（分析化学专业论文）烟碱分子印迹聚合物的识别机理与分析应用研究.pdf

中国科学技术大学硕士学位论文摘要 摘要 分子印迹技术以免疫学中的抗原抗体结合为理论基础，模拟生物分子识别 进行化学合成并应用于生物化学分析，是当代生物与化学交叉领域的新兴学科 之一。分子印迹技术可制备具有特定选择性和亲合能力的分子识别材料。该技 术与高效液相色谱分析技术相结合，广泛用于药物及生物样品中目标成分的分 离及富集。 本论文在详细综述烟碱分析方法的发展概况和分子印迹技术的研究现状 基础上，引用离子对反相高效液相色谱建立了测定烟碱的新方法，并通过模板 预组装方式合成了烟碱分子印迹聚合物，对该聚合物的识别机理和选择性进行 了研究，将其应用于固相萃取吸附剂，探讨了其在选择性萃取人体头发样品中 烟碱的应用。具体而言，本论文所做工作包括以下四个方面： 1 对烟碱的分析分离技术的现状和分子印迹技术的产生、分析原理及其应 用研究进展，尤其是在分离和固相提取方面的进展进行了综述。 2 以庚烷磺酸钠作为离子对试剂，建立了反相离子对高效液相色谱法测定 烟碱及其衍生物的新方法，探索了溶液p h 值、洗脱液组成等因素对分离结果 的影响，对流动相的组成、洗脱方式进行了优化。方法具有简单、准确度高、 实用性强等优点。 3 采用膜板自组装技术，以烟碱分子为模板、甲基丙烯酸为功能单体、乙 二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈为引发剂，合成了非共价型烟碱 分子印迹聚合物，并利用1 h 核磁共振波谱、紫外光谱和x 一射线光电子能谱 等光谱技术对膜板分子与功能单体之间的印迹反应进行了研究，探讨了聚合物 的识别机理。 4 将烟碱分子印迹聚合物用做固相萃取吸附剂，研究了溶剂p h 值、极性等 因素在萃取过程中对上样、淋洗、洗脱各步骤的影响。应用于头发样品中烟碱 的测定，可实现对烟碱有效的富集和分离。研究结果表明，在优化条件下，烟 中国科学技术大学硕士学位论文摘要 碱分子印迹聚合物对目标物质烟碱具有很好的识别能力，可以成功地应用于复 杂生物体系中烟碱的提取与分析。该方法可用于吸烟者和不吸烟者烟碱摄入量 的有效检测，为烟碱分子印迹聚合物的实际应用提供了新的分析方法。 关键词：烟碱，分子印迹技术，分子识别，高效液相色谱，头发，固相萃取 1 1 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t t h em o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u ei sb a s e do nt h eb i n d i n go fa n t i g e n a n t i b o d y t h e o r y b e t w e e nt h eb i o l o g i c a la n d c h e m i c a lw o r l d ，i ti san e w l yd e v e l o p e ds u b j e c t o fs y n t h e s i z i n gc h e m i c a lc o m p o u n d sw h i c hh a v em o l e c u l a rr e c o g n i t i o na b i l i t ya n d t oa p p l yi ti nc h e m i c a la n db i o l o g i c a la n a l y s i s m o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n o l o g y c o u l dp r o d u c em o l e c u l er e c o g n i t i o nm a t e r i a l sw i t hh i g hs e l e c t i v i t ya n da f f i n i t y t h ec o m b i n a t i o no ft h et e c h n i q u ew i t hh p l ci s w i d e l yu s e d i ns o l i dp h a s e e x t r a c t i o n ( s p e ) o fd r u g sa n db i o l o g i c a ls a m p l e s p r i m a r ys t u d i e si nt h et h e s i sa r e i n c l u d e da sf o l l o w i n g ： 1 i n t r o d u c t i o n ：t h ea n a l y t i c a lt e c h n i q u e so fa s s a y i n gn i c o t i n e ，t h ed e v e l o p m e n t a n da p p l i c a t i o no fm o l e c u l a ri m p r i n t i n gt e c h n i q u e ，e s p e c i a l l yt h ea p p l i c a t i o np r o s p e c t i ns e p a r a t i o na n de x t r a c t i o nw e r er e v i e w e d 2 an e wr e v e r s e d p h a s eh p l cm e t h o du s i n gs o d i u mh e p t a n es u l f o n a t ea sa n i o n - p a i rr e g e n tw a sd e v e l o p e df o rs i m u l t a n e o u sa s s a yo fn i c o t i n ea n dn i c o t i n e r e l a t e ds u b s t a n c e s o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rc h r o m a t o g r a p h i cs e p a r a t i o n ，s u c ha s p ho fs o l u t i o n ，e l u t em o d e ，m o b i l ep h a s e ，w a v e l e n g t h ，w e r ei n v e s t i g a t e d t h i s m e t h o da p p e a r ss i m p l e ，a c c u r a t ea n dp r e c i s e 3 an i c o t i n e m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r ( m i p ) b a s e d o nn o n c o v a l e n t i n t e r a c t i o nw a ss y n t h e s i z e du s i n gm e t h a c r y l i ca c i da sf u n c t i o n a lm o n o m e r s ， e t h y l e n eg l y c o ld i m e t h a c r y l a t ea sc r o s s l i n k e r , a z o b i s i s o b u t y r o n i t r i l ea si n i t i a t o r a n dn i c o t i n ea st e m p l a t em o l e c u l e s 1 hn m r ，u va n dx p ss p e c t r o m e t r i cm e t h o d s w e r ea d o p t e dt os t u d yt h es e l e c t i v er e c o g n i t i o nc h a r a c t e r i s t i c so ft h ep o l y m e r 4 u s i n gn i c o t i n e i m p r i n t e dp o l y m e ra s s o l i dp h a s ee x t r a c t i o ns o r b e n t s ，w e t e s t i f i e dt h ef e a s i b i l i t yo fs e l e c t i v e l ye x t r a c t i n gn i c o t i n ef r o mh u m a nh a i r f a c t o r s i n f l u e n c i n gi t sp e r f o r m a n c ew e r es t u d i e d ，s u c ha so fp ha n dp o l a r i t yo fs o l u t i o n s i nt h el o a d i n g ，w a s h i n ga n de l u t i n gp r o c e d u r e s t h es e l e c t i v i t yo ft h en i c o t i n em i p s w a se v a l u a t e da n dt h ee x t r a c t i o nm e t h o do fn i c o t i n ef r o mh u m a nh a i rw a so p t i m i z e d i i i 中国科学技术大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ns u m m a r y ，t h em e t h o dc o m p r i s i n gas a m p l ep r e p a r a t i o nt h r o u g hm o l e c u l a r i m p r i n t i n gs o l i dp h a s ee x t r a c t i o ns t e pf o l l o w e db yr e v e r s e d p h a s eh p l cs y s t e m s h o w e dg r e a tr e c o g n i t i o na b i l i t i e st on i c o t i n e t h eh i g hs e l e c t i v i t ya n da c c u r a c y s h o u l dm a k et h i sm e t h o ds u i t a b l ef o rs e p a r a t i o na n da n a l y s i so fn i c o t i n ei nb i o l o g i c a l o re n v i r o n m e n t a lc o m p l i c a t e ds a m p l e s k e y w o r d s ：n i c o t i n e ，m o l e c u l a r l yi m p r i n t e dp o l y m e r s ，m o l e c u l a rr e c o g n i t i o n ， h i g h p e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y , h u m a nh a i r ，s o l i dp h a s e e x t r a c t i o n 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 第一章绪论 1 1 烟碱的分析方法及其发展现状 1 1 1 烟碱概述 自从19 世纪中叶香烟问世以来，吸烟人口不断增多。人们逐渐发现许多 疾病与吸烟有关，因此吸烟与健康问题越来越受到人们的关注。吸烟是烟草滥 用的一种方式，也是影响人类健康、引发各种疾病和导致死亡的重要原因之一。 研究证实吸烟与癌症、心血管疾病、慢性肺部疾病、溃疡病和糖尿病的并发症 有密切关系】。全球每年因吸烟而死亡的人数超过3 0 0 万【6 1 。吸烟散发出的 烟雾中有5 0 0 0 多种化学物质，其中约有5 0 多种化学致癌物质，烟碱是香烟烟 雾中的主要毒性物质成分1 7 】。 烟碱，又称尼古丁( n i c o t i n e ) ，分子式c 1 4 h 1 4 n 2 ，化学名称为卜甲基一2 一 ( 2 - p l ：啶基) 吡咯烷。烟碱具有左旋光性，是有较强碱性的有机二元弱碱 ( p k 。1 = 3 1 2 ，p k a z - - 8 0 2 ) 。p h 9 时，主要以烟碱分子状态存在。纯的烟碱在室温 下为无色或淡黄色油状液体，有强烈辛辣味，有潮解性，2 0 密度为1 0 0 7 1 ， 沸点2 4 6 ，溶于水和有机溶剂，在6 0 以下时可与水生成水合物，易溶于醇、 醚、氯仿、石油醚等有机溶剂中，可随水蒸汽一起蒸出，在空气中遇光容易氧 化。 1 1 2 烟碱分析的重要性 烟草中主要有4 种生物碱：烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱，其中烟 碱含量最高，约占烟草中生物碱总量的9 0 ，是一种对中枢神经少量时有兴 奋作用而大量时有抑制作用的有效成分。尼古丁有毒性，对人体有强烈的生理 作用，是导致人们吸烟成瘾的重要物质基础。尼古丁除作用于大脑外，还可放 松骨骼肌肉，影响心血管系统和内分泌，作为一种高毒性、无色易挥发、易溶 解于水的物质，尼古丁可通过呼吸系统、皮肤、胃肠道及孕妇的胎盘吸收，对 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 人体的健康产生危害。 由于主动吸烟和被动吸烟者均能吸入烟气中的尼古丁，那些暴露于环境 烟草烟气( e n v i r o n m e n t a lt o b a c c os m o k e ，e t s ) 的非吸烟人群同样受到烟草 的危害1 8 j 。人体头发、尿液、血液、唾液等中的尼古丁含量与吸烟人群的摄入 剂量或非吸烟人群暴露e t s 的程度呈正相关关系【9 1 。因此，尼古丁和其衍生物 常用作衡量烟草对人体健康的影响程度、区分主动吸烟者和被动吸烟者的重要 生物标记物，受到生物医学、环境科学及烟草健康研究的广泛重视【l o 】。快速 而准确测定烟草以及生物样品中的尼古丁具有重要意义。 对于生物样品来说，尼古丁在头发中的半衰期长于其在尿液、血液等体 液中的半衰期，通过对头发中尼古丁的检测j 可以获得长期吸烟及暴露于环境 烟草烟气对人体健康影响的相关信息【1 1 , 1 2 1 。 1 1 3 烟碱的分析方法 1 1 3 1 前处理方法 由于环境和生物样品基质复杂且烟碱在环境和生物体内的含量较低，检测 较为困难，因而提取方法显得特别重要。 1 液液萃取法( l i q u i d l i q u i de x t r a c t i o n ，l l e ) l l e 应用得比较多，是提取样品中尼古丁和其衍生物的经典方法【1 3 小】。 但由于l l e 缺乏选择性，对大多数物质都可萃取分离且使用的有机溶剂大多 易挥发，对环境造成一定污染，操作繁琐、费时，已较少使用。 2 固相萃取法( s o l i dp h a s ee x t r a c t i o n ，s p e ) s p e 技术操作简单，使用灵活、溶剂消耗少、易于自动化，是目前样品预 处理最简洁、高效、灵活的一种手段l l6 1 。近年来，s p e 与色谱分析联用技术 已发展为测定微量及痕量成分的重要分析方法。 s p e 是一种吸附剂萃取。样品首先通过填有吸附剂的萃取柱，目标物和杂 质被保留在柱上，然后分别用不同的溶剂选择性除去杂质，洗脱出待测物，达 到分离的目的。用作s p e 吸附剂填料的主要有：石墨碳、离子交换树脂、键 合硅胶、免疫亲和吸附剂、分子印迹聚合物等。早期报道的方法多用离子交换 树脂作为s p e 吸附剂检测样品中的尼古丁，如商品化的e x t r e l u t 1 、d r u gt e s t 1 、 x a d 2 等树脂型萃取小柱【1 7 硼】。目前应用最广泛的是c 1 8 键合硅胶吸附剂。 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 y v a n 等【1 9 1 采用c 1 8 萃取柱和气相色谱质谱联用( g c m s ) 同时测定头发中的 鸦片剂和可卡因。n i c h k o v a 等【2 0 】采用c 1 8 小柱提取了人体尿液中的氯酚并成 功对其进行了免疫测定。b a i d o o 等也报道了使用c 1 8 固相萃取小柱成功提 纯和富集了人体尿液中的烟碱和其衍生物。 但是，离子交换树脂和c 1 8 键合硅胶等经典的s p e 吸附剂均存在选择性较 差，对复杂样品难于有效分离的问题。分子印迹聚合物作为一种有着选择性结 合位点的高度交联网状聚合物，将其用作s p e 的吸附剂，有着显著的优越性能， 必将受到广泛的关注和研究。 3 超临界流体萃取法( s u p e r c r i t i c a lf l u i de x t r a c t i o n ，s f e ) 近年来，使用s f e 方法测定烟碱的方法也有报道 2 2 1 。超临界流体萃取方 法具有萃取速度快、选择性好、可在室( 低) 温下操作、无溶剂残留污染、能耗 低、萃取齐i j ( c 0 2 ) 便宜易取等一系列优点，但设备和操作要求条件较高，难于 普及。 1 1 3 2 检测方法 测定烟碱常用的分析方法有重量分析法、分光光度法、电化学分析法、旋 光法、滴定分析法、极谱分析法、红外光谱分析法、原子吸收法、色谱法。有 关这些分析方法具体的优、缺点见表1 1 。同时，也有采用毛细管电泳法、核 磁共振法测定烟碱的报道。另外，使用放射免疫分析法( r i a ) 测定烟碱的报 道也较多【3 2 】，但r i a 所需仪器成本高，测试时间长，应用范围较窄。 近几年，国内外关于色谱法测定烟碱，特别是生物介质中烟碱的研究发展 迅速，逐步成为最重要的烟碱分析方法，其定量检测限可达0 1n g m l 。下面 介绍几种主要的色谱分析法。 1 气相色谱( g a sc h r o m a t o g r a p h y , g c ) g c 方法分离能力较强，广泛应用于复杂有机样品的分析，是检测烟草及 卷烟烟气中烟碱的常规方法。杨金辉等【3 4 1 以c h 2 c 1 2 作萃取溶剂，采用p e 1 7 弹 性石英毛细管柱，快速、简便、准确测定了烟叶中烟碱等4 种主要生物碱。m o o r e 等【3 5 】把毛细管柱气相色谱电子俘获检测法作烟碱全氟酰化之后用于灵敏检测 和分析，灵敏度达10 1 2g 。f e y e r a b e n d 等用涂交联h p f f a p 柱、氮磷检测 器，快速测定了尿、血浆等生物体液中的烟碱和可天宁。g c 方法可在对烟碱分 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 析的同时，对样品中的其它组分进行测定。 同时，气相色谱质谱联用技术( g c m s ) 测定烟碱的研究也有很多报道 3 7 - 3 8 】。对于烟叶香气、卷烟烟气等复杂样品，其成分至今仍未完全确定，g c m s 用于分析复杂体系混合物方法简单、有效，所以对该类样品中烟碱等组分的鉴 别与测定，g c m s 较为合适。用g c m s 对环境中空气和人发、尿、唾液、 血等生物样品中烟碱及其代谓 物和相关组分进行测定也是比较好的方法。 表1 1 烟碱分析方法的比较 分析方法优点缺点参考文献 2 高效液相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h ，h p l c ) 4 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 h p l c 方法具有简捷、快速、重现性好等特点，是测量烟碱的重要手段。 从七十年代开始，已有关于使用h p l c 测定生物样品中烟碱和其衍生物的报 道。根据b a r l o w 的报道【3 引，在进行h p l c 测定前需进行柱前衍生化。c h a m b e r s 报道了使用d b t b ( 2 t h i o b a r b i t a r i ca c i d ) 测定烟碱及衍生物的h p l c 方法， 该法简单且成本较低【4 0 1 。 为了考察烟碱对人体的作用，不少研究者用h p l c 分析了人尿、血及头发 中的烟碱及其衍生物可天宁和3 一羟基可天宁等。m o o r e 等【4 1 1 用s p h e n s o r b o d s 2 柱，紫外检测器，测定人尿中烟碱、可天宁和3 一羟基可天宁，其检出限 为5 0n g m l 。0 d o h e r t y 等【4 2 】以s p h e n s o r bo d s 2 柱，0 0 5 m o l l 的庚基磺酸钠 水溶液和庚基磺酸钠的甲醇溶液为梯度流动相，用m e l d r u m 氏酸代替二乙基丙 二酰硫脲作为衍生剂，大大提高了烟碱及其衍生物的稳定性和测定的灵敏度。 h a r i h a r a n 等首先用液液萃取和c 2 柱固相萃取分离、提纯被动吸烟者尿样， 然后以d b c 8 柱，含三乙胺、庚基磺酸盐的磷酸柠檬酸盐缓冲溶液与乙腈溶液 ( v v ：9 l ：9 ) 为流动相，2 苯基咪唑和n 一乙基降烟碱为内标物，对提纯样品中的烟 碱和可天宁同时测定，并与g c 法进行了比较，h p l c 有更高的灵敏度。 烟碱是二元弱碱，在不同的介质中有不同的存在状态。当p h 结合 分子印迹聚合物 洗脱 再结合 聚 合 添加交联剂 图i - i 分子印迹过程原理示意图 可见，空穴的立体结构与模板分子的空间立体结构完全相同。当空穴的立 体结构与某一特定空间结构的物质分子完全吻合时，即对该分子产生特殊的亲 和力。这样的空穴便可以对待分离混合物中的模板分子表现出特效的选择性和 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 识别能力，从而达到分离、纯化的目的。 分子印迹技术根据模板分子与聚合物单体官能团之间的作用方式，可分 为模板预组织法( 共价方式) 和模板自组装法( 非共价方式) 。 模板预组织法由w u l f f 首先提出【6 1 1 。聚合前模板分子与可聚合的功能单体 通过可逆共价键结合( 硼酸酯、缩醛酮、酯和螯合作用、硼酸基) 衍生化形成 可聚合的模板单体，用过量交联剂经自由基聚合得高交联大分子，通过水解或 酸解使模板分子与聚合物间共价键断裂，释放出模板分子，形成对模板分子有 特异性吸附功能的共价型印迹聚合物。在预组织中，作用力单一，能产生更多 专一的结合位点。共价印迹过程要求模板分子和功能单体之间的作用为可逆共 价键，可用于形成可逆共价键的化合物有限，限制了预组织法的应用性，此外， 由于共价作用一般较强，在模板预组织或识别过程中，结合和离解速度慢，难 以在短时间内完成吸附或解吸，达到热力学平衡，不利于发展快速的识别方法 ( 如色谱法) 。 模板自组装法由m o s b a c h 等创立【6 2 1 ，是制备具有选择性印迹聚合物的最 简单方法。首先模板分子与可聚合的功能单体在溶液中通过离子作用、氢键、 疏水作用、偶极、金属鳌合、电荷转移、范德华力等弱的非共价键作用，形成 主客体配合物，再通过交联剂聚合将结构固定在聚合物网络结构中，除去模板 分子后得到聚合物，其结构中含有对模板分子有选择性结合的识别位点。聚合 物的分子识别特性主要决定于客体分子与模板聚合物内功能基团之间的超分 子作用，所以可根据模板分子的基团种类灵活的选择功能单体，且可以用简单 的溶剂萃取除去模板分子，但易产生非专一性的结合位点。 模板自组装法相对模板预组织法具有印迹方法简单、模板分子和功能单体 之间作用力较弱易于除去、印迹聚合物与模板分子的可逆性结合作用快等优 点。同时，模板自组装法合成的非共价分子印迹聚合物其分子识别过程更接近 于天然的分子识别系统，如抗体和抗原。模板自组装的实用性广，各种作用力 可以相互影响产生协同作用，是目前广泛采用的合成方式。 1 2 3 分子印迹聚合物的制备 在分子印迹聚合物的制备中，模板分子、功能单体、交联剂以及引发剂和 致孔剂对聚合物的性质都有很大影响。在设计分子印迹聚合物体系时要选择与 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 模板分子尽可能有特异结合的功能单体，然后选择适当的交联剂和溶剂。另外， 合成方法和聚合条件也起着非常重要作用。 1 2 3 1 功能单体、交联剂和引发剂 非共价分子印迹聚合方式中常用的单体是甲基丙烯酸( m a a ) ，是模板自 组装方法中通用的有潜力的功能单体，因为它能通过氢键和离子作用与许多客 体分子结合，其印迹聚合物有高选择性的结合能力。有时可以和抗体相媲美。 而2 一三氟甲基丙烯酸( t f m a a ) 作单体时，三氟甲基有强烈的吸电子效应，单 体酸性较强，更适用于碱性化合物的分子印迹【6 3 】。共价分子印迹技术中常用 功能单体有含乙烯基的硼酸和二醇，含有硼酸酷的硅烷混合物和合有氨基的硅 烷胶颗粒。比如，4 一乙烯苯硼酸、4 一乙烯苯甲醛、4 一乙烯苯胺、4 一乙烯苯酚。 交联剂较常用的是乙二醇二甲基丙烯酸酯( e g d m a ) 6 4 1 。最近含有三或三 个乙烯基团的交联剂也被研究，色谱结果表明，选用季戊四醇三丙烯酸酯 ( p e t r a ) 和三甲氧基丙烯酸交联制备的印迹聚合物对模板底物氨基酸衍生 物和其柱容量和选择性均优于e g d m a 6 5 1 。其它交联剂有二乙烯基苯( d v b ) ， 3 ，5 一二( 丙烯酰胺) 苯甲酸，n 一0 一二丙烯酰一l 苯丙氨醇，n ，n 一亚甲基二丙烯 酰胺，季戊四醇四甲基丙烯酸酯，三甲醇基丙烷三甲基丙烯酸酯( t r i m ) 。在 分子印迹制备中常用的引发剂是偶氮二异丁腈( a i b n ) 和偶氮二异庚腈 ( a b h n ) 。 1 2 3 2 引发方式和聚合方法 通常情况下，非共价m i p 制备过程中的聚合反应是通过自由基引发的，一 般以偶氮二异丁腈( a i b n ) 或偶氮二异庚腈( a b h n ) 为引发剂。常用的引发方式 有光照、加热、加压、电合成等。低温光引发应用最为普遍，其中又以紫外光 的能量适中而应用最多【6 6 1 。热引发也较为常见，但此法对热不稳定的化合物 不适用。 聚合方法有封管聚合、原位聚合、悬浮聚合、分散聚合、多步溶胀、表面 印迹、膜制备技术等多种，目前大多数制备采用的是封管聚合和悬浮聚合的方 法。 1 封管聚合 封管聚合操作简单、适用范围广，是目前使用最多的方法。它是将模板分 9 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 子、功能单体、交联剂和引发剂按一定比例溶解在惰性溶剂( 通常是氯仿或甲 苯) 中，然后超声波脱气，通氮气除氧，真空下密封，经热聚合( 6 0 。c 1 2 0 。c ) 或紫外光照射引发聚合一定时间可得块状聚合物。经粉碎、磨细、筛选等过程 获得合适大小的粒子，洗脱除去模板分子。 封管聚合方法制各的印迹聚合物具有满意的“记忆功能”，对模板分子有 良好的选择性和识别特性。合成的操作条件易于控制，实验装置简单，便于普 及。但此方法需经过特殊筛选等预处理手续。粉碎过程不可避免会产生不规则 粒子和大量过细粒子，粒子的不规则性会影响印迹聚合物的选择性和色谱柱 效，超细粒子使色谱柱柱压降明显升高甚至堵塞色谱柱，装柱前需反复沉淀倾 析除去，步骤费时、繁琐。并且经过沉降处理后可使用的粒子，通常仅占研磨 后聚合物的4 0 一6 0 ，产量较低。 这些问题促使分子印迹技术的研究有待进一步深入，以获得更满意的技术 改进或取代封管聚合的方法。在1 9 9 3 年，m a t s u i 等首先将原位聚合法引入 m i p s 的制备中，在色谱柱内直接合成m i p s 固定相，方法具有直接、简便的 优点。另外，为了适应传感器方面的应用，又发展了薄层和聚合物膜的m i p s 制备方法如相转移法、表面模板聚合等。 2 悬浮聚合 悬浮聚合是制备色谱特性良好的球形颗粒聚合物最简便、最常用的方法之 一。由于通常使用的单体是疏水性的，常选用水或强极性溶剂，这些溶剂会削 弱或破坏单体与模板分子的结合强度，极大降低功能单体与模板分子间相互作 用的数量与强度，影响聚合物对模板分子的识别能力。因此很难在水相中悬浮 聚合制备m i p s 。 为了克服水或高极性有机溶剂的干扰问题，m a y e s 和m o s b a c h e 6 7 1 提出以全 氟烷烃为分散相的悬浮聚合法，即在液态全氟烷烃中形成非共价印迹混合物乳 液，采用氟化的表面活性剂及其它含氟的表面活性剂作为稳定剂，光引发聚合 直接制得聚合物微球。这种方法可以控制微粒的大小和粒径分布，但不利于模 板分子的识别。 1 2 4 分子印迹聚合物在分析中的应用 分子印迹聚合物具有预定性( p r e d e t e r m i n a t i o n ) 、特定识别性( s p e c i f i c 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章 r e c o g n i t i o n ) 和l 实用性( p r a c t i c a b i l i t y ) 的特点，且表现出抗恶劣环境的能力、高度 的稳定性和长期的使用寿命，在很多领域都展现了良好的应用前景。 1 2 4 1 色谱分离 分子印迹聚合物用作色谱固定相提纯和分离手性物质是分子印迹技术早 期研究的一个重点，也是分子印迹技术进展最大的一个领域。 拆分合成药物一直是制药工业中的难题。目前市场上大约有5 0 0 种光学活 性药物，9 0 以外消旋体的形式出售。1 9 9 2 年美国食品和药物管理局( f d a ) 要求今后凡是新的光学活性药物都必须把光学异构体分离出来，分别测定其药 物动力学和毒理学的各项指标，这就给分离对映异构体技术提出了新要求。用 分子印迹技术制得的印迹聚合物做手性固定相，当模板分子为d 或l 构型对 映体时，m i p s 便具备了预定的对映体选择性，可用其作色谱的手性固定相用 于拆分外消旋体，从对映体的洗脱次序对其进行表征。例如，当用r 构型的 分子做模板，则s 构型的分子将先被洗脱，反之亦然。m i p s 用作手性固定相 己经成功分离氨基酸衍生物6 8 1 、氨基酸 6 9 】、氨基酸乙内酰脲【7 0 】、b 一肾上腺素 阻滞剂：心得安( p r o p r a n o l 0 1 ) 等1 7 。 另外，分子印迹聚合物用于非手性分子的识别分离也有很多报道。如 s e l l e r g r e n 7 2 峙艮道了以药物p e n t a m i d i n e 为模板的分子印迹聚合物，用此作为吸 附剂完成了对尿样中p e n t a m i d i n e 的提取、纯化、和浓缩，使之达到能够被直 接检出的浓度，z a n d e r 等人吲报道了以烟碱作为模板分子合成的聚合物，测 定口香糖中所含的尼古丁和尼古丁衍生物含量，得到了很好的分离富集效果。 同时，还有关于皋丸酮【7 4 】、胆固醇【75 1 、唾液酸【76 1 、巴比妥类化合物等分子印 迹聚合物用作模板分子的分离应用研究报告。 由于m i p 颗粒的尺寸的均匀性和孔径的均匀性受制备条件限制，在色谱分 离中的应用仍存在着很多问题，如柱效低，流出峰的拖尾严重，重现性差，限 制了其使用范围。 1 2 4 2 抗体仿生 将m i p s 作为抗体模拟物代替抗体或受体建立竞争分析法，称为分子印迹吸 附测定法( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds o r b e n t a s s a y ，m i a ) 。m o s b a c h 等【4 9 】首先用m i p 代替抗体在放射性免疫分析( r i a ) 测定中检测血清中的吗啡、茶碱、安定等 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 药物，取得了与单抗相似的交叉反应，与用多酶免疫测定技术得到的结果相当。 m i p s 模拟天然抗体具有很大的优越- 4 9 , 7 7 】：制备过程简单，不需实验动 物和免疫技术；稳定性好，可耐酸、碱、高温、高压环境及有机溶剂，且可回 收多次利用；可以作为自然界难以获得的抗体有用的补充，不会因生物降解受 到破坏。 1 2 4 3 固相萃取 固相萃取可从复杂体系中选择性的萃取所需成分，是分析检测中常用的样 品处理与富集方法。但常规的故乡萃取大多采用正相吸附、反相吸附和离子交 换的分离模式，对于目标样品仍存在选择性差、无法完全去除基质干扰等问题。 选用特异性好的m i p 为固相萃取剂，可以实现高选择性萃取分离，克服生物或 环境样品体系复杂、前处理手续繁杂等不利因素，为样品的采集、富集和分析 提供了极大的方便，可用于医药、食品和环境分析样品的制备，对于痕量分析 有重要作用。同时，由于印迹聚合物不受外界环境极性的影响，在有机相、水 相体系均可使用，与其它萃取过程相比，具有显著优势。 m i p 在固相萃取中的应用已有很多报道。s e l l e r g r e n l 7 2 】首次报道了以p e n t a m i d i n e ( p a m ，a i d s 病毒的抑制药物) 为模板制备的p a m m i p ，用作固相萃取 剂，可直接用于实际尿样中痕量p a m 的测量。m u l d o o n 和s e l l e r g r e n 等7 8 7 9 峙艮道 将阿特拉津( a t r a z i n e ，- r e 除草剂) 的分子印迹聚合物固相萃取剂用于实际 生物样品，并用反相色谱和酶联免疫分析法测定牛肝中阿特拉滓，结果表明， 未纯化的样品色谱测定的回收率为6 0 9 ，酶联免疫分析法的回收率为7 9 6 ， 而纯化后的样品，其回收率分别达到8 8 7 矛1 9 2 8 ，可见经过m i p 固相萃取， 准确度大大提高。z a n d e r 等【73 j 报道了以尼古丁为模板制备的n i c m i p ，用于固 相萃取分析戒烟口香胶中的尼古丁和尼古丁氧化物，得到了很高的回收率和较 好的重现性。m u l l e t t 等【8 0 1 将尼古丁m i p 用于固相萃取，并与积分脉冲洗提技术 联用，成功地测定了烟草中的尼古丁，检测限达到1 8l t g m l 。方法较液相色 谱不仅成本低、分析时间短，且灵敏度和准确度均较高。 目前关于分子印迹聚合物固相萃取( m o l e c u l a r l yi m p r i n t e ds o l i d p h a s e e x t r a c t i o n ，m i s p e ) 技术的研究表明m i s p e 是样品分离、纯化和富集的有效方 法。但是，关于m i s p e 的研究仍处于初级阶段，有待进一步的深入。 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章 1 2 4 4 生物传感器 近几十年来，生物传感器以其突出的灵敏度和特异性引起了广泛的关注。 生物传感器是由分子识别元件和信号转换器( 如电极、光极、场效应晶体管、 压电晶体、热敏电阻等) 所组成。其中，分子识别在传感器技术中起着关键的 作用。m i p 化学和物理性质比较稳定，又具有良好的分子识别能力，所以非常 适合作为传感器的识别元件。 分子印迹技术使得人们可以根据分析对象，进行分子设计，制各出相应的 分子识别元件，提高传感器对被分析物的选择性。将m i p 作为传感器的敏感部 件，然后通过各种电、热、光、质等手段转换成可测信号，用以定量分析各种 物质。目前己用m i p 膜传感器测定的对象有氨基酸衍生物、吗啡：除草剂、有 机溶剂、神经毒剂水解产物、金属离子等。t a n 等【8 l 】使用烟碱分子印迹聚合物 以石英晶体为载体，制备了对尼古丁有响应的尼古丁分子印迹传感器。该传感 器对水相体系中的尼古丁有强选择性和高灵敏响应，成功地用于测定了人体血 清和尿液中的尼古丁，检测限达n 2 5 x1 0 m o l l 。 虽然m i p 在传感器的应用上有巨大的潜力，但目前大部分报道的分子印迹 传感器响应时间较长，是限制分子印迹传感器发展的一个严峻问题。 1 2 4 5 催化剂 分子印迹聚合物的出现，使合成具有选择性催化性能的高分子材料成为可 能。分子印迹聚合物内的孔穴类似于酶活性中心，因此具有模拟酶催化作用。 通过选用适当的模板和功能单体在孔穴内可以定制出与底物结合的结合位点 和起催化作用的活性基团，这些基团以最佳取向在空间进行确定排列。 模板聚合物作催化剂时，如果用催化反应中的过渡态类似物作为模板，则 能制备出与有催化活性的抗体类似的有效催化剂。这种催化剂的优点是制备容 易，稳定性好。由于印迹聚合物中的活性中心具有不同的结合能力，其催化作 用更接近组装的多克隆抗体 综上所述，对于复杂体系中待测物的分析检测，样品的前处理是整体分析 方法中不可忽视的一个环节，往往影响分析的成败。一种理想的样品处理和制 备技术应是少用或不用溶剂、低成本、易操作、高效率、有选择性和适合于宽 中国科学技术大学硕士学位论文 第一章 浓度范围样品的分离。 自1 9 9 4 年s e l l e r g r e n 首次报道将分子印迹聚合物用于固相萃取，近年来相 继有一些相关报道出现。通常样品的制备都包括溶剂萃取，由于分子印迹的出 现j 可以用固相萃取替代，并且可利用分子印迹聚合物选择性富集目标分析物。 随着分子印迹技术发展和广泛的应用，m i s p e 技术将m i p 作为固相萃取吸 附剂用于复杂样品分析前的预富集和清洗，有着传统方法无可比拟的优点：不 但可以获得高度的选择性和亲和性，而且可以事先决定其选择性，聚合简单、 快速、大大缩短了预处理时间。同时，由于m i p 既可在有机溶剂中使用，又可 在水溶液中使用，故与其他萃取过程相比，具有独特的优点。在诸如低浓度环境 样品的分离富集，农药残留检测，环境中有害化学品的监测，生物体中药物含 量的检测等方面，m i s p e 有着良好的应用前景。必将吸引越来越多的研究者从 事这方面的研究和工作。随着生物技术、电子技术、合成手段和现代分析检测 手段的迅猛发展，分子印迹聚合物的制备、表征和理论体系将日臻完善，其应 用范围将更加广泛。， 1 3 本论文研究目的和工作内容 随着生命科学、医学、环境科学的迅速发展，烟碱对于人体健康的危害 越来越受到重视。因为人体头发、尿液、血液、唾液等中的烟碱含量与吸烟人 群的摄入剂量或非吸烟人群暴露e t s 的程度呈正相关关系，烟碱和其衍生物 常用作衡量烟草对人体健康的影响程度、区分主动吸烟者和被动吸烟者的重要 生物标记物。因此，研究可快速、准确测定烟草以及生物样品中烟碱的分析方 法具有重要的意义。 但由于烟碱大多存在于复杂基体中且含量较微，如何对它进行有效的分离 和检测成为突出问题。现阶段对烟碱的研究技术主要依靠测定过程中的高灵敏 度检测，对复杂样品中烟碱的提取富集测定方法研究则较薄弱，一般仍沿用传 统的前处理方法，选择合适的样品前处理方法确保分析结果的准确可靠显得至 关重要。 本论文采用与人类密切相关的烟碱分子作为模板分子，使用紫外光谱、 中国科学技术大学硕士学位论文第一章 x 一射线光电子能谱和1 h 核磁共振波谱研究了烟碱分子和功能单体甲基丙烯酸 之问的结合机理和识别位点，制备出对烟碱具有特定识别选择性的分子印迹聚 合物，并将其用作固相萃取吸附剂，对分子印迹固相萃取过程中，影响固相萃 取效果的各方面因素进行了探讨和优化。将优化的m i s p e 方法应用于选择性固 相萃取吸烟者和不吸烟者的头发样品，实现了对头发中烟碱的有效纯化、富集。 再选用反相离子对高效液相色谱进行定量分析，可实现头发样品中微量或痕量 烟碱的准确检测。 本论文建立的准确测定人体头发中烟碱的新方法，对于研究生物样品、环 境样品等复杂样品中烟碱的分析方法、评价烟草烟气暴露量对人体健康的影响 程度，具有重要意义。 由于印迹聚合物在模板选择方面的广泛性，只要改变合成过程中的模板分 子种类，便可制各出对不同物质具有高度特定选择性的固相萃取填料，因此可 以针对不同的样品体系进行m i s p e 研究，有着广泛的应用范围。 参考文献 1 j a n s o nc ，i n t j t u b e r c u l o s i sl u n gd i s e a s e ，2 0 0 4 ( 8 ) ：510 513 【2 m a n n i n od m ，h o m ad m ，r e d ds c ，c h e s t ，2 0 0 2 ( 1 2 2 ) ：4 0 9 4 1 2 3 】b o n i t ar ，d u n c a nj ，t r u e l s e nt ，j a c k s o nr t ，b e a g l e h o l er ，t o b a c c o c o n t r 0 1 ，1 9 9 9 ( 8 ) ：1 5 6 1 6 1 4 l a wm r ，m o r r i sj k ，w a l dn j ，b r m e d j ，19 9 7 ( 315 ) ：9 7 3 9 7 9 5 m a y e ra s ，n e w m a nj s ，r e s p i r p h y s i 0 1 ，2 0 0 1 ( 1 2 8 ) ：3 1 1 6 】r i v e r ol r ，p e r s s o nj l ，r o m i n ed c ，i n t j h y g i e n ee n v i r o n h e a l t h 2 0 0 6 f 2 0 9 ) ：1 1 4 7 h a r v e yh d ，f l e m i n gp ，p a t t e r s o nm ，i n tj e n v i r o n h e a l t hr e s ，2 0 0 2 ( 1 2 ) ： 2 6 9 2 7 5 8 】w