（微生物与生化药学专业论文）纳他霉素产生菌基因组重排选育高产菌株.pdf

天津科技大学 学位论文原创性声明 吣l i l l l l l l l i l l l l l m 川帅 y 17 9 7 3 8 2 本人郑重声明：所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究 成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包括任何其他个人或集体已经 发表或撰写的成果内容。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明 确方式标明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：王丰缸辱 n 日期：2 喟年q 月 j 日 专利权声明 本人郑重声明：所呈交的论文涉及的创造性发明的专利权及使用权完全归天津科 技大学所有。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名：螂 1 3 期：冰年q 月二日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授 权天津科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口( 请在方框内打“”) ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口( 请在方框内打“ ) 。 作者签名：孓奉酞享 导师签名：王级 日期：2 譬年犁月l 日 1 3 嫩j 洲年牛月l 日 摘要 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种多烯大环内酯类抗生素，能够有效抑制霉菌和酵 母菌的生物活性，是有广阔应用前景的生物防腐剂和抗真菌药物。 本论文以纳他霉素产生菌褐黄孢链霉菌s g 1 和s g 2 为出发菌株，应用基因组重 排技术选育纳他霉素高产菌株，并对基因组重排选育方法的优越性进行检验。主要内 容有以下几个方面： 首先，建立了褐黄孢链霉菌的原生质体制备再生与融合的较优条件，采用双亲灭 活的方法，进行两轮多亲本原生质体融合，通过琼脂块初筛和摇瓶复筛，最终得到1 株高产重排菌株f 2 2 ，其纳他霉素产量达到2 7 6 9 l ，比亲本菌株p s 3 提高了6 4 3 ， 比原始出发菌株s g 2 提高了9 7 1 。 其次，分别考察了简单的双亲本原生质体融合、传统的原生质体制备与再生和基 因组重排这三种选育方法对纳他霉素产量提高的影响，结果表明，两轮基因组重排后， 获得的重排菌株f 2 2 的产量比亲本菌株p s 3 的产量提高了6 4 3 ，而两轮原生质体 融合后，获得的融合菌株r 2 1 的产量比亲本菌株p s 3 的产量只提高了3 0 9 ，而反 复的原生质体制备和再生不能诱发菌株的正突变。实验证明基因组重排技术是一种高 效的菌种选育方法。 关键词：褐黄孢链霉菌；纳他霉素；原生质体融合：基因组重排 a b s t r a c t n a t a m y c i ni s o n ek i n do fm a c r o l i d ea n t i b i o t i c s 、析t i l2 6 - m e m b e r e dr i n gp o l y e n e 8 t n l c 眦，w h i c hh a sab r o a da p p l i c a t i o np r o s p e c ta st h eb i o - a n t i s e p t i ca n da n t i f u n g a la g e n t f o ri t sb i o l o g i c a la c t i v i t yt or e s t r a i nt h eg r o w t ho fm o l da n dy e a s t i nt h ep a p e r , s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u ss g 一1a n ds g 一2w e r eu s e da st h es t a r t i n g s t r a i n s t h e ng e n o m es h u f f l i n gw a su s e dt ob r e e dn a t a m y c i nh i g hp r o d u c t i o ns t r a i n ，a n di t s e f f i c i e n c yw a sv e r i f i e d 1 1 1 em a i nr e s e a r c hc o n t e n t sa n dr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s f i r s t l y , n l ec o n d i t i o n sf o rp r e p a r a t i o n , r e g e n e r a t i o na n df u s i o no ft h ep r o t o p l a s tw e r e o p t i m i z e d a f t e rt w oc y c l e so fr e c u r s i v ep r o t o p l a s tf u s i o n ，t h es h u f f l e ds t r a i nf 2 - 2w h i c h w e r es e l e c t e db ya g a rm e t h o da n df l a k ef e r m e n t a t i o nw a so b t a i n e d , w h o s en a t a m y c i n p r o d u c t i o nr e a c h e d2 7 6 9 l ，w h i c hw a si n c r e a s e db y6 4 3 a n d9 7 1 i nc o m p a r i s o n 谢t l l t h a to ft h ep a r e n t a ls t r a i np s - 3a n d o r i g i n a ls t r a i ns g 一2 s e c o n d l y , t h r e em e t h o d s ，w h i c hi n c l u d e ds i m p l et w o - p a r e n tp r o t o p l a s tf u s i o n , t r a d i t i o n a lp r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n dr e g e n e r a t i o na n dg e n o m es h u f f l i n g ，w e r eu s e dt o i m p r o v et h ep r o d u c t i v i t yo fn a t a m y c i nr e s p e c t i v e l y 1 1 圮r e s u l t ss h o w e d , a f t e rt w oc y c l e so f r e c u r s i v ep r o t o p l a s tf u s i o n , n a t a m y e i np r o d u c t i o no ft h es h u f f l e ds t r a i nf 2 2i n c r e a s e db y 6 4 3 i nc o m p a r i s o nw i mt h a to ft h ep a r e n t a ls t r a i np s - 3 a f t e rt w oc y c l e so fs i m p l e t w o - p a r e n tp r o t o p l a s tf u s i o n , n a t a m y c i np r o d u c t i o no f t h ef u s e ds t r a i nr 2 - li n c r e a s e db y 3 0 9 i nc o m p a r i s o nw i t l lt h a to ft h ep a r e n t a ls t r a i np s - 3 p r o t o p l a s tp r e p a r a t i o na n d r e g e n e r a t i o nc o u l dn o tl e a dt op o s i t i v em u t a t i o n i tp r o v e dt h a tg e n o m es h u f f l i n gw a sah i g l l e 舵c t i v eb r e e d i n gw a y k e yw o r d s ：& r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ，n a t a m y c i n , p r o t o p l a s tf u s i o n , g e n o m es h u f f l i n g 目录 1 前言1 1 1 纳他霉素概述1 1 1 1 纳他霉素的结构1 1 1 2 纳他霉素的稳定性1 1 1 3 纳他霉素的抑菌活性及安全性。2 1 1 4 纳他霉素的应用情况3 1 2 纳他霉素研究进展。4 1 2 1 纳他霉素产生菌4 1 2 2 纳他霉素发酵工艺研究进展4 1 2 3 纳他霉素基因工程研究进展。5 1 3 基因组重排育种研究概况5 1 3 1 基因组重排原理6 1 3 2 基因组重排的方法6 1 3 3 基因组重排的优点7 1 3 4 基因组重排的例子应用8 1 4 原生质体融合9 1 4 1 原生质体制备1 0 1 4 2 原生质体再生1 1 1 4 3 原生质体融合1 2 1 4 4 原生质体融合的标记1 3 1 5 本论文的立题依据与研究内容1 3 1 5 1 立题依据1 3 1 5 2 研究内容1 3 2 材料与方法1 5 2 1 材料。1 5 2 1 1 菌种1 5 2 1 2 主要药品。1 5 2 1 3 主要仪器1 7 2 1 4 培养基1 7 2 1 5 相关溶液1 9 2 2 实验方法。2 0 2 2 1 原生质体的制备与再生2 0 2 2 2 原生质体的融合。2 0 2 2 3 菌体干重的测定。2 1 2 2 4 纳他霉素产量的测定生物检测法。2 1 2 2 5 纳他霉素产量测定高效液相色谱法2 2 2 2 6 发酵液残糖的测定2 3 2 2 7 菌种保藏方法：2 4 2 2 8 纳他霉素发酵工艺2 4 3 结果与讨论：2 5 3 1 原生质体的制备及再生2 5 3 1 1 菌丝培养基对菌体生长、原生质体形成和再生的影响2 5 3 1 2 甘氨酸对原生质体形成与再生的影响2 6 3 1 3 菌龄对原生质体形成与再生的影响2 6 3 1 4 溶菌酶浓度对原生质体形成与再生的影响2 7 3 1 5 酶解温度对原生质体形成及再生的影响。2 8 3 1 6 酶解时间对原生质体形成及再生的影响。2 8 3 1 7 再生培养基的选择2 9 3 1 8 最佳条件下的原生质体制备与再生2 9 3 1 9 原生质体的形成过程。3 0 3 2 原生质体的融合和再生3 0 3 2 1 双亲株原生质体灭活剂量的确定3 1 3 2 2 原生质体融合条件的确定3 1 3 2 3 褐黄孢链霉菌最佳融合条件下的灭活原生质体融合3 4 3 3 琼脂块初筛方法的建立3 4 3 4 基因组重排菌种选育3 7 3 4 1 基因组重排选育菌株3 7 3 4 2 对照试验。4 0 3 5 重排菌株的菌落和发酵特性。4 4 3 5 1 出发菌株s g - 2 与重排菌株f 2 - 2 的菌落形态比较。4 4 3 5 2 重排菌株的遗传稳定性实验4 5 3 5 3 重排菌株发酵特性研究4 5 3 6 讨论4 7 4 结论。：j 4 8 1 ；j 是 l 基4 9 6 参考文献5 0 7 论文发表情况5 5 8 致谢5 6 天津科技大学硕士学位论文 1 前言 1 1 纳他霉素概述 。 1 1 1 纳他霉素的结构 纳他霉素( n a t a m y c i n ) 是一种多烯大环内酯类抗生素，其结晶粉末呈白色或乳白 色，几乎无臭无味，含有三分子结晶水。分子式为c 3 3 i 1 4 7 n 0 1 3 ，分子量为6 6 5 7 5 ，化 学结构如图1 - 1 所示。 图卜1 纳他霉素分子结构 f i g 1 - 1m o l e c u l es t r u c t u r eo fn a t a m y c i n 纳他霉素具有一个2 6 元内酯环，环外有一个糖苷键连接的碳水化合物基团氨 基二脱氧甘露醇( m y c o s a m i n e ) 。分子式中还含有4 个共轭双键，全为顺式。纳他霉素 是两性物质【1 1 ，分子当中含有一个碱性基团和一个酸性基团，其电离常数p k a 值分别 为8 3 5 和4 6 ，相应的等电点为6 5 。其结构上存在两种典型构型：烯醇式结构和酮式 结构，这就决定了它在许多溶剂中的低溶解性。纳他霉素在水中或低级醇中的溶解性 随着p h 的降低或升高而增加，在中性p h 下溶解度最低，而在p h 低于3 或高于9 时 溶解度增大【2 j 。 纳他霉素的四烯发色团使其具有一种高不饱和特性，可与溴和含活性氧的化合物 相互作用：此外，它以环氧族的形式保持弱氧化性，当纳他霉素在冰醋酸中用热的碘 化物处理后会析出碘。纳他霉素通过酸水解作用可以释放出海藻糖氨，内酯可以通过 碱水解作用皂化【2 l 。 1 1 2 纳他霉素的稳定性 纳他霉素干粉在避光避潮下是稳定的化合物，室温下保存几年只有很小一部分失 去活性。三水化合物同样稳定，但其无水形态不稳定，在室温封闭的瓶子中保存4 8 h 失去1 5 的活性。纳他霉素溶液在室温下稳定且活性最强。纳他霉素在含水乙醇中结 1 前言 晶，形成细长强烈双折射针型，有平行的消光性和正的延伸率。纳他霉素的稳定性受 p h 值、温度、光照、氧化剂和重金属等条件的影响而变化1 3 。5 1 。所以，产品应避免与 氧化物和硫氢化物等接触，最好储存在玻璃、塑料和不锈钢容器中，也可以通过添加 e d t a 或聚磷酸盐来防止失活【2 , 4 5 , 6 1 。 ( 1 ) p h 值：纳他霉素在p h 4 5 9 o 之间非常稳定，在极端p h 下纳他霉素迅速失 活，形成各种各样的分解产物。在低p h 值时其主要的裂解产物是海藻糖胺；在高p h 值时，如p i l l 2 ，由于内酯皂化可形成纳他霉酸，用强碱处理导致进一步的分子破裂， 产生一系列的后醛醇反应。据报道，p h 值对于纳他霉素的稳定性有一定的影响，但 对纳他霉素的抗真菌活性没有明显的影响。 ( 2 ) 温度：温度对纳他霉素的活性几乎没有影响( 在中性水溶液中) 。纳他霉素在室 温条件下是稳定的，5 0 放置几天或1 0 0 短时处理，其活性几乎无损失。1 2 0 条件 下加热不超过1 h 仍能保持纳他霉素的部分活性。 ( 3 ) 光照：纳他霉素在紫外光下分解，失去四烯结构。丫辐射也能使纳他霉素分解。 ( 4 ) 氧化剂：纳他霉素不宜与氧化剂如过氧化氢、漂白粉等接触，否则抑菌活性会 明显下降。防止氧化的方法是使用抗氧化剂，如叶绿素、抗坏血酸、丁基羟基茴香醚、 丁基甲苯等。 ( 5 ) 重金属：一些金属离子可以促进纳他霉素的氧化失活，尤其是铁、镍、铅、汞 等重金属。因此，纳他霉素适宜存放在玻璃、塑料或不锈钢容器中，也可以添加e d t a 或聚磷酸盐来防止失活。 ( 6 ) 鉴别用颜色反应：把纳他霉素晶体加入滴有一滴浓盐酸的点滴板上，颜色马上 变蓝；如果滴加一滴浓磷酸，颜色马上变绿，几分钟后，都会变成浅红色。 1 1 3 纳他霉素的抑菌活性及安全性 纳他霉素几乎对所有的霉菌和酵母具有抗性，是一种广谱的抗霉菌、酵母菌、某 些原生动物和某些藻类剂的多烯大环内酯类抗生素。但它没有抗细菌活性。这是由于 真菌的细胞膜含有麦角固醇，而细菌细胞膜中不含这种物质，多烯大环内酯类抗生素 能有选择的和固醇结合，结合的程度与膜的固醇含量成正比，结合后形成膜一多烯化 合物，引起细胞膜结构的改变，导致细胞膜渗透性的改变，造成细胞内物质的泄漏【7 】。 纳他霉素对于抑制正在繁殖的活细胞效果很好，而对于破坏休眠的细胞则需要较高的 浓度。纳他霉素对真菌孢子也有一定的抑制效果。1 9 5 6 年，t r e s n e r 8 j 曾测试过纳他霉 素对5 0 0 种霉菌的抗性，所有菌种都被1 1 0 u g m l 的纳他霉素抑制。1 9 5 9 年，k l i s 8 j 比较了纳他霉素、山梨酸、放线菌酮、制霉菌素、龟裂霉素等的抑菌效果，发现纳他 霉素对1 6 种在肉汤和琼脂中培养的霉菌是最有效的抑制剂，绝大多数霉菌在 0 5 6 9 9 m l 的纳他霉素浓度下被抑制，极个别的种在1 0 - 2 5 u g m l 的纳他霉素浓度下 被抑制，多数酵母菌在1 m 5 0 # g m e 的纳他霉素浓度下被抑制。魏宝东1 9 j 等人通过对 纳他霉素抑菌特性的研究也得到了类似结论。 纳他霉素无毒，并且不致突变、不致癌、不致畸、不致敏。由于其难溶于水和油 2 天津科技大学硕士学位论文 脂，纳他霉素很难被消化道吸收，大部分摄入的纳他霉素会随粪便排出。给奶牛饲喂 高剂量的纳他霉素，结果表明，9 0 的纳他霉素及其分解产物经粪便排出1 4 】，人口服 5 0 0 m g 纳他霉素后，在血液中的含量少于l m g m l 。1 9 6 6 年，l e v i n s k a s 等【4 j 研究了纳 他霉素的急性毒性和慢性毒性，证明纳他霉素对人体器官没有明显影响，也不产生伤 害。1 9 7 3 年h a m i l t o nm i l l e r 4 】报道纳他霉素口服毒性最小，静脉注射毒性极大。1 9 7 7 年，d eb o e r 和s t o l kh o r s t h u i s 4 研究了真菌对纳他霉素形成抗性的可能性，他们在连 续几年使用纳他霉素的食品仓库中，没有发现真菌形成抗性的证据，使用大于m i c ( 最 低有效抑制浓度 ) 的纳他霉素量，人为诱导也没有发现真菌形成抗性的证据。1 9 8 2 年， r a y 和b u l l e r m a n1 4 】报道纳他霉素能减少黄曲霉( a s p e r g i l l u sf t a v u s ) 产生的黄曲毒素、 赭曲霉( a s p e r g i l l u so c h r a c i n ) 产生的赭曲毒素、圆弧青霉( p e n i c i l l i u mc y c l o p i u m ) 产生的 青霉酸、展开青霉( p e n i c i u i u mp a t u l u m ) 产生的展开青霉素。因此，纳他霉素能减少真 菌毒素给人类造成的危害，是一种高效、安全的新型生物防腐剂。 1 1 4 纳他霉素的应用情况 1 1 4 1 世界各地的法规 1 9 8 5 年，s m i t h 和m o s s 报道：f a o 和w h o 给出纳他霉素的最大摄入量( a d i ) 为0 3 m g k g 体重。奶酪和香肠的一般消费者每天摄入量约为0 0 0 2 m g k g 体重【3 】。1 9 9 8 年g r a s 专家组认定纳他霉素用于酸奶、奶油、干酪、酸性稀奶油和农家干酪非常安 全。目前，荷兰、比利时、法国、西班牙、意大利、瑞典等国家都允许纳他霉素用于 干酪和硬香肠的防腐，荷兰还批准纳他霉素用于苹果和梨的防腐。在中国，纳他霉素 被批准用于干酪、肉制品、月饼、糕点、果汁原浆以及易发霉食品加工器皿的表面， 一般采用2 0 0 3 0 0 m g k g 悬浮液浸泡或喷洒，残留量不超过l o m g k g 。纳他霉素也被 批准直接添加到发酵酒、酸奶和色拉酱中，限量为l o m g k g ( 食品添加剂使用卫生标准： g b 2 7 6 0 _ _ 9 6 ，1 7 o ，防腐剂) 1 4 j 。 1 1 4 2 纳他霉素在食品中的应用 纳他霉素在食品中的应用研究较早，涉及乳酪、果汁、饲料、粮储等诸多领域。 1 9 8 2 年6 月，美国f d a 正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂i 刎。1 9 9 0 年1 月9 日，我 国卫生部签发了国内第一个生物食品防腐剂一乳酸链球菌( n i s i n ) 的使用证明，1 9 9 6 年，中国食品添加剂标准化技术委员会正式批准纳他霉素可作为食品防腐剂【5 】。乳酸 链球菌对革兰氏阳性腐败细菌有抑制作用，但对霉菌和酵母菌无效；而纳他霉素对霉 菌和酵母菌具有极强的抑制或杀灭作用，这一点正好和乳酸链球菌素的抑菌谱互补。 纳他霉素和乳酸链球菌素是目前国际上批准使用的仅有的两种生物食品防腐剂。 1 1 4 3 纳他霉素在医疗中的应用 纳他霉素除了用作食品防腐剂，还可药用。近几年，报导纳他霉素医疗应用的文 献越来越多，它的临床应用范围也越来越广泛，主要由于它具有以下一些优良性质： ( 1 ) 口服毒性非常低； ( 2 ) 没有证实通过肠道吸收； 3 1 前言 ( 3 ) 没有发现过敏性； ( 4 ) 没有碰到交叉抗性。 纳他霉素以几种制剂形式( 悬浮剂、乳剂、软膏和鞘状药片等) 被用于抗皮肤和粘 膜的真菌感染，既可以单独使用也可以与新霉素、氢化可的松及其它类固醇类药品共 同使用。纳他霉素还可用于阴道和肺部真菌感染的治疗1 3 , 5 , 1 0 。 1 9 9 7 年9 月，k a l i u z h n a i al d ，m u r z i n ae a 报导，不同剂量的纳他霉素用于治疗 由真菌引起的儿童皮肤和粘液膜感染非常有划1 1 】。最新的文献显示，纳他霉素已成功 的用于真菌性角膜炎的治疗中，临床应用方式为使用5 混悬液滴v 1 曼 1 2 , 1 3 1 。 此外，纳他霉素已成功用于真菌性角膜炎的治疗中，纳他霉素口服不吸收，限于 局部用药。因其难溶于水，临床上使用5 混悬液滴眼，眼部耐受且无毒性。 目前，纳他霉素已在乳制品、肉类、水果、饮料等食品工业中得到广泛的应用【l 引， 已经商品化生产的纳他霉素有美国c y a n a m i d 公司的m y p r o z i n e ，美国g b 发酵工业公 司的d e l v o c i d ，此外，还有n a t a f u c i n 、p i m a f u c i n 、n a t a m a x t m 等商品名称。其中，霉 克( n a t 衄趿1 m ) 是由纳他霉素和乳糖以1 ：1 ( 质量比) 的比例混合而成，可用于食品表面 防腐处理或直接添加到食品中。 1 2 纳他霉素研究进展 1 2 1 纳他霉素产生菌 纳他霉素产生菌为链霉菌，基内菌丝体通常发育良好，多分枝，无隔膜而连贯； 它的气生菌丝丰茂，气生菌丝通常较基内菌丝粗，颜色较深，当菌丝逐步成熟时，大 部分气生茵丝分化成孢子丝，产生呈长链的孢子。目前，报道的纳他霉素产生菌有恰 塔努加链霉菌( s t r e p t o m y c e sc h a t t a n o v g e n s i s ) a t c c1 3 3 5 8 ，纳塔尔链霉菌( s t r e p t o m y c e s n a t a l e n s s ) i s p5 3 5 7 和褐黄孢链霉菌( s t r e p t o m y c e sg i l v o s p o r e u s ) a t c c1 3 3 2 6 三株。 1 2 2 纳他霉素发酵工艺研究进展 早在1 9 6 0 年，c y a n a m i d 1 5 】就报道了发酵生产纳他霉素的传统方法。但接下来的 相关报道比较少，直到九十年代，有关纳他霉素的生产研究才重新受到关注。 1 9 9 3 年，m 八艾森申克【1 悯j ( c n1 0 7 1 4 6 0 a ) 报道了发酵法生产纳他霉素的菌 种培养和繁殖方法。专利i l n ( c n1 0 7 2 9 5 9 a ) 报道了通过控制发酵培养基的p h 值可以 提高纳他霉素的生产速率。在纳他霉素发酵主阶段即抗生素生产阶段，向发酵液中加 入适宜的p h 控制剂( 如n a o h 、k o h 、c a ( o n ) 2 等) 以控制发酵液p h 值，使其维持在 5 9 6 1 ，可提高纳他霉素生产速率和产率。同年，奥尔裂1 8 】的专利( c n1 0 7 0 6 8 8 a ) 报 道了连续发酵法生产纳他霉素。第一阶段，进行有效的菌种繁殖，伴随部分纳他霉素 的产生。在发酵的第二阶段进行连续生产，维持发酵液的体积基本不变，使加入培养 基的速度和取出发酵液的速度基本一致，维持至纳他霉素不再以成本有效的方式产 生，产量可达6g l 1 2 9 l 。 1 9 9 4 年，e i s e n s c h i n k 等人【1 9 1 的专利报道了流加碳、氮源进行纳他霉素发酵的过 4 天津科技大学硕士学位论文 程。指出发酵培养基中至少应有1 5 9 l 的蛋白氮源和8 0 9 l - - 2 5 0 9 l 的碳源，其中碳 源要不断流加，使碳源浓度保持在5 9 l 3 0 9 l ，纳他霉素产量可达至少5 9 l 。 2 0 0 0 年，e n s h a s y 等人【驯报道了接种物类型和培养条件对纳塔尔链霉菌产生纳他 霉素发酵的影响。指出用孢子悬液而不用营养细胞进行种菌繁殖，用于接种的孢子悬 液浓度应为1 0 8 个m l 。培养条件主要研究了溶氧水平对发酵的影响，并指出向培养 基中添加水溶性生物聚合物如褐藻酸钠可以降低溶解氧，使纳他霉素的产量下降。同 年，他们报道【2 1 】通过最佳碳、氮源的选择及其比例的优化，只使纳他霉素产量提高到 1 5 9 l 。 2 0 0 4 年，专利c n l 5 1 5 6 7 8 2 2 】报道了纳他霉素发酵、提取工艺。通过流加碳源及 控制发酵参数，可使产量达到4 0 g l - - - 5 6 9 l 。 1 2 3 纳他霉素基因工程研究进展 纳他霉素生产菌作为一种链霉菌，因其复杂的生活周期和次级代谢网络，对其分 子生物学的研究不但具有应用价值，也具有重要的理论意义。目前，世界上对纳他霉 素产生菌基因工程方面的研究仅刚刚起步，有关的文献很少。 1 9 9 9 年，a p a r i c i o 等人 2 5 1 研究了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的生物合成基因 簇，染色体组包含1 1 0 k b 碱基对。他们还报道了由功能基因分隔的两个亚簇编码的聚 酮合酶基因组，包含两个主要的基因p i m s o 和p i m s l ，p i m s o 编码一个相对较小的乙 酸激活聚酮合酶( p k s ) 基因( 大约1 9 3 k d a ) ，p i m s l 编码一个巨大的多酶基因( 大约 7 1 0 k d a ) 2 0 0 0 年，a p a r i c i o 等人【2 4 l 报道了纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的一个含1 6 个开 放读码框，s 4 9 s s b p 基因簇的序列，它是继制霉菌素后报道的第二个多烯大环生物合 成基因簇，它编码聚酮合酶( p k s ) 的1 3 个同源酶基因，p k s 被分配在五个巨大的多酶 系统中( p i m s 0 - p i m s 4 ) 。同年，m a r t avm e n d e s ，j e s u sea p a r i c i o 等人 2 5 1 又研究报道了 纳塔尔链霉菌中的一个隐蔽质粒p s n a l 的基因图谱和全部核苷酸序列，d n a 分子大 小9 3 6 7 b p ，g + c 的含量占7 1 3 ，拷贝数3 0 。p s n a l 包含七个开放阅读框，分别编 码不同的蛋白质。 2 0 0 1 年，m a r t a 等人【2 6 i 报道了从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌中获得的目的基因 片段p i m d ，它编码细胞色素p 4 5 0 环氧酶，负责将4 。5 去环氧匹马霉素 ( 4 ，5 d e e p o x y p i m a r i c i n ) 转变成匹马霉素。4 ，5 去环氧匹马霉素是一种生物活性物质， 是从纳他霉素产生菌纳塔尔链霉菌的一个重组突变体中分离得到的。 目前，对纳他霉素生物合成途径的了解还不像阿维霉素、红霉素等抗生素那么清 楚。尤其是合成途径中的某些基因功能还未完全明确，整个合成途径的调控也还未知， 对纳他霉素的结构改造工作也仅是刚刚开始。但随着人们对纳他霉素生物合成基因簇 理解的不断深入，将积极推动采用基因工程技术提高纳他霉素生物合成能力或改造其 化学结构的工作，而这些研究最终将促进抗生素产量、质量的不断提高和新型抗生素 的发现。 5 1 前言 1 3 基因组重排育种研究概况 2 0 0 2 年z h a n g 等在n a t u r e 上发表了一篇题目为“g e n o m es h u f f l i n gl e a d st or a p i d p h e n o t y p i ci m p r o v e m e n ti nb a c t e r i a ”的论文，在这篇文章中他们首次提到了基因组重 排( g e n o m es h u f f l i n g ) 的概念。基因组重排技术就是在传统诱变基础上，通过细胞融合 技术，对诱变后的微生物细胞进行基因组重组，从而将正向突变的菌株的优点结合在 一起，进而提高微生物细胞的正向突变频率及正向突变速度m2 8 1 。 1 3 1 基因组重排原理 基因组重排技术是在d n a 改组等定性进化技术的基础上发展起来的( 图1 2 ) ，是 分子定向进化在全基因组水平上的延伸，它将重组的对象从单个基因扩展到整个基因 组，因此可以在更为广泛的范围内对菌种的目的性状进行优化组合陋3 0 。进行基因组 重排首先需要有一个含有各种不同正突变的基因组库，随后通过原生质体融合将这些 正突变菌株的全基因组进行随机重组，并筛选目的性状进一步改进的菌株来进行下一 轮基因组重排，这样通过循环多轮的随机重组可以快速、高效的选育出表型得到较大 改进的杂交菌种【3 1 3 3 】。 图1 - 2d n a 改组过程 f i g 1 - 2p r o c e s so fd n as h u f f l i n g 1 3 2 基因组重排的方法 基因组重排是通过原生质体融合来实现的，是在模拟d n a 重组的条件下对原生 质体进行递推式多次融合( r e c u r s i v ep r o t o p l a s tf u s i o n ) ，最后筛选出具有多重正向进化标 记的目标菌株( 图1 3 ) t 弘3 5 1 。 在“g c n o m es h u f f l i n gl e a d st or a p i dp h e n o t y p i ei m p r o v e m e n ti nb a c t e r i a 一的这篇文 章中对基因组重排( g e n o m es h u 团j n 曲的具体做法如下【3 4 j ：在采用递推式原生质体融合 对目标菌株进行融合的过程中，首先要进行原生质体的制备，然后模拟d n a 改组的 反应温度条件对原生质体进行融合，然后在非选择条件下再生；再生原生质体孢子混 6 天津科技大学硕士学位论文 合培养，长成菌落后就构成了f 1 ，将f 1 再制备成为原生质体，同时用同样的方法再 进行融合再生，这一过程重复三次得到后代菌落。这一过程中操作的方法与原生质体 融合技术基本相同。 a 曩e 薯u 矗is e n n a i l n ，盯啊r 嘲阿咂-耵 嘲恺 一 ds h i 仃b 【“x 触 r o dp 哗1 y c 弦皓i a d _ 巾日r yt n 日 图1 - 3 诱变剂诱变与基因组重组技术对提高菌株突变率的影响 f i g 1 - 3t h ei m p a c to ni m p r o v i n gm u t a t i o nr a t eo fs t r a i n sb ym u t a g e na n dg e n o m es h u f f l i n g 1 3 3 基因组重排的优点 基因组重排即循环原生质体融合，与经典育种在每一代只有两个亲本进行重组相 比，具有多亲本杂交的优势。它的特点是l 姗j ： ( 1 ) 基因组重排的对象是细胞内整套基因组，在许多情况下，参与次级代谢产物生 物合成的结构基因在染色体上成簇排列，但控制结构基因表达的调节基因则位于生物 合成基因簇外，因此将微生物整套基因组视作一个单元进行基因组重排更适合于微生 物次级代谢产物产生菌的遗传改造。 ( 2 ) 用于基因组重排的亲本为多个亲本以增加突变基因的来源，多亲本原生质体融 合后的再生细胞不需进行分离、筛选或者经过简单的筛选，直接用作下一轮原生质体 融合的次级混合亲本，如此循环数次，以达到迅速产生基因组突变和重组的目的。 ( 3 ) 基因组重排技术无需了解微生物的代谢途径、编码生物合成酶的基因以及基因 表达调控的知识，尤其适用于在微生物代谢产物产生菌的遗传改造。 许多应用于发酵工业的生产菌株都是通过随机的诱变技术筛选得到的，这些菌株 可以生产氨基酸、核酸、维生素和抗生素等各类代谢物。虽然这种经典的方法极大的 促进了发酵工业的发展，但也具有比较大的缺陷：首先是效率低，筛选一株优良的生 产菌株需要大量的时间和工作量，重复的诱变过程也很难避免一些生产突变株的菌体 生长、对底物的同化利用和对极端环境的耐受性等特性都比野生型菌株要差。最后， 那些具有较强的突变能力的菌株经过多轮的理化诱变后可以产生更为多样性的突变 从而提高它们在诱变后的存活几率，因此通过诱变得到的生产菌株的遗传稳定性往往 比野生型菌株差。虽然近年来也发展了一些其它的菌种改良方法在某些方面解决了上 7 o_已i 1 前言 述不足，如在宿主细胞中转化入致突变基因以提高遗传稳定性、基于基因组信息的比 较分析的菌株重构方法等，但这些方法的应用也存在一定的局限性。同经典的诱变方 法相比，通过基因组重排技术可以更为快速和高效的筛选出优良菌株，而且这些菌株 往往剔除了负突变而集多种正突变于一体，因此在很大程度上弥补了经典诱变方法的 缺陷。 1 3 4 基因组重排的应用实例 尽管基因组重排技术诞生的时间较短，但是已经在许多领域获得了成功地应用， 其应用前景受到了人们的广泛关注，举例说明如下。 1 3 4 1 提高微生物的环境耐受性 研究采用乳酸细菌为实验材料进行。乳酸细菌在牛奶中生长时，易于受到环境变 化的影响。p a t n a i k 等f 3 9 加】研究人员在研究乳酸发酵时，采用基因组重排技术提高了 一株工业用乳酸杆菌的耐酸性。结果显示：经基因组改组技术改组后的乳酸杆菌菌株 在液体和固体培养基上培养时比野生菌株的p h 耐受性更高，在p h 4 0 时产生的乳酸 的量要比野生型高出3 倍。由此可见基因组改组不仅可以提高乳酸产量，而且可以提 高乳酸杆菌对环境的耐受性，这对解决微生物对环境的适应性及其他特征具有重大的 意义。 应用基因组重排在提高微生物对有毒物质的耐受性和降解能力方面也有成功的 例子。d a i 等【4 l l 通过三轮基因组重排将s p h i n g o b i u mc h o r o p h e n o l i c u m 对剧毒杀虫剂五 氯苯酚的耐受浓度提高了1 0 倍以上，并可将培养基中所含的3 r a m 五氯苯酚完全降解。 通过分析表明基因组重排可将包括导致提高菌体生长速率、五氯苯酚降解酶的组成型 表达和提高对五氯苯酚的抗性的多种突变组合在一起。 1 3 4 2 提高产品产量 ! 研究采用弗氏链霉菌为实验材料进行【3 4 1 。如图1 _ 4 所示，弗氏链霉菌是商业生产 泰乐菌素( t y l o s i n ) 的菌株，其中菌株s f l 是从自然界中分离到的野生型稳定单克隆： s f 2 1 是s f l 经过2 0 轮常规诱变得到的泰乐菌素高效生产菌株，m a x g e n 公司将野生 型菌株s f l 先进行了一轮常规诱变，然后通过两轮基因组改组，得到两个高产的菌株 g s l 、g s 2 。经分析g s l 、g s 2 的泰乐菌素产量是s f l 的9 倍多，比s f 2 1 还高，从统 计学上分析与s f 2 1 差异不大( 图1 - 4 b ) ：但从生理学角度上看，g s l 、g s 2 跟s f 2 1 相 比有明显的差异，s f 2 1 形成的是粗糙的小的单克隆，而g s l 和g s 2 与野生型s f l 菌 落形态相似，这一现象显示g s l 、g s 2 是比s f 2 1 更加性状优良的菌株。从上面的结 果我们可以看出，弗氏链霉菌通过两轮基因组改组得到了普通诱变剂需要2 0 轮诱变 才能得到的结果。从理论上讲，这是传统诱变过程与基因组改组之间的差异。而对于 研究者而言，是2 4 0 0 0 次实验与1 0 0 0 0 0 0 次实验之间的区别，也就是一年的努力与2 0 年工作的差异，见图1 - 4 a 。 由此可见，基因组改组技术可以大幅度地缩短菌株选育周期，同时基因组改组技 术采用的递推式重组技术在挑选种群中明显地增大了菌株的进化几率，扩大了变异范 8 天津科技大学硕士学位论文 围，增加了获得高产突变菌株的机会，可使得目的菌株更快地投产，产生效益【4 2 l 。 - 戽罚 c i m m i 翻l ( h n o m e s t r a i n 寸“盯i 岣 i m p r o w m m t ( 2 0 y l e m1 1y n r 10 6b _ 日i - ) 2 4 , 0 0 0m l a 8 s f l o s t r a i n t i t r e r e l gi 。1 ) $ f 11 - 0 士0 1 $ f