（生物医学工程专业论文）血浆蛋白质在生物材料表面的吸附和竞争吸附研究.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 吸附量与单组分吸附量相当。虽然材料表面的白蛋白吸附量高于纤维蛋白原吸附 量，但材料表面纤维蛋白原的竞争吸附能力却大于白蛋白竞争吸附能力。根据统 计热力学理论和均一位势模型，推导出b s a f g z 元蛋白体系在p e u l c p 复合材料 表面的竞争吸附模型方程。 关键词：生物材料，血浆蛋白质，牛血清白蛋白，牛血浆纤维蛋白原，等温吸附， 竞争吸附，吸附动力学 i i 重庆大学硕士学位论文英文摘要 a b s t r a c t p r o t e i nc a nb es p o n t a n e o u s l ya d s o r b e do n t o a n ys o l i ds u r f a c e ，w h i c hw a s d i s c o v e r e dv e r ye a r l ya n dh a sw i d er i s ei nb i o m e d i c i n e ，b i o m a t e r i a la n db i o e n g i n e e r i n g f i e l d s n l ea d s o r p t i o na n dc o m p e t i v ea d s o r p t i o no fp l a s m ap r o t e i n sw a st h ef i r s tp h a s e o ft h ew h o l eb l o o dc o a g u l a t i o np r o c e s sw h e nm a t e r i a l sc o n t a c t e dw i mb o o l d a n dt h i s a d s o r p t i o nl a y e rw a sm a i nr e a c t i o ns i t eb e t w e e nb l o o da n dm a t e r i a l s t h ev a r i e t ya n d q u a n t i t yo fa d h e s i o np r o t e i no nb i o m a t e r i a l sd e t e r m i n ef o l l o w i n gp l a t e l e ta d h e s i o na n d t h r o m b o k i n e s i sr e a c t i o n ，b u tt h e s ea r ea f f e c t e db yt h es b r f a c ep r o p e r t yo fb i o m a t e r i a l s s ot h er e s e a r c ho fp l a s m ap r o t e i na d s o r p t i o nb e h a v i o ri ss i g n i f i c a n ti nb i o c o m p a t i b l e m a t e r i a l s 1 1 l er e s e a r c hn o to n l yw i l lb ec o n d u c i n gt ou n d e r s t a n da n t i c o a g u l a t i o n m e c h a n i s mo f b i o m a t e r i a l ，b u ta l s ot og u i d eo u r s t u d yf o rn e wb i o m a t e r i a l sd e s i g n w ii n v e s t i g a t e dt h ea d s o r p t i o na n dc o m p e t i v ea d s o r p t i o no fp l a s m ap r o t e i n so i l p e u l c pc o m p o s i t eb i o m a t e r i a ls u r f a c eb yf l u o r e s c e n tq u a n t i t a t i v ea n a l y s i s 弛em a i n e x p e r i m e n t sa n d r e s u l t sw e r oa sf o l l o w s ： ( 1 ) b o v i n es 烈 b n la l b u m i n ( b s a ) a n db o v i n ep l a s m af i b r i n o g e n( f g ) w e r e f l u o r e s c e n tl a b e l l e dw i mf l u o r e s c e i ni s o t l a i o e y a n a t e ( f i t c ) f i t c b s aa n df i t c f g f l u o r e s c e n c es t a n d a r d 殂l r v ew a so b t a i n e d t h ee x p e r i m e n tr e s u l t ss h o w e dt h a tl a b e l l e d p r o t e i nw a sv e r ys t a b l eu n d e rs p e c i f i e dt e m p e r a t u r e l a b e l l i n gd i d ta f f e c ta d s o r p t i o n b e h a v i o r ( 2 ) t h ei s o t h e r m a la d s o r p t i o np r o c e s so ft h ep r o t e i ns o l u t i o nw i t hs i n g l e c o m p o n e n to np e u - l o pc o m p o s i t em a t e r i a ls u r f a c ew a sr e s e a r c h e d b s aa d s o r p t i o n q u a n t i t ya n df ga d s o r p t i o nq u a n t i t yo fp e u - l c pc o m p o s i t em a t e r i a ls u r f a c ew e r e d e c r e a s e dw h e nt h ee n v i r o n m e n t a lt e m p e r a t u r ef i s e d 1 1 1 em a x i m a la d s o r p t i o nd e n s i t y o fb s aa n df go fp e u l c pc o m p o s i t em a t e r i a ls u r f a c ew e r e1 6 3 2 8 i t g c m 2a n d o 2 5 8 3 1 u g c m 2 t h ea d s o r p t i o nh e a tb e t w e e nb s aa n dm a t e r i a l sw a s 一6 4 2 4k j m 0 1 a n d t h ea d s o r p t i o nh e a tb e t w e e nf ga n dm a t e r i a l sw a s - 4 3 8 4k j m 0 1 1 1 l cr e s u l t ss h o w e d t h a tt h ea d s o r p t i o no fb s aa n df go np e u l c pc o m p o s i t em a t e r i a ls u r f a c ew e r en o t o n l ym o n o - m o l e c u l a rl a y e ra d s o r p t i o n , b u ta l s ow e r ep h y s i c a la d s o r p t i o n ( 3 ) t h ea d s o r p t i o ne q u i l i b r i u mo fb s a a n df go np e u l c ps u r f a c ew e r ef i t t e d w i t hl a n g m u i rm o d e la n df r e u n d l i c hm o d e l o nt h eb a s eo ft h ed a t a , w eo b t a i n e d a d s o r p t i o ne q u i l i b r i u m m o d e l e q u a t i o n f o rb s aa n d f g u n d e rd i f f e r e n t t e m p e r a t u r e t h e s ec o n f i r m e da l b u m i na n df i b f i n o g e ni s o t h e r m a la d s o r p t i o nc o u l d i i i 重庆大学硕士学位论文 英文摘要 d e s c r i b eb yl a n g m u i ra d s o r p t i o nm o d e l ( 4 ) s i n g l ec o m p o s i t i o np r o t e i na d s o r p t i o nd y n a m i c so n t ot h es u r f a c e so f p e u l c p c o m p o s i t ew a si n v e s t i g a t e d a l o n gw i t l lt h ep r o t e i ni n i t i a lc o n c e n t r a t i o ni n c r e a s e d b s a a n df ga d s o r p t i o nq u a n t i t yo nc o m p o s i t es u r f a c ea l s ei n c r e a s e d ，a n dt h e nt h ea d s o r p t i o n t e n d e dt oe x l u i l i b d u m b yu s i n gap r o g r e s s i v ea p p r o a c hc o m p u t i n gm e t h o d ，t h e c o m p l i c a t e dk i n e t i c se q u a t i o nw a ss o l v e d t h e r a t ec o n s t a n t so fa d s o r p t i o n , d e s o r p t i o n a n dt r a n s f o r mo f b s aa n df gw e r ee s t i m a t e d ( 5 ) b s a - f gb i n a r yp r o t e i ns y s t e mc o m p e t i t i o na d s o r p t i o no n t ot h es u r f a c e so f p e u l c pc o m p o s i t ew a si n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf gw a sm o r ec a p a b l eo f c o m p e t i t i v ea d s o r p t i o nt h a nb s a o nt h es u r f a c e so fp e u - l c pc o m p o s i t e t h eb i n a r y p r o t e i nc o m p e t i t i o na d s o r p t i o nm o d e lw a se s t a b l i s h e d k e y w o r d s ；b i o m a t e r i a l ，p l a s m ap r o t e i n , b o v i n es c l b ma l b u m i n , b o v i n ep l a s m a f i b r i n o g e n ，i s o t h e r m a la d s o r p t i o n , c o m p e t i t i o na d s o r p t i o n , a d s o r p t i o n d y n a m i c s i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重庞太堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：c 司矛秀签字日期：2 明夕年钿，钼 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重庆太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重庞太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“4 ”) 学位敝作者虢周7 笔 签字日期：如夕年g 月。日 聊群：泐 签字日期卿年占月o 日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 引言 蛋白质是生命科学的重要研究对象，是由含有d n a 编码的2 0 种l 型i f , 氨基 酸，通过f t 碳原子上的取代基间形成的肽键连成的，是具有特定空间构象和生物 功能的生物大分子。蛋白质在固体表面的吸附涉及各种各样的生物物理现象，如 细胞粘附和生长、生物材料的血液相容性、补体的激活、血液凝固、油水界面和 气水界面蛋白有机膜层的形成等。总之，任何涉及到界面与蛋白溶液接触的过 程都会受蛋白在界面吸附的影响。因而，蛋白质的界面现象吸引了各个学科和背 景的学者的深入研究。 在生物医学领域，蛋白质吸附的研究有重要意义。当血液与人工移植材料接 触时，会发生血浆蛋白质的吸附，从而引起血液的凝固和免疫反应，如何阻止血 液蛋白质的吸附，以减少血液凝固是非常重要的。被吸附蛋白质结构、吸附量以 及吸附机理对活体内移植生物材料( 如人造血管、心脏、肾等) 的效果有着至关 重要的影响。近年来，通过对血浆蛋白质在固体表面上吸附的研究【2 翔，发现促进 某些蛋白质在移植组织上的吸附可以抑制许多有毒蛋白质、纤维蛋白原的吸附防 止血液的凝固。 蛋白质也参与了细胞一材料表面相互作用过程。细胞表面的粘附受体蛋白和 基底表面的配体蛋白之间的相互作用，调控细胞在表面的粘附和生长等生物学行 为【4 j 。如何充分利用蛋白质在界面的吸附特性及其生物学活性，设计生物材料或控 制细胞粘附和生长，是组织工程和生物医学工程等领域的重要研究内容。蛋白质 分子在表面的吸附特性与表面物理化学性质、蛋白本身的性质及其它蛋白的存在 与否密切相关。 目前人们对蛋白质在各种表面的吸附行为的认识还远未达到完善的水平。本 文的e l 的是研究血浆蛋白质在经化学修饰改性的复合生物材料表面的吸附和竞争 吸附行为，以指导新材料的设计与合成。 1 2 血浆蛋白质及其吸附特性 1 2 1 血浆蛋白质的组成 血浆是血液的重要组成分，呈淡黄色液体，相当于结缔组织的细胞问质。血 浆蛋白质是血浆中最主要的固体成分，含量为6 0 8 0 9 l ，血浆蛋白质种类繁多， 功能各异。用不同的分离方法可将血浆蛋白质分为不同的种类。目前临床较多采 用简便快速的醋酸纤维薄膜电泳法，所获得的血浆蛋白种类及正常含量见表1 1 。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 表1 1 血浆蛋白的主要组成 ! ! ! ! ! ! ：! ! 些翌生竺! ! 垩匹里型! 1 2 1 1 1 巴! 匹苎堂 血浆蛋白种类生成部位主要功能含量( g 1 0 0 m l 血浆) 白蛋白 白蛋白( a l b u m i n ) 存在于血浆中的水溶性很高的球状蛋白质。它占血液中总 蛋白质含量的5 0 6 0 ，其分子量为6 6 3 k d 的单链分子。人和牛的血浆白蛋白都 是由5 8 5 个氨基酸残基组成的一条肽链的蛋白质。分子内有大量极性氨基酸，所 以血浆白蛋白有很高的溶解度。它含有1 7 对二硫键。整个分子可以看成由3 个结 构类似的结构域组成，这三个结构域共形成两个疏水性的“口袋”：其中一个是由强 疏水性的基团组成，可以结合长链脂肪酸；另一个疏水性较弱。 血浆白蛋白在肝脏中合成。机体的营养状态、激素平衡、血浆中之渗透压等 因素均能影响其合成。白蛋白是目前研究较多的与生物材料血液相容性有关的血 浆蛋白。许多研究表明【5 t 6 l ，当生物材料高吸收血浆白蛋白和生物材料表面白蛋白 预处理后能够明显抑制材料的血液相容性。 纤维蛋白原 纤维蛋白原( f i b d n o g e n ，f g ) 又称凝血因子i ，分子量3 4 0 k d ，由肝细胞合成 和分泌，占血浆总蛋白的2 3 。f g 是由两个相同的组分组成的对称性的同质二 聚体，其中每个组分含有a c t ( 分子量6 6 k d ) 、b p ( 分子量5 2 k d ) 和t ( 分子量 4 6 5 k d ) 三条不同的肽链，大小约为4 5 0 x 9 0 a 。这三条链组成两条肽链并经肽链 的n 端通过2 9 对二硫键相连，在分子的中间形成一个球状的二硫键结构，b d 和t 链的c 端结束于分子的两侧，形成球状结构域。 纤维蛋白原是血浆中含量最高的凝血因子，在血液凝固和血小板聚集中均具 有重要作用，是生物材料吸附蛋白的主要成分。大量研究表明【7 8 】，纤维蛋白原水 平的变化不仅与凝血、出血性疾病、应激等有关，而且与冠心病、心肌梗死、脑 血管病等有关，因而纤维蛋白原的研究倍受关注。 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 2 2 蛋白质吸附的机理 蛋白质吸附过程是多种形式的相互作用的结果。研究认为，蛋白质吸附过程 中的相互作用包括氢键、静电和疏水等非共价的相互作用【9 】。三种相互作用的本质 都与静电作用相关。其中氢键的形成是由于电负性原子与氢形成的基团中，氢原 子周围分布的电子少，正电荷氢核与另一电负性强的原子之间产生静电吸引，从 而形成氢键。疏水相互作用又称为非极性相互作用，发生于非极性基团之间，蛋 白质同时含极性和非极性的基团，当蛋白质处于水溶液中时，极性基团之间以及 极性基团与水分子之间易发生静电吸引而排开非极性水基团，因此疏水相互作用 并非是疏水基团之间有吸引力的缘故，而是非极性基团由于避开水的需要而被迫 接近f j0 1 。这些相互作用本身与小分子的吸附没有差别。蛋白质吸附的独特性在于 吸附的是大分子，以及吸附过程蛋白质可以发生各种物理( 如构象变化) 和化学 的变化，从而导致生物学活性( 如酶活) 的变化。 由肽链结构可知，无论多长的肽链，其一端一定有一个游离的氨基酸( n h 2 ) ， 另一端有一个游离的羧基( c o o h ) 。根据蛋白质种类不同，组成肽链的氨基酸系 列有所不同。碱性氨基酸( 如赖氨酸) 有两个n h 2 ，而酸性氨基酸( 如谷氨酸) 有 两个羧基，形成肽链只用一个氨基和羧基，在肽链表面保持一个自由氨基或羧基， 导致蛋白质表面带正电和负电。因此，象氨基酸一样，蛋白质也属于两性电解质， 根据所处溶液p h 不同，表面净电荷可正可负。 蛋白质的三维空间结构和表面酸性氨基酸和碱性氨基酸基团的密度将决定其 吸附性能。由于蛋白质表面大都含有带负电的酸性氨基酸基团和带正电的碱性氨 基酸基团，有研究认为蛋白质在材料表面的吸附过程的推动力主要通过蛋白的表 面电荷与吸附基体表面的相反电荷发生静电吸引作用建立离子键【h 】。因而，控制 蛋白质在材料表面吸附行为的主要因素是肽链的侧链氨基酸基团表面上自由氨基 n h 4 + 和羧基c o o 。同时生物材料的表面界面性质对蛋白质的吸附速率、吸附量和 吸附机理有重要的影响。在生理环境中( p h = 7 2 7 4 ) 大部分蛋白质都带负电， 材料本身的表面电性将影响蛋白质在材料表面的吸附【坦】。 蛋白质是具有一定空间构象的生物大分子，所以蛋白质吸附也必须考虑到空 间的位阻效应，界面的几何形状对其构象也有一定的影响。温度也会影响蛋白质 吸附过程，对一般的吸附而言，吸附都是放热反应，所以温度的升高不利于吸附 的进行，而且蛋白质是具有生物活性的分子，温度太高容易导致蛋白质的失活。 此外，血浆稀释倍数和吸附时间也是吸附的因素之一。 1 2 3 蛋白质的竞争吸附 研究材料表面吸附蛋白的种类和数量，一直是血液相容性研究的重要内容之 一。近年来的文献中，除继续关注血浆中最为重要和常见的白蛋白( a l b u m i n , a l b ) 、 重庆大学硕士学位论文1 绪论 纤维蛋白原( f i b r i n o g e n ，f g ) 和球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 在材料表面吸附状 况外，还进一步研究了以往较少注意的v w 因子( y o nw i l l e b r a n df a c t o r , v w f ) 、纤 维连接蛋白( f i b r o n e c t i n , f n ) 、波连蛋白( v i l r o n e 。o t i n ) 等与生物材料表面的相互 作用过程d 3 - 1 5 。c n u n k c m e i e rj m 等1 4 1 研究发现v w 因子会与血小板表面上的受体 g pib ( g l y c o p r o t e i nib ) 结合后，引起血小板内游离钙离子浓度升高，导致血小 板内颗粒物质释放，引起血小板聚集、变形及表面p 一选择素暴露。t s a i 等f j5 】研究 发现血浆中的纤连蛋白和波连蛋白也会与血小板面特异性受体结合，参与材料表 面引起的血小板的活化过程。 研究认为，蛋白质吸附是一个竞争性的过程，材料表面最初所吸附的蛋白质 可被血浆中体积较大的和不易溶解的疏水性蛋白质所取代。材料长时间与血液接 触后，蛋白质的吸附才趋于平衡。目前对生物材料表面蛋白质吸附的研究主要集 中在白蛋白和纤维蛋白原”6 1 。纤维蛋白原一方面促进血小板反应，另一方面可被 一种参与内源途径凝血的高分子量蛋白质所替代。二者均与凝血有关。 为了研究蛋白质吸附层组成对抗凝性的影响，l y m a n 、b r a s h 和b a i e r 等 1 7 j s 】先 把高分子生物材料分别在白蛋白、y - 球蛋白及纤维蛋白原等溶液中进行单独吸附 然后研究它们的抗凝血性。结果预先吸附白蛋白的高分子材料其血小板的吸附量 最少，而且表现出较好的抗凝血性，而预先吸附纤维蛋白原或t 球蛋白的则恰恰相反， 它们都粘附大量的血小板而表现出较差的抗凝血性。 在体外的血浆研究中发现，f g 的吸附会随着血浆浓度的降低而增加，有一个 最大吸附的血浆浓度。当血浆浓度大于最大吸附的血浆浓度时，吸附力学曲线达 到最大值后，吸附量会随时间的延长逐渐降低。且随着血浆浓度的降低，达到最 大吸附的时间也延长；若血浆浓度低于最大吸附的血浆浓度，贝l j f g 的吸附随时间 的延长而逐渐增加，直至达到吸附平衡，即恢复为常见的l a n g m u i r 等温吸附。这 一现象就是著名的 v r o m a n 效应”，其产生是f g 被血浆中其它与材料表面有更大亲 和力的蛋白成分( 如h m w k ) 置换所致 1 9 i 。 许多材料都发现存在v r o m a n 效应，但f g 被置换的程度各不相同，差异很大， 置换f g 的蛋白种类亦因材料不同而异。实际上，w o m a n 效应并不是f g 独有的现象。 l c n s e nh g 等【2 0 】用免疫技术测定研究了a l b ，i g g 和f g 在聚苯乙烯( p s ) 和聚氯乙烯 ( p v c ) 表面的吸附情况，结果发现，不是f g ，而是a l b 和i g g 在中等血浆稀释倍 数时出现了最大吸附。黄嘉 2 q 用不同稀释倍数的血浆和相同的蛋白在聚碳酸醋 ( p c ) 和p v c 上对此进行了检验，证实三种蛋白都有v r o m a n 效应。f n 的v r o m a n 效 应也在p s 和玻璃表面被观察到【2 2 1 。 由此可见，v r o m a n 效应具有普遍性，它反映了血浆蛋白对材料表面有限位点 的竞争吸附。 4 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 3 生物材料与蛋白质的相互作用 1 3 1 蛋白质在材料表面的吸附过程 早在上世纪6 0 年代就已经发现，生物材料植入体内后，蛋白质在材料表面的 吸附是继水和无机盐离子吸附后在几秒钟内发生的。血小板和血液中的其他有形 成分直到1 r a i n 后才开始黏附，此时蛋白质层的厚度约2 0 r i m ，而后再在蛋白质吸附 层上进一步诱发血液的凝卧2 引。也就是说，生物材料的抗凝血性是通过其表面对 血浆蛋白的吸附而表现出来的。因此，从那以后，高分子材料表面的组成与结构跟蛋 白质吸附层的关系以及蛋白质吸附层的组成与结构跟材料抗凝血性之间的关系就 一直是生物材料研究的一个重要内容。 靠近 1j r 9 士2 = = = = = 广1 弋7 黏附 脱附 图1 1 蛋白质在生物材料表面的吸附和脱附过程 f i g1 1a d s o r p t i o na n dd e s o r p t i o no f p r o t e i no n t ot h es u r f a c eo f b i o m a t e r i a l s 1 运输性质；2 - 溶剂介导的蛋白质材料之间的相互作用； 3 - 蛋白质材料之间的短程相互作用；4 一释放结合水和抗衡离子作用引起的熵增： 5 蛋白质变性引起的熵增；6 一溶剂热扰动；7 一溶剂剪切流动；8 其他吸附质取代 有关蛋白质在材料表面的吸附行为有非常多的综述报道。一般认为，决定蛋 白质在材料表面吸附和脱附行为的物理化学因素通常有8 种( 图1 1 ) 。从蛋白质靠 近材料表面，到在生物材料表面黏附，到从材料表面脱附的每一个过程中都有其 独自的特征。在靠近过程中，蛋白质分子的运输性质和蛋白质与材料表面的本征 5 些 重庆大学硕士学位论文1 绪论 相互作用共同决定蛋白质靠近表面的程度，它们也同时受溶剂分子运动和其本身 分子运动性质的影响【2 4 】。 ， 在黏附过程中，以下三个因素构成稳定黏附在材料表面的驱动力：( 1 ) 蛋白质 和材料界面间的短程相互作用；( 2 ) 材料表面使蛋白质变性引起的熵值增加 2 5 1 ； ( 3 ) 由于在蛋白质与表面之间释放结合水以及相反电荷离子而引起的熵增 “。 在蛋白质从材料表面的脱附过程中，有三个因素使黏附表面去稳定化并引起 脱附：( 1 ) 热扰动；( 2 ) 剪切流动；( 3 ) 其他能够更稳定地吸附于表面的物质和蛋 白质竞争吸附所做的功。 1 3 2 材料表面物理化学性质对蛋白质吸附的影响 材料表面物理形貌 除了通过晶体断裂才能得到平整的表面外，任何材料都不可能避免地具有一 定的表面形貌。生物材料的表面形貌既包括非人为的无规形貌，也包括人为的具 有规则几何形状的表面形貌。材料表面的粗糙程度会影响材料表面所吸附的蛋白 质的种类和数量。一般认为，对于同种材料而言，材料表面光洁度的提高因较少 地吸附蛋白质而有利于减少血栓的形成，粗糙程度过高的材料容易引起凝血。 研究者提出，具有抗凝血性能的材料，应该在0 1 o 2 t t m 范围内具有物理的 或化学的不均匀微相分离结构存在【27 1 。人们从中得到启示，仿制血管内膜的结构 研制“伪内膜”生物材料，以提高抗凝血性能。 材料表面的亲疏水性 生物材料表面的亲，疏水性是影响蛋白质吸附、细胞粘附的一个重要因素【2 羽。 亲水性的表面吸附作用较弱，并且是可逆的，这有利于调整材料的结构以减少蛋 白吸附、适应细胞的生长；疏水性的表面吸附作用强，又不可逆，不易形成材料 结构的重建。如果高聚物的侧基含有亲水性基团，如一o h ，c o o h ，c o n h 2 ，n h ， s 0 3 n a ，一s 0 3 h 等，则材料的生物相容性有所改善，特别体现在抗凝血作用的提高。 这主要是因为亲水性基团所构成的亲水区容易黏附白蛋白，对血小板的黏附有阻 碍作用，不易形成血小板在材料表面的黏附、聚集和凝血系统的激活，从而阻止 了血小板血栓的形成；在疏水区则有选择性的吸附y 球蛋白和纤维蛋白原，吸附 之后所引起的蛋白构象改变要比亲水性表面吸附的蛋白大。疏水性表面能与球蛋 白分子上的f a b 部分吸附，另外，球蛋白分子上的f c 部分则指向外侧，而血小板 表面含有f c 受体，两者结合，进一步促使疏水性表面更容易吸附血小板。 由于细胞和材料之间的粘附是以蛋白质为介导而发生的细胞膜上的受体能特 异性地识别材料上粘附的蛋白质，因而材料必须具有一定的疏水性才能吸附蛋白 质。所以并不是亲水性越强，抗凝血性能越好，而是要求材料的亲水性区域和疏 水性区域有一个适宜的比例，具体体现微相分离结构的结构，才能反映材料具有 6 重庆大学硕士学位论文1 绪论 较好的抗凝血性能。 由于血管内膜有亲水区和疏水区所构成的微相不均匀分离结构，使得血管具 有独特的抗凝血性和血液相容性。微相分离结构是指材料表面有两种或两种以上 的分子或基团形成不同的微相区( 即亲水区和疏水区) ，亲水区和疏水区比例不同， 分别构成材料的连续相和分散相，材料中的连续相决定并控制着材料微相区的结 构和性能。例如，亲水性的羟乙基丙烯酸甲酯( h e m a ) 和疏水性的苯乙烯制成 a b a 型的嵌段共聚物具有微相分离结构，其中h e m a 作为共聚物的连续相，苯乙 烯作为共聚物的分散相，苯乙烯分散在h e m a 中，h e m a 决定着生物材料的性质。 材料微相分离结构的形式可以体现亲水性疏水性、正负电荷、结晶态非结晶 态等结构，所以在材料表面往往存在着化学及物理性质的不同，使得材料具有独 特的性能。例如，材料大分子链上含有聚集态的亲水链和疏水链时，可以降低血 浆纤维蛋白的吸附，提高材料表面的抗血栓性能。用四氧化锇固定技术及电子显 微镜观察发现，具有微相分离结构的高聚物材料与血液接触后，不同的血清蛋白 可以被选择性吸附在材料表面不同的区域，如血清白蛋白易吸附于材料表面的亲 水区，y 球蛋白和纤维蛋白原则在材料表面的疏水区可以被选择性吸附。 材料表面能 大量体外实验证明，蛋白质的吸附和细胞的粘附、增殖与相接触材料表面的 生物特异性直接相关，基材的表面能量影响哺乳动物细胞的粘附【2 9 1 。一般认为， 表面能较高的表面比能量较低的表面更有助于促进细胞在生物材料表面的粘附。 这主要是由于材料的表面能会影响到血清中的蛋白质在材料表面的吸附，进而介 导细胞的粘连。 s h e l t o n 等 3 0 l 指出材料表面能与凝血所需的界面反应能密切相关。疏水性材料表 面自由能较低，与血液界面亲和性较大，因而呈现良好的抗凝血。具有亲水性表 面的材料，由于与血液界面亲合性较大，使其界面自由能大大降低，减少了对血 液多种组分的吸附和相互作用，因而同样呈现良好的抗凝血性能。一般来说，材 料表面自由能越低，抗凝血性能越好。p e t e r 等【3 1 】提出，材料的临界表面张力为 2 0 x 1 0 。3 0 x 1 0 - 3 n m 时，材料具有较好的血液相容性。 材料表面电荷 细胞电泳测定表明，红细胞、白细胞和血小板表面、蛋白质等都带有负电荷， 血管壁也呈负电性( 1 2 8 m v ) ，所以血液在血管中流动，不易引起血栓形成。 一般认为，如果材料表面带有适量的负电荷，它可以阻止这些细胞和蛋白的黏附， 具有较好的血液相容性。多数实验证明带负电荷表面比正电荷或无电荷表面所引 起的凝血要少，但也有些实验结果得到相反的结论。玻璃、陶瓷表面带有负电荷 却引起了强烈的血液凝固反应，这主要是因为这些负电荷激活了凝血因子而导 7 重庆大学硕士学位论文1 绪论 致内源性凝血。这也进一步说明血液相容性不仅与表面电荷的性质有关，还与其 他因素( 如电荷密度、微相分离结构、材料的亲水性或自由能) 有关。 有人提出p ”，宏观呈现负电而微观小区域带正电的微相分离结构才具有良好 的抗凝血性能，为了抑制血小板的黏附，材料总体呈负电荷，在局部微观上为防 止凝血因子的活化，在1 0 0 a 范围内带正电荷。而且，材料表面的电荷分布及电荷 密度对材料血液相容性也有着重要的影响，只有在某一适当的电荷密度下，材料 的抗凝血效果才最好，如果材料表面的电荷密度较大，同样能影响血小板的功能。 另外，材料表面带负电荷会引起某种蛋白质的吸附形成钝化层，材料对血液的毒 性减小，从而使材料具有更好的血液相容性。 材料表面化学官能团和生物活性因子 聚合物材料表面的化学官能团对蛋白质吸附和细胞黏附有重要的影响。某些 官能团如羟基、氨基、羧基、酰氨基、磺酸基等可通过调节表面的亲水性和表面 电荷而减少蛋白质的吸附、促进细胞的黏附和生长，而砜基、硫醚、醚键等对蛋 白质吸附及细胞生长的影响不大，刚性结构如芳香聚醚类则不利于蛋白质的吸附 及细胞的黏附。采用等离子技术将磺酸基引入材料表面，可使其模拟肝素的生理 活性而提高材料的抗凝血性。利用接枝聚合技术可将含有羟基、羧基和酰氨基等 官能团的单体接枝于聚氨酯表面，以提高其对人体血管内皮细胞的相容性【3 3 1 。 将生物活性因子固定在材料表面是减少蛋白质吸附及提高材料细胞相容性的 最有效手段之一，但也存在着成本高、活性因子易失活的缺点。常见的活性因子 包括各种贴壁因子( 如f n 、v n 、胶原、聚赖氨酸) 、各种生长因子如成纤维细胞 生长因子( f g f ) 、促进骨和软骨组织形成的骨形态发生蛋白( b m p ) 、血管内皮 细胞生长因子( v e g f ) 等1 。a n n 等【3 4 】应用胺解后层。层自组装技术，在聚乳酸的 表面引入了生物活性大分子胶原，在其表面种植静脉血管内皮细胞，研究发现胶 原的引入大大提高了聚乳酸表面的细胞相容性。武忠等【3 5 】采用液相合成法合成 r g d ( a r g - g l y - a s p ) 三肽，然后用紫外光辐射与化学偶合相结合的方法将r g d 接 枝到聚酯( p e t ) 薄膜上，种植体外培养的人脐静脉内皮细胞( h u v e c ) ，定常流 条件下研究发现接枝r g d 肽可以提高材料表面黏附细胞稳定性。 1 3 3 蛋白质吸附与生物相容性 蛋白质在生物材料表面的吸附相当复杂，对于蛋白质的吸附是单分子层还是 多分子层，可逆还是不可逆等问题，文献中的争论很多。一般的观点认为：疏水 性的表面比亲水性的表面更容易吸附蛋白质分子。从热力学上解释，当溶液中的 蛋白质分子吸附于疏水性材料表面时，其分子链的构象进行调整，使得分子链中 的疏水部分与疏水性的材料表面相互接触，而分子链中的亲水性部分则与水分子 相互作用。蛋白质的这种吸附行为破坏了水分子在疏水性材料表面的疏松有序排 重庆大学硕士学位论文1 绪论 列，增大了体系的熵值，降低了水与材料表面之间的表面自由能，在热力学上是 有利的。反之，随材料表面亲水性的提高，蛋白质在材料表面的吸附将逐渐变为 热力学上不利的行为。从动力学上解释，疏水材料表面与蛋白质分子中的疏水部 分之间的吸引力有利于蛋白质分子在材料表面的吸附，而亲水材料表面的水化层 和蛋白质分子周围的水化层之间的排斥作用不利于蛋白质的吸附。血浆中自蛋白 的分子链中不含有亲水糖链，是疏水性最强的蛋白质，其在疏水性表面的吸附也 最容易发生。 材料的生物相容性受许多因素的影响，如表面的物理形貌、亲疏水性、表面 能、电荷性质、化学官能团和生物活性因子等。事实上，上述材料性能对生物相 容性的影响在微观的本质上都与表面黏附蛋白的构象密切相关。材料界面蛋白质 细胞生物系统相互间的信息传递决定了材料的生物相容性，然而目前仍无法确定 知道材料和生物系统间究竟是怎样发生作用的。尽管如此，初步的研究表明，吸 附于生物材料表面的蛋白质能否维持其天然的空间构象是决定生物材料是否具有 良好生物相容性的重要因素 3 6 , 3 7 。当吸附于材料表面的蛋白质能够维持其天然构 象或未产生可以引发不良级连反应的构象时，细胞在该材料表面表现出良好的相 容性能；反之，当吸附的蛋白质发生变性或产生可以引发不良级连反应的构象时， 则细胞在该材料表面表现出差的相容性能。 1 4 蛋白质吸附的研究方法 蛋白质几乎可以自发地吸附在任何表面上，这种现象很早就己经被人们发现， 自1 9 3 0 年以来，文献上己经不断有关于蛋白质吸附的研究报导。最开始的时候， 这些研究主要集中在确定蛋白质分子量、电泳和色谱等方面。后来的报导侧重于 关于吸附的机理，特别是发生蛋白质结构重排时一些机理的研究。总体上说，蛋 白质吸附的研究方法可以分为三类：即( 1 ) 电学性质方法；( 2 ) 光学性质方法； ( 3 ) 光谱技术。 1 4 1 红外光谱法 m o r r i s s e y 和s t r o m b e r g 最早利用红外光谱( i n f r a r e ds p e c t r o s c o p y ) 技术来测定 血液蛋白的羰基在硅胶表面上的结合率。随后，k o u t s o u k o s 等人利用此方法研究 了白蛋白在a f 0 2 0 3 表面上的吸附。二者的数据均表明在蛋白质等电点附近，先被 吸附的蛋白质分子结构变化较小，而吸附层外层的蛋白质分子结构却发生了较大 的变化，这可能是横向相互作用的结果。 但是，由于在吸附环境中有水的存在，会干扰蛋白质分子的红外吸收。为了 避免这种情况，在实验中需采取特殊方法处理，如烘干后分析，或者将溶液中的 水以重水d 2 0 代替。衰减全反射傅立叶红外光谱( f t m r ) 可以测定蛋白质的 9 重庆大学硕士学位论文1 绪论 二级结构，适合于研究蛋白质在溶液中或吸附载体上的结构变化。利用f t i r a t r 技术，s e r v a g e n t 等吲比较了b s a 在各种不同表面上吸附时的构象变化；l i n g 等【3 9 l 研究了* 蛋白酶在页硅酸盐上吸附时构象变化与酶活性变化的关系；王东安等i 椰】 对牛血清白蛋白( b s a ) 在聚醚氨酯( p e u ) 涂覆改性材料表面的静态吸附进行了 定量表征。 1 4 2 荧光标记法 某些荧光物质( 如异硫氰酸荧光素、卟吩、四环素等) 在与蛋白质作用后， 荧光强度显著增大，且荧光强度与溶液中蛋白质的浓度呈线性关系，因此可用以 测定蛋白质的含量。荧光标记的目的是生产出最大发光量的蛋白质，且在溶液中 仍具有活性。 异硫氰酸荧光素( f 1 u o r 鼯c e i ni s o t h i o c y a n a t e ，f i t c ) 是荧光分析中最常用的荧 光标记物之一。在碱性条件下，f i t c 分子中的异硫氰基可直接与蛋白分子中的自 由氨基经碳酰化反应形成硫碳氨基键，称为荧光蛋白标记。黄春保等【4 ”采用反相 流动注射方法，研究了碱性介质中，次氯酸钠氧化异硫氰酸荧光素牛血清白蛋白 ( b s a ) 标记物的化学发光行为；詹东妮【4 2 1 以牛血清白蛋白( b s a ) 和牛血浆纤 维蛋白原( f g ) 为标记对象，以f i t c 为荧光探针，进行蛋白质的荧光标记，建立 荧光定量方法。 1 4 3 圆二色光谱法 圆二色( c i r c u l a rd i c h r o i s m ，c d ) 光谱是研究蛋白质二级结构常用的方法。其 基本原理就是测量光活性物质对左右圆偏振光的吸光率之差。从圆二色光谱可以 获得蛋白质二级结构中a - 螺旋含量的变化，c d 数据拟合可以用来计算蛋白质的二 级结构和分析蛋白质的三级结构4 3 1 。k o n d o p 4 卅用c d 法测量了纳米硅胶( 1 5 r i m ) 作吸附剂时蛋白质的二级结构，由于纳米粒子在测量波长内引起的散射干扰很小， 因此可以直接对含有吸附剂的蛋白质溶液进行测定。c h e n 等f 4 5 1 以纳米t i 0 2 作为吸 附剂，用c d 法测定了纤维白蛋白吸附时的构象变化。 1 4 4 同位素示踪法 同位素示踪方法可以根据示踪剂信号的变化来确定发生结构变化的特定部 位，通过测定蛋白质吸附过程中特定位置处示踪剂的变化可以检测蛋白质构象的 变化。邱永兴等【4 6 】利用放射碘同位素标记技术研究了三种主要血浆蛋白质( 白蛋 白、免疫球蛋白和纤维蛋白原) 在聚苯乙烯g - ( 十八烷聚氧乙烯) 接枝共聚物表 面的吸附动力学、等温吸附及竞争吸附；计剑等4 刀采用1 2 5 i 放射标记方式研究纤 维蛋白原和自蛋白在聚甲基丙烯酸甲酯接枝十八烷基聚氧乙烯( p m m a - g - s p e o ) 表面上的静态吸附行为。但是示踪剂的加入可能会影响蛋白质分子构象的稳定性， 并进一步影响蛋白质的吸附。 1 0 重庆大学硕士学位论文l 绪论 1 4 5 核磁共振法 核磁共振( n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ，n m r ) 技术【4 s 】是分子结构分析中一种 重要的波谱学研究手段，它能够提供原子水平的分子平面和立体结构，以及动态信 息。因此其研究领域和应用范围已经从化学和物理学延伸到生物学、医学、材料 科学等几乎所有自然科学领域。其主要特点是：在分析测定时，样品不会受到破坏