（分析化学专业论文）碳纳米管和纳米金颗粒用于dna和小分子检测的研究.pdf

t r 一 r e q u i r e m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fs c i e n c e l n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y i nt h e g r a d u a t es c h o o l o f h u n a nu n i v e r s i t y s u p e r v i s o r p r o f e s s o ry a n gx i a o h a i p r o f e s s o rw r a n gk e m i n m a y2 0 1 1 r 学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所 取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任 何其他个人或集体已经发表或撰写的成果作品。对本文的研究做出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律后果由本人承担。 作者签名：日期：加，年j 啁芗日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权湖南大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇 编本学位论文。 本学位论文属于 l 、保密0 ，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密影 ( 请在以上相应方框内打“”) 作者答名：嘶 导师签名：之岁扬多l 弄q ，参 日期：必if 年箩月多f 日 日期：抄【年厂月旧 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 摘要 碳纳米管和纳米金颗粒，具有独特的化学、光学、力学性能，并且稳定性好， ：生物相容性好，已在化学、生物学、物理学等多个学科领域得到广泛应用。本论 文利用单壁碳纳米管( s w n t ) 和纳米金颗粒，结合核酸探针的特异性识别能力， 采用不同的信号转导方式发展了双链d n a 和小分子的分析检测方法： ( 1 ) 单壁碳纳米管的类过氧化物酶活性用于双链d n a 的检测 自然界中d n a 大多以双链d n a 形式存在，灵敏、准确地检测双链d n a () 在生物学研究及应用领域中具有重要意义。利用类过氧化物 酶d 的s d 催n 化a 活性，发展了一种检测方法。该方法无需标s记wn，t通sdsdna过紫外吸收 光谱的测量即可实现检测，检测下限为1 1 5n m ，特异性较好。该方法为特异性 检测d s d n a 提供了一种新的思路。 ( 2 ) 单壁碳纳米管荧光猝灭效应用于银离子的检测 痕量银能够杀灭食品、饮水中的病菌，但摄入过量的银对人体又有毒害作用。 利用富含胞嘧啶的单链d n a ( s s d n a ) 对于a 矿的特异性识别作用和s w n t 对荧光 染料的猝灭作用，发展了一种a g + 的检测方法。该方法仅需一步混合即可实现检 测，检测下限达n o 6n m ，并用于在自来水、娃哈哈纯净水中测定a g + 。 ( 3 ) 纳米金颗粒的团聚效应用于甲氧檗因的检测 甲氧檗因具有良好的抗癌活性，能特异性结合碱基都是腺嘌呤的d n a 序列 ( p o l y ( a ) ) 。将p o l y ( a ) 修饰至纳米金颗粒的表面，当有甲氧檗因存在时，纳 米金颗粒发生团聚，导致溶液颜色和颗粒尺寸发生变化。据此利用紫外可见光谱、 共振瑞利散射和动态光散射三种方法实现了甲氧檗因的定量检测。其中动态光散 射方法灵敏度最高，检测下限达到0 1 9p m 并具有较好的特异性，改变序列的设 计，可用于其他药物分子的检测。 关键词：碳纳米管；纳米金颗粒；双链d n a ；银离子；甲氧檗因 i i 4 ， 、1 a b s t r a c t r e c e n t l y , c a r b o nn a n o t u b e sa n da un a n o p a t i c l e sh a v eb e e nw i d e l yu s e di n a n a l y t i c a lc h e m i s t r y ，b i o l o g y ，p h y s i c s ，e t c ，b e c a u s eo ft h e i r a d v a n t a g e s ，s u c ha s u n i q u ec h e m i c a l ，s t r u c t u r a l ，p h o t o n i e sa n dm e c h a n i c a lp r o p e r t i e s ，h i g hs t a b i l i t y ，a n d g o o db i o c o m p a t i b i l i t y i nt h i st h e s i s ，as e r i e so fd e t e c t i o nm e t h o d sw e r ed e v e l o p e df o r s m a l lm o l e c u l e s a n dd o u b l e s t r a n dd n a ( d s d n a ) ，w i t hc a r b o nn a n o t u b e s ，a un a n o p a r t i c i e s ，a n dt h e s p e c i f i cr e c o g n i t i o no fn u c l e i ca c i dp r o b e s t h em a i nc o n t e n to ft h i st h e s i s a r e s u m m a r i z e da sf o ll o w s ： ( 1 ) d o u b l e s t r a n d e dd n ad e t e c t i o nb a s e do n p e r o x i d a s e 1 i k ea c t i v i t vo f s i n g l e - w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e d n a n a t u r a l l ye x i s t si nd o u b l e s t r a n d e df o r m s e n s i t i v ea n da c c u r a t ed e t e c t i o n f o rd o u b l e s t r a n d e dd n ai ss i g n i f i c a n ti nb i o l o g i c a lr e s e a r c ha n di t sa p p l i c a t i o n a d o u b l e 。s t r a n d e dd n ad e t e c t i o ns t r a t e g yw a sd e s i g n e di nt h i st h e s i so nt h eb a s i so f p e r o x i d a s e - l i k ea c t i v i t yo fs i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e t h i sa s s a yc o u l dr e a l i z e r e a lt i m em o n i t o r i n gb yu v 。v i ss p e c t r u mw i t h o u ta n yl a b e l ，a n dh i g h l ys e n s i t i v e a n d a c c u r a t ed e t e c t i o n ，w i t had e t e c t i o nl i m i to f11 5 n m t h i ss i m p l ea n ds e n s i t i v e s t r a t e g ys h o w sg r e a tp r o m i s i n gf o ro t h e rb i o m o l e c u l e ss e n s i n g ( 2 ) s i l v e r ( i ) i o nd e t e c t i o nb a s e do nf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n ge f f e c to f s i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e t r a c ea g 十c a nk i l lf o o db a c t e r i ai n d r i n k i n gw a t e r ，b u te x c e s s i v ei n t a k ew i l l h a v et o x i ce f f e c t so nt h eh u m a nb o d y a d e t e c t i o nm e t h o df o ra g + h a sb e e n d e v e l o p e db a s e do nt h ef l u o r e s c e n c eq u e n c h i n go fs i n g l e w a l l e dc a r b o nn a n o t u b e s ( s w n t s ) a n dt h es p e c i f i c a l l yb i n d i n ga b i l i t yo fc y t o s i n e c y t o s i n e ( c c ) a n d ( a g + ) t h i sm e t h o do n l yn e e d so n e s t e pm i x i n gw i t had e t e c t i o nl i m i to f0 6n m a n dc o u l d b ea p p l i e dt oa g + d e t e c t i o ni nr e a ls a m p l e ( 3 ) c o r a l y n ed e t e t i o nb a s e do na un a n o p a r t i c l e sa g g r e g a t i o n c o r a l y n eh a sg o o da n t i t u m o ra c t i v i t ya n dc a ns p e c i f i c a l l yb i n dt op o l y ( a ) i n t h e p r e s e n c eo fc o r a l y n e ，a u n a n o p a r t i c l e sl a b e l e d b yp o l y ( a ) l a b e l e da u n a n o p a r t i c l e sa r ea g g r e g a t e d ，r e s u l t i n gi nt h ec o l o ra n ds i z ec h a n g e s o nt h i s b a s i s c o r a l y n ew a sd e t e c t e db yu v - v i s s p e c t u r e ，r e s o n a n c es c a t t e r i n gs c a t t e r i n ga n d d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g t h ed e t e c t i o nl i m i tc o u l dr e a c ho 19p mb yd y n a m i cl i g h t s c a t t e r i n g i to f f e r san o r m a ls t r a t e g yf o rd r u gs e n s i n g ，a n db r o a d e nt h ea p p l i c a t i o no f k e y w o r d s ：c a r b o nn a n o t u b e s ；a un a n o p a r t i c l e s ；d o u b l e s t r a n d e dd n a ；s i l v e r ( i ) i o n ； c o r a l y n e i v 学位论文原创性声明“i 学位论文版权使用授权书i i 摘要“i a b s t r a c t 本文所用英文缩略 第1 章绪论1 1 1 碳纳米管在分析检测中的应用1 1 1 1 以碳纳米管为荧光猝灭剂的检测方法“2 1 1 2 以碳纳米管为近红外荧光试剂的检测方法3 1 1 3 基于碳纳米管催化活性的比色分析方法“4 1 1 4 基于碳纳米管的光散射分析方法”4 1 1 5 基于碳纳米管的电化学活性的检测方法一5 1 2 纳米金颗粒在分析检测中的应用6 1 2 1 基于纳米金颗粒的比色分析方法一6 1 2 2 基于纳米金颗粒的光散射分析方法一8 1 2 3 基于纳米金颗粒的荧光分析方法1 1 1 2 4 基于纳米金颗粒的表面等离子体共振分析方法1 2 1 2 5 基于纳米金颗粒的电化学分析方法1 3 1 3 本论文拟开展的工作1 5 第2 章单壁碳纳米管的类过氧化物酶活性用于双链d n a 的检测一1 5 2 1 前言1 6 2 2 实验部分1 7 2 2 1 试剂与仪器l7 2 2 2 溶液的配制1 7 2 2 3 单壁碳纳米管的预处理1 8 2 2 4 可行性考察18 2 2 5 定量检测：l8 2 2 6 特异性考察1 9 2 3 结果与讨论1 9 2 3 1 检测原理1 9 2 3 2 可行性论证一2 0 2 3 3 实验条件优化一2 2 2 3 4 灵敏度考察一2 6 v 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 2 3 5 特异性考察2 6 2 4 小结2 7 第3 章单壁碳纳米管猝灭效应用于银离子的检测”2 8 3 1 前言2 8 3 2 实验部分2 8 3 3 3 4 第4 章 4 1 4 2 4 3 3 2 1 试剂与仪器2 8 3 2 2 溶液的配制2 9 3 2 3 单壁碳纳米管的预处理2 9 3 2 4 可行性考察2 9 3 2 5 定量检测2 9 3 2 6 特异性考察2 9 3 2 7 实际水样测定2 9 结果与讨论2 9 3 3 1 检测原理3 0 3 3 2 可行性论证3 0 3 3 3 实验条件优化31 3 3 4 灵敏度考察3 l 3 3 5 特异性考察3 2 3 3 6 实际水样测定3 3 小结3 3 纳米金颗粒的团聚效应用于甲氧檗因的检测3 4 前言3 4 仔u 吾 实验部分3 4 4 2 1 试剂与仪器3 5 4 2 2 溶液的配制3 5 4 2 3 纳米金颗粒的制备、修饰与表征3 5 4 2 4 条件优化3 6 4 2 5 定量检测3 6 4 2 6 特异性考察3 6 结果与讨论3 6 4 3 1 检测原理3 6 4 3 2 纳米金颗粒的d n a 修饰与表征3 7 4 3 3 实验条件的优化3 9 4 3 4 灵敏度考察4 0 v i 4 3 4 5 4 6 4 7 致谢5 5 v i i 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 本文所用英文缩略 缩略词名称 a t p三磷酸腺苷 。dls动态光散射 d n a 脱氧核糖核酸 d s d n a ，双链d n a e b 溴化乙锭 f r e t荧光共振能量转移 m b 分子信标 m w n t单壁碳纳米管 n i r 近红外 o t a赭曲霉素 p c r 聚合酶链式反应 p o l y ( a )都是腺嘌呤的d n a 序列 r r s共振瑞利散射 s e r s表面增强拉曼散射 s p r表面等离子体共振 s w n t单壁碳纳米管 t f o形成三链的寡核苷酸 t m熔解温度 v l l i 论 纳米材料是指在三维空间尺度上至少有一维处于纳米尺度范围( 1 1 0 0n m ) 或由它们作为基本单元构成的材料。纳米材料因具有表面效应、小尺寸效应、量 子尺寸效应和宏观量子隧道效应等【l 】，使其展现出特殊的化学与光学特性。在s c i 数据库中以“n a n o p a r t i c l e * o rn a n o t u b e * o rn a n o w i r e * n a n o d o t * o rn a n o r o d * 0 1 g r a p h e n e * 作为检索式，学科类别限定在化学领域，发现近五年来将纳米材料应 用于化学领域的相关报道为1 2 7 万余篇，其中涉及碳纳米管和纳米金颗粒的报道 最多，分别占3 0 和1 7 。由此可见，碳纳米管和纳米金颗粒已经成为应用最广 的两类纳米材料。 本章主要对纳米材料中的碳纳米管、纳米金颗粒进行简要概述，其中包括它 们的基本性能以及在分析检测中的研究进展。在此基础上，提出本论文的主要构 想。 1 1 碳纳米管在分析检测中的应用 碳纳米管最早是日本科学家l i j i m a t 2 】发现的。它是一种由碳六元环构成的类 似石墨平面卷曲而成的纳米级中空管，每个碳原子通过s p 2 杂化与周围3 个碳原子 发生完全键合，各单层管的顶端由于形成封闭曲面的需要，存在一定数量的五元 环。根据碳纳米管中碳原子层数的不同，可将其分为单壁碳纳米管( s w n t ) 和 多壁碳纳米管( m w n t ) 两种形式。如图1 1 所示，s w n t 是由单层石墨卷成柱状 无缝管而形成，而m w n t 一般由几层到几十层石墨片同轴卷绕构成，层间距为0 3 4 o 4 0n m 。与m w n t 多壁碳纳米管相比，s w n t 具有缺陷少，径分布范围小，均 一性更高等特点【3 j 。 氏 b 图1 1 碳纳米管的结构：( a ) s w n t ( b ) m w n t l 4 i 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 碳纳米管具有以下性质：( 1 ) 可以作为有效的荧光猝灭剂；( 2 ) 有近红外 的荧光特性；( 3 ) 催化活性高；( 4 ) 散射信号强；( 5 ) 具有良好的导电性能。 因此已被广泛用于化学、生物学、物理学等领域。下面主要介绍碳纳米管在分析 化学中的几种典型应用。 1 1 1 以碳纳米管为荧光猝灭剂的检测方法 由于碳纳米管本身存在离域的7 c 电子，易于和含有7 【电子结构的荧光物质发 生冗呱键的相互作用，使得能量或电子发生转移，因此，碳纳米管可以作为荧光 物质的猝灭剂。碳纳米管具有吸收光谱宽( 大约从5 0 0n m 9 0 0n m ) ，猝灭效率 高【5 】等特点，在荧光分析检测中引起了人们的广泛关注。 杨荣华研究小组【6 】利用s w n t 和一端标记荧光分子的分子信标( m b ) 实 现了目标d n a 的检测，其检测原理如图1 2 所示。由于m b 与s w n t 之间具有 强烈的冗7 c 堆积作用，使得m b 打开并缠绕在s w n t 上，此时荧光分子与s w n t 靠近，从而导致荧光发生猝灭。当目标d n a 存在时，由于竞争作用，m b 与目 标d n a 杂交形成刚性的双链结构，致使荧光分子远离s w n t ，实现荧光信号 的增强。根据荧光强度的变化实现了目标d n a 的定量检测，与传统的m b 相 比，有效降低了背景信号，提高了信背比。另外，该方法还具有通用性好，可 推广到其它小分子【7 】和离子 8 1 的检测中。 + 图1 2 分子信标结合s w n t 检测目标d n a l 6 1 该小组【9 】还基于s w n t 和嵌入型染料发展了一种免标记的d n a 检测方法， 其检测原理如图1 3 所示。s w n t 与单链捕获d n a 、溴化乙锭( e b ) 之间由于兀咄 堆积作用，可组装成s w n t d n a e b 复合体，此时，e b 染料的荧光会被s w n t 猝灭。当目标d n a 存在时，由于竞争作用，目标d n a 与捕获d n a 杂交形成双 链结构。此时，e b 染料由于更容易嵌入双链d n a ，从而远离s w n t 表面，引起 荧光信号的增强，从而实现对目标d n a 的检测。基于类似的原理，g u o 等【m 】利 用s y b rg r e e ni 嵌入双链d n a 的特征，结合s w n t 的猝灭性能，实现了h 矿+ 的 检测。 2 1 1 2 以碳纳米管为近红外荧光试剂的检测方法 碳纳米管在9 0 0 1 6 0 0n m 具有近红外( n i r ) 的荧光特性【l u ，目前，很多研 究工作利用该特性结合s w n t 实现了对生物小分子 1 2 , 1 3 、离子【1 4 1 和蛋白质【1 5 1 的 检测，通常s w n t 的n i r 的变化模式有2 种：光强度变化以及波长变化。 如图1 4 所示，c h e n 等【l5 】利用s w n t 的近红外荧光信号强度实现了凝血酶 的检测。当s w n t 超声分散以后，加入凝血酶的核酸适体，核酸适体缠绕于s w n t 上，在1 1 4 2n m 处产生较强的近红外荧光信号；当加入凝血酶后，凝血酶与它的 核酸适体相结合，使核酸适体脱离s w n t ，导致在11 4 2n m 处近红外荧光信号下 降。该方法的检测下限为0 2n m ，并有望应用于其他蛋白的检测。 图1 4 利用s w n t 近红外荧光特性检测目标凝血酶【1 5 】 除了利用光强度的变化作为信号，波长的变化也能作为信号的手段。h e l l e r 等【1 4 1 研究了结合到s w n t 上的含3 0 个核苷酸的d s d n a ，发现它由b 构象转变为 3 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 z 构象，从而调节s w n t 周围电介质的环境，将s w n t 近红外的发射能量降至 1 5m e v 。这种发射波长的变化可以用于h 9 2 + 的检测，并可用于检测血液、黑墨水， 活的哺乳动物细胞以及组织中的h 9 2 + 。 1 1 3 基于碳纳米管催化活性的比色分析方法 由于碳纳米管具有类过氧化物酶的催化功能，能够催化底物显色，因此，可 以利用碳纳米管的催化功能，采用比色法实现对目标物的检测。该方法免标记， 不需要昂贵的仪器，相对而言，成本较低。s o n g 等【1 6 】首次利用s w n t 的催化功能 实现了单核苷酸多态性的检测，其检测原理如图1 5 所示。单链d n a 和s w n t 结合 后，在高盐条件的作用下，可以起到保护s w n t 的作用，离心不容易产生沉淀。 当目标d n a 存在时，单链d n a 与目标d n a 发生杂交，使单链d n a 脱离s w n t 表面， 高盐条件下离心容易沉淀，弃上清液后重新分散在催化体系中会产生较强的催化 信号；当出现错配的d n a 时，单链d n a 只会部分脱离s w n t ，在高盐条件下离心 沉淀较少，弃上清液后重新分散在催化体系中则产生较弱的催化信号，据此可以 实现单核苷酸多态性的检测。此外本实验室【l7 】也利用s w n t 的该种特性，结合“裂 开型”的腺苷核酸适体，对腺苷进行检测。 叠未 c l 气一 - - _ _ 一。_ 一 蕾一咖n 蓍 嘞t m p 图1 5 利用s w n t 催化法检测单核苷酸多态性【1 6 】 1 1 4 基于碳纳米管的光散射分析方法 碳纳米管具有较强的光散射信号，结合该特征用共振瑞利散射的方法越来越 多地应用于分析检测中。h u a n g 等【1 8 】利用m w n t 的散射特征实现对目标d n a 的检 测，其检测原理如图1 6 所示。在磁颗粒和m w n t 上分别修饰两种序列不同的d n a ， 没有目标d n a 存在时，磁颗粒和m w n t 各自成分散状态，经过一次磁分离后，d n a 修饰的m w n t 仍然保留在溶液中，产生较强的散射信号。当有目标d n a 存在时， 由于d n a 之间的杂交作用，m w n t 交联到磁颗粒上，经过一次磁分离后，多壁碳 纳米管被除去，因此，溶液中的散射信号减弱，实现了对目标d n a “s i g n a lo f f 的检测过程。此外，该小组【1 9 】还利用m w n t 的散射信号实现了单核苷酸多态性的 4 聱静 图1 6 利用m w n t 散射信号检测目标d n a 1 8 】 1 1 5 基于碳纳米管的电化学活性的检测方法 碳纳米管的表面效应表现在直径小、表面能高、原子配位不足，使其表面原 子活性高，易与周围的其它物质发生电子传递作用，因而被广泛应用于电分析化 学领域。 利用碳纳米管本身具有的电化学性能，通过电化学的方法直接检测d n a 中 的鸟嘌呤( g ) 或腺嘌呤( a ) 的电化学信号，可构建免标记的d n a 传感器【2 0 1 。 z h a n g 等【z l j 将s w n t 直接组装在电极表面增加电子转移速率，通过检测鸟嘌呤 ( g ) 产生的电化学信号，实现了对d n a 杂交的检测，检测限达到2 0n m 。该传 感器的主要优点在于免标记，并且可以重复利用超过3 0 0 0 次，再生性能好。此外， 碳纳米管还可在电极表面组装，加快电活性分子如亚甲基蓝【2 2 1 ，4 ，4 ，苯二胺2 3 】 等的电子传递速率，实现了d n a 的高灵敏检测。利用碳纳米管优良的导电性能， 结合酶标记产生电化学信号，也可实现对目标d n a 的高灵敏检测。如w a n g 等【2 4 1 利用碳纳米管并结合碱性磷酸酶放大的方法检测d n a ，检测限达到5 4a m 。此外 也有研究小组将碳纳米管结合纳米颗粒实现了目标物的信号放大检测。如c h a n g 等1 2 5 j 用钯纳米粒子及m w n t 混合修饰玻碳电极，将寡聚核苷酸共价连接到 m w n t 的羧基上，制成电化学d n a 生物传感器，对互补单链d n a 进行定量检 测，检测限达到0 1 2p m 。 当生物大分子结合到碳纳米管的表面时，碳纳米管的电导率会随之发生变化， 利用碳纳米管的这种特性可以构建电化学传感器实现对生物大分子的检测。l e e 等【2 6 】将核酸适体功能化的s w n t 发展了一种检测凝血酶的电化学传感器，其检测 原理如图1 7 所示。当加入凝血酶时，核酸适体功能化s w n t 的电导率急剧下降， 5 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 其降低值与凝血酶的量直接相关，因此，实现了凝血酶的电化学检测，检测限约 为1 0n m 。由于很多蛋白质有相应的核酸适体，因此，该方法具有良好的通用性。 图1 7 基于碳纳米管的电学性质检测凝血酶【2 6 】 1 2 纳米金颗粒在分析检测中的应用 纳米金颗粒在特定的波长会产生强烈的表面等离子体共振现象，从而具有极 强的光散射信号，常被用于比色，荧光，光散射，表面等离子体共振( s p r ) 等 技术中。此外由于它本身具有导电性，且易于修饰，可以承载多个信号分子，从 而引起电信号的增加，因此也可广泛地应用于电化学分析检测领域。以下主要介 绍纳米金颗粒在分析检测中的几种常见的应用。 1 2 1 基于纳米金颗粒的比色分析方法 纳米金颗粒具有良好的生物相容性，可通过在其表面交联上多个生物分子构 建比色方法实现生物分子的检测。c h e n 等【2 7 】将腺苷的核酸适体修饰到纳米金颗粒 表面，利用比色法实现了腺苷的检测，原理如图1 8 所示。在高盐溶液环境中，纳 米金颗粒容易团聚，溶液颜色由红色变为蓝色。当腺苷存在时，腺苷与核酸适体 结合，引起核酸适体发生构象变化。同时，改变了纳米金颗粒表面的电荷密度， 并提高了纳米金颗粒的稳定性，高盐溶液环境下，纳米金颗粒依然呈单分散状态， 保持原来的红色。根据溶液颜色不同，实现了对腺苷的检测。该方法快速，简便， 设计具有一定的通用性，有望应用于医学诊断和环境监测。 图1 8 基于修饰的纳米金颗粒结合核酸探针用于腺苷的检测f 2 7 】 6 夕 淼 氨 j 逮一 一 硕士学位论文 此外，也有研究小组基于d n a 熔解温度( t m 值) 的改变来构建纳米金颗粒 的比色方法。如图1 9 所示，m i r k i n 研究小组【2 8 】通过设计包含a 、t 碱基配对的 两段d n a 序列，并分别修饰至纳米金颗粒的表面。另外，设计了一段茎部含有g 、 c 碱基配对的发夹探针，将两种纳米金颗粒与发夹探针混合。当加入4 ，6 二脒 基2 苯基吲哚( d a p i ) 、色霉素a 或溴化乙锭( e b ) 后，由于配基与d n a 之间的 作用，纳米金颗粒发生团聚。由于配基与杂交的d n a 牢固结合以后，使得杂交 的d n a 解链所需的温度增加，因此提高温度解链之后，使得团聚的纳米金颗粒 又分散，从而可以实现不同配基的选择。 图1 9 利用比色法改变t m 值选择配基【2 8 】 在纳米金颗粒表面进行修饰，相对繁琐费时，y a n g 等2 9 1 采用未经修饰的纳米 金颗粒与核酸适体发展了可实现赭曲霉素( o t a ) 检测的比色方法，原理如图1 1 0 所示。 j 。 s a l t s a l t 海海 q i la u n p s 八，、o t aa p t a m e r o t a 哆c o m p o u n d 。f o t a 删阳m e r 图1 1 0 基于未修饰的纳米金颗粒结合核酸适体用于o t a 的检测【2 9 】 7 a 多 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 当没有目标物o t a 存在时，核酸适体吸附在纳米金颗粒表面，改善了纳米金 颗粒的稳定性，即使在高盐的条件下，纳米金颗粒仍可保持原来的红色。当有目 标物o t a 存在时，核酸适体与o t a 结合形成特定的构型，核酸适体脱离纳米金 颗粒的表面，引起纳米金颗粒的团聚，溶液由红色变为蓝色，从而实现了o t a 的 检测。该方法具有一定的通用性，已成功应用于四环素【3 0 j 和可卡因1 3 1 】的检测。 此外，z h u 等【3 2 】利用纳米金颗粒的比色方法实现了对单碱基突变的检测。特 定的寡核苷酸链与d s d n a 可发生结合形成稳定的三链结构，加入纳米金颗粒后， 在高盐环境下，纳米金颗粒发生团聚变色。当寡核苷酸链上发生单碱基突变时， 与d s d n a 的结合力减弱，寡核苷酸链容易吸附到纳米金颗粒上，提高了纳米金 颗粒的稳定性，在高盐环境下，纳米金颗粒仍可保持原来的红色。因此，根据纳 米金颗粒的颜色变化可实现对单碱基突变的识别。 利用纳米金颗粒的比色方法还可用于金属离子的检测，如h 矿+ 能与胸腺嘧啶 ( t ) 结合形成t _ h 9 2 + t 结构，a 矿能与胞嘧啶( c ) 结合形成c a 矿c 结构。利 用这两种金属离子对碱基的特异性结合作用，可设计特定的序列结合纳米金颗粒 的比色方法实现对h 9 2 + 、a 矿的检测【3 3 4 1 。 1 2 2 基于纳米金颗粒的光散射分析方法 纳米金颗粒在特定的波长会产生强烈的表面等离子体共振现象，从而具有极 强的光散射信号，比相同尺寸的荧光分子强几个数量级，已经有研究小组基于纳 米金颗粒的静态【35 1 、动态【3 6 1 、线性【3 7 1 或者非线性3 s , 3 9 光散射方法实现了对生物 分子的分析检测。 ( 1 ) 基于共振瑞利散射的分析检测 自1 9 9 5 年p a s t e r n a c k 等【4 0 】报道了共振瑞利散射( r r s ) 检测核酸以来，纳米金 颗粒的共振瑞利散射技术在核酸【4 1 1 、蛋白质4 2 小1 和无机分子4 5 】的分析检测方面得 到越来越多的应用。如图1 1 1 所示，z h a n g 等【4 6 】设计了一条与腺苷核酸适体 ( d n a l ) 部分互补的d n a 2 序列，d n a 2 的一端标记了巯基，另一端为四个鸟嘌 呤( g ) 。当与d n a l 杂交后修饰于纳米金颗粒的表面。当腺苷存在时，基于竞争 作用，d n a l 与腺苷特异性结合，并与d n a 2 发生解离。d n a 2 末端的g 形成分子 间g 四聚体结构，引起纳米金颗粒的团聚，从而使r r s 散射峰的强度增强，实现 了对腺苷的检测。该方法的灵敏度高，检测限低至1 8n m ，同时，拓展了纳米金 颗粒在r r s 中的应用范围。 ( 2 ) 基于动态光散射的分析检测 动态光散射( d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ，d l s ) 方法不仅可以监测散射光强度 的变化，而且还可以监测颗粒尺寸的变化。h u o 小组基于纳米金颗粒的动态光散 射信号已实现对d n a 杂交【4 7 1 、抗原抗体【4 8 1 和蛋白与蛋白相互作用4 9 】的研究。 本实验室【5 0 】将生物小分子腺苷的核酸适体裂开，利用该方法很好地实现了目 标物腺苷的检测。如图1 1 2 所示，首先将腺苷的两条裂开的核酸适体分别修饰在 纳米金颗粒表面，当目标物腺苷存在时，腺苷与纳米金颗粒表面的核酸适体结合， 拉近纳米金颗粒之间的距离，颗粒之间会发生团聚，从而引起一定的颜色变化， 同时也会引起颗粒粒径的变化，该方法检测腺苷的灵敏度可以达到7n m ，与比色 法相比，检测限低了5 个数量级，且该方法简单易行，只需一步混合即可实现目 标物的检测。该工作进一步拓展了动态光散射的应用范围。 i 8 p - t - ，：”害 矽。 - 一 - 氐、 厂 + 黪繇：强 “j 谚7 舔7 簪 q 葛舞蠢溱、。驾彰 。史鬈。k烂 逻 ：繁夏氍= x a d e n o s i n et o n n t r a l i o ni m c r e s s ( “一。；- ” 图1 1 2 基于动态光散射的方法对腺苷的检测【5 0 】 9 上 一 一 一 霉；上 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 脱氧核酶( d n a z y m e ) 是通过体外筛选技术( s e l e x 技术) 得到的具有酶 活性的核酸，其酶活性通常与某些金属离子密切相关，使其在金属离子的分析检 测中备受关注f 5 l 】。m i a o 等 5 2 】利用铅离子依赖性的d n a z y m e 结合动态光散射的方 法实现了铅离子的检测。如图1 1 3 所示，首先设计了两段不同的d n a 序列，分 别修饰在纳米金颗粒的表面，当加入铅离子依赖性的d n a z y m e 序列时，与纳米 金颗粒上修饰的d n a 杂交，此时，纳米金颗粒为团聚状态，颗粒尺寸较大。当 铅离子存在时，激活d n a z y m e ，在切割位点将其切断，使团聚的纳米金颗粒重 新分散，颗粒尺寸减小。最后，采用d l s 监测纳米金颗粒尺寸的变化，间接测得 铅离子的浓度。该方法的灵敏度较高，检测下限达到1n m 。 图1 1 3 基于动态光散射的方法对核酶依赖性的铅离子的检测【5 2 】 - ( 3 ) 基于表面增强拉曼散射的分析检测 近年来，表面增强拉曼散射( s u r f a c e e n h a n c e dr a m a ns c a t t e r i n g ，s e r s ) 以 灵敏度高和抗外界因素( 如湿度，氧气) 干扰能力强等优势【5 3 1 ，结合纳米金颗粒 的增强效果已被广泛应用于目标物的检测。k a n g 等【5 4 】基于纳米金颗粒的增强效 应构建了一种s e r s 方法实现了d n a 的放大检测，其检测原理如图1 1 4 所示。 首先将捕获探针固定在金纳米线表面以捕获目标d n a ，进而结合一端标记了染料 且另一端修饰了纳米金颗粒的报告探针。最后，利用s e r s 方法实现了目标d n a 的放大检测，该方法的检测限达到1 0p m 。 1 0 a un w t a r g e th y b r i d i z a t i o n s e r ss i g n a l 图1 。1 4 基于纳米金颗粒增强效应并结合表面增强拉曼对目标d n a 的检测p 4 j 此外，纳米金颗粒上还可通过沉积银实现拉曼信号的增强。如m i r k i n 等 5 5 】 通过在纳米金颗粒上沉积银，构建了一种s e r s 方法实现d n a 的放大检测，如图 1 1 5 所示。首先固定在表面的捕获探针可以捕获目标d n a ，进而结合报告探针修 饰的纳米金颗粒，该报告探针上标记了拉曼活性染料。然后，通过在纳米金颗粒 上沉积银，实现拉曼信号的增强。另外，作者通过在报告探针上修饰不同的拉曼 活性染料，可实现多目标d n a 的同时检测。 a g h y d r o q u i n o n e - i 卜 图1 1 5 基于纳米金颗粒上沉积银增强拉曼信号对目标d n a 的检测 5 5 1 1 2 3 基于纳米金颗粒的荧光分析方法 纳米金颗粒具有较强的荧光猝灭效应，是一种广谱的猝灭剂，能够对很多荧 光分子进行有效的猝灭。因此，纳米金颗粒在荧光分析检测中受到了人们的广泛 关注。j i n 等i s 6 基于纳米金颗粒的猝灭性能发展了一种检测药物小分子的荧光方 法，其检测原理如图1 1 6 所示。首先将标记了荧光染料的富鸟嘌呤( g ) 序列 ( g d n a ) 与纳米金颗粒共孵育，此时g d n a 会通过静电作用吸附于纳米金颗粒 弦一 ” 岛g 眠 硒他 g c 帕瓣 丌m戮缎擀黜擀膦职榭 一 融妁卜 碳纳米管和纳米金颗粒用于d n a 和小分子检测的研究 的表面，染料的荧光被纳米金颗粒猝灭。当药物大豆苷元存在时，这种药物会结 合g d n a ，使g d n a 形成四聚体的形式，脱离纳米金颗粒的表面，产生荧光信号， 根据荧光信号的强弱实现了药物小分子的检测。 瓣 薹固基 臀曙 _ 港、厂g d n a ：5 - f a m - t t a g g g t t a g g g v i a g g g t t a c - c - 3 = g n p = l i g a