（应用化学专业论文）四氮唑类生物染色剂的合成研究.pdf

摘要 四氮唑类是目前在生物化学及细胞生物学方面应用很广泛的生物染色剂，主要用于检 测脱氢酶及与氧化还原相关的其它酶的活性、细胞毒性及增殖分析、植物选种等。四氮唑盐 本身及其还原态f o r m a z a n 均无毒，可以直接进行生物体的活体分析和体内分析。目前国内 尚无四氮唑盐类生物染色剂的生产，完全依赖进口，对其合成的研究对于填补国内空白及增 强我国自产医学关键试剂在国际上的竞争力具有非常重要的意义 我们对该类产品的合成工艺进行了研究，采用的合成工艺如下。由苯甲醛和苯肼或对 硝基苯肼合成苯甲醛苯腙或对硝基苯甲醛苯腙，然后再和相应的芳胺的重氮盐反应得到四氮 唑盐的中间体f o r m a z a n 。然后再将f o r m a z a n 氧化，得到相应的四氮唑盐。其结构均经过熔 点、取光谱及n m r 得到确证 采用上述工艺合成的5 种四氮唑类生物染色剂包括：2 对碘苯基3 - 对硝基苯基5 苯基 氯化四氮唑、2 5 - 二苯基- 3 ( 1 荣基) 氯化四氮唑、3 , 3 c 甲氧基4 4 - 二苯撑- 3 ”，3 双 ( 2 - 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) ，4 , 4 - 二苯撑3 ”3 胛双( 2 ，5 - 二苯基氯化四氮唑) 和 3 , 3 c 甲氧基4 ，4 - 二苯撑3 ”3 乜双( 2 5 二苯基氯化四氮唑) ，部分产品已经过中试，为 工业化生产提供了一条可供选择的途径 对芳香腙制各、芳香胺的重氮化及f o r m a z a n 中间体制备过程中的各种条件进行了优化， 并首次使用c 1 2 作为氧化剂将f o r m a z a n 中间体氧化成四氮唑盐，相对于文献采用的四醋酸铅 氧化法，简化了反应条件，提高了反应收率。 关键词：合成，四氮唑盐，f o r m a z a n ，脱氢酶 垒堕 t h et e u a z o l i u ms a l _ b 跚w i d e l yu s e di nb i o c h e m i s t r ya n dc e l lb i o l o g ya sc o l o u ri n d i c a m m b m i c l y , 埘, r a z o l l u ms a l t s 搬u s e df o rt h ed d 蒯o no f d e h y d r o g e n a s ea c t i v i t yo ra n yo t h e r z y m e s y s t e m sw h e r er e d o x 烈l u i v a l e n t sa g e n e r a t e d e 昌：f o rt e s t i n gc e l lp r o l i f m f i o na n dc e l lv i a b i l i t y a n df o rc y t o t o x i c i t yt e s t s , f o rt e s t j n gs e e dv i a b i l i t y n o wn os u c hr e g e a n t sa r ep r o d u c e di nc h i n a , s oi ti si m p o r t a n tf o rr e s e a r c ho f t h e i rs y n t h e s i sa n df o re x p o r to f t h e n l - t h es y n t h e s i sr o u t ei sa sf o l l o w s ：a r o m a t i ch y d r a z o n ew a ss y n t h e s i sf r o ma r o m a t i ca l d e h y d e a n dh y d r a z i n e a r o m a t i ch y d r a z o n er e a c t e dw i t ht h ed i a z o l i u ms a l to f 出_ o m 越i ca m i n et of o r m f o 曲n 雹蕴皿f o r m a z a n 啪so x i d e dt ot e 灯a z o n l mt h e i rs m l c t o r ew k sc o n f i r m e db yn m ra n di r f i v et 衄r a z o l i m w a ss y n t h e s i z e di n c l u d i n g2 - ( 4 - i o d o p h e n y l ) - 3 ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 - p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ； 2 , 5 - d i p h e n y l - 3 - ( 1 - n a p h t h y l ) - 2 h - t e u a z o l i u m c h l o r i d e ； 3 , 3 d i m e t h o x y - 4 。4 - d i p h e n y l e n e - 3 ”，3 ”- b i s ( 2 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 - p h e n y l t e m t z o f i u mc h l o r i d e ) ； 4 , 4 - d i p h e n y l e n e - 3 “3 “。- b i s ( 2 ，5 - d i p h e n y l t e t r a z o l i n mc h l o r i d e ) a n d3 , 3 1 - d i m e t h o x y - 4 - d i p h e n y l e n e - 3 ”3 ”- b i s ( 2 ，5 - d i p h e n y r e l r a z o h u m c h l o f i d e ) c o n d i 缸o n sw a se x p l o i d e df o r 讲即日蒯o f a s o m a t i ch y d r a z o n e , d i a z o l i u ms a l to f a s o m a f i c a m i n ea n df o r m a z a n c h l o r i n ew a s 丘s f tu s e d 越o x i d a mf o rp r e p a r a t i o no ft e l z a z o l i m nf i o m f o n n a z mc o m p a 掀1w i t hl e a dt e w a a c e t a mm e t h o dr e p o r t e di nl i t e r a t u r e , l h ey i e l dw a sj 玎c 朋坦靼= d 东南大学学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含 其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得东南大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 东南大学学位论文使用授权声明 东南大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆有权保留本人所送交学位 论文的复印件和电子文档，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。本人 电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。除在保密期内的保密论文外，允许论 文被查阅和借阅，可以公布( 包括刊登) 论文的全部或部分内容。论文的公布( 包 括刊登) 授权东南大学研究生院办理。 研究生签名：导师签名：e l 期 第一章绪论 第一章绪论 1 1 四氮唑盐的结构及其分类 四氮唑盐根据分子中所舍的四氮唑环的数目可以分为单四氮唑盐和双四氮唑盐，其结 构通式分别为： 单四氮唑 双四氮唑 它是一类季铵化的四氮唑盐，其中五元环上含一个碳原子和四个氮原子，因此具有类 盐的一些性质。四唑盐的主要变化在于2 ，3 ，5 位的三个取代基，现在作为染色荆使用的四 氮唑盐中，取代基大多为芳香环 1 2 四氮唑盐的生物学性质及应用 1 9 4 1 年，k u l m 和h e r d e ! 发现了四氮唑盐类物质具抗菌活性并能使细菌的特定部位染 刨”，自此，人们发现了这类物质在生物化学方面的特殊用途 四氮唑盐类本身是一种无色的化合物，但其还原态( f o r m a z a n ) 却是有色物质。 + 2 h = ；= = = ；= - 2 h ( 氧化态) ( 还原态) 例如三苯基氯化四唑盐及其还原态吸收光谱图为图1 1 ，三苯基氯化四唑盐只在紫 外区吸收，而其还原态在可见光区吸收 、吲 一 东南大学硕士学位论文 。- , | 州| 。 | j 、|f ff ；| j | - - f i 图1 1 三苯基氯化四唑盐及其还原态溶液的吸收光谱 ( 图中为氧化态，为还原态l 由于许多四氮唑盐的氧化还原势与生物系统中的氧化还原势值重叠，因此可以作为生物 细胞的着色剂。大多数四氮唑盐及其f o r m a z a n 都无毒，因此可直接用在活性微生物或哺乳 动物的活性组织研究，通常四氮唑盐用于检测脱氢酶的活性或其中产生氧化还原的其它酶系 统。 1 2 1 在脱氢酶中的应用 脱氢酶能从底物中将电子转移到氧化试剂或电子体上。四唑盐做为受氢体在反应中由脱 氢酶将底物氢原子转移到四唑盐而形成有色的f o r m a z a n 局部沉淀，显微镜下可判明该酶在 细胞的定位。至于显示何种脱氢酶则由所用底物而定。如用琥珀酸钠，f o r m a z a n 是琥珀酸 脱氢酶作用下的产物，用乳酸钠或苹果酸钠则是乳酸脱氢酶或苹果酸脱氢酶作用的结果。但 有些脱氢酶需有辅酶i 删a d + ) 或辅酶c n a d p 韧- 能发生作用，显示这种脱氢酶时须另加所 需的辅酶，辅酶i 、辅酶或黄素蛋白 d 或f m n ) 可作为氢接受体，当n a d + 和n a d p + 接受脱氢酶释放的氢时，它们即成为还原n a d ( 即n a d h ) 和还原n a d p ( 即n a d p h ) ，其 电子转移示意图为图1 2 ： 2 第一章绪论 底物 厂圈 厂剧 脱氢酶 l 国 黄素蛋白 ( f a d 或 i _ j 图1 2 电子转移到四唑盐的图解 f a d ：黄素腺嘌岭核苷酸，f 瑚：黄素单核苷酸 可用于检测乳酸脱氢酶的四唑盐如m r t 埘，3 ，3 ，二甲氧基4 ，4 1 二苯撑- 3 ”，3 一 双( 2 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) 四，2 - 对碘苯基- 3 - 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑脚， 检测琥珀酸脱氢酶活性的四唑盐如n i t r ob t _ f j ，n m 目，检测葡萄糖岳磷酸酯脱氢酶活性 的四唑盐如n i t r ob 1 蛔 1 2 2 过氧化物岐化酶( s o d ) s o d 能催化过氧化物阴离子发生岐化作用，生成过氧化氢和分子氧，是一种很重要的 抗氧化酶。其活性测定法有很多，其中3 ，3 二甲氧基4 ，4 二苯撑- 3 ”，3 巳双( 2 对 硝基苯基- 5 苯基氯化四氮唑) 由于使用方便而被广泛用于定性测试p 棚。四唑盐2 午仁碘苯 基h - ( 4 _ 硝基苯基) 5 ( 2 ，4 苯二磺酸心h - 四唑单钠盐有高度水溶性，在过氧化物阴离子的还 原作用下能产生一种水溶性的f o r m a z a n 染料，可以用于定量测定。 1 2 3 细胞增殖突变及毒性试验 m r 一”】比色法可用于测定细胞活性，m t t 和2 对碘苯基- 3 - 对硝基苯基- 5 苯基氯化四 氮唑【l l 】用于细胞增殖分析，用于检查细胞增殖突变及毒性试验酶诊断和临床化学日本同 仁化学研究所研制出种新型细胞检测法改良试剂( c c k - 8 ) ，其基本原理为：该试剂中含 有w s t - - 8 其化学名称为：2 - ( 2 甲氧基- 4 一硝基苯基n o 硝基苯基) _ 5 ( 2 ，4 - 二磺酸苯) _ 2 h 四唑单钠盐 ，它在电子还原受体1 甲氧基一5 一甲基吩嗪嗪硫酸二甲酯( 1 m 劬。巧p m s ) 的 存在下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色f o n n a z 龇染科( f o r m a z a n d y e ) 生成的f o r m a z a n 物的数量与活细胞的数量成正比，因此可利用这特性直接进行细 3 东南大学硕士学位论文 胞增殖和毒性的定量分析。因其具有使用简便、安全、快速、准确等特点，已在日本、美国 和欧洲等国家被众多从事生物细胞研究和药物筛选的科学家所采用，备受青睐 1 2 4 植物选种 种子生活力的生化测定：在短期内急需了解种子发芽率或当某些样品在发芽末期尚有 较多的休眠种子时，可应用生活力的生化法快速估测种子生活力。生活力测定是应用2 ，3 ， 5 一三苯基氯化四氮唑无色溶液作为一种指示剂，这种指示剂被种子活组织吸收后，接受活细 胞脱氢酶中的氢，被还原成一种红色的、稳定的、不会扩散的和不溶于水的三苯基f o r m z a n 据此，可依据胚和胚乳组织的染色反应来区别有生活力和无生活力的种子。除完全染色的有 生活力种子和完全不染色的无生活力种子外，部分染色种子有无生活力，主要是根据胚和胚 乳坏死组织的部位和面积大小来决定，染色颜色深浅可判别是健全的，还是衰弱的或死亡的 种子。 1 2 5 蛋白质含量的测定 蛋白质含量有很多测定方法，例如：酚试剂法、b c a 法、双缩脲法等。其中酚试剂法 和b c a 法是较常用的蛋白质含量测定方法，但这两种方法的缺点是都需要高浓度的二价铜 离子溶液。而使用四唑盐类生物染色剂则避免了这种缺陷，其原理是利用四氮唑盐在碱性条 件下可被蛋白质的糖类还原而生成f o r m a z m 染料，该染料在不同的p h 条件下显色，从而可 以测定出蛋白质的含量。 1 2 6对贵重金属的缓蚀 巯基苯并四氮唑等一些杂环化合物对青铜具有优异的缓蚀作用，正日益引起人们的重 视，在文物和青铜制品的保护方面显示了四氮唑盐类化合物的另一个广阔的应用前景【1 2 】 1 3 部分四氮唑盐 1 8 9 4 年，四氮唑盐开始出现在有机化学里，上世纪四十年代人们发现它的用途后便开 始大量的研究和合成这类化合物l “目前常见的部分四氮唑盐产品列表如下： 4 第一章绪论 东南大学硕士学位论文 3 ，3 二甲氧基4 ，4 ，- 二苯 撑3 ”，3 双( 2 对硝基苯基 5 苯基氯化四氮唑) 3 ，3 二甲氧基- 4 ，二苯 撑- 3 ”，3 巳双( 2 ，5 二苯基 氯化四氮唑) 3 ，3 7 二甲氧基_ 4 ，4 ，- 二苯 撵3 ”，3 匕双( 2 ，5 - - - 对硝基 苯基氯化四氮唑) 3 ，3 二甲氧基4 ，= 苯 撑3 ”，3 乜双( 2 苯基5 对甲 氧基苯基氯化四氮唑) 3 ，3 二甲氧基4 ，4 ，c ：苯 撑3 ”，3 圾( 2 - 苯基5 - ( 3 ， 4 二甲氧基苯基) 氯化四氮 唑) 3 ，3 二甲氧基4 ，4 f 二苯 撑3 ”，3 双( 2 ( 2 毗啶基) 5 对氯苯基氯化四氮唑) 3 ，3 二甲氧基4 ，4 ，- 二苯 撑3 ”，3 巳双( 2 ( 2 - 毗啶基) - 5 封硝基苯基氯化四氮唑) 4 ，4 ，二苯撑3 ”，3 双( 2 ， 5 二苯基氯化四氮唑) 4 ，4 二苯撑- 3 ”，3 乜双( 2 苯基5 甲基氯化四氮唑) 叮 q 护 ( 气y o c n 3 剐 p i 丫o c h 3 j l 如c h 3 d a 妒 q - c - 1 3 h 3 c op 锄 弋持 h 3 c _ c lp c h 3 弋玲 h 3 c qp c h 3 弋坶 玛w h 3 c qp c h ， 弋玲 码c qp 卜c h 3 弋坶 h 3 c qp c h 3 弋坶 f 卜 在商品四氮唑盐中，阴离子除氯离子外还可以是其它的酸根，如- b r ，- i ，醋酸根等。随 着四氮唑盐应用的日益增加。四氮唑盐的种类也在不断的增加 1 4 四氮唑盐的合成方法 四氮唑盐主要通过f o r m a z a n 氧化得到 6 旷叮旷叮 叮 吼眼叮叮 第一章绪论 酬r 2 - n h n - 昔 - 1 4 1f o r m a z a n 的制备方法【1 】 四氮唑盐 1 4 1 1 由重氯盐制备 1 4 111 重氮盐和芳香腙反应 重氮盐和乙醛或乙醛酸芳香腙的偶合反应需要在碱性条件下进行，通常是用强碱、毗啶 或者醋酸钠。许多已知的f o r m a z a n , 用这种方法合成。反应式如下： 工 d h o r n o 1 4 1 1 2 由重氮盐和含活性亚甲基或次甲基的化合物反应 ，、显 # n c 麓：h 5 + 万一 伊毛o c 2k 一 重氮盐和多种含活性亚甲基反应的反应机理为： 牛nx 八+ h n 0 2 ( 3 ) c 嗜葑o + 茹n r 皿f i l 2 佴- i o d o p h e n y l ) - 3 - f o r m a z a n ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 - p h e n y l t e t r a z o l i u mc h l o r i d e 2 3 苯甲醛对硝基苯腙的制备 向5 0 0 r i d 的三颈瓶中投入1 5 3 9 ( 0 1 m 0 1 ) 的对硝基苯肼，1 2 0 m l 水，1 2 0 m l 的乙醇， 搅拌溶解。 把1 0 6 9f 0 i m 0 1 ) 的苯甲醛溶于2 0 0 m l 的乙醇中，缓缓加入到e 述对硝基苯肼溶液 中 继续搅拌2 h ，静置2 h ，过滤洲，固体用少量水洗涤，晾干得到橙红色固体2 3 9 ，收率 8 9 8 。 所得固体未经纯化直接用于下步反应 2 4 对碘苯胺的制备 对碘苯胺是制各2 对碘苯基- 3 一对硝基苯基- 5 苯基氯化四氮唑的一个重要原科，根据文 献，试用两种方法制备对碘苯胺。 1 4 也 一审 1lllllj 第二章2 - 对碘苯基3 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑的合成 2 4 1 两步反应制对碘苯胺 2 4 1 1 反应原理 ( 1 ) n a c l 0 3 + 6 h c ! + 3 1 2 6 i c l + n a c l + 3 h 2 0 n h 2 鉴! f o n h 2 2 4 1 2 步骤 在棕色试剂瓶中加入1 8 0 r a l 冰醋酸，再加入1 s g ( o 0 1 7 m 0 1 ) 氯酸钠，1 3 9 ( 0 0 5 l m o l ， 略过量) 磨细的碘，再加入3 0 m l 浓盐酸，震摇至固体溶解后，即生成了i c l 的醋酸溶液。 如反应( 1 ) 将上述i c l 溶液转入2 5 0 m l 容量瓶中，补加冰醋酸至刻度，此溶液浓度即为0 4 m o l l ， 再把溶液转移至棕色瓶中，保存于阴暗处。 取上步所得i c l 溶液1 5 0 m l ( 含i c i o 0 6 m 0 1 ) 加入5 0 0 m l 三颈瓶中，搅拌，再加入4 6 5 9 ( o 0 5 m 0 1 ) 苯胺，加热到8 0 反应3 0 m i n 用3 5 * * 的n a o h 溶液调p h 值到1 0 左右，在冰水浴冷却至o ，析出晶体 过滤，晶体用约1 0 0 0 m l 水洗涤，得黑白混杂的固体。 晾干，再用适量汽油重结晶，过滤晾干得无色针状晶体3 9 ，m p 6 1 6 3 c ，收率2 7 4 2 4 1 3 结果 经多次实验，发现此方法制取对碘苯胺收率较低，不适于制各生产用对碘苯胺，因碘在 冰醋酸中不易溶解，所以第一步反应中要加大量冰醋酸作溶剂，而且生成的i c ! 不稳定，容 易给反应中引入副反应，大量的冰醋酸也给第二步调p h 值带来了很大的困难，需要加大量 的n a o h 溶液，结果出现的是白色和黑色固体的混合物，其中有大量n a c l 和c h 3 c h 2 0 0 n a 等盐，给分离和提纯带来了困难，需要用大量水洗去，增加了产品的损失。 2 4 2 一步反应制对碘苯胺 2 4 2 1 反应原理嗍 + 1 2 2 4 2 2 步骤 称l l g ( o 1 2 t 0 0 1 ) 苯胺、1 5 9 ( 0 1 7 t 0 0 1 ) n 棚c q 置入2 5 0 m l 三颈瓶中，再加入1 0 0 m l 东南大学硕士学位论文 水，搅拌，冰水浴中冷却到l o 以下 将2 5 4 9 ( o 1 m 0 1 ) 碘研成粉末，分十到十五批加入上述苯胺盐酸盐悬浮液中，反应放 热，控制加入速度，使过程中温度不超过1 0 ( 3 加完后冰水浴中反应3 0 m i n ，当上层溶液变清，碘的颜色褪掉后，瓶中有大量白色和黑 色固体产生 过滤得粗品粗品中加1 0 0 m l 汽油，在7 5 8 0 ( 3 搅拌回流1 0 m i n ，趁热把上层清液倒入 烧杯中冷却结晶，下层油状物继续加汽油重结晶( 母液可重结晶三到四次) ，将多次重结晶 的清液合并，静置冷却。 过滤，固体用少量汽油洗涤，得接近无色的针状晶体，晾干，得2 1 5 9 ，m p 6 2 6 3 c ， 收率8 2 ，( 文献嘲：6 3 6 4 c ，8 0 哟。 ， 2 4 3 结果 该方法制备对碘苯胺步骤少，反应条件要求宽松，产率高，多次实验产率和晶体的熔点 稳定，放大量做产率和熔点也稳定，如下表所示： 表2 1 对碘苯胺制备的多次实验结果 与第一个方法相比，这个方法步骤简单，原料易得，反应条件要求不高，产率高而且稳 定。可以放大为工业生产。 2 5 对碘苯胺的重氮化 2 5 1 步骤 称8 8 9 ( o 0 4 t 0 0 1 ) 对碘苯胺置入2 5 0 m l 兰颈瓶中，再加入3 1 m l 水和7 0 m l 浓盐酸，搅 拌加热至4 0 4 5 c ，出现大量白色悬浮固体，停止加热，搅拌下用冰盐浴冷却到0 c 以下 称2 8 9 ( 0 0 4m 0 1 ) n a n 0 2 溶于1 2 m l 水中配成溶液，用滴液漏斗把配制好的n a n 0 2 溶 液滴入上述对碘苯胺盐酸盐悬浮中，滴加过程的温度不要超过5 在控制反应温度的情况 1 6 第二章2 - 对碘苯基- 3 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑的合成 下可尽快滂完。 滴加过程中，溶液颜色逐渐加深直至棕黑色，白色悬浮固体逐渐转化为黄色悬浮固体 滴加过程应在冷却条件充分的情况下尽快滴完，以缩短时间，减少副反应的发生嘲。 2 5 2 机理 重氮化反应的机理如下。 n a n 0 2 + h c i n a c i + h o n o + h o n o + h c i - + n o + c l + 1 2 0 缸一筑一缸一对尘垒舡一肾磐 h 午睁h 垂m 酶n 硼望加一盆西h 2 a r + ，a r n 暑n + h 2 0 舡一齑兰n + c r 呻i a r 一船n c r 2 5 3 影响重氮化反应的因素鲫 重氮化反应过程中的温度很重要，一般的芳胺重氮化过程中温度都要求在o 左右，由 于反应放热较明显，所以降温措施和滴加速度要很好的控制，一般在o 5 实验过程中发现，如滴加速度过快，温度高于7 时亚硝酸分解速度较快，瓶口处出现 较浓黄烟( n 0 2 ) 。 酸的用量要适当过量，一般控制在h c i 是胺基的2 5 倍左右，酸浓度过高易导致重氮盐 的分解，酸浓度过低又会重氮盐易于偶联。 反应过程用淀粉碘化钾试纸检测亚硝酸钠滴入量，使亚硝酸钠稍过量。 1 7 东南大学硕士学位论文 2 6f o r m a z a n 的制备 2 6 1 步骤 称9 6 9 ( o 0 4 m 0 1 ) 苯甲醛对硝基苯腙置于1 0 0 0m l 三颈瓶中，再加入3 0 0 m l 甲醇，6 0 m l 吡啶，搅拌溶解，溶液呈棕黑色，冰盐浴冷却到o c 将2 5 1 所制得的对碘苯胺重氮盐溶液加入到苯甲醛对硝基苯腙的溶液里，加入过程放 热明显，溶液逐渐变为黑色，有气泡，控制加入速度，使反应过程中体系温度不超过i o c 对碘苯胺重氮盐溶液加入完毕后在i o c 后在常温搅拌2 h 过滤，黑色固体用2 0 0 m l 甲醇 分两到三次洗涤，至洗液里酒红色，用2 0 0 m l9 0 c 的热水分两到三次洗涤，最后用l o o m l 甲醇分两次洗，把所得紫黑色固体于通风处晾干，得到紫黑色固体约9 9 ，m p l 7 2 1 8 0 c 2 6 2 反应机理 ：攀一毒p 一毒专- 薅葑； ：p 一叶卜时葑季一土 1 8 第二章2 - 对碘苯基3 对硝基苯基- 5 苯基氯化四氮唑的合成 2 6 3 溶剂种类对反应结果的影响 由重氮盐和腙生成是四氮唑盐合成的关键一步，反应要在碱性条件下才得以进行。受 到多种因素的影响。其中溶剂与碱是两个主要的因素。溶剂和碱的选择直接影响到反应的结 果。实验中对比了以甲酵作溶剂，吡啶提供碱性条件和以四氢呋喃作溶剂，k o h 提供碱性 条件的两种方式，得到f o r m a z a n 粗品的结果比较如下表 表2 2 溶剂种类对反应的影响 由上表可知，两种方法中用甲醇作溶剂比用t h f 作溶剂稍好一些，所以在实际实验中 我们采用甲醇作溶剂，用吡啶提供碱性。 2 6 4 甲醇和毗啶混合比例对结果的影响 甲醇的吡啶的比例也影响到产品的收率和熔点，由于苯甲醛对硝基苯腙在毗啶中溶解度 很大而在甲醇中溶解度较小，所以甲醇和吡啶的比例变化也影响到混合溶剂的总用量，我们 用刚好使苯甲醛对硝基苯腙溶完的量来进行实验。对比结果如图2 1 5 毫 罄n - t o g 嗥 霹 鹭 n o0 1 5o025乱3 0 甲醇，毗啶混合液中毗啶的含量( v v ) 1 1 1 7 0 苗 和 1 0 0 3 凄 赫 d 1 o 1 住o 图2 1 溶剂比例对实验结果的影响 从图中两条曲线的最高点可以看出，当吡啶与甲醇的比例大于1 ：3 的时候已不适合进 东南大学硕士学位论文 行反应制取中间体，而吡啶与甲醇的比例小于l ：6 的时候又大大增加了溶剂的体积，扩大 反应容器的体积，不适于工业化，所以我们实验中采用的甲醇与吡啶的比例为5 ：1 2 6 5 温度对反应结果的影响 在对碘苯胺重氮盐和苯甲醛对硝基苯腙的反应中，温度也影响反应的结果，实验结果如 图2 2 。 2 t 0 0 1 7 0 ，他 竣， 1 7 2 1 7 0 - 2021 0 2 1 41 8 温度( ) 】哥 酱 8 图2 2 温度对反应结果的影响( 图中熔点温度为该点熔程中点数据) 由图中数据可知反应最佳温度应在0 - - 5 ( 2 2 6 6f o r m a z a n 的精制1 1 明 将2 6 1 所得9 9f m 粗品置入2 5 0m l 装有回流冷凝管的单口瓶中，再加入1 8 0 m l 二氧六环，加热回流1 5 m i n ，用滴管滴加6 0 r a l 水，震荡混合均匀，冷却至室温，放置3 h 过滤，固体用少量甲醇洗，晾干得到6 9 带有墨绿色金属光泽的固体，m p l 8 4 1 8 6 c ， 6 6 ( 文献【l l ：m p l 8 5 1 8 6 c ，6 0 呦 2 6 7 粗品精制过程中溶剂比对收率的影响 二氧六环和水的用量比影响到精制过程的收率得产品的熔点，多次对比结果如下表 第二章2 对碘苯基3 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑的合成 花 阳 舅 。 g 彗” h 鸵 柏 0 2o 4o 0 01 0 二氧六环和水的体积比“、，) 1 1 m 1 啦 ! m 薹 1 蔼d 7 ”2 1 7 0 1 图2 3 二氧六环和水的比例对结果的影响( 图中熔点温度为该点熔程中点数据) 从图中曲线总的效果可以看出，二氧六环和水的体积比在3 ：1 的时候是最佳比例。 2 72 对碘苯基3 对硝基苯基孓苯基氯化四氮唑的制备 2 7 1 反应机理 卜藓一卜鬈一卜 j 。li 2 7 2 实验过程 r v n 一r n n 一彤 一“f j t r 夜- 将2 6 6 得到的f o r m a z a n 置入5 0 0m l 三颈瓶中，再加入4 0 0 m l 甲醇，搅拌，使固体均 2 1 东南大学硕士学位论文 匀悬浮于甲醇中，冰盐浴降温至o c 通入c 1 2 ，至溶液颜色褪为浅褐色，停止通c 1 2 ，过程温度不高于1 5 c 在常温搅拌2h ， 静置过滤， 固体置于通风处晾干得到产物2 对碘苯基3 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑约 3 9 ，m p 2 2 8 2 3 0 c 收率5 0 ( 文献【”i2 2 9 c 2 0 ) 我们创新性地采用了用氯气氧化的方法，通过熔点和红外验证证了产品的结构，收率有 了较大的提高，使其工业化生产成为可能 2 82 对碘苯基3 对硝基苯基辱苯基氯化四氮唑的表征 其红外图谱跟标准图谱对照是一致的。 2 9 本章小结 在实验中探索了对碘苯胺重氮盐和苯甲醛对硝基苯腙溶液的反应最佳温度，还确定了 反应的最佳溶剂种类和用量，从而保证了中间体的收率和纯度。 在中间体的氧化方面，我们首次使用氯气作氧化剂，提高了氧化收率，优化了反应条件， 更适合于工业化 ；i-三-i= 第三章2 ，5 - 二苯基- 3 - ( i - 萘基) 氯化四氮唑的合成 第三章2 ，5 二苯基3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的合成 2 ，5 - - - 苯基- 3 - ( 1 一萘基) 氯化四氮唑分子式为c 2 3 i l ，c 1 n 4 ，英文名为：2 ，5 - d i p h e n y l - 3 ( 1 - n a p h t h y l ) - 2 h - t e t r a z o l i mc h l o r i d e ，由h a u s s e r 等在1 9 5 1 年首先厶成t 3 2 j ，结构为 3 1 所用试剂和仪器 卜 苯甲醛、毗啶、二氧六环分析纯上海凌峰化学试剂有限公司 l 荣胺化学纯泗联化工厂 亚硝酸钠分析纯上海振兴试剂厂 盐酸甲醇分析纯 上海实意化学试剂有限公司 氯仿分析纯上海化学试剂有限公司 北京电光学仪器厂x l - 4 型数字熔点仪 真空循环水泵、搅拌器、温度计 3 22 ，孓二苯基3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的合成路线 2 ，5 - - - 苯基- 3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的合成路线p 铆】为：苯甲醛与苯肼缩合成苯甲醛 苯腙，再和1 4 9 胺的重氮盐反应生成f o r m a z a n ，然后再把f o r m a z a n 氧化生成2 ，5 - - - 苯基- 3 - ( 1 萘基) 氯化四氮唑。 旷+ o 一一o f 一叼 即嘎 圆詈 岱n c r 东南大学硕士学位论文 疏 叼+ 曲一叽泸 c o 3 3 苯甲醛苯腙的制备 卜 2 ，5 - d i p h e n y l - 3 - ( 1 - n a p h t h y l ) - 2 h - t c t r a z o l i u mc h l o r i d e 将2 1 6 9 ( 0 2 m 0 1 ) 苯胼置于1 0 0 0 m l 装有回流冷凝管的三颈瓶中，再加入6 0 0 r a l 甲醇，加 热搅拌，全溶后，停止加热，搅拌下冷却至5 分批缓慢加入2 1 2 9 ( 0 2m 0 1 ) 苯甲醛，反应轻微放热，出现乳白色针状沉淀，搅拌2 h ， 静置1 h 过滤，固体用少量甲醇洗涤，置阴暗通风处晾干，得乳白色针状固体未经纯化即用 于下步反应 3 4 萘胺的重氮化 将1 4 3 9 ( o 1m 0 1 ) 萘胺研成粉末，置于2 5 0m l 三颈瓶中，再加入2 0 m l 浓盐酸，加入 $ o m l 水，搅拌，加热至4 0 4 5 c ，出现大量白色悬浮固体，停止加热，再用冰盐浴冷却到 0 以下 将6 9 9 ( 0 1 t 0 0 1 ) n a n ( h 溶于3 0 m l 水中 用滴液漏斗把n a n c h 溶液小心滴入萘胺盐酸盐悬浮液中，反应放热明显，控制滴加速 度，使过程温度不超过5 1 2 o， 莎 一 。 瞄 第三章2 ，5 二苯基- 3 ( 1 - 綦基) 氯化四氮唑的合成 3 5f o r m a z a n 的制备 3 5 1 步骤 称1 9 6 9 c o 1 m 0 1 ) 苯甲醛苯腙置于l o o o m l 三颈瓶中，再加入4 0 0 m l 甲醇和8 0 m l 毗啶的 混合溶液，搅拌，溶解，冰盐浴冷却到o 将3 4 制得的萘胺重氮盐溶液小心的加入到苯甲醛苯腙的溶液里，反应放热明显，应控 制加入速度，使过程温度不超过1 5 1 2 。 加完后l o ( 2 搅拌3 h ，常温搅拌2 h ，静置3 h ，过滤。 固体用2 0 0 m l 甲醇分三次洗涤至洗液浅红色，再用2 0 0 m l9 0 热水分两次洗，再用2 0 0 m l 甲醇洗，固体置通风处晾干。得深紫色固体1 8 3 9 ，m p l 4 0 1 5 0 c 收率5 2 6 3 5 2 溶剂类别对反应的影响 实验中对比了以甲醇作溶剂，毗啶提供碱性条件和以四氢呋喃作溶剂，k o h 提供碱性 条件的两种方式，得到中间体粗品的结果比较如下表 表3 1 两种溶剂对结果的影响 由上表可以看出，选用t h f 作溶剂时无法得到中间体固体，所以实验中选用甲醇作溶 剂，用毗啶为碱。 3 5 3 温度对反应结果的影响 在萘胺重氮盐和苯甲醛苯腙的反应中，温度也影响反应的结果，实验中我们对比结果如 图3 1 东南大学硕士学位论文 轻 侣o 1 柏 1 4 4 1 鸵 1 4 0 鬟， 1 冀 1 斟 1 匏 1 3 0 1 2 。 - 2 o 2 4 01 0 住1 0 温度( ) 5 2 蟊 酱 s o s 图3 1 温度对反应结果的影响( 图中熔点温度为该点熔程中点数据) 由表中数据可知反应最佳温度应在0 - 5 c 3 5 4甲醇和吡啶比例对结果的影响 甲醇和吡啶的比例也影响到产品的收率和熔点，由于苯甲醛苯腙在毗啶中溶解度很大而 在甲醇中溶解度较小，所以甲醇和毗啶的比例变化也影响到混合溶剂的总用量，我们用刚好 使苯甲醛苯腙溶完的量来进行实验。对比结果如下 驼 柏 舢 l v 鼍” 罄 算 3 2 乱1 0n 1 5 0 2 0 0 2 50 3 0 毗睫与甲醇用量比( v v ) 图3 2甲醇和吡啶的比例对结果的影响 1 0 0 1 2 0 嘉 蠢 1 0 0 f ， 0 0 第三章2 , 5 二苯基- 3 - ( 1 - 萘基) 氯化四氮唑的合成 从图中曲线数据可以看出，当吡啶与甲醇的比例大于l ：3 的时候已不适合进行反应制 取中间体，而吡啶与甲醇的比例小于l ：6 的时候又大大增加了溶剂的体积，扩大反应容器 的体积，不适于工业化，所以我们实验中采用的甲醇与吡啶的比例为5 ：1 3 6f o r m a z a n 的精制 3 6 1 步骤 把3 5 1 所得1 8 3g 固体置于2 5 0m l 装有回流冷凝管的单口瓶中，再加入9 0 r a l 二氧六 环，加热回流3 0 m i n 滴加3 0 m l 水，冷却，析出晶体，放置2 h 。 过滤用少量甲醇洗，得有金属光泽紫黑色固体，固体置于通风处晾干，得1 4 9 ，m p l 7 2 1 7 3 c ，收率7 6 5 ( 文献【l 】：1 7 3 c ，8 0 ) 3 6 2二氧六环和水的比例对精制结果的影响 我们探索t - - - - 氧六环和水的体积比对精制结果的影响，结果如下表 毫 * 善 o工03 0 4 0 5o j i 水和二氧六环的体积比( v v ) 藩 蠢 一 图3 3 水和二氧六环的比例对结果的影响( 图中熔点温度为该点熔程中点数据) 从圈中曲线结果可以看出，二氧六环和水的最佳比例仍为3 ：1 ，所以实验中我们采用 此比例。 再h花娃辩“鸵柏艟“艟柏 礓为”宠阳旺秘h敬柏 东南大学硕士学位论文 3 72 ，5 - - - 苯基3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的制备 3 7 1 步骤 将3 6 1 步骤中得到的1 2 2g 中间体置于1 5 0m l 三颈瓶中，再加入7 0 m l 甲醇，冰盐浴 降温至o c 。 搅拌下缓慢通入c 1 2 。通入c 1 2 过程反应放热明显，应严格控制通气速度，使温度不高 于1 5 。至溶液变澄清，无固体残余 i o c 搅拌3 h ，常温搅拌2 h 。 把溶液转移入2 5 0m l 单口瓶中，减压蒸去溶剂，再加入5 0 m l 甲醇，加热回流3 0 m i n ， 再减压蒸去溶剂。 再加5 0 m l 氯仿，加热回流3 0 m i n ，再减压蒸去溶剂，得租品。 3 7 22 ，孓二苯基- 3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的粗品精制 用氯仿和甲醇等体积比溶液两次重结晶，得到3 5 9 淡黄色固体，m p 2 3 6 2 4 0 c 。收率 2 7 1 ( 文献【1 】= 2 3 8 - 2 4 1 c ，2 8 拗 实验过程中尝试了多种重结晶试剂，有时要多次重结晶才能收到理想的效果 3 82 ，孓二苯基3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的表征 其红外图谱跟标准图谱一致 、=-旧#9-暑 第三章2 ，5 二苯基3 ( 1 萘基) 氯化四氮唑的合成 3 9 小结 我们在实验中探索了萘胺重氮盐和苯甲醛苯腙溶液的反应最佳温度，还确定了反应的 最佳溶剂种类和用量，从而保证了中间体的收率和纯度。 在中间体的氧化方面，我们首次使用氯气作氧化剂，提高了氧化收率，简化了反应条 件，更适合于工业化。 东南大学硕士学位论文 第四章3 ，3 7 二甲氧基4 ，4 7 二苯撑3 ”，3 双( 2 对硝 基苯基5 苯基氯化四氮唑) 的合成 3 ，3 - 二甲氧基- 4 ，4 二苯撑- 3 ”，3 也双( 2 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) ，分子 式为c 4 蹦1 2 n 1 0 0 6 ，英文名3 , 3 - d i m e t b o x y - 4 , 4 - d i p h e n y l e n e - 3 ”, 3 - b i s ( 2 - ( 4 - n i t r o p h e n y l ) - 5 - p h e n y l 蛐l i u mc h l o r i d e ) ，淡黄色晶体，由伽u 等于1 9 5 6 年首先合成渊，结构如 下 随着生物医学的发展，3 ，3 二甲氧基4 ，4 7 二苯撑- 3 ”，3 巳双( 2 对硝基苯基5 - 苯基氯化四氮唑) 在生物医学领域和细胞学领域中的应用越来越重要，对其合成的研究也有 着非常大的市场前景。 4 2 药品和主要仪器 苯甲醛、二氧六环分析纯上海凌峰化学试剂有限公司 对硝基苯肼分析纯国药集团化学试剂有限公司 亚硝酸钠分析纯上海振兴试剂厂 盐酸分析纯上海化学试剂有限公司 k o h分析纯上海久亿化学试剂有限公司 t h f 分析纯天津市科密欧化学试剂开发中心 甲醇 分析纯 上海实意化学试剂有限公司 北京电光学仪器厂) a l 4 型数字熔点仅 真空循环水泵、搅拌器、温度计 第四章3 3 二甲氧基4 二苯撑3 ”3 ”双( 2 对硝基苯基- 5 - 苯基氯化四氮唑) 的合成 4 33 ，3 二甲氧基- 4 ，4 二苯撑- 3 ”，3 ”双( 2 对硝基苯基孓 苯基氯化四氮唑) 的合成路线 由苯甲醛与对硝基苯肼合成苯甲醛对硝基苯腙后再与联大茴香胺重氮盐反应得到 f o r m a z ，最后再由f o r m a z a n 氧化得到产品3 ，3 - 二甲氧基- 4 ，4 二苯撑- 3 ”，3 双( 2 对硝基苯基5 苯基氯化四氮唑) 合成路线如下： h 3 c q h 2 n 卜p 南r n 1 2 c t 旷+ 蚪d 一一扩吣 h 3 c o , 三q 机丹心一0 c h 3 ( 4 ) o 州 器 n 0 2 3 。3 - d i m e t h o x y - 4 , 4 - c l i p h e n y l e n e - 3 ”，3 - h i s ( 2 ( 4 - n i t r o p h e n y l ) 5 - p h e n y l t e t r a z o l i u m c h l o r i d e ) 3 1 东南大学硕士学位论文 4 4 联大茴香胺盐酸盐的重氮化 向2 5 0 m i 三颈瓶中投入1 2 6 9 ( 0 0 4 t 0 0 1 ) 联