（预防兽医学专业论文）红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备.pdf

陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制各 红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备 研究生：陈琦 导师：李厚达教授 摘要 1 目的 人红细胞血型系统非常复杂，血型抗原的正确鉴别在保证输血安全、调查人 种分布、建立稀有血型库及许多疾病的诊断、分型甚至治疗方面都有极其重要的 作用。抗原的鉴别有赖于相应抗体的获得。而我国除a b o 血型定型试剂外，其它 临床及实验所用斑型抗体几乎全部依赖进口，这极大地制约了血型学研究在我国 的发展。本研究的e 1 的即通过常规的杂交瘤技术及目前迅速发展的基因工程抗体 技术劁备针对各种血型抗原的单克隆抗体及基因工程抗体，以期获得效价高、特 异性强并具有自主知识产权的血型抗体，为它们最终能大规模生产应用于临床及 积极开展国际交流、互通有无打下坚实的基础。 2 方法 根据实验目的，本课题内容共分三部分 2 1 红细胞血型单克隆抗体的制备 一 分别用健康成人“o ”血及胎儿脐血红细胞免疫b a l b c 小鼠，经过3 次免疫 及一次加强免疫，取免疫小鼠脾细胞与s p 2 0 骨髓瘤细胞融合，通过血凝试验初筛， 保留血凝效价达4 + 的细胞株扩大培养，获得的杂交瘤细胞上清分别用谱红细胞、 原核表达的k e u - 3 0 e 血型抗原多肽及w e s t e r n b l o t 进行抗体特异性鉴定，同时进行 抗体类型、效价及抗原表位的检测，对部分单克隆细胞株通过腹水扩大培养，以 进一步提高其效价。 2 2s c f v 6 w c g - h p v l 6e 7 双功能分子的制各 扬州大学博士学位论文 用实验第一部分获得的一株抗红细胞血型糖蛋白g p a g p b 的杂交瘤细胞株 6 d 7 c 9 进行r t - p c r ，分别扩增其v h 、v l 基因，并用l i n k e r 将其拼接成6 d 7 c 9 的s c f v 基因，转化原核表达载体p b a d g i i i a ，获得的阳性克隆命名为： p b a d s g f v 6 1 ) t c 9 ，通过w e s t e r nb l o t 分析及间接血凝试验检测s c f v 的蛋白表达及 血凝活性。将获得的p b a d s g f v 6 d t c 9 与已有的人乳头瘤病毒1 6 型e 7 基因片段 ( i - i p v l 6 e 7 ) 通过一l i n k e r 经p c r 拼接，转化，获得的双分子阳性克隆命名为： p b a d s g f v 6 d t c 9 h p v l 6e 7 ，通过w e s t e mb l o t 分析及间接血凝试验检测表达产物 的双特异功能，即其与h p v l 6e 7 抗体和r b c 同时结合，并通过血凝反应检测 h p v l 6e 7 抗体的能力。 2 3r h ( d ) 抗原f a b 抗体的制备 收集5 份血清中抗r h ( d ) 效价在1 ：2 5 6 5 1 2 之间的人淋巴细胞，提取r n a ， 用多对引物p c r 分别扩增其v h 、v x 基因，同时，分别从p a o m b 3 x t r 和 p c o m b 3 x a 噬粒中扩增c h i 、q 、c l ，通过重叠p c r ，构建重链的f d 基因及完整 的k a p p a 、l a m d a 轻链，并进一步重叠p c r ，获得f a b 抗体片段。f a b 经酶切、连 接并电转化到噬菌体抗体表达载体p c o m b 3 x s s 中，构建获得抗r h ( d ) 的f a b 抗体 库，经四轮p h ( - ) r h ( + ) 红细胞阴阳淘筛，获得的阳性克隆分别进行血凝试验、 w e s t e r nb l o t 分析及测序鉴定。 3 结果 3 1 红细胞血型单克隆抗体的制备 3 1 1m n s s 血型系统m a b s 获得的8 种杂交瘤细胞株中，其中4 株作用于g p a 的m 表位、1 株作用于 g p a 的n 表位；3 株为同时抗g p a 和g p b 蛋白的g p a g p b m a b s 。杂交瘤细胞 培养上清效价介于l 2 4 - 1 x 2 q 之间，腹水m a b s 效价在l 2 - 7 - i x 2 - 1 2 之间。除1 株m a b ，i c l c 9 c 4 为t g m 外，其他7 株m a b s 均为l g g 。通过杂交瘤细胞培养上 陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备 清与谱红细胞的反应格局，结合m a b s 抗原表位检测，确定4 株、1 株m a b s 可分 别特异性结合于g p a 的m 、n 表位；另3 株m a b s ，6 d 7 c 9 、7 c 9 h 4 和7 c 9 g 1 1 ， 与“o ”型血红细胞膜的w e s t e r nb l o t 结果显示，它们为抗g p a g p bm a b s 。 3 1 2i i 血型m a b s 获得了3 个抗i 的m a b s ：a i o g 5 f g e 2 e 7 、a 1 1 g 5 f g e 2 c 4 和a 1 0 g 2 。杂交瘤细胞 培养上清效价介于l x 2 - 1 _ 1 2 - 4 之间，其中a 1 0 g 5 f 9 e 2 e 7 的腹水效价在 1 x 2 - 1 0 - 1 x 2 1 之间。三株m a b s 均为i g g 3 型。通过杂交瘤细胞培养上清与谱红细 胞( 含胎儿i 血型、成人i 血型及成人稀有i 血型) 的反应格局，确定这3 株m a b s 特异性结合i 抗原。 3 1 3k e l l 血型系统的m a b s 获得3 个抗k e l l 的m a b s ：4 h 2 a 8 、2 f 9 f 5 和4 d 1 0 g l l ，杂交瘤细胞培养上 清效价介于l 2 - 5 1 2 - 1 0 之间，抗体亚型检测均为i g g l 。通过杂交瘤细胞培养上 清与k e l l 蛋白原核表达多肽k e l l 3 0 e ( k e l l 蛋白c 末断的3 0 个氨基酸) 的e l i s a 检测，确定这3 株m a b s 特异性结合k e l l 抗原。 3 2 s e f v 6 d 7 0 h p v l 6e 7 双功能分子的制备 s c f v 6 d 7 c 9 测序结果表明：v h 隶属小鼠i g 重链第1 i 亚组，而v l 隶属小鼠i g k a p p a 链亚组。w e s t e r nb l o t 分析显示：在相对分子质量3 30 0 0 处有s c f v 目 的蛋白表达( 与c - m y e 融合) ，血凝试验证明该表达产物有红细胞凝集活性。在 此基础上构建的p b a d s e f v 6 m c g - h p v l 6i 7 双功能表达载体，经诱导表达后， w e s t e r nb l o t 分析发现在相对分子质量5 00 0 0 处有目的蛋白条带。而含双功能蛋 白的细菌培养上清加入h p v l 61 7 抗体( 病人血清) 及r b c 后，未观察到明显的 血凝现象。 3 3 r h ( d ) 抗原f a b 抗体的制备 构建获得总库容为7 4 x 1 0 6 的f a b 抗体库。经四轮r h ( ) 砌l ( + ) 红细胞阴阳淘 筛，获得了2 株能与r h ( + ) 红细胞特异凝集，而与r h ( ) 红细胞不凝的阳性克 扬州大学博士学位论文 隆，w e s t e r nb l o t 表明所获抗体能特异结合红细胞上的r h 抗原。d n a 序列分析 表明：所获2 株阳性克隆的序列相同，v h 属v h 3 2 3 亚群家族，vk 属v gi i i 亚 群家族。 4 结论 4 1 单克隆抗体 1 ) 获得了5 株抗g p a 的m a b s 2 ) 获得了3 株作用于g p a g p b 的m a b s 3 ) 获得了3 株抗i 抗原的m a b s 4 ) 获得了3 株抗k e l l 抗原的m a b s 4 2 基因工程抗体 1 ) 构建的s c f v 6 d t c 9 有红细胞凝集活性 2 ) s e f v 6 d t c 9 - h p v ( e 7 ) 双功能蛋白能融合表达，但未通过血凝反应检测到血清中 的h p v l 6 e 7 抗体 3 1 获得有红细胞凝集活性的特异性抗r h ( d ) 的f a b 抗体 关键词：红细胞；血型；单克隆抗体；基因工程抗体，噬菌体抗体库 堕堕! 塾塑丝垒型璺塞堕亟焦墨茎里三矍幽型l p r e p a r a t i o no f m o n o c l o n a la n t i b o d i e sa n dg e n e t i c e n g i n e e r i n g a n t i b o d i e sa g a i n s tb l o o d g r o u pa n t i g e n s p h d c a n d i d a t e ：q ic h e n s u p e r v i s o r ：h o u d a l i a b s t r a c t a i m ： b l o o dg r o u pa n t i g e n si nh u m a ne r y t h r o c y t es u r f a c ei sq u i t ec o m p l e x u p t on o w 2 9 b l o o dg r o u ps y s t e m sh a v eb e e nw e l ld e f i n e d ，t h e ya r ee n c o d e db y3 8g e n e si n v o l v e d i nm o r et h a n7 0 0b l o o dg r o u pa n t i g e n s d e t e c t i o no f b l o o dg r o u pa n t i g e n sp l a yc r u c i a l r o l e si nm a n ya s p e c t s ，s u c h 鹊e n s u r i n gs a f eb l o o dt r a n s f u s i o n , s t u d y i n gt h ed i s t r u b u t i o n o f h u m a nr a r e s ，e s t a b l i s h i n gr a r eb l o o dg r o u pd a t a b a s e ，a sw e l la ss e r v i n ga sd i a g n o s t i c o rt h e r a p e u t i cr e a g e n tu s e dc l i n i c a l l y b u tt h ee s s e n t i a ld e t e m i n a n t st od ot h e s ei st oh a v e a d e q u a t eb l o o dg r o u pa n t i b o d i e s u n f o r t u n a t e l y , t h e y a r es e v e r e l yl a c ka n du n a v a i l a b l e i nc h i n a t h eg o a lo f t h es t u d yi st op r e p a r ea n t i b o d i e ss p e c i f i c a l l ya g a i n s td i f f e r e n tr e d c e l la n t i g e n sb ym e a n so f t r a d i t i o n a lh y b r i d o m at e c h n i q u ea n da n t i b o d ye n g i n e e r i n g t e c h n o l o g y t h e s ea n t i b o d i e sm a y b e u s e df o ri d e t i f i c a t i o no f b l o o dg r o u p ，d i a g n o s i so f d i s e a s e s ，a n dd e v e l o p i n gi n t e r n a t i o n a lc o m m u n i c a t i o n , w h i c hh e l pa c c e l e r a t eb l o o d g r o u ps t u d yi nc h i n a m e t h o d s t h es t u d yi sd i v i d e di n t ot h r e ec o m p o n e n t si nt e r m s 谢圮宅x p e 甄m e 辩a la i m s 1p r e p a r a t i o no fm a b sa g a i n s tb l o o dg r o u pa n t i g e n s 堑塑盔堂堡主堂垒鲨苎 8w e e k 。o l df e m a l eb a l b cm i c ew e r ei m m u n i z e dw i t he i t h e rt y p e o r e db l o o d c e l l so ru m b i l i c a lb l o o dc e l l s s p l e n o e y t e sf r o mt h ei m m u n i z e dm i c ew e r ef u s e dw i t h s p 2 0m y e l o m ac e l l s t h ec l o n e sw i t ht h ea g g l u t i n a t i o nr e a c t i o ng r a d eo f4 + w e r e r e m a i n e df o rf u r f l l e rc u l t u r e 。s p e c i f i c i t yo fm a b sw a si d e n t i f i e db yp a n e le r y t h r o c y t e s ， p m k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c to fk e l l 3 0 ca n dw e s t e r nb l o ta n a l y s i s t h et i t e ro f s u p e m a t a n ta n da s c i t i cf l u i dw e r et e s t e db yd i r e c ta n di n d i r e c ta g g l u t i n a t i o n t h e s u b c l a s s e sa n di s o t y p e sw e r ei d e n t i f i e db ym o n o c l o n a la n t i b o d yi s o t y p i n gk i tt h e c o m p l e m e n t a ls t r u c t u r e so ft h ec o m b i n i n gs i t e so ft h e i ra n t i b o d ya n t i g e nw e r e d e t e r m i n e db ye n z y m e - t r e a t e dr e dc e l l s 2c o n s t r u c t i o no fs c f v 6 们c 9 一h p v l 6e 7b i f u n c t i o n a lm o l e c u l e t h ev a r i a b l er e g i o n so f l i g h ta n dh e a v yc h a i n sw e r ea m p l i f i e db yr t - p c rf r o m 6 d 7 c 9 ，ah y b r i d o m ac e l ll i n ea g a i n s tg l y c o p h o r i naa n dg l y c o p h o r i nb ( g p a g p b ) o b t a i n e df r o mt h ef i r s tp a r to f t h es t u d y s c f v 6 d t c 9w a sc o n s t r u c t e db yc o n n e c t i n gv i i a n dv 。g e n ew i t ha l i n k e r , i tt h e nf u r t h e rt r a n s d u c t e di n t op r o k a r y o t i ce x p r e s s i v ev e c t o r p b a d g l i i a ，t h ep o s i t i v ec l o n ei sd e s i g n a t e da sp b a d s c f v 6 d t c 9 w e s t e r nb l o t a n a l y s i sa n di n d i r e c ta g g l u t i n a t i o nw c t ep e r f o r m e dt od e t e c ti t ss p e c i f i c i t ya n d a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t y s c f v 6 d 7 c 9 一h p v l 61 2 7b i f n n c t i o n a lm o l e c u l ew a sc o n t r a c t e db y o l o n i n gs c f v 6 d 7 c 9g e n e sa n dt h ee 7g e n eo f h u m a np a p o l l m a v i r u sv i r u s1 6i n t ot h e s 锄ee x p r e s s i o nv e c t o rt of o r mab i f n n c t i o n a le x p r e s s i o nv e c t o r , n a m e dp b a d - s c f v 6 附h p v l 61 7 w e s t e r nb l o ta n a l y s i sw e r ep e r f o r m e dt od e t e c tt h ee x p r e s s i o no f b i f u n c t i o n a lm o l e c u l e m o r e o v e r , i n d i r e e ta g g l u t i n a t i o nw a sp e r f o r m e dt od e t e c ti t s b i f n n c t i o n , t h a ti si th a st h ea b i l i t yt ob i n dw i t hh p v l 6e 7a n t i b o d yp r e s e n ti np a t i e n t s 8 e r t m la n dr b c ，a n dr a p i d l yd e t e c ti - i p v l 6e 7 a n t i b o d yb ya g g l u t i n a t i o nr e s p o n s e 3c o n s t r u c t i o no ff a b a n t i b o d ya g a i n s tr h ( d ) a n t i g e n t h ev a r i a b l er e g i o n so f l i g h ta n dh e a v yc h a i n sw e r ea m p l i f i e db yr t - p c rf r o m 陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备 t h e p b m c s o f v o l u n t e e r s w i t h h i g h t i t e r ( 1 ：2 5 6 5 1 2 b y i n d i t e c t a g g l u t a t i o n ) a n t i b o d y t o i 地( d ) a n t i g e n m e a n w h i l e ，t h eg e n e so f c o n s t a n tr e g i o n so f l i g h ta n dh e a v yc h a i n s w e r ei s o l a t e df r o mp c o m b 3 x ra n dp c o m b 3 x xp h a g m i dc a r r y i n gt h et e m p l a t e s r e s p e c t i v e l y vkl i g h tc h a i na n df dh e a v yc h a i nw e r el i n k e db yt h ef i r s ts p l i c i n g o v e r l a p p i n ge x t e n s i o np c r ( s o e ) ，a n daf u l l l e n g t hf a bg e n ew a sc r e a t e db yi h e s e c o n ds o e t h ef a bg e n ew a sl i g a t e dt op h a g m i dp c o m b 3 h s sa n dt r a n s f o r m e dt oe e o l ix l l 一b l u eb ye l e c t r o p o r a t i o n t h eo b t a i n e dh u m a nf a bp h a g ea n t i b o d yl i b r a r yw a s p a n n e du s i n gr h ( ) ，i 强( + ) r b cf o u rt i m e s t h ep h a g ea n t i b o d i e sa g a i n s tr h ( d ) w e r e h i g h l ye n r i c h e d i n d i r e c ta g g l u t a t i o nt e s t ，w e s t e r nb l o ta n a l y s i sa n ds e q u e n c i n ga n a l y s i s w e r ep e r f o r m e dt od e t e c tt h es p e c i f i c i t yo f f a ba g a i n s tr h ( d ) r e s u i j s 1 p r e p a r a t i o no fm a b sa g a i n s tb l o o dg r o u pa n t i g e n s 1 1m a b sa g a i n s tm n s sb l o o dg r o u pa n t i g e n s e i g h th y b r i d o m ac e l ll i n e sw e r eo b t a i n e d t h et i t e ro fs u p e r n a t a n tw a sb e t w e e n 1 2 - 4 - 1x 2 - s ，a n dt h et i t e ro fa s c i t i c f l u i dw a sb 蚋慨l 2 。7 二l 2 1 2 t h e i m m u n o g l o b u l i ns u b c l a s s e so f a l lt h em a b sw e r ei g ge x c e p t1 c 1 c 9 c 4 ，w h i c hw a si g m f o u ra n t i - mm a b sa n do n em a t inm a bw e r ed e t e r i m i n e db ya g g l u t i n a t i o nt e s tu s i n g p a n e le r y t h r o c y t e sa n dt h et e s to ft h ec o m b i n i n gs i t e si na n t i o d ya n t i g e n w e s t e r nb l o t a n a l y s i sp r o v e dt h a tt h r e em a b sr e e o g n i z e ag p a i g p bp r o t e i n ， 1 2m a b sa g a i n s tl ib l o o dg r o a pa n t i g e n ， t h r e eh y b d d o m ac e l ll i n e s a g a i n s tib l o o dg r o u pa n t i g e nw e r eo b t a i n e d t h et i t e r o fs u p e m a t a n tw a sb e l w v e e nlx 2 _ 4 _ l 矿t h ea s c i t i c f l u i dt i t e ro fa i o g s f g e 2 e 7w a s b e t w e e ni x 2 1 0 - - 1 x 2 一t h ei m m a n o g l o b u l i ns u b c l a s s e so f t h et h r e em a b sw e r ei g g 3 a n t i im a b sw e r ed e t e r i m i n e db ya g g l u t i n a t i o nt e s tu s i n gp a n e le r y t h r o c y t e sw i t l lt h e 扬州大学博士学位论文 a d u l tir a r eb l o o d a d u l tib l o o da n df e t a lib l o o d 1 3m a b sa g a i n s tk e l lb l o o dg r o u pa n t i g e n t h r e eh y b r i d o m ac e l ll i n e s ，4 h 2 a 8 、2 f 9 f 5a n d4 d 1 0 g 1l ，a g a i n s tk e l lb l o o dg r o u p a n t i g e nw e r eo b t a i n e d n 地t i e ro fs u p e m a t a n tw a sb e t w e e nl x 2 - 5 1 x 2 1 0 t h e i m m u n o g l o b u l i ns u b c l a s s e s o fa l lt h em a b sw e r e i g g l a n t i k e l lm a b sw e r e d e t e r i m i n e db ye l a s au s i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o np r o d u c to fk e l l 一3 0 e ( t h e3 0a m i n o a c i d sa tt h ec - t e r m i n a lo f k e l lp r o t e i n ) 2c o n s t r u c t i o no fs c f v 6 斫c 9 一h p v l 6e 7b i f u n c t i o n a lm o l e c u l e s e q u e n c i n ga n a l y s i so f s c f v 6 d t c 9s h o w e d t h a tt h eh e a v yc h a i no f 6 d 7 c 9 b e l o n g e d t ov h i is u b g r o u pa n dt h el i g h tc h a i nb e l o n g e dt ovki v s u b g r o u p w e s t e r nb l o t a n a l y s i sa n di n d i r e c ta g g l u t i n a t i o np r o v e ds c f vw a se x p r e s s e da n dh a da g g l u t i n a t i n g a z t i v i t y b a s e do nt h i s ，p b a d - s c f v 6 d 7 c g - h p v l 6e 7v e c t o rw a sc o n s t m c t c da n dt h e b i f u n c t i o n a lm o l e c u l ew a se x p r e s s e di ne ，c o l ia f t e rb e i n gi n d u c e db yi p t g w e s t e m b l o ta n a l y s i sc o n f i r m e dt h a tt h eb i f u n e t i o n a lm o l e c u l ew a sa b l et ob i n d 、 i mh p v l 6e 7 a n t i b o d yi ns e r u m ，b u ta g g l u t a t i n gr e s p o n s ef a i l e dt ob eo b s e r v e dw h e nh p v l 6e 7 a n t i b o d yi np a t i e n t s s c r t l r nw a sa d d e di n t ot h eb i f u n c t i o n a lp r o t e i na n dt h e nf - 姒t h e l a d d e df r e s hh u m a nr b c 3c o n s t r u c t i o no ff a b a n t i b o d ya g a i n s tr h ( d ) a n t i g e n t h er e p e r t o i r e o f h u m a n p h a g e d i s p l a y f a b l i b r a r y w a s 7 4 x 1 0 6 a f t e r 4r o u n dp a n n i n g w i t h g h ( - y r b c ，7c l o n e sw e r ec h e c k e df o rt h e i rb i n d i n ga c t i v i t i e sb ya g g l u t a t i o nt e s ta n d2c l o n e s c o u l db i n dt or h ( + ) r b cs p e c i f i c a l l y w e s t e r nb l o td e m o n s t r a t e dt h a tb a c t e r i a l l ye x p r e s s e ds o l u b l e f a bc o u l dr e c o g n i z eg h ( d ) a n t i g e n s e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eo b t a i n e dt w oc l o n e sh a d t h ei d e n t i c a lv i i a n dv kg e n e s t h eh e a v e ) , c h a i nb e l o n g e dt oh u m a nv h 3 - 2 3s u b g r o u pa n dt h e l i g h tc h a i nw a sv ti m s u b g r o u pg a n e 陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备 c o n c u l s i o n s 1m a b so b t a i n e d 1 ) f i v em a b sa g a i n s tg p aa n t i g e n 2 ) t h r e em a b sa g a i n s tg p a g p ba n t i g e n 3 、t h r e em a b sa g a i n s tia n t i g e n 4 ) t h r e em a b sa g a i n s tk e ua n t i g e n 2g e n e t i c e n g i n e e r i n ga n t i b o d i e s 1 ) s c f v a d 7 c 9h a dt h ea b i l i t yt oa g g l u t a t eh u m a nr b c 2 ) s c f v 6 w c s - h p v ( e 7 ) b i f u n c t i o n a lm o l e c u l ec o u l db ee x p r e s s e di nf u s i o n ，b u tt h e h p v l 6e 7a n t i b o d i e si np a t i e n t ss e i l 1 1 1 1f a i l e dt ob ed e t e c t e db ya g g l u t a t i o n r e s p o n 3 ) f a ba n t i b o d y ，w h i c hs p e c i f i c a l l ya g g u l a t e dr h ( + ) r b c ，w a s o b t a i n e d k e yw o r d s ：r e dc e l l ；m o n o c l o n a la n t i b o d y ；g e n e t i ce n g i n e e r i n ga n t i b o d y ；p h a g e d i s p l a ya n t i b o d yl i b r a r y 陈琦：红细胞血型单克隆抗体及基因工程抗体的制备! 英文缩写 r b c r h r h ( - ) m a b s c f v f a b v h v l c h c l h p v i g g g p a g p b e l l s a d n a d n t p e d t a l 啪 f i t c b p n t k d a 部分缩写的中英文对照 英文全名 r e d c e l l r b cw i t hk ha n t i g e n r b cw i l h o u tr h a n t i g e n m o n o c l o n a la n t i b o d y s i n g l ec h a i nv a r i a b l er e g i o nf r a g m e n t f a bf r a g m e m v a r i b l er e g i o no f h e a v yc h a i n v a r i b l er e g i o no f l i g h tc h a i n c o n s t a n tr e g i o no f h e a v yc h a i n c o n , q a t l r e g i o no f l i g h tc h a i n h u m a np a p o l l m a v i r u sv i r u s i m m u n o g l o b u l i n g g b ，c o p h o r i na g l y c o p h o r i nb e n z y m e - l i n k e x li m m u n o s o r b e n ta s s a y d e o x y r i b o n u c l e i ca c i d d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a m c e t i ca c i d i s o p r o p y l - b - d - t h i o g a l a c t o s i d e f l u o r e s c e i ni s o t h i o c y a n a t e b a s ep a i r n u c l e o t i d e k i l o d a l t o n 中文全名 红细胞 r h 抗原阳性红细胞 r h 抗原阴性红细胞 单克隆抗体 单链可变区片段 f a b 片段 重链可变区 轻链可变区 重链恒定区 轻链恒定区 人乳头瘤病毒 免疫球蛋白质g 血型糖蛋白a 血型糖蛋白b 酶联免疫荧光吸附试验 脱氧核糖核酸 脱氧核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 异丙基硫代半乳糖基 异硫氟酸荧光索 碱基对 核苷酸 千道尔颁 2 扬州大学博士学位论文 s o d i u md o d c c y ls u l f a t e n n n ，n - t e t r am e t h y le t h y l e n ed i m n i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e l h a n e r i b o n u c l e a s e r v e r s ea a n s c r i p t a m p i c i l l i n n e wb o v i n ey d e r u m r i b o n u c l e i ca c i d p o i y a c r y l a m i d eg e le l e c n o p h o r e s i s p h o s p h a t e ，b u f f e r e x ls a l i n e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p o l y e t h y l e n i m i n e m o l e i i t e r m i l l i l i t e r m i l l i m e t e r r o t a t ep e rm i n u t e d a y h o u r m i n u t e s e c o n d m i c m 簪a m m i c r o l i t e r v e 瞧l 坞 十二烷基硫酸钠 n ，n ，n n - 四甲基乙二胺 三( 羟甲基) 氨基甲烷 核塘核酸酶 逆转录 氨苄青霉素 小牛血清 核糖核酸 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 聚乙烯胺 摩尔浓度 毫升 毫米 辕愉 天 小时 分钟 秒 微克 徽升 比 哪 佻 盯 挪| 耋 枞 i 苣 嗽 嘟 删 眦 啪 呻。 。 咖 。 唱 ， 扬州大学博士学位论文 本课题研究意义 抗体的获得是红细胞血型鉴定的先决条件，红细胞血型抗体的研制之所以重 要主要体现在以下几个方面： 1 防止输血反应 输血是人类疾病治疗的重要手段，大量临床实践表明：除a b o 血型以外，其 它血型系统如r h 、k e l 、m n s s 、d i e g o 、d u b 、硒d d 、p 等的抗原抗体不合均会 造成严重的输血反应及新生儿溶血病，其发生率达l 。因此，在欧美等发达国家， 常规进行r h 、k e l l 、s s 等的血型检测。但在我国，临床上常常遇到a b o 血型相 配，但却出现因其它血型系统抗原抗体不合造成的交叉配血凝集现象，即使出现 这种情况，因血型鉴定用抗体在我国的严重匮乏，导致基层医院和血站无法做进 一步鉴定，因此我们制备的血型鉴定用抗体，是保证输血安全，防止输血反应的 基本条件。 2 是我国建立稀有血型库的需要 在长期进化过程中，2 9 个血型系统的3 8 个血型基因已出现了7 0 0 余种等位 基因，众多等位基因的出现是造成人群中稀有血型出现的根本原因。所谓稀有血 型是指此种血型抗原在人群中的分布比例 o 1 ，如m u r 血型在我国只发现了2 例，而r h ( ) 血在汉族人中的比例也只有o 4 。不同种族、不同地域的人其血型分 布差异很大，对一个民族和地区进行稀有血型的普查，是研究人种起源、人类迁 徙的重要手段。在欧美等发达国家，资料的收集及稀有血型库的建立早己开展， 我国有1 3 亿人口，5 6 个不同的民族，但稀有血型的分布、调查和研究工作却是空 白，目前上海血液中心已准备筹建我国自己的稀有血型库，而它的建立离不开大 量血型抗体