（皮革化学与工程专业论文）生物材料用胶原蛋白的交联及其表征.pdf

腭川太学硕十学位论文生物材料用胶原蛋白的交联及其表征皮革化学与工程专般硕士生：周磊指导教师：李志强现今生物材料懿研究能否成渤，关键之怒理想三维结构支架的构造。生物材料支架能为细胞生长提供依附的载体，并能促进细胞的生长，最终形成具有一定功能和形态的缀织或器官。因此，寻找熊充分发挥组织再生潜力的细胞终基矮秘精是骚究静孩惑痰容。胶愿蛋白具有鼠好的生物和化举特性。它来源广泛；具肖低抗原性、良好的生物桐容性、生物可降解性且在体内一定时间内分解成易于吸收的小分予和短豉；篡蠢较驽熬弼渗鳃洼，宫熊霆多容易改镶，与其它生物涟娃缝分程莛使用，熬有协同效应，易于细胞程胶原材料表谣增殖生长。缀过多年的生物和临床应用，人们发现胶原蛋白作为生物支架材料的不足，这严重制约着胶原蛋白良好特性的发挥。人鳃发现，胶艨蛋自力学强度不大，不熊承受作为体内织织器富豹力学环境静簧求；溶簿麓麓狡原蛋自，不易固定；垒镌降解速率抉，不易控制。这些都与胶原蛋白相对较低的分子鬣和粒径有关。基于对以往已经_ 陂用在胶原蛋囱的各种物理和化学交联改性方法的总结，本论文灏矮一静应瘸农羧滠蛋童主豹菠鍪交联雾l y 一骧代丁肉蘸，采辩天然胶原鬣自进行硫代交联改性。以新鲜猪皮为初始原料，经枯草秆菌中缝鬣白酶a s 1 3 9 8 两步( 抑活) 热溶法提取胶原蛋白，在交联剂的作用下，发生化学改性，聚绞的磷究了不同酸溶液、不同眯唑用餐产生的不同p l 秘溶液环壤和不丽改襁湿度对骏簌缀自物理纯学链矮静影晌。包括对胶藤猿自的分子蠢、粒径大小殿分布、蛋白纤维形貌、氨熬酸组成变化和蛋白凝胶热机械性能的袭镊，还有蛋白膜材料的袭颇亲水性、力学性能的研究，以及蛋白改性后可纺性的考察。实验结果表明，此交联方法能够对胶原蛋白进行较为明鼹的改性，平均分一一型i 堑堡主鲎焦堡塞子量和最高分子量分别提高了2 3 倍和i 7 倍，育将近一半的蛋自其商高分子量，量分予量呈不连续分布，易于腔原蛋白的税械往能的提高。稠应的，随着胶原蛋自侧向交联和线性化排布的发生，在粒径和纤维彤虢方面都发生了显著的变化。蛋自膜材料良好的亲水性能不变，且膜的断裂伸氏率显著提高。实验表明，乳酸溶液环境不能发生的交联改性，能够在醋酸溶液中很好的进行，在中性p h条件菠圈内+ 咪唑的用鼍对胶蹑蛋自改性的影响最大，温度的影响很小。本论文进行了y 一巯代丁内醮交联剂的台成，通过红外光谱和接触角实验，表明其与标准物较好的吻合。本磷究还列改性产物进行r 纺丝实验，表明改性后的蛋白舆有了以往没有的可拉丝性能，但改进程度岗有限，霰进一步研究。关键词：胶原蛋白；y 硫代丁内聪；硫代改性；分予壁分东；非变性大孔s d s p a g e ；可纺性鼹川i 大学硕士学位 宅文m o d i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft h ec r o s s l i n k e dc o l l a g e np r o t e i nf o rb i o m a t e r i a l sl e a t h e rc h e m i s t r ya n de n g i n e e r i n gp o s t g r a d u a t e ：z h o ul e is u p e r v i s o r ：l z h i q i a n ga b s t r a c tn o w a d a y st h ec o n s t r u c t i o no fa ni d e a ls c a f f o l dw i t ht h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r ew a so n eo ft h ek e yn c m r sw h e t h e rb i o m a t e r i a l sc a r lb es u c c e s s f u l l yd e v e l o p e d t h eb i o m a t e r i a ls c a f f o l dc a ns u p p l ya d h e r e n tc a r r i e rf o rc e l lg r o w t h i tc a l lp r o m o t ec e i lg r o w t h ，a n df i n a l l yf o r ms p e c i a lf u n c t i o n a la n dm o r p h o l o g i ct i s s u eo ro 辖a n ，t h e r e f o r e ，i tw a st h ec o r er e s e a r c ht of i n dt h ee x t r a c e l l u l a rm a t r i xm a t e r i a l st h a th a v ed e v e l o p e dt i s s u er e g e n e r a t i o np o t e n t i a l c o l l a g e np o s s e s s e dt h eg o o db i o l o g i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c s ，t h es o u r c eo fc o l l a g e nw a sw i d e 。c o l l a g e nh a dl o wa n t i g e n i c i t y , g o o db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t ya n dd e g r a d a t i o n ，t h e nd e c o m p o s e di n t os m a l lm o l e c u l e sa n ds h o r tp e p f i d e st h a tw a sb e n e f i c i a lt ob o d ya b s o r p t i o na f t e rs o m et i m e t h ed i s s o l u b i l i t yo fc o l l a g e nw a sg o o d ，a n df u n c t i o n a lg r o u pw a sm o d i f i e de a s i l y w h e nc o l l a g e nw a sd i s 翻a y e dw i t ho t h e rb i o l o g i c a la c t i v ec o n s t i t u e n t ，i th a ds y n e r g i s t i ce f f e c ts ot h a tc e l lc a l le a s i l yp r o l i f e r a t eo nt h es u r f a c eo fc o l l a g e n a st h eu s eo fb i o l o g ya n dc l i n i cf o rm a n yy e a r s ，p e o p l ef o u n dt h ed e f i c i e n c yo fc o l l a g e na sb i o l o g i c a ls c a f f o l dm a t e r i a l s t h i sd e f i c i e n c yr e s t r i c t e ds e r i o u s l yd e v e l o p m e n to fc o l l a g e nw i t hg o o dc h a r a c t e r i s t i c s p e o p l ef o u n dt h a tc o l l a g e nw a s n ts a t i s f i e df o rm e c h a n i c a le n v i r o n m e n to fb o a yo r g a na si t sl o wm e c h a n i c a ls t r e n g t h t h ec o l l a g e nw a s n te a s i l yb ef i x e da n dt h er a t eo fb i o l o g i c a ld e g r a d a t i o nw a st o or a p i dt oc o n t r o l ，a l lo f t h o s ew e r er e l a t e dw i t hr e l a t i v e l yl o wm o l e c u l a rw e i g h ta n dd i a m e t e ro fp a r t i c l e w i t ht h es u m m a r yo na 1 1k i n d so fp h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o di nt h em o d i f i c a t i o no fc o l l a g e nb e f o r e ，i nt h i sp a p e r , an e w s t y l ec r o s s l i n k i n ga g e n t ，y t h i o b u t y m l a c t o n e ，u s e di nm o d i f i c a t i o no fn a t u r a lc o l l a g e nw a sa d o p t e d 。f r e s hp i g s k i na st h er a wm a t e r i a l ，c o l l a g e ne x t r a c t e db yh a yb a c i l l u sn e u t r a lp r o t e a s e四川人擎硕士学位论史a s1 3 9 8t w o s t e p ( i n h i b i t i o no fp r o t e a s ea c t i v i t y ) h e a td i s s o l v i n gt e c h n i c sw a sm o d i f i e db yt h ec r o s s l i n k i n ga g e n t 。t h ei n f l u e n c i n gf a c t o r so np h y s i c a la n dc h e m i c a lc h a r a c t e ro fc o l l a g e n ，d i f f e r e n ta c i de n v i r o n m e n t ，d i f f e r e n tp ha d j u s t e db yd i f f e r e n ta r n o m l to fi m i d a z o l e ，a n dd i f f e r e n tm o d i f i c a t i o nt e m p e r a t u r ew e r es t u d i e d a tt h es a m et i m e ，m o l e c u l a rw e i g h to fc o l l a g e n ，d i a m e t e ra n dd i s t r i b u t i o no fp a r t i c l e s ，e x t e r i o ro fp r o t e i nf i b e lc o m p o s i t i o nv a r i a t i o no fa m i n oa c i da n dt o k e no fh e a tm e c h a n i c a lp r o p e r t yo fc o l l a g e n ，s u r f a c eh y d r o p h i l i cp r o p e r t yo fp r o t e i nm e m b r a n em a t e r i a l ，a n ds p i n n a b i l i t yo fm o d i f i e dp r o t e i nw e r es t u d i e d t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec o l l a g e np r o t e i nc s i tb em o d i f i e do b v i o u s l yw i t ht h i sc r o s s l i n k i n gm e t h o d t h em e a nm o l e c u l a rw e i g h ta n dh i g h e s tm o l e c u l a rr a i s e2 3t i m e sa n d1 7t i m e s ，a n da l m o s th a l fo fp r o t e i nw e r ea t t r i b u t e dt o瓢g hm o l e c u l a rw e i g h t st h a tp r e s e n ta s y n e c h i ad i s t r i b u t i o n ，a n dw a sc o n t r i b u t e dt oe n h a n c e m e n to fm e c h a n i c a lp r o p e f t yo fc o l l a g e n a c c o r d i n g l y , a st h ec o l l a g e nl a t e r a l l yc r o s s l i n k e da n dl i n e a r i z e d ，d i a m e t e ra n de x t e r i o ro fp a r t i c l e sc h a n g e do b v i o u s l y g o o dh y d r o p h i l i cp r o p e r t yo fp r o t e i nm e m b r a n em a t e r i a lw a sn o tv a r i e d ，a n dt h er a t eo fb r e a k i n g 赣o n g a f i o nw a si n c r e a s e de v i d e n t l y t h ee x p e r i m e n td a t as h o w e dt h a tc r o s s l i n ka c t i o nw a sa b l et og e n e r a t ei na c e t i ca c i ds o l u t i o nr a t h e rt h a ni nl a c t i ca c i ds o l u t i o n 。ht h er a n g eo fn e u t r a lp h ，t h ee f f e c to ft h ei m i d a z o l ea m o u n to nt h em o d i f i c a t i o no fc o l l a g e n w a sm o s tr e m a r k a b l e ，r e v e r s e l y , t h ee f f e c to ft e m p e r a t u r ew a sl i t t l e i nt h i sp a p e r , t h es y n t h e s i so fy m e r e a p t o b u t y r o l a e t o n e ，t h ec r o s s l i n k i n ga g e n t ，w a sc a r r i e do u t 。a n dt h e ni tw a si na g r e e m e n tw i mt h es t a n d a r di nt h ec o m p a r i s o nb e t w e e nt h ei rs p e c t r u ma n dc o n t a c ta n g l ee x p e r i m e n t s s p i n n i n ge x p e r i m e n tw a sa l s oc a r r i e do u te l e m e n t a r i l y i ts h o w e dt h a tt h em o d i f i e dp r o t e i np r o c e s s e dp a r t l ys p i n n i n gp r o p e r t yt h a tc o l l a g e nw a s n tp r o v i d e dw i t hb e f o r e b u tt h ee x t e n to fm o d i f i c a t i o nw a sl i m i t e d ，i tn e e d 翘* d l e rs t u d y k e yw o r d ：c o l l a g e n ：y t h i o b u t y r o l a c t o n e ；t h i o m o d i f i c a t i o n ；m o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n ；n o n d e n a t u r i n gm a c r o p o r o u ss d s - p a g e ；s p i n n a b i l i t y四川人学硕l 学位论文i 前言1 1 课题提出的背景现今生物材料的研究，特别是组织工程化人： 器官的研究能否成功，关键之一怒疆想三缍绪掏支黎钓鞫逡。生物裁瓣支繁筏为绥羹羹生睦疆供寝辫沟载体，并能促进细胞的生长，最终形成擞有一定功能年形态的组织或器官。因此在组织工稷支架研究中，寻找能充分发挥组织再生潜力的细胞外基质材料是研究的棱哇 内寮l l l 。胶愿凝自，由于蠡囊 茏良懿他学、生耘特性，在生物、医学等诸多颁域有着广泛豹斑用。胶原豺料已经应髑在了人工皮歇、a 工盘管、a 工尿道、人工心脏瓣膜、植入人工牙、止血海绵、美容外科等生物医用材料中【2 】，创造燃了极大的生物和经济份馕。但是，如何使改性后的胶鼹蛋自，满足生物豺释麓至组织工疆翱精对基覆瓣簧求，或秀菸鼯豹缁德努蕊矮李孝精，弼怒今后科学研究工作的重瓣课题。 ，2 羧原翡结构胶原主要存程予动物的皮、骨、软骨、牙齿、肌腱、韧带和血管中，是结缔组织极重要的结构蛋白质，超篇支撑器官、保护机体的功能。胶原是哺乳动物体内食量最多的鬣自质，占体内獗自质总量的2 5 一3 0 ，糨当于体重的6 1 3 】。在垒镌体内，最鬻藏韵三耱蔽凝疑 鍪、嚣激、疆委 菝琢，飘疆主要由l 垒菝原构成，软骨由姒捌胶原构成，皿管、皮肤和其它软组织、器官的间质中同时含有l 烈和型胶原，其中i 型胶原在生皮中禽量最丰富。其它的类型的胶原，妇存凌予基膜中豹垄荻琢释缀麓努基矮孛瓣v 型黢鼹，在耋然雾孛枣在较少。i 型皎原由三条螺旋肽链缎成，含两条n ( 1 ) 链，一条a ( ) 链，a( i ) 链和n ( i i ) 链只是在一级结构上有微小差异。胶原分子中多肽链的基本版黪是g 坤- - x - - y 恩期结 鸯，其中甘氨酸( g l y ) 占l 站，蹿氨酸( p r o ) 和羟精氨酸( h y p ) 约占2 2 。囊予膝氨酸稻羧脯氨酸瞧喏环豹存在，使褥获覆多肽链只能形成左乎螺旋。在簿一个链端有两个短的非螺旋( e x t r a h e l i c a l ) 端肽，它既没有g x y 的重复结构也没有三螺旋构象。它们占分子的2 ，喇且对纾维豹蠡缓装有美键豹非爱。然嚣，逶过黢瓣孛熬藏氨酝襞伍酶，枣黪定瓣赣氨酸嗣羟赖氨酸残蕊氧化脱去氨罄形成共价交联，进而使纤维结构稳定。这种交联对胶原分子的有规律的超分子聚集具有决定性意义。s c h m i t t 模型提出，按巴型态鲎塑圭兰堡堡墨照四分之一错列排列| 3 勺原胶原分子之间，可以在蕻头、尾部熬迭的区域通过赖氨酸残蘩器形成一对镯囱荚债交联 4 l ，可由在魄镜下蕊察天然胶舔靛疆嚷襁闻的周期横纹得到佐证。胶原的分子不仅是侧向聚集，而且有轴向延伸。不同组织中的胶原，其化学组成和结构都有麓异，可以分成纤维状胶原( 在生皮及瓢髓中) 、玻璃状菠器( 在繁缀缓戆嚣索) 、较嚣矮黢鼷( 在较嚣中) 等j l 种。胶原纤维在大多数组织中，有6 7 n m 轴向同期的( 在脊椎动物的皮中时6 5 n m ) ，而且在横向上，为类圆形。纤维的直径内组织的类型和发育的程艘决定，脊搬动物从2 0 至5 0 0 n m 。从鹇胚胎的跟腱、皮和角膜中分离的完整纤维，长度觚l 至1 0 0 咎r a 。在维织中纤维爨缀织静撬藏行为和翔侮控镪纤维静赢径与长度鼹当前研究的黛耍问题1 5 】。1 。3 黢漂蛋自在生物毒孝料领域审的应用胶原蛋白具有优良的生物相容性和低抗原性，在烧伤、倒伤、美容、矫形和组织修复等方面具衡广泛的应用价值。根据不同的用途，胶原被制备成为胶藤注射渡、止血粉刹、心脏瓣膜、皮默移植用海缀、手术线纤维、组织工摆支絮末| 辩稍久工皮获等。在烧、剑臻涂疗孛，觚受觖中鬟褒翡较藤，经过冷冻干燥制成的胶原膜被用于创面覆盖，作为自体皮肤细胞的载体和支架，可以防止感染、促进上皮细胞的增生和刨伤的愈合。在美容、矫形治疗中，胶原可以用于友获及缝绞嫒损懿修复。注入熬羧爨苓经曩露支撑窝续充终震，恧显还筑诱导宿主细胞、毛细血管的生长和成纤维细胞的增殖，促进组织霆建。胶原海绵用于创伤止血，能诱导虚小板附着、激活血液凝固因子，有优良的止血和促进创伤迅遴敷合的功效。医用胶照的话l 备的主要爨的是除去组织中的菲胶愿成分彝抗蒙糍艨，获褥嵩筑度的胶原簸、胶原纤维域胶原组织| 6 1 。对胶原的应用，因使用目的不同而对其结构的要求是不间的。例如，可促进生物体软组织生长的注射性胶原，应是保持胶原分子结构完艇性的可溶蚀胶器。这耱蔽原在律瀑、俸滚条搏下簸重薮形残与天然菠簸辐囊羹豹缍维毒鸯蒙，与生物体细胞和其它结缔组织成分保持正常的相置作用。在组缀工程中，胶豚形成的薄膜、海绵、凝胶、管状物等一般要求其保持一定的力学机械性能，同时这些薄膜、海绵、凝胶、管状物在体外及薪生组织缨魔产生的胶器酶的作用下，易毅缓毂进入体内代谢。为了避免耢辩在体悫辩解过快 7 1 ，繇不上俸内缁臌和组织生长繁殖的速度，除了用醛交联胶原外，还蒙求胶原的分子量尽可能大，2一婴删奎堂堡主兰垡媲塞医学胶原制品一项爨要的技术嫩题就是控制胶原蛋自在人体内的吸收率。用于裁 窜食晶脏嚣骥豹承解黢蒹，为了洼蔽漂骥懿有一定熬强壤，氇要求永瓣胶原保持较大的分子量。因此应根据胶原应用得不同领域，对蕻进行相应的改性和修饰。在亵憝培莠祭律下，多数绸藤是毒穗璧簌羧莲懿，欲傻缨藏生长、分辱艺、增殖避而代谢，需疆有一个结合位点。胶原分子能提供这样的结合位点。例如，成纤维细胞在胶原上生长时，代谢和形态与熟在体内生长极为相似。因此，胶原分予可作为组织修复的支架材料。此外，幽于人们认识划胶原基质熊键遴薪缓织豹生长，就稳建了久工缩簸舞基矮，以健送入工皮的铡造。y a r m a s 镣久首先用胶原一硫酸软骨素多孔交联的支架成功地制得人工皮肤。据临床报告，这种人工皮肤能治疗严重烧伤的瘸人【8 l 。此外，h u y n h 等人程体外，利用l 型胶禚薅终褥缀慈萋予三续缝擒懿瓣中，可裁成舔簿豹缀您姊润矮支架，垮l 鍪孛皮胶鞭制成的接枝物( d = 4 m m ) 毽台到宿主组织上，从而擒供一个重建功能化血管的支架。三维胶原支架可程体内生物降解，并且由于飘有利于细胞吸附的大比袭匿积，便于巍管的形成，阿瘸作人造搬餐、心脏瓣膜壤细胞移穰装嚣1 9 l 。1 4 生物材料用胶原蛋白的优缺点胶原蛋白是由动物体内合成的生物高分子，是人和脊椎动物体内含鬣最多、分毒矮f “夔蛋白葳，传为生懿耱攀毒窀豹谯熹蠢：a 具有低抗原性；b 良好的生物相容性，因体内组织的细胞外基质的骨架就是由胶原臻白构成；c ，生物可降簿健，能够在髂内一定时闻斑分解藏易于嗷牧豹夺分予帮短默；d 具有较好的可溶解性；e 寓能团多，容易改性7 1 ；f 。与其它垒锯溪毪缝分奁一起使建，其鸯镑霜效应，荔予囊魔在获琢糖精表面增殖嫩长；g 来源广泛，占脯乳动物体内总蛋白质的约1 3 。键是，胶原蛋黩也舂其作为生物韦孝料的不足：a + 力学强度不大，不能承受作为体内组织器官的力学环境的要求；b 胶原蛋白易于发生胶化反虑，不利于胶原材料发挥它在体内的生物功能；3四川大学颂士学位论文e 溶麟蓐豹胶原蛋囊，不易固定，不适合用 髻生物支絮= 孝瓣；d 生物降解速率快，不易控制。不过，在医用材料领域，胶原鬣白还是现今优先采用的生物高分子。1 。5 胶嚣鬣鑫生物毒考糕的发暴趋势使用胶原蛋白作为生物材料，主要是作为某个组织的支架材料，因此对其高分子量、力学性能、生物降解行为( 即生物保留时间) 和相应的生物相容性、缨胞毒瞧鄂提出了严铬黝要求，懿装黢厩耪料达不到这些基本鹣辇标，它作为生物材料的生命力是有限的。关于力学性能，崔组织环境中，支架材料经常处于复杂的力学状态。采用现成的组织材料，比如牛心包，有其自身的优势，它由许多层薄片组成，而每层毒不同豹取向方淘，带来了它奁警嚣主蘸力学套囱同毪。毽怒，实际应蠲豹效果并不瑗想。采用蛋囱纤维，可以进行需要的化学改性，调熬它的生物、化学指标。现在的交联胶原蛋白材料，有的以合成离分子作纤维材料，在其外包覆有胶裁爨鑫，虽然农甥簸奉| 耧数搜缝霹鞋渍足，毽是经过一段不长的时淘，随着胶原的降解，合成离分子对生命体的细施毒褴和生物相容髋麓等阔题郡念暴露出来。若以纯胶原为纤维材料，如果交联程度低，则分子掇较小，强度不够，反之，如果箍单的提高交联度，褥由交联剂辩来的细胞毒憔无法去除，墩不麓穰好豹斑矮子实舔。这成戈了一令矛蜃豹两个方翟，是骞滤遗霹交袋糗瑷的深入研究，找到解决的办法。关于擞物降解的保留时间，某些幼物体材料，如将猪皮用作组织工程材料，发生有蔽鹣醛簿，终为生秘支架接瓣，在体痰生猕降壤霹阗豹不同要求，只蠢通过交联潋性来达到调节降解速率的目的。关于材料的细胞毒性的问题，主要是由于交联剂引入新的共价交联造成的。一方蕊，如果使用本身必膏生物毒性的交联剂，那么交联反应臌的洗脱成为必要豹步骥，可这往往氇怒魄较难瑷完全骰嚣豹。豫莱捷麓本身怒无毒洼豹交鞭剂来交联胶原蛋白，胶原材料的表稍和在降解产物中都会可能产生毒性，这就和交联的机理密切相关，要看交联剂给胶原蛋白引入什么样的交联键。无论鼹双氧毽还怒s c h i f f 碱的交联，降鳃爨罄会产生一定鹣毒健。关于生物相容性，如果材料保留绝大部分的胶原结构，一般能够具有较好的生物相密性的。4一四删查兰! 塑主兰垡熊塞绦一毫所述，交鼗剡的选择或戈关键，它溅麓够绘胶原渗来足罄大了力学强发，又可隧满足生物材辩对缁腿毒往翻降解产物的要求。潋双硫键为铡，在动物体内的多种多样的生物酶中，对双硫键有还原作用的很少，而且动物体内自身合成的蛋白质交联结构中，双硫键也占有很大的比例。我们设想能够向胶原蛋蠢中引入一s s 一结秘豹交联键，寻求溃是查凌爱毒孝睾毒黪交联条馋，滋孬笈够用束纺丝，编织届，用作生物支架材料。1 6 攀令胶原蛋麴的 芝学改性方法1 ，8 改性方法的类聚主要分为两种一共混改性和交联改性共混改性，可以有效的改善胶原蛋白材料易受体内胶原酶降解的作用，且g l 入了毅熬耪精、鞭敬莲戆，援懑了它豹力学强度，鲡，p m m a 、麦聚耱等。近期，清华大学冯庆玲教授主掩的“国家8 6 3 项目”睃原基硬组织修复材料的仿生制各及廊用。就是采用了纳米级一羟基磷获石胶原聚乳酸( n a n o - h a c o u a g e n p l a ) 三元焚聚物翅佧三缳多孑l 夤支絮毒孝辩，和天然嚣撩出，猩主要的组藏釉微结构上其有相钕性，程细胞培养和动物实验中，擞示了材料的生物活性。一周内，在支槊材料中，有成骨纤维细胞的粘附、生长和增殖，达到诱导组织再生( g t r ，g u i d e dt i s s u er e g e n e r a t i o n ) 的目的【l0 j 。但是总镄上说，枣予共漉搴| 粒懿多稳、多錾努，螽鲶疆霾难，大多舞会豢亲程餐缝熬问题和难以去除的生物毒性，例如钙化、表面凝血等。交联改性，在胶原蛋白分子内和分子间，通过某些交联方法引入共价键的交联，在绦整大部分获愿蛋自络稳戆霹黠，掇舞蛋白缍维豹力学性能和纯学稳定髓，控制降解速殿，并且使胶艨蛋自作为擞物材料的优势继续存在。由于此种方法的交联剂用黛少、成本低、方法简便，应用前景很广阔。 s ，2 黢漂蛋白交鼗改性方法懿磷究臻获这里主要叙述化学交联剂改蚀：( 1 ) 戊二醛( g l u t a r a l d e h y d e ，g t a )戊二醛是最鬻掰豹交联蓑，在分子藤影簸交联，霹以绘蔽藩蛋鑫撵傲疆褰的弹性模量，能够达到5 0 一6 0 浆帕”，分子量提高，生物相容性良好，但是它的细胞毒性的问题始终无法解决。塑型查兰婴! ：兰篁笙兰( 2 ) 二亚氨基酯类( d i i r n i d o e s t e r s )如使用d m s ( d i m e t h y ls u b e r i m i d a t e ，辛二亚氨二甲基醚) 和d t b p ( 3 。37- d i t h i o b i s p r o p i o n i m i d a t e ，双硫二丙二亚氨甲基醚) 作为胶原蛋白的改性交联剂，d m s 处理的胶原收缩温度提高了1 2 。c ，达到7 0 * ( 2 d t b p 处理的提高了2 2 。c ，达到8 0 。c 。虽然d m s 和d t b p 带来胶原的交联密度较d t a 的小，不过可能带有双硫键的d t b p 能够比d m s 与组氨酸产生更多的交联，从而收缩温度更高“2 1 。在r a j a r a m 等人的既往研究中发现，与未改性胶原蛋白膜材料的力学性能相比较，在g t a 、d m s 和d t b p 三者各自适宜的交联条件下得到的改性胶原蛋白膜，抗张强度从原来的4 2 m p a ，分别提高至1 2 4 m p a ，5 4 m p a 和9 5 m p a ，但伸长率从原来的5 6 ，分别降低至3 2 5 ，5 2 和3 5 【j 3 】。因而改性后的蛋白材料，更加硬而脆，还需要更进一步的研究改进。( 3 ) 己异二氰酸酯( h e x a m e t h y e n n ed i i s o c y a n a t e )己异二氰酸酯的交联材料具有细胞毒性问题i l ”。( 4 ) 京尼平( c j e n i p i n ，环烯醚萜类)是首先用来交联的无毒性的蛋白交联剂。h s i n g - w e n 在这方面的研究发现，使用京尼平作交联剂固定牛心包，可以形成稳定的生物相容的改性胶原材料，且细胞毒性明显低于戊二醛和环氧交联产物。比较交联前后的力学性能变化，京尼平改性的材料，相同拉伸应力下的伸长率显著提高( 大约3 倍) ，但断裂应力几乎没有变化。而且反应机理不明，有蓝色产物生成【15 1 。( 5 ) 双碳化二亚胺类如e d c ( 1 - e t h y l 一3 一( 3 一d i a m i n o p r o p y 0 1 ) - c a r b o d i i m i d e ，1 一乙基一3 ( 3 一二甲丙氨基) 碳化二亚胺) 可与氨基发生反应，活化羧基，交联效果明显，但不能在水性条件下反应，抗酶降解性差，有细胞毒性，易钙化【”】。( 6 ) 谷酰胺转氨酶( t r a n s g l u t a m i n a s e )b r o w n ，e m 和t a y l o r ，m m 等人研究其对明胶的作用发现，作为酰基供体的谷酰胺转氨酶与作为酰基受体的级氨基酸之间发生酰胺转移反应，形成一( y 一谷酰胺) 赖氨酸的交联结构，交联效果明显，熔点达到9 0 以上，粘度提高，具有生物相容性 1 7 1 18 1 。同时，y o s h i h i r on o m u r a 也采用此交联剂对鲨鱼i 型胶原进行改性，发现变性温度较未改性的胶原提高了2 【l9 j ，但缺少细胞毒性和分子量的报道，且成本较高。( 7 ) 物理交联塑业奎兰堡= ! 三兰堡丝苎物理交联，不使用交联剂，也不存在交联剂带来的细胞毒性的问题，但是，现有技术产生的交联效果不够明显，交联度低且不均匀，力学强度差。例如：紫外光照射、高温脱水、光敏剂氧化交联等方法。( 8 ) 含硫化合物：蛋白质分子中二硫键起着很重要的作用，如角蛋白就是由于含有胱氨酸这样的双硫键，而使蛋白质具有极高的化学稳定性和良好机械性能【2 。正是由于二硫键的稳定性，蛋白质分予才能保持自己的结构，保持自己的生化特性。因此，人们开始考虑利用交联二硫键来改善胶原【2 ”。在n i c o l a sf l 的研究工作中，较早的提出了对胶原蛋白进行硫化改性的研究，他提出了一种由胱胺( c y s t a m i n e ) 与两倍的丁二酸酐( s u c c i n i ca n h y d r i d e ) 反应，合成所需的交联，n ，n ：双丁二酰胱胺( n ，n ! d i s u c c i n o y l c y s t a m i n e ) 。在咪唑的参与下( 与合成交联剂两端的羧基发生缩和，脱去一个水，使之活化) ，合成的交联剂与胶原的氨基( - - n h 2 ) 作用，发生交联。最大巯基接枝量达到o 3 i m m o l g ( c o l l a g e n ) 口”。与g t a 改性的胶原相比，经硫化改性的胶原能够更好的抵抗大多数酶的消化作用( 如胶原酶) 。但胰蛋白酶例外，在该酶作用下，硫化改性胶原的降解速度明显大于g t a 改性的胶原，抗张强度仅有了g t a 改性胶原的一半【2 ”。n o r i h i s ay a s u i 也于2 0 0 3 年报道了这方面的研究工作，采用p e a s ( n 一 ( 2 - p y r i d y l d i t h i 0 )e t h y l 】4 a z i d o s a f i c y l a m i d e ，n 一【( 2 一吡啶双硫) 乙基1 4 叠氨水杨酰胺) 作为硫化胶原蛋白的交联剂阱】。但缺少对上述两种交联剂和交联产物的毒性分析、氨基酸分析。1 7 硫代改性生物材料的研究现状作为酰基的供体，硫酯已经广泛的用于生产酯类产物上。譬如，使用y 一硫代丁内酯( y - - t h i o b u t y r o l a c t o n e ) 向1 一丁醇引入巯基瞄j 。近年来，m a l i n tg u s t a v s s o n 和p e r vp e r s o n 利用y 一硫代丁内酯对糖进行选择性酰化。作为酰基受体的x g o ( x y l o g l u c a no l i g o s a c c h a r i d e s ，木葡聚糖寡糖) 在c a l b ( c a n d i d aa n t a r c t i c a l i p a s e b ，念珠菌南极脂肪酶b ) 的催化下( 在反应过程中，硫代丁内酯的环装结构被打开) ，与作为酰基供体的y 一硫代丁内酯( yt h i o b u t y r o l a c t o n e ) 发生选择性酰化反应，生成带有活性巯基的糖分子。改性的x g o 在x e t ( x y l o g l u c a ne n d o t r a n s g l y c o s y l a s e ，木葡聚糖内反葡基转胺酶) 的作用下，催化交联成高分子量的木葡聚糖，进而得到一个多糖的网状解聚物。最终改善了纤维素材料的表面性质曙6 j 。通常情况下，因为胶原与壳聚糖有着诸婴型查黛堡主堂笙丝塞多相议酶姆| 琏，两使韭t l 窜鼹在壳聚犍一匕瓣交联改毯剡，有应用在茨照上的可熊。为了褥到一种替代g t a 交联改往黢爨的生物活性树辩，k u f i m o t o 采用经碱洗和表面脱水的牛皮，在咪唑参与下，岛y 一硫代丁内酯在室温下进行交联改性1 2 7 ，改性濂程见图1 1 。y 一硫代丁内酯，又名4 ，5 一二氢2 一( 3 h 卜一嚷吩黥，蓍免在繇蹲及蘑菇霉咪孛发瑗黪| 2 瓣，该交联麓已蔌涯饔无毒萑。骨褊旦脒旦粞川+ 吸旦一卜k s “圈1 1 牛瘦硫代改性流程承纛图f i g 1 1s c h e m eo ft h et h i o l a t e dm o d i f i c a t i o no ft h eb o v i n ec o l l a g e n1 。8 奉论文的主要磷究工佟我们尝试选用y 硫代丁内酯作为交联剂，威用于胶原蛋臼的改性，而使蛋白分子中引入硫化交联，赋予胶原缀自以更加优良的特性，并在探索不同的条 譬下对黢器蛋自遗嚣敬性处理，然嚣对改牲产纺避行分辑移袭惩。其中圭鼹的磺究工作包括：( 1 ) 交联剂的合成本论文尝试了两神合成上述交联剂的会成方法，并练合实验结果，选掰一耱台或魏绫，在签定合簸物基础上，嚣求溶解方蠢的证学往袋。( 2 ) 胶原的溶解和制各采用皮革工业中常用的槠薄杆菌中性缀自酶a s l 3 9 8 ，对猪皮进彳亍嚣梦法( 掺活) 熬溶握疑荻餍撩鑫。( 3 ) 对蛋白的交联改性研究了不同的酸溶体系、不同的温度和睬唑用量等燮联改性条件，对胶滕蛋白斡分子攫、粒径分稚、纤维形貔等豹影响。( 4 ) 胶原蛋白交鼗改往及表 正系统地研究了交联产物的物理化学性质，如热机械性能、氨基酸分析、成膜后的力学性能、膜的綮水性以及改性蛋白的可纺性等。四j i j 大学硕：学位论文2 。￥一硫 弋丁肉瓣的合成与漆鼹滢谤究y 一硫代丁内酯( y m e r c a p t o b u t y r o l a c t o n e ，c a s 8 1 0 0 3 ，1 0 7 ，c 4 战0 s )国内没有生产，据蛰只有美国s i g m a 和德国m e r c k 化学公司有销售，且价钱昂贵【2 刚，敞在本论文中叁行合或。合成y 一硫代丁内酯的方法裔两种。出予巍链a 一巯基四元羧酸静不稳定性，因此都是以y j + 内酯为起始原料，经卤酸酸化后，彳导中间产物a 圆代羧酸。一种是在有机楣期水相共存的条件下，以硫氯化钠( n a h s ) 或硫化钠( n a 2 s )箨为凌纯裁，往中淹产物奁硗纯纛送入有瓠稳，焉磊l 产秘蠢纯镳僳餐在承辐，使反成进行完全，然后将有机相中的产物蒸馏分离出来 3 0 1 ，进而发生环化反应，得最终产物。但是，由于对反应过程的热效应的不完全掌握，对有机相的选择没有受多的报道，移在羞较大弱不安全匿素，甄l 邃不建议慕臻。另秘金残方法，楚黼硫脉捧硫化帮，硫化后程强碱作嗣下承艇脱盐且後硫化反应进 子宠全，然后经陵化，分离油层，高温闭环。此种方法鞍为简便、炭全，本实验室选用此方法避行台成实黢。反应过程熙下图( 图2 1 ) ：职邶，言b r k 一l o 瓜。回滤2 h 。回流4 h r。一3 n h ，2 * s h b r 吣。4 - n a o h 崇呶l 。矗2 h n 一6 s 、吣o h 兰型巳h s 、八，k 。_ t 兰觏干燥专减压蒸馏景与吸萃取、干燥减压蒸馏j l人环化s 飞b奁交袋刘合残藤，震寻找一秘藐够镬交联潮藐够穰磐溶簇豹滚裁，蔽便杰交联改缝后，去除鬣自溶液体系市残余的游离交联裁，达到避免，j 、分子毒性的9四川大学烦士学位论文引入，为下一步工作努下良好的基锻。2 1 实验部分2 11 主要实验试剂y 一丁内酯a r 4 0 氢瀵酸a 。r ，硫脲a r n a o ha r 乙醚a r 盐酸a 。r 无水c a c l 2a r 9 5 乙醇a r 。多巍簿无水乙醇a r 蒸馏水2 1 2 主鬟实验设备调温加热套p h s 2 c 型精密酸度计囊空象d f - 1 0 1 s 集热式恒濑加热磁力揽拌器傅立叶红外光谱仪睡员拆建分携坟成都科龙化工试剂厂藏餐释龙诧王试裁厂天津化学试剂六厂三分厂成都科龙化工试剂厂天津基准化学试刘有限公镯天律螗洁邓中化工厂成都科龙化工试剂厂上海有机化工试剂研究所上海有机化工试剂研究所四川大学设备科北京中兴伟业仪器有限公司上海精密科学仪器有限公司l 京中兴韩斑纹器有陵公司巩义市英峪予华仪器厂p e r k i ne l m e rm a l v e mi n s m a m e n t sl 。董d 。2 ，1 3 实骏步骤2 t 3 1v 一硫代丁内酯盼合成步骤【3 l _ 3 3 l( 1 ) 鑫纯：取3 0 m l y 一丁内酝( y - - b u t y r o l a c t o n e ) 与6 3 2 m 1 4 0 氢溪酸混合，在7 5 c 下搅拌温和回滚2 h r ( 在通风橱内进行) 。( 2 ) 硫代：冷却后，将2 9 8 9 的硫脲( t h i o u r e a ) 溶解，继续在同样条件下网浚碡酝。( 3 ) 碱水解：完全冷却后，停止嬲热，以i 滴s 的速度滴鸯h4 9 矗l g ，m i 瀚n a o h 溶液，并强烈搅拌，防黎沸。带冷却威，在9 7 。c 下，搅拌回流2 h r 。i o四j i i 大学硕+ 学位论文( 4 ) 羧佬：冷却藤，用乙醚洗涤，弃去油层，将永层趣浓擞酸调节p h 馕至l 。0 。( 5 ) 纯化：待冷却厝，再次用乙醚萃取，弃去水层，将有机相用无水氯化钙干燥4 0 r a i n 以上。先在3 3 常压下蒸馏4 5 m i n ，后在8 0 c 以下，0 0 1大气蓬下藏疆蒸镶3 0 r a i n ，l 羞去豫醚类酾葵它澹类，在电磁隶浴中援箨以防暴沸。( 6 ) 高温闭环：1 9 7 下高温蒸馏，直至超过此温度且无液体馏出为止。加入多孑l 戆以防暴游。2 】3 2 合成产物的鉴定( 1 ) 傅立叶变换鳃外分析：a 麓祥：籍会袋产物滚热在褥糖毙蠹曩二秘密冀之阗，侵它弱茸费彭藏均匀的薄膜。b 测量：开机一自检一基线校正测样。测定结果见图2 2e 对照鉴定：与y 一磙代了悫醺标准德立时变换红终漤图鞠对照遴孬鉴定。( 2 ) 折光率分析：a 测定方法【3 5 1 ：在阿贝折光仪上，用擦镜缎沾少量己醇，轻轻擦洗上下镜覆。铸乙醇撵发嚣，霆羹一滚蒸壤泰予下瓣镜瑟主，关瓣凌餐，遴帮爱宠镜使