（生物医学工程专业论文）新型HIV整合酶抑制剂的合成及其与金属离子相互作用的研究.pdf

北京工业大学工学博士学位论文 单、产率高、反应条件温和的还原方法。 为了研究喹嗯啉酮衍生物及吡啶( 喹喏) 酮羧酸衍生物与金属离子的相互作 用，用紫外可见光谱法及荧光光谱法确定其在有机溶剂中与h i v 整合酶活性域 的二价金属离子作用模式，以确定其选择性。用紫外可见光谱法研究了8 种喹 嗯啭酮衍生物与7 种金属离子( c u 2 + ，c 0 2 + ，f c 2 + ，m g z + , n i 2 + ，m 1 1 2 + 和z n 2 ) 的相 互作用，以确定其选择性；通过紫外滴定方法，求得金属离子与喹嗯啉酮衍生物 以及吡啶( 喹喏) 酮羧酸衍生物两者之间的络合比，并探讨了两者之间的作用机 制；用量子化学从头计算方法，依据实验结果建立的络合模型，对络合体系的前 线轨道( f m o ) 能量进行了计算，并结合优化后的结构参数解释了喹嗯啉酮衍生物 对c u 2 + 离子选择性以及位置效应。采用同样的研究方法，研究2 种吡啶( 喹喏) 酮羧酸衍生物对不同金属离子的选择性( n d ，k 十c u 2 + ，c 0 2 + ，f e 2 + ，m 9 2 + ，n i 2 + ， m n 2 + ，c a 2 和z 矗2 十) ，重点探讨其对m 矿+ 和c a 2 + 离子选择性的大小及络合比。 关键词：h i v 整合酶抑制剂，芳基二酮酸，睦曝啉酾衍生物，毗啶( 睦喏) 酮衍 生物，金属离子识别 a b s t r a c t b a s e do nt h er e s e a r c hs t a t u sa n di n h i b i t o r ym e c h a n i s mo fh i v i n t e g r a s e , o u tp r o j e c ti s 璺 d e s i g na n d 洲h e s i z eas e r i e so fp o l y h y d r o x y l a l e da r o m a t i c1 3 - d i k e t oa c i d s ，q l i i m a l o l 够 d e r i v a t i v e sa n dp y r i d o n ec a r b o x y l i ca c i dd e r i v a t i v e s t h e i rs p e c i a ld i v a l e n tc a t i o nb i n d i n g p r o p e r t i e si sf u l m e rs t u d i e db ym e a n so f u v - v i sa n df l u o r g s g a n e es p e c t r a a l lt h er e s u l t ss h o u l d b eg u i d et os y n t h e s i so f d i k e t oa c i d sa n dt h e i rb i o i s o s t e r e s ( q u i n o x a l o n ed e r i v a t i v e sa n dp y r i d o n e c a r b o x y l i ca c i dd e r i v a t i v e s ) a n dh a v ei m p o r t a n c ef o rf o t h e rd e s i g no fn e wa r y ld i k e t oa c i d sh i v i n t e f e s ei n h i b i t o r s p o l y b y d r o x y l a t e da r o m a t i c sa n da r y lb d i k e t oa c i d s ( d k a s ) a t w oc l a s s e so fi m p o r t a n t h 1 vi n t e g r a s ei n h i b i t o r sw i t hh i g ha c t i v i t ya n ds e l e c t i v i t yt oh i vi n ，w eh a v ef t r s td e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d1 2d i k a t oa c i d sd e r i v a t i v e sa n d8q u i n o x a l e n ed e r i v a t i v e st h a th a v eb o t hd i k e t o a c i d a n dc a f f e o y lo rg a l l o y le n t i t i e si no n em o l e c u l el i n k e db ya r y l a m i d e s e e k i n gv i a b l er e p l a c e m e n t f o rt h ec r i t i c a lp h a r m a c o p h o r ea n ds u b s t i t u t i n gc a r b o x y lt oh e t e r o c y c l i cf u n c t i o n a l i t yo v e r c o m e t h el o wb i o a v a i l a b i l i t ya n db i o l o g i c a l l yl a b i l ep r o p e r t i e so f d i k e t oa c i dd e r i v a t i v e s i no n eh a n dt h e i d e ao p t i m i z e dt h es t r u c t u r eo fd i k e t oa c i d s t h eo t h e rh a n di st oi m p r o v et h ei n h i b i t o r ys e l e c t i v i t ) i o f p o l y h y d r o x y l a t e da r o m a t i c s i nt h ek e ys t e po f o x a l y l a t i o no f a r y la c e t p h e n o n e s ，t h eo p t i m i z e d m e t h o d sp r o v i d eab e t t e rs e l e c t i o nf o rt h ei m p o r t a n ts t e p t h es t r u c t u r e so f a l l2 0c o i n p o u n d sh a v e b e e nc h a r a c t e r i z e db ys p e c t r a la n a l y s i si n c l u d i n g hn l 帆”cn m r ，i ra n dm s t h er e s u l t i n g c o m p o u n d so ft h er e a c t i o nb e t w e e na r y ld i k e t o a c i d sa n do - p h e n y l u n e d i a n l i n ea r eq u i n o x a l o n e d e r i v a t i v e s ，i n s t e a do f b a n z i m i d a z o l e s ，w h i c ha r ec o n f i r m e db yx - r a yc r y s t a l l o g r a p h i ca n a l y s i so f t h ea n a l o g o u sc o m p e l 】i l d o fr e p l a c i n gt h ek e yp h a n n a c o p h o r eo fd k a sw i t h 枷d r u g - l i k es t r u c t u r e ，p y r i d o n e c a r b o x y l i ca c i ds t r u c t u r eb a s e do nt h eb i o i s o s t e r i s m , t w oq u e s t i o n sm u s tb ec o n s i d e r e d 0 1 1 e 岱t o m a l n m i nt h es e l e c t i v ei n h i b i t i o no nh i vi na sd i k e t oa c i d s ；t h eo t h e ri st oc o n s i d e rt h es e l e c t i v i t y a n da f f m i t yt om 矿a n ds t a b i l i t yi nv i v o b yt h em o d i f i c a t i o no ft h es t r u c t u r eo fh y d r o p h o b i c a r o m a t i c sa n ds u p e r i m p o s i t i o nt h em o d e lo fp h a r m a c o p h o r i cm o l e c u l a r s ，w eh a v ed e s i g n e da n d s y n t h e s i z e d2 0p y r i d o n ed e r i v a t i v e sa sp o t e n t i a lh i vi n t e g r a s ei n h i b i t o r s i nt h e s em o l e c u l a r s ， a r o m a t i cs u l f o n a m i d ea n dc a r b o n y l a m i d em o i e t i e sm a p p e dt h eh y d r o p h o b i ea r o m a t i c s ，3 - c a r b o x y l o re a r b o x y ld e r i v a t i v e sr e s i d u e sa n d4 - c a r b o n y lo rt h ena t o mi nh e t e r o e y c l e sm a p p e db yt h e h y d r o g e n d o n o rf e a t u r ea n dh y d r o g e n - a c c e p t o rf e a t o r e sr e s p e c t i v e l y d u r i l l gt h es y n t h e s i so f h e t e r o c y e l es u b s t i t u t e dq u i n o l i z i n ed e r i v a t i v e s ，t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a tk o h c h 3 c h 2 0 h s y s t e mh a v eh i g h e ry i e l dt h a nn a o h c h 3 0 hs y s t e mi nt h es t e po fh y d r o l y s i s i nt h es t e po f r e d u c i n ge t h y l1 - n i t r o - 4 - o x o - 4 h - q u i n o l i z i n e - 3 - c a r b o x y l a t e ，w ef i n das i m p l em e t h o dw i t hh i 曲 一i - 北京工业大学工学博士学位论文 y i e l da n dm i l dc o n d i t i o n s t os t u d yt h ei n t e r a t i o no f m e t a lc a t i o nw i t hq u i n o x a l o n ed e r i v a t i v e sa n dp y r i d o n ed e r i v a t i v e s ， u v - v i sa n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p yi no r g a n i cs o l v e n ti su t i l i z e da sa na l t e r n a t i v em e t h o dt o a s s a yt h e i rp o s s i b l eb i n d i n gp r o p e r t i e sw i t hm e t a li o n s ，c o n s i d e r i n gt h a tt h e s ec o m p o u n d sa r e d e s i g n e d t oc o o r d i n a t ew i t hd i v a l e n tm e t a li o n si l lt h eh i vi n t e g r a s ea c t i v ed o m a i n t h e p r e l i m i n a r yi o nb i n d i n gp r o p e r t i e sw i t hd i f f e r e n td i v a l e n ti o n s ( c u 2 + ，c 0 2 + ，f e 2 + ，m 矿，n i 2 + ， m n 2 + a n dz n 2 1h a v eb e e ni n v e s t i g a t e dt oc o n f i r mi t ss e l e c t i v i t y u v - v i st i t r a t i o ne x p e r i m e n t s t u d i e dt h es t o i m e t r i cr a t i o na n dm e c h a n i s mo fi n t e r a c t i o no fm e t a lc a t i o nw i t hq u i n o x a l o n e d e r i v a t i v e sa n dp y r i d i n ed e r i v a t i v e s t h es e l e e t i v i t ya n dp o s i t i o ne f f e c tt oc 一+ o fq u i n o x a l o n e d e r i v a t i v e sh a sa l s ob e e ne x p l a i n e du s i n gq u a n t u mc h e m i s t r ya bi n i t i om e t h o db a s e do nt h e c o m p l e x m o d e c o n s t r u c t e d f r o m t h er e s u l t s o f u v - v i se x p e r i m e n t s w e h a v e f o u n d t h a t t h ee n e r g y d i f f e r e n c eo ff r o n t i e rm o l e c u l a ro r b i t a l ( f m o ) a n do p t i m i z e dp a r a m e t e r so fs t r n c u t r eo ft h e s e c o m p l e x e sf o r m e db yq u i n o x a l o n ed e r i v a t i v e sw i t hc 一+ c a ne x p l a i nt h et h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t s t h es e l e c t i v i t yo fp y r i d o n ed e r i v a t i v e st od i f f e r e n tm e t a lc a t i o n s a + ，k + 。c u 2 + ，c 0 2 + ，f e 2 + ， m 孑+ ，n i 2 + ，v l n e + ，c a 2 + 和z n 2 + ) h a sa l s ob e e ni n v e s t i g a t e d 璐i 1 1 9u v - v i sa n df l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y w ea l s od i s c u s s e dw i t he m p h a s i so nt h ed i f f e r e n c eo fs e l e c t i v i t ya n ds t o i m e t r i c r a t i o nb e t w e e nm 9 2 + c a 2 + a n dt w ok i n d so f p y r i d o n ed e r i v a t i v e sr e s p e c t i v e l y k e yw o r d s ：h i n t e g m s ek u h i b i t o r s 。a r y ld i k e t oa c i d , q u i n o x a l o n ed e r i v a t i v e s ，p y f i d o n e d e r i v a t i v e s ，m e t a lc a t i o nr e c o g n i t i o n 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得北京工业大学或其它教育机构的学位或证书 而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示了谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 日期i 爿：翌：? 本人完全了解北京工业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内容， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 签名：导师签名： 第1 章绪论 1 1 国内外研究进展 艾滋病( a i d s ) 是1 9 8 1 年首次在美国发现的，1 9 8 3 年确证人类免疫缺陷病 毒( h u m a ni m r n u n o d e f i c i e n c yv i r u s 。h i v ) 是主要病原体。h i v 感染率高，传播 迅速。联合国艾滋病联合规划署( u n a i d s ) 和世界卫生组织( w h o ) 2 0 0 5 年 1 2 月发布的最新年度报告显示【l 】2 0 0 5 年，全世界已有3 1 0 万人死于艾滋病， 新感染的艾滋病病毒人数约为4 9 0 万，报告警告说，目前全球艾滋病病毒感染者 总数已达到4 0 3 0 万人，如果不采取更加有效的预防措施，到2 0 1 0 年前，全世界 1 2 6 个中、低收入国家还将有4 5 0 0 万人感染艾滋病病毒。目前，中国现有艾滋 病毒感染者和病人约6 5 万人，所以遏制艾滋病的发展已经到了刻不容缓的地步。 i i 1 艾滋病毒结构及其生命周期 h i v 是引起全球性艾滋病蔓延的主要病原体，h i v 病毒颗粒是一个直径大约为 1 0n m 的圆球体。核心共有两个单链r n a 和由病毒编码的逆转录酶，整合酶和蛋 白酶【2 】( 图1 1 ) 。 h i v 模型h 内部结构示意图 图1 1h i v 模型及内部平面结构示意图 f i g u r ei - 1h i vm o d e la n dv i e w so f i n n 日s t r h c t u m 核衣壳由病毒删3 p 1 7 、p 2 4 、p 7 、p 6 等组成，病毒颗粒的最外面的包膜则 由病毒编码的糖蛋白g p l 2 0 和g p 4 1 以及类脂等组成。h i v 有三个基因组，两端各 北京t 业大学t 学博十学位论文 有长末端重复序，q j ( l t r ) ，序列为5 l t r - g a g p o i - e n v - l t r - 3 【3 】。还有6 个调节基因 t a t 、r e v 、n e f , v i f , v p r 、v p u 分别编码6 种调节蛋白。g a g 基因编码病毒的核心蛋 白，表达时先生成一个分子量为5 5 0 0 0 的蛋白前体p 5 5 ，在h i v 所编码的蛋白酶作 用下，p 5 5 裂解为p 1 7 、p 2 4 、p 7 和p 6 ，p 2 4 和p 1 7 构成核衣壳内膜，p 6 和p 7 二者与 病毒r n a 合成为病毒核心的组成部分。p o l 基因主要编码h i v 复制和整合所需的 两个重要的酶，一个是逆转录酶p 5 1 ，另一个是整合酶p 3 4 。在g a g 和p o l 两个基因 的重合区内开始的一段编码列含有p r o 基因，编码蛋白酶p l l 。蛋白酶可裂解h i v 的蛋白前体成为有特定功能的成熟蛋白，锄v 编码分子量为8 8 0 0 0 的蛋白前体，经 过糖基化后分子量增加到1 6 0 0 0 0 ，形成h i v 的包膜糖蛋白前体g p l 6 0 ，进一步裂 解为病毒颗粒包膜糖蛋白印1 2 0 和g p 4 l 【4 1 ( 图l 一2 ) 。 l t r i 图1 - 2h i v 基因组及其编码蛋白 f i g u r e l - 2 h i v g e n e n o m ea n d c o d e o f p r o t e i n h i v 侵入人体后，首先识别c d 4 受体t 淋巴细胞和巨噬细胞，由病毒外膜 的g p l 2 0 与细胞表面的c d 4 受体及辅助受体结合，然后，病毒跨膜g p 4 1 与细胞 膜融合( 该融合过程需要细胞趋化因子受体如c c r 5 和c x c r 4 等) ，病毒外膜和 细胞膜融合以后，引起病毒脱壳，病毒核心部分进入细胞，在逆转录酶的作用 下，病毒的r n a 转录为双链d n a ，双链d n a 在整合酶的作用下与宿主细胞染 色体d n a 整合形成前病毒d n a ，随染色体的复制而复制。前病毒d n a 的转录 过程是分阶段进行的。早期转录的长链m r n a 被切割成短链m r n a ，作为模板 指导合成h i v 和t a t 、r e v 等调节基因编码的调节蛋白，当调节蛋白合成到一定的 量时，转录则由早期向晚期转换，开始合成长链m r n a ，并合成病毒颗粒组装 第1 章绪论 所需的结构蛋白，长链m r n a 和结构蛋白即可组装成新的病毒颗粒，从而完成 h i v 复制过程【5 】( 图1 - 3 ) 。 图1 - 3 h i v 的生命周期 图1 - 3h i v l i f e c y c l e 由h i v 的生命周期可以看出，h i v 在细胞内的复制不仅需要逆转录酶和蛋白 酶的作用，还需要病毒特有的整合酶起整合作用。 1 1 2 f 1 ) a 批准的抗h i v 临床药物 自1 9 8 7 年f d a 批准齐多夫定( j 岍) 用于临床以来，到2 0 0 5 年为止f d a 一共批准了2 7 种治疗艾滋病的新药上市( 见表1 1 ) ，其中2 0 0 3 年就批准了四个 品种。主要分为以下几类【6 】： 1 核苷类逆转录酶抑制剂( n r t i s ) ：z i d o v u d i n e ( a z t ) ，d i d a n o s i n e ( d d i ) ， z a l c i t a b i n e ( d d c ) ，s t a v u d i n e ( d 4 t ) ，l a m i v u d i n e ( 2 t c ) ，a b a c a v i r ( a b c ) ， e m t r i c i t a b i n e ( f t c ) ，t e n o f o v i rd i s o p r o x i lf u n m r a t e ； 2 非核苷类逆转录酶抑制剂( n n r t i s ) ；n o v i r a p i n e , d e l a v i r d i n e , e f a v i r e n z , e m i v i r i n e ； 3 蛋白酶抑制剂( p i s l ：s a q u i n a v i r , r i t o n a v i r , i n d i n a v i r , n e l f m a v i r , 北京1 1 业大学r 学博+ 学位论文 a m p r e n a v i r , l o p i n a v i r , f o s a m p r e n a v i r , a t a z a n a v i r ； 4 融合抑制剂( f u s i o ni n h i b i t o r s ) ：e n f u v i r t i d e ( t - 2 0 ) 。 表l - 1 抗h i v 药物的名称、结构和分类 t a b l e1 1n 衅i n e 、t m t t u r ea n ds o r to f t h ea n t i h i vm e d i c i n e s 分类名称( 商标别名)结构生产商f d a 批准日期 拉米夫定和齐多夫定 ( 复方剂) l a m i v u d i n ea n d 葛兰素史克 1 9 9 7 9 2 7 z d o v u d i n eg l a x o s m i l k l i n e ( c o m b i v i r ) 恩曲他滨 n h 2 e m n i c i t a b i l * 丸5 ( e m t r i v a ，f t c ) j| j 吉利厄德科学 入g i l e a ds c i e n c e s2 0 0 3 7 2 核苷类h 刊 逆转录拉米大定n h 2 1 9 9 5 1 1 1 7 酶抑制l a m i v u d i n e 念 葛兰素史克 剂 ( e p i v i r , 3 t c ) g l a x o s m i 删i n e h 吲 阿巴卡韦，拉米夫定( 复方荆)葛兰素史克 a b a c a v i r l a m i v u d i n eg l a x o s m i t h k l i n e2 0 0 4 8 2 ( e p z i c o m ) n h 2 扎西他宾， 罗氏 z a l c i t a b i n e , n h o f l l l l a l l n - l a 1 9 9 2 6 1 9 d i d e o x y c y t i d i n e影o r o c h e ( h i v i d , d d c ) h 飞叫 、_ 一 o 齐多夫定 h o c h s z i d o v u d i n e , 入p 葛兰素史克 1 9 8 7 _ 3 1 9 a z i d o t h y m i d i n e g l a x o s m i t h k l i n e ( g e t r o v i r , a z t , z d v ) h 刈 n a 4 第1 章绪论 ( 续表1 - 1 ) 分类 名称( 商标别结构 生产商f d a 批准 名)日期 ( 阿巴卡韦，齐多夫( 复方剂) 定和拉米夫定)葛兰素史克 a b a c a v i r , g l a x o s m i t h k2 0 0 0 1 1 1 4 z i d o v u d i n e , a n d l i n e l a m i v u d i n e ( 删v i r ) 替诺福韦二索罗基 ( 复方帮) 富马酸盐，恩曲他滨 吉利厄德科 t e n o f o v i r 学2 0 0 4 8 2 核昔 d i s o l a o x i l e m t r i c i t a b g i l e a d 类逆h i es d e n e 魅 转录 c r r u v a d a ) 酶抑o 制剂 地达诺新 h 电 百时美施贵 宝 b r i s t o l1 9 9 1 1 0 9 m y e r s - s q u i b b2 0 0 1 1 0 3 1 ( e c ) d i d a n o s i n e , d d i , l _ - _ j d i d e o x y i n o s i n e ( d e x ) 替诺福韦二索罗基 o h臀 富马酸盐 一啦 吉利厄德科 t e n o f o v i rd f = 毒：x 。y 学2 0 0 1 1 0 2 6 c - i l c a d ( 、7 i t r e a d , t d f l 忙嗽“气一扣。呐r 。i s c i e n c e s o 司它夫定 h 洲s s t a v u d i n e 办一 百时美施贵 ( z 咄d 4 1 ) 宝 1 9 9 4 6 2 4 h 叫 b r i s t o l m y e r s - s q u i b b 阿巴卡韦 v n h 葛兰素史克a b a c a v i r h 嗲 g i a x o s m i t h k 1 9 9 8 1 2 1 7 ( z i a g a l ) h a w i ：i l i n e ”刊 甘 - 5 北京工业大学工学博士学位论文 ( 续表1 - i ) 分类名称( 商标结构 生产商f d a 批准 别名) 日期 地拉韦定 w 辉瑞 d e l a v i r d i n e “叶弋阶两 p f i z e r1 9 9 7 4 4 ( g e s o r i t a o r , o c h 鳓h 非核 d l v ) 苷类 百时美施贵宝 b r i s t o l1 9 9 8 9 1 7 逆转 依法韦伦 氍n r 弋o m y e r s - s q u i b b 录酶e f a v i r e n z 抑制 ( s u s t i v a ) 剂 h 奈韦拉平 裴洲 勃林格殷格翰 n e v i r a p i n e 翔 b o e h r i n g e r 1 9 9 6 6 2 1 陋m u n e , 厶 i n g e l h e i m b b r g s 8 7 ) 安泼那韦 n 葛兰素史克 1 9 9 9 1 4 1 5 a m p r e n a v i r 沁。联n g l a x o s m i t h k l i n e ( a g e n e r a s e , ko l 。 a p v ) c 心 替拉那韦 崦毽 勃林格殷格翰 t i p r a n a v i r b o e h r i n g e f 2 0 0 5 6 2 2 ( a p t i v u s ) i n g e l h e i m 蛋白 酶掷 驮克1 9 9 6 3 1 3 制剂 瞄矿、hh o 州 m e r c k 茚地那韦 i n d i n a v i r ( c r i x i v a 珥 i d v , m k - 6 3 9 1 沙奎那韦 罗氏 s a q u i n a v i r 同下h o f f m a n n - l a 1 9 9 7 1 1 7 ( f o r t o v a s e ) r o c h e 罗氏 h o f f n m - l a1 9 9 5 1 2 6 r o c h e 沙奎那韦甲 q 傲 c h 鳓峪繁嘞 磺酸 s a q u i n a v i r m e s y i a t e ( i n v i r a s e ， s q 6 - 第1 章绪论 ( 续表1 - 1 ) 洛匹那韦和利 嫩 雅培制药 托那韦 a b b o t t2 0 0 0 9 1 5 l o p i n a v i ra n d l a b o r a t o r i e s r i t o m v i r 0 c a l e t r a ) 福沙那韦 一啦 葛兰素史克 f o s a m p r e a a v i r g l a x o s m i t h k l i n e2 0 0 3 1 0 2 0 蛋白c a l c i u m 酶抑 ( 1 x i v a ) 制剂 利托那韦 阶g 雅培制药撕t o n 州r ( n o r v i r 9 a b b o t t1 9 9 6 3 1 a b t - 5 3 8 ) 气 叮l a b o r a t o r i e s 阿扎那韦 峭鼹 百时美旋贵宝 a t a z a n a v i r b r i s t o l2 0 0 3 6 2 0 s u l f a t e m y e r s - s q u i b b ( r e y a t a z ) 奈非那韦 q 雌 阿古伦制药 n e l f i t m v i r 呵毽 a g o u r o n 1 9 9 7 3 1 4 m e s y l s t ep h 郐睡瞳吣a 址蛐 ( v 细嘲鸭 n v v ) 融合 y t s l i h s l i e e s q n q q e 抑制恩福韦地k n e q e l l e l d k w a s l罗氏 剂 e n i 血_ i i d ew n w f h o f f m a n m l a2 0 0 3 3 1 3 ( f u 她t - 2 0 ) r o c h e 1 9 9 5 年，美籍华裔科学家何大一教授发明了目前临床上常用的“鸡尾酒疗 法”，即应用蛋白酶抑制剂和逆转录酶抑制剂进行组合治疗，全面阻止病毒复制， 降低h i v 中单个点突变的可能性，从而延缓耐药性产生。尽管“鸡尾酒疗法” 在诞生时给a i d s 的治疗带来了一场革命，使得a i d s 发病率和死亡率都有所下 降，但是仍然有一部分病人对其中一种或多种药物产生抗药性，特别是这种疗法 不能彻底地根除低水平状态下病毒持续进行的复制，h i v 仍然存在于某些机体组 织中( 如外周血液的单核细胞或者休眠的t 淋巴细胞等) ，需要使用药物进行长期 治疗；此外，组合使用治疗药物价格非常昂贵，限制了它们在不发达国家的应用。 北京工业大学工学博士学位论文 由于存在上述问题，人们希望通过对h i v 的生命周期的了解及其致病机制进行 更深入的研究，寻找作用于h i v 生命周期中其他靶点的抗a i d s 药物，从而在“鸡 尾酒疗法”中添加一种具有新功能的药物，达到增强组合治疗的效果。 近年来，作为抗艾滋病的候选药物大量化合物已经合成出来，这些药物的靶 点集中于h i v 病毒生命周期的每一个过程【6 】：吸附( a b s o r p t i o n ) 一进x ( m t r y ) + 融 合( f u s i o n ) - 脱壳( u n c o a t i n g ) 一逆转录( r e v e r s et r a n s c d p t i o n ) + 整合( i n t e g r a t i o n ) 一转 录( 仃a n s c r i p t i o n ) 一成熟( m a r a r = 蛐。在这个周期中，i - i v 整合酶是逆转录病毒复 制过程中必不可少的一种酶，更重要的是人体内并没有发现相同功能的酶类似物 存在，因此如果有一种药物能够选择性地抑制i - i i v 整合酶，将不会破坏健康细 胞，从而降低了毒性m 。因此，h i v 整合酶是抗艾滋病药物设计的理想靶点f 8 】l 1 1 3 艾滋病药物设计的新靶点一h 整合酶 h i v 整合酶可以和病毒d n a 特异性地结创9 】，也可以和其它d n a 非特异结 合，但是却只对病毒d n a 行使特异的整合功能。此特异性与整合酶的两个碱性 氨基酸l y s l 5 6 、l y s l 5 9 和病毒的特异性序列及二价阳离子有关【1 0 1 。整合酶与病 毒d n a 形成一稳定的核蛋白复合物后，才行使3 加工和链转移活性。此复合物 的稳定性依赖于病毒d n a 5 端保守的双核苷酸c a 和二价阳离子。病毒d n a 的 l t r 末端6 个碱基对于形成稳定的复合物很重要，被称作，整合信号序列砸s s ) 【1 1 1 2 1 。其中最重要的是5 端两个核苷酸c a ，若这两个核苷酸缺失或突变，则复合 物的稳定性大大降低【1 3 】，此稳定性还需要二价阳离子m n 2 + 、m 9 2 + 或c a 2 + 的存在。 二价阳离子的一个重要作用是促进整合酶多聚体的形成。整合酶活性位点附近的 碱性基团l y s l 5 6 、l y s l 5 9 可以特异性的识别病毒d n a 末端保守的双核苷酸c a ， 从而使底物接近酶活性中心，因此也有利于特异性切割。 逆转录病毒与宿主细胞染色体的整合过程大致分为三个步骤( 见图1 - 4 ) 【1 4 3 ： 第1 章绪论 c o m p l e x e s a s s e m b l e d 0 1 1 i m m o “l i z , e d d n ac 4 n 1 1 帅8 f r o m l 哪鲥蛔d c l p 盘 k + ，一= 亳i 云享= 。“ 睁一= = = 等苗r 一 ”囝 ，螂一：一 i、 奄7 2 3 “堋= 叼”2 图l - 4 整合酶整合过程示意图【1 5 】 f i g m e1 - 4t h ei n t e g r a t i o np _ o l 妇o f h i vi n t c g r a s c 第一步为组装过程。整合酶首先与细胞质中病毒的双链d n a 结合，组装形成 一个稳定的d n a - 酶复合物。 第二步为3 末端加工过程。整合酶再从病毒d n a 链的3 末端各切下两个核苷 酸，露出高度保守的c 觫端。 第三步为链转移过程。上步产生的病毒d n a 蛋白复合物转运到细胞核中，在 核里，整合酶交错切割宿主细胞染色p j k d n a ，产生间隔5 个碱基的交错切口，然 后病毒d n a 的3 末端带自由羟基的碱基与宿主d n a 的5 末端进行酯交换反应，即 共价结合完成整合作用。 随后宿主细胞的酶修补病毒d n a 与宿主d n a 之间裂隙。这就完成了整个整合 过程，形成了一个线性的整合d n a ，可随着宿主d n a 的复制而复制，从而达到 病毒增殖的目的( 整合过程如图l 4 ) 。整合过程的前两步均是由整合酶催化的。所 以整合酶的功能包括3 加工和链转移活性，因此抑制这两步反应，就有可能抑制病 毒的整合以及接下来的复制。此外在体外利用重组的整合酶进行实验时还发现另 外称为“去整合( d i s i n t e g r a t i o n ) ”过程，它可以看作是整合反应的逆过程，即使 病毒d n a 与靶d n a 分开，并将靶d n a 重新连接起来，此反应只在体外存在，在 体内则无此活性。研究还发现，整合酶在行使功能时，是以多聚体的形式发挥作 用的，通常是二聚体和四聚体【9 1 ，并需要二价阳离子如m 矿+ 或者m f + 作为辅助因 子存在。 北京工业大学工学博士学位论文 1 2hlv 整合酶抑制剂研究现状 目前h i v 整合酶抑制剂研究的作用对象主要集中在以下几个方面；抑制3 ， 一加工过程和链转移反应；抑制h i v 整合酶多聚体的形成；阻断整合酶与底物 d n a 的结合以及干扰核定位。 1 2 1 核苷酸类整合酶抑制剂 齐多夫定单核苷酸1 ( a z t m p ) 和2 属于核苷酸类整合酶抑制剂，是第一个与 整合酶相互作用的抑制剂。利用放射性元素标记a z t m p 衍生物和蛋白水解谱图 对a z t m p 的结合模式进行分析，发现a z t m p 能与整合酶中心区域的3 1 - 4 螺旋 部分结合【1 6 1 。该化合物抑制h i v 整合酶催化3 末端加工过程和链转移，其i c 分别为1 0 0 和6p ，m o l l 。另一化合物3 是由脱氧胞菅酸和脱氧腺苷酸结合而成的 双核苷酸，也能与整合酶中心区域的c t - 4 螺旋部分结合。该化合物抑制瑚 v 整 合酶催化3 末端加工过程和链转移的i c 5 0 分别为1 5 0 和3l a m o l l 。具有鸟苷四 重结构的长寡核苷酸类整合酶抑制剂4 、5 、6 ，主要是通过与整合酶活性催化区 域的残基形成氢键而发挥抑制作用，其抑制h i v 整合酶催化3 末端加工过程和 链转移的i c s o 分别为7 0 和8 5 、1 0 0 和9 0 、8 0 和6 0 n m o l ，l t m 。 p o = p 、 口 甲 0 2 p 、 寸 1 ( 删p ) 2 叫c y c l i c n u d t 表1 - 2 三种核苷类抑制剂抑制活性嗍 t a b l e1 - 2i n h i b i t o r ya c t i v i t