2 0 0 0 年研究 发现：油菜菌核病抗性主要受核基因控制，但存在一定的母性效应，核基因作用 6 方式表现为显性和加性基因作用。刘春林等在2 0 0 0 年利用f 2 群体定位了3 个抗 菌核病的q t l s ，其连锁贡献率为5 6 ( 贡献最大的一个q t l ( s c 2 ) 的贡献率为 2 9 ) 。李永红等在2 0 0 1 年研究发现油菜抗( 耐) 菌核病遗传是由基因的加性效应 和非加性效应共同控制的。 1 3 3 2 油菜抗菌核病种质筛选和利用情况 何昆燕在2 0 0 3 年利用抗病材料d h 8 2l 和感病材料d h b a 0 6 0 4 配制f l ，经 小孢子培养加倍获得d h 群体，其中8 2 个d h 系用作定位中双2 号、中双4 号、 中油0 8 3 、中油0 8 4 、中r 7 8 3 和中r 8 8 8 等，以及江苏省农科院经济作物研究所 获得的宁r s 1 等一批抗病品种的成功选育就是一些很好的例子。胡保成等在 1 9 9 6 年对玻里马不育系的研究表明，玻里马不育系9 0 a ，分别比其保持系9 0 b 平均病株率和病情指数低4 9 8 和6 8 6 ，并把其抗病性转育成新的不育系，且 表现较强的抗病特性。李永红等在2 0 0 1 年用细胞质雄性不育系陕2 a 、玻里马 a ( p o l a ) ，1 7 6 3 a 分别与9 2 p 1 5 7 、垦c 卜垦c 8 和l 4 5 四个恢复系进行不完全双列 杂交，以其f l 代为试验材料，在田问自然萌发和人工接种核盘菌的条件下，调 查了各组合的发病率和病情指数，估算了亲本及其组合抗( 耐) 菌核病的配合力效 应。结果表明：以陕2 a 为母本的组合表现出较强的抗( 耐) 病性。 1 3 3 - 3 油菜抗菌核病育种情况 利用目前筛选出的抗( 耐) 性品种进行杂交以及根据抗性与其形态性状的关 系进行选择是一条有效的途径，如中油8 2 1 、中双系列品种均达一定抗性水平， 在生产上推广。“九五 以来，我国育成了5 0 多个高产、优质抗病品种，具有代 表性的有“中油杂2 号”、“中双9 号”、“华杂4 号”、“华双3 号”、“中双7 号”、 “皖油18 、“宁杂3 号”、“湘油1 5 号”、“川油2 1 、“油研7 号”、“沪油1 5 ”、 “蓉油6 号”、“湘杂油l 号”、“湘杂油2 号”、“浙双7 2 、“秦优7 号”、“青杂2 号 等。其中，“中油杂2 号和“中双9 号”尤其具有代表性。“中双9 号于 2 0 0 2 年通过湖北省品种审定，在湖北省区试中，菌核病平均发病率( 1 3 3 1 ) 比对照中油8 2 1 降低2 8 ，病情指数( 6 4 7 ) 比对照降低3 6 ，是菌核病高抗品 种。 在防治油菜菌核病的措施中，抗源的筛选和抗病育种显得尤其重要，而抗性 鉴定方法的研究又是其关键环节之一。 7 1 4 与油菜植株抗性相关的酶系 一般认为油菜植株体内的过氧化物酶、超氧物歧化酶和苯丙氨酸解氨酶是与 抗病性相关的酶，大多数研究表明这些酶活性高低都与植物的抗病性强弱成正相 j 刍 5 5 5 8 】 o 1 4 1 过氧化物酶 过氧化物酶( p o d ) 是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸 作用、光合作用及生长素的氧化有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性 不断发生变化。p o d 是一种氧化还原酶，在脱氢酶的参与下，可以催化许多重 要酚类物质的氧化反应，参与木质素的聚合过程，过氧化物酶还是细胞内重要的 活性氧清除剂，从而与植物抗病性有密切关系。f r e u d e n b e r g 和n i s h 的研究表明， 可能由于过氧化物酶能催化松柏醇的脱氢氧化，其氧化产物可进一步聚合成木质 素，木质素的形成能防御入侵的病原菌进一步扩展，并且过氧化物酶能促进酚氧 化【5 9 】。大量的研究表明，过氧化物酶活性与植物的抗病性正相关。用病原菌接种， 抗病品种的过氧化物酶活性迅速升高，而感病品种的过氧化物酶活性降低或没有 变化，或者其活性升高的时间延迟【6 0 1 。 1 4 2 超氧物歧化酶 超氧物歧化酶( s o d ) 普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自 由基( 0 2 - ) 的酶。s o d 在正常情况下主要是清除植物体内活性氧，而活性氧可 以通过对病原微生物的毒害作用而诱导植物产生保卫素和过敏性反应。因此，关 于s o d 与植物抗病性的关系虽有研究，但尚未取得一致性结论。 1 4 3 丙氨酸解氨酶 苯丙氨酸解氨酶( p a l ) 在植物次生物质( 木素、黄酮类物质等) 的代谢中 起重要作用，与植物的抗病作用有密切关系。在植物的抗病反应中，苯丙烷类代 谢途径是一条重要的产生抗菌物质的途径，酚类物质、植保素和木质素等一些重 要的抗菌物质均由该途径产生。p a l 是该代谢途径中的关键酶和限速酶【6 l 】，p a l 活性的直接与植物的抗性强弱密切相关。许多研究者在不同植物的研究中都发现 抗性品种受侵害后p a l 活性增加高于感病品种，酶活性增高的同时还伴随着木 质素和绿原酸含量的增加。上述均表明p a l 在植物抗病性中的重要地位，其活 8 性高低可作为植物抗病性强弱的生化指标之一【6 2 1 。 鉴于上述酶在植物抗病性中的作用，诱导物作用于植物后其体内抗病相关酶 活力的变化，己逐渐成为诱导抗病剂研制者衡量植物诱导抗病效果的重要生理指 标之一，这方面已有很多报道。如黄有凯等用哈茨木霉发酵液诱导水稻的抗病性， 能使过氧化物酶的活力比对照高2 5 倍【6 3 】。许艳丽等用寡聚糖处理大豆叶片后接 种花叶病毒，使叶片中多酚氧化酶和过氧化物酶的活性大幅度地提高 6 4 1 。宾金华 等在研究茉莉酸甲脂诱导烟草幼苗抗炭疽病与p a l 活性及细胞壁物质的关系时 发现，经茉莉甲脂诱导处理的3 个不同抗性品种，其体内p a l 活性均明显高于 对照，且与木质素的含量正相关【6 5 】。徐勤松等在进行z n 对菹草叶抗氧化酶活性 的变化和超微结构损伤影响的研究时发现，z n 可诱导菹草叶中过氧化氢酶活性 的增加，使处理后的酶活远高于对照惭】。 在油菜中，吴纯仁1 9 8 9 年研究发现抗病品种比感病品种酚含量高，受侵染 的植株比侵染前其酚含量增加，并且离病斑越远，酚含量越低。刘胜毅1 9 9 8 年 研究表明核盘菌和草酸接种皆诱导油菜p o d 活性增加，抗病品种的增加幅度大 于感病品种，它们与抗性高低呈正相关，抗病品种比感病品种过氧化物酶同功酶 带多、活性高，低浓度的草酸( 4 0 p m o l l ) 诱导p a l 活性的增加，高浓度则抑制。 草酸诱导s o d 活性增加，且抗病品种增幅比感病品种大。 1 5 本研究的目的与意义 国内外对油菜核盘菌生物学特性报道较多，但对不同菌株生物学特性比较的 报道较少。本研究对四川省6 个油菜核盘菌菌株生物学特性进行比较，希望了解 不同生态条件下核盘菌的差异，加深对油菜核盘菌多样性的认识，从而为这些区 域在防治油菜菌核病的措施上提供一定的参考。通过油菜菌核病室内药效试验， 筛选出对油菜核盘菌抑制效果较好的杀菌剂以及相应的浓度，为农业生产上油菜 菌核病的防治提供药剂选择参考。油菜菌核病抗病性鉴定方法比较，为在抗病育 种中接种方法的选用起到一定的指导作用。对四j i i 农业大学油菜研究中心g i 系 列育种材料的菌核病抗性鉴定，筛选抗源材料，为抗病育种提供物质支持。油菜 抗、感品种酶活性测定，了解防御酶在未接种的油菜植株中的活性水平及接种后 酶活性变化，对抗病性鉴定、抗性材料筛选有一定的参考价值。 9 2 材料与方法 2 1 试验材料与设计 用采自四川6 个区域的油菜菌核病菌株进行生物学特性比较研究，这6 个区 域分别为雅安、乐山、绵阳、绵竹、宜宾和成都。在四川农业大学新区教学农场 设置a 、b 两试验区：试验a 区供油菜菌核病抗性鉴定方法比较，该区种植两抗 病品种：中油8 2 1 和中双9 号，两感病品种：u g 2 0 和雅黄；试验b 区供抗源筛 选，该区种植四川农业大学油菜研究中心提供的自交系g l 系列育种材料4 4 份和 对照中油8 2 1 。试验a 区的材料播种时间为2 0 0 6 年1 0 月5 日，播种方式为种子 直播，采用随机区组设计，4 个处理，4 次重复，每小区1 5 m 2 。试验b 区的材 料播种时间为2 0 0 6 年1 0 月1 5 日，播种方式为种子直播，采用随机区组排列， 每小区鉴定1 0 株，3 次重复。 2 2 核盘菌的分离、纯化与鉴定 在四川6 个区域的市郊，田间随机选择病株，每个病株只采一粒菌核，每个 区域采集5 0 粒。将菌核剪成2 m m 左右，用7 5 乙醇浸泡3 0 秒，再用1 n a c l o 消毒2 - - - 3 分钟，最后用无菌水清洗3 遍，将菌核上的水用灭菌滤纸吸干，移至 p