（生物医学工程专业论文）大型海藻组织细胞培养系统的研究.pdf

大型海藻组绷细胞培养系统的研究 摩尔浓度比固定在1 6 ：1 ，在2 0 的更新率下，p e r f u s i o n 培养的中后期( 约9 2 7 天时) n 、p 的浓度能基本维持稳定。在n 维持浓度为o 4 1 2m m o l l 时，比 生长速率最大为0 1 1 8 ，最终生物量增长1 9 2 倍：n 维持浓度达到约2 5 0m m o l l 时，细胞生长开始明显受到抑制。 本文通过k l a 、o e r 等参数测定，进行了不同系统的0 2 c 0 2 传质动力学方 面的研究，创建了大型海藻组织细胞在光生物反应器中的控制培养关系的数学 模型。工程参数测定结果表明，海带配子体细胞培养的光饱和点为2 0 0 0l u x ，适 宜通气速率为1 0 0m lm i n 1 。建立的m o n o d 数学模型较精确地描述了细胞生长 速率和氮、磷稳定浓度之间的关系，pm a x = 0 1 1 8d a y 1 ，k s n = o 0 2 2 6m m o l l k s p = 0 0 0 1 4 2 m m o l l 。 关键j 闻大型海藻海带配子体次培养光生物反应器生长动力学 大型海藻组缈细胞培养系统的研究 s t u d i e so nc u i t i v a t i o no fm a c r o a i g a i t i s s u e s c e i l s a b s t r a c t m a c r o a l g a e ，c o m m o n l yk n o w n a ss e a w e e d s ，a r ea l le m e r g i n gs o u r c eo fb i o a c t i v e n a t u r a lp r o d u c t s ，w h i c hh a v eb e e na p p l i e d 、 ，i d e l yi nm a n yf i e l d s t e c h n i q u e sf o r c u l t u r i n gc e l l sa n dt i s s u e sf r o mm a c r o a l g a ea r es i g n i f i c a n t l yu n d e v e l o p e dr e l a t i v et o m i c r o a l g a e g a m e t o p h y t ec e l l so fl a m i n a r i aj a p o n i c aa r ee m p l o y e di nt h ep r e s e n t s t u d i e s w ed e s c r i b et h es u b c u l t u r ea n dp h o t o b i o r e a c t o rc u l t i v a t i o n so fl a m i n a r i a j a p o n i c af e m a l eg a m e t o p h ”i cc e l l si n c l u d i n gg r o w t h ，a s s i m i l a t i o n so fn u t r i e n t sa n d k i n e t i c s f i v ec u l t i v a t i o nm o d e sa r ed e v e l o p e da c c o r d i n gt ot h ea e r a t i o ns t y l e si n s u b c u l t u r es y s t e m t h es u i t a b l ec u l t u r i n gm o d ei se x p l o r e db yb i o m a s s ，n u t r i e n ta n d p h a sar e s u l t ，m e m b r a n e ，s h a k ea n db u b b l ec u l t i v a t i o nm o d e sa r e u s e f u li n a m p l i f i c a t i o no fl a m i n a r i aj a p o n i c af e m a l eg a m e t o p h y t i cc e l l s b u tt h em e m b r a n e m o d ei st h em o s ts u i t a b l ew a y t h es p e c i f i cg r o w t hr a t eo fm e m b r a n ei so 0 7 7d a y 一 a n dt h eu l t i m a t eb i o m a s sp r o d u c t i v i t yi n c r e a s e db y1 4 4t i m e s ，w h i c hi sh j ：g h e ra b o u t 1 7 8 ，1 6 6a n d2 6 8t i m e st h a nb u b b l e ，s h a k ea n ds t a t i cm o d er e s p e c t i v e l y t h e a s s i m i l a t i o n so fn u t r i e n t s ( n i t r a t ea n dp h o s p h a t e ) a r es i m i l a ri nt h ed i f f e r e n t s u b c u l t u r es y s t e m s ，w h i c ha r ea c c o r d i n gw i t hg r o w t hc u r v e s b u b b l e - - c o l u m na n ds t i r r e d - t a n kp h o t o b i o r e a c t o r sa r ee m p l o y e di nb i o r e a c t o r s y s t e m i nb u b b l e c o l u m np h o t o b i o r e a c t o rs y s t e m ，l a m i n a r i aj a p o n i c af e m a l e g a m e t o p h y t i cc e l l sa r ec u l t i v a t e di nb a t c h ，f e d b a t c ha n dp e r f u s i o nm o d e s t h er e s u l t s h o w st h a tp e r f u s i o nc u l t i v a t i o ni st h em o s te f f e c t i v em o d e t h es p e c i f i cg r o w t hr a t e o fb a t c ha n dp e r f u s i o nm o d ei s0 0 6 3 0d a y 1a n d0 0 9 2 9d a y lr e s p e c t i v e l y a st o f e d b a t c hm o d e ，t h es p e c i f i cg r o w t hr a t ei s0 0 6 2 0d a y 。1a n dd e c r e a s e dt o0 , 0 3 6 0d a y 。1 a f t e rn u t r i e n t sa r ea d d e d c o m p a r e dw i t ht h ei n i t i a lc e l ld e n s i t y , t h eu l t i m a t eb i o m a s s i i j 大型海藻组棼v 细胞培养系统的研究 p r o d u c t i v i t y i n c r e a s e db y2 ，9 3 1 ，4 ，2 2 3a n d1 6 0 8 1t i m e sr e s p e c t i v e l yf o rb a t c h ， f e d b a t c ha n dp e r f u s i o nm o d e s i ns t i r r e d t a n kp h o t o b i o r e a c t o rs y s t e m ，l a m i n a r i a j a p o n i c af e m a l eg a m e t o p h y t i cc e l l sa r ec u l t i v a t e di np e r f u s i o nm o d e ，a n dl o n g - t e r m e f f e c t so fv a r i o u sn i t r a t ea n d - p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n sw i t hc o n s t a n tl e v e l sa r e q u a n t i f i e da sw e l l t h er e s u l ts h o w st h a tu n d e rt h ep e r f u s i o nr a t eo f2 0 w i t l la c o n s t a n tm o l a rr a t i oo f n i t r a t ea n dp h o s p h a t eo f1 6 ：t ，t h ec o n c e n t r a t i o no f n i t r a t ea n d p h o s p h a t er e a c hc o n s t a n tl e v e li nt h em i d d l e l a t ep e r i o do f t h ec u l t i v a t i o nr 9 2 7d a y s ) t h em a x i m u ms p e c i f i cg r o w t hr a t ei so 1 1 8d a y a n dt h eu l t i m a t eb i o m a s s p r o d u c t i v i t yi n c r e a s e db y19 2t i m e sw h i l et h en i t r a t ec o n c e n t r a t i o ni sm a i n t a i n e da t o 4 1 2m m o y l t h ec e l lg r o w t hw a si n h i b i t e dw h e nt h ec o n s t a n tc o n c e n t r a t i o no f n i t r a t ei sa b o u t2 5 0m m o l l k i n e t i c si sc a r r i e do u tb yt h ew a yo fv o l u m e t r i co x y g e nm a s st r a n s f e rc o e f f i c i e n t f k l a ) a n do x y g e ne v o l u t i o nr a t e ( o e r ) t h er e s u l to f e n g i n e e r i n gp a r a m e t e r si n d i c a t e s t h el i g h ts a t u r a t i o np o i n ti s2 0 0 0l u xa n dt h es u i t a b l ea e r a t i o nr a t ei s10 0m lm i n 一a m o n o dm a t h e m a t i c a lm o d e le l u c i d a t i n gt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h es p e c i f i cg r o w t h r a t ea n dt h ec o n s t a n tc o n c e n t r a t i o n so f n i t r a t ea n dp h o s p h a t ew a se s t a b l i s h e d 1 a 爪“= o 1 1 8d a y “，k s n ；o 0 2 2 6m m o l l ，k s p2 0 0 0 1 4 2m m o l l k e yw o r d sm a c r o a l g a el a m i n a r i a j a p o n i c ag a m e t o p h y t ec e i l s s u b c u l t u r e p h o t o b i o r e a c t o rg r o w t hk i n e t i c s 大型海藻组绷细胞培养系统的研究 第一章前言 大型海藻体内含有多种生物活性物质，广泛用于农业、食品、化工等领域 ( r a d m e re ta 1 ，1 9 9 6 ) ，从藻体内分离的多种具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤等药用 价值的化合物，日益受到医学界的关注( m a y e re t a l ，2 0 0 1 ；w i s ee t a l ，2 0 0 3 ) 。部 分食用大型海藻已在我国实现大规模人工栽培养殖，其规模和经济效益已成为国 民经济的一个重要组成部分，目前，我国已实现了海带、紫菜等1 1 个属的大型 海藻的规模化养殖( 向文洲等，2 0 0 2 ) ，光生物反应器培养海藻组织细胞已成为 大型海藻养殖业育苗技术发展的一个重要方向( z o ue t a l ，2 0 0 3 ) 。另外，利用光 生物反应器培养大型海藻组织细胞可以基于经济、无限量和资源循环再利用的 方式在植物体外合成生产重要的海洋植物次生代谢物质。但大多数大型海藻的组 织细胞培养的研究目前还仅处于种子资源保藏阶段，大型海藻细胞的光生物反 应器培养的研究到目前仅开展1 0 年左右( q ie t a l ，1 9 9 5 ) ，同微藻培养技术相比 还处于起步阶段，因此，大型海藻组织细胞培养系统的研究具有现实指导意义。 1 大型海藻的概述 1 。1 大型海藻的种类 海洋面积约占地球面积的7 0 ，是人类赖以生存和发展的资源宝库，在海 洋中生存着种类多、分布广的海洋藻类。海藻( a l g a e 或s e a w e e d s ) 属低等隐花 植物，根据藻类学家( d a w s o n ) 的分类，海洋中藻类品种达1 5 0 0 0 余种，分为 微藻和大型海藻( 吕惠敏等，1 9 9 8 ) 。其中大型海藻有2 5 0 属( 黄知清等，2 0 0 2 ) ， 迄今被人类广为利用的大型海藻主要有红藻门( 如紫菜、石花菜、江篱等) ，褐 藻门( 如海带、裙带菜、马尾藻等) ，绿藻门( 如石莼、礁膜、松藻等) 三大类 和少量蓝藻门( 张淑梅等，2 0 0 1 ) ，其中有经济价值的海藻约有1 0 0 余种( 王素娟， 】9 8 1 ) 。 大型海藻组织，细胞培养系统的研究 1 2 大型海藻的用途 1 2 1 大型海藻在食品和工农业中的应用 大型海藻作为食品已有悠久的历史，早在1 5 0 0 年前，我国人民就知道食用海 带，近代对海藻的食用范围更广，食用方法也是多种多样。海藻是中国、日本和 韩国的传统食品，每年生产量和消费量都非常大。海藻中含有大量有益于健康的 营养成份。海藻富含蛋白质，必需氨基酸的含量也比陆地植物丰富，尤其是紫菜、 红毛菜、裙带菜和海带中含有很多人体必需氨基酸，不仅味道鲜美，而且具有较 高的营养价值，是主要的海藻食品( 张经浩，2 0 0 0 ) 。 大型海藻除了具有重要的食用价值外，也是海藻工业不可缺少的原料。其中 最重要的是从褐藻和红藻中提取得到的藻胶酸、琼胶、卡拉胶等物质。藻胶酸可 制造人造纤维，藻胶酸的可溶性碱盐浓缩后，可作为染料、皮革、布匹等的光泽 剂，藻胶酸盐也在建筑工业上被利用，可提高建筑物的不透水性，在橡胶工业中， 可增加橡胶的粘稠性。琼胶和卡拉胶被广泛应用于食品、造纸、纤维板以及许多 建筑工业上，比如在生产水果胶、果酱和糖水浸果品时以琼胶来代替果胶质，也 有以琼胶做稠浓的汤和鲜味汁，也有加到炼乳、冰洪淋和乳酪中，在糖果工业上 它们是最好的滤过剂，又是金属和木材的磨光剂，在造纸工业中琼胶用作纸的粘 胶，在纺织工业上则可作纺织物的加浆( 赵焕登，1 9 9 3 ) 。 大型海藻还可为农业提供肥料和饲料。因为其中含有农作物所必需的钾肥、 磷肥及其它各种盐类，能使作物的根和茎粗壮、坚挺，同时也能增强作物的抗病、 抗旱、抗寒的能力。另外，利用藻类的固氮作用，可提高土壤的肥力。此外，大 型海藻，主要是褐藻，己用在工厂加工作为饲料，因为这种藻类的粉料除含有高 价热量外，还有维生素( b ，c ，d ，e ，k ) 和微量元素( b ，c o ，c r ，i ，n o ，n i ，z n 等) ， 良好的效果己在猪、牛、马、羊和家禽的饲养中得到证实( 赵焕登，1 9 9 3 ) 。 1 2 2 大型海藻的药用价值 大型海藻是原始的海洋植物，其体内的生物活性物质在医药领域日益受到各 国科学家们的广泛关注( r a d m e re ta 1 ，1 9 9 6 ；m a y e re ta 1 ，2 0 0 4 ) 。比如，在 o k i n a w a n l a u r e n c i a 属中发现的卤化萜类物质，有很强的抗菌活性( v a i r a p p a n e t 大型海藻组绷细胞培养系统的研究 a 1 ，2 0 0 1 ) ；从大型褐藻s a r g a s s u mp a t e n s 中发现了一种硫酸多糖，有很强的抗 单纯疱疹病毒( h s v ) 的活性( z h ue ta 1 ，2 0 0 3 ) ：从大型褐藻c y s t o s e i r am y r i c a 中醇提取到了系列二萜类物质，并验证有一定的细胞毒性作用( a y y a de ta 1 ， 2 0 0 3 ) ；从s t y p o p o d i u mz o n a l e - 属中发现的新型萜类物质具有对抗人类肺癌和结 肠癌的细胞毒性( d o r t ae ta 1 ，2 0 0 2 ) ；在s a r g a s s u mc a r p o p h y l l u m 属中发现的甾 醇类物质，对多种癌细胞系都显示了强烈的细胞毒性( t a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) ；从 s a r g a s s u ms i l i q u a s t r u m 中发现了抗氧化活性的物质( l i me ta 1 ，2 0 0 2 ) ；从大型 红藻p o r p h y r a t e n e r a 属中提取了抗突变活性的物质( o k a ie t a l ，1 9 9 6 ) ：西班牙 g r a nc a n a r i a 岛附近的海域中打捞的4 4 种大型海藻中提取出了多种活性物质， 它们均表现了很强的抗菌活性，而且抗菌普很广，包括葛兰氏阳性菌、阴性菌， 真菌，分支杆菌，酵母菌等多种微生物( g o n z a l e ze ta 1 ，2 0 0 1 ) ；从大型红藻 a m p h i r o a z o n a t a 中提取到了一种抗肿瘤活性的棕榈酸等等( h a r a d a e t a l ，2 0 0 1 ) 。 因为海藻具有陆生植物所不具备的分子结构和生理、生化特性，有着不少特 殊的医疗保健功能，对治疗人类的常见病、多发病具有显著的疗效。概括地说， 其多糖、不饱和脂肪酸、蛋白质、氨基酸、多肽、牛磺酸、多萜、甾类和酶等成 分具有抗炎、抗凝血、降血压、降血脂、抗肿瘤等独特功能( 阮积惠，2 0 0 1 ) 。 2 大型海藻组织细胞培养条件的研究 2 1 培养形态 到目前为止，大型海藻组织细胞的培养形态主要有两种形式，配子体 ( g a m e t o p h y t e ) 和微繁殖体( m i c r o p l a n t l e t ) 。 配子体是某些大型海藻，比如海带和裙带菜世代交替的一种形式。栽培在海 里的藻体属于孢子体世代，它们是受精卵生长发育的孢子体，染色体为二倍体， 形态为叶状体。由孢子体上的部分细胞经减数分裂，形成孢子，分别分化为雌、 雄配子，这个过程称为配子体世代。其染色体为单倍体。在适宣的培养条件下， 配子体可不断分裂增殖，而形成培养藻种的无性繁殖系( 克隆) ( 戴继勋，2 0 0 2 ) 。 配子体克隆具有可长期保存，遗传性纯一，发育全能性的特点，以此为依据的克 大型海藻组织，细胞培养系统的研究 隆育苗方法较现行的育苗方法工艺简便、品准纯度提高、不受季节限制，是某些 大型海藻的生物技术在生产上的具体应用，有望成为改革传统育苗方法的新模式 ( 李志凌等，2 0 0 3 ) 。 由于微繁殖体制备技术的限制，目前只有三种大型海藻( a g a r d h i e l l as u b u t a t a o c h t o d e ss e c u n d i r a m e a ，p o r “e r i ah o r n e m a n n i i ) 的m i c r o p l a n t l e t 用于光生物反应器 中培养研究( h u a n ge ta 1 ，2 0 0 3 ；b a r a h o n ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。制备m i c r o p l a n t l e t 的技术 被称为愈伤组织诱导和枝芽再生技术( h u a n ge ta i ，1 9 9 7 ) 。因为这种培养物对剪 切力的耐受性比配予体好，并有文献报道已从中提取了陆生植物稀有的卤化萜类 物质( h u a n ge ta 1 ，1 9 9 8 ) ，并以之为实验材料研究了这类结构复杂的化合物的生 物合成过程和相应的催化酶，m i c r o p l a n t l e t 现已成为研究大型海藻组织或细胞的 培养条件、次生代谢产物以及生长动力学的理想材料。 2 2 温度 温度是培养大型海藻组织细胞时非常重要的条件因素，海藻对温度的要求 因种而异，有各自的适温范围，如l a m i n a r i a 属，适宜温度为5 1 8 ( l u n i n ge t a 1 ，1 9 7 8 ) ，红藻a g a r d h i e l l as u b u l a t a 为2 4 左右( h u a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。不适宜 的温度会影响细胞生长，表现为诱导其分化或是致死。目前已有报道用测定p 。 ( 光合速率) 大小的方法来确定藻体最佳培养温度( h u a n ge ta 1 ，2 0 0 2 ) 。 2 3 光照 光照是大型海藻组织细胞进行光合作用的能量来源，包括光强度和光周期 两个参数。光强度( 1 i g h = ci n t e n s i t y ) 的国际统一单位是“e n l 。2 s ，常用单位 是l u x 。光周期( p h o t o p e r i o d ) ，即人工白昼黑夜时间之比( 如1 0hl i g h t 1 4hd a r k ， 简写为1 0h ：1 4h 或1 0 ：1 4 l d ) ，国内以日光照时数( d a y l e n g t h h o u r s ，d h ) 表 示。 光生物反应器培养大型海藻组织细胞时，光强度必须满足细胞进行光合作 用的需要，否则将影响光合作用效率，减少生物量积累，当然，过大的光强度也 会诱导细胞分化或产生光抑制( c o u t i n h oe ta 1 ，1 9 8 7 ) 。长期以来，国内一直采用 2 0 0 0 3 0 0 0l u x 的光强度培养海带( l a m i n a r i a j a p o n i c a ) 配子体( 王素娟，1 9 9 4 ) ， 大型海藻组织细胞培养系统的研究 近来杨迎霞指出，4 5 0 0l u x 充气悬浮培养条件下可以获得更大的生物量( 杨迎霞 等，2 0 0 2 ) 。另外，q i 在s t i r r e dt a n k 中培养糖海带( l a m i n a r i as a c c h a r i n a ) 配予 体时发现，当其它因素( 供气、营养等) 不限制藻体生长时，藻的生长速率精确 地受到光强度的影响( q ie ta l i ，1 9 9 5 ) 。近年来国外研究光饱和点的方法转变为 测定藻体p 。值，当光强超过某一阀值后，p 。不再改变( r o r r e re ta 1 ，2 0 0 1 ) 。 在光周期方面的研究指出，在适宜的光周期下，可观察到藻体生长最快( u 最大) ，或者光合速率最大( p 。最大) 。h u a n g 在b u b b l e c o l u m n 中研究了不同光 周期对大型红藻a g a r d h i e l l as u b u l a t a 生长的影响，发现1 6h ：8h 时，m i c r o p l a n f l e t 的p 。值和q 。值( 暗呼吸速率) 达到最大值。当光周期不适宜时会诱导藻体分化 3 9 1 ，甚至引起色素体解体和藻体死亡( h u a n ge ta i ，2 0 0 2 ) 。 2 4 无机碳源和通气速率 海藻是光自养生物，二氧化碳是光合作用所必须的条件，氧是其呼吸所必要 的条件，公式表示如下： 6 c 0 2 + 6 马o # 尝c 6 q ：d 6 + 6 d 2 目前，光生物反应器培养大型海藻组织细胞一般以空气中的c 0 2 和0 2 作为其 生长代谢所需的气体源，其中的c 0 2 在水中主要以游离的c 0 2 、碳酸盐( c 0 3 2 - ) 和重碳酸盐( h c 0 3 ) 的形式存在，它们的平衡关系如下： c o l + h 1 0 口- - - h l c 0 3 h 2 c q 毒h 七h c o s 一 2 h c 0 3 一c 0 3 2 + 0 + c 0 2 这些平衡受p h 的影响很大，一般p h 8 时，以重碳酸盐和碳酸盐 的形式存在。海水的p h 值一般为8 0 8 3 ，所以海水中的c 0 2 只占极少部分( 赵焕 登，1 9 9 3 ) 。另外，由于大气中c 0 2 含量很低( 仅0 0 3 2 ) ，且大多数大型海藻可 以利用重碳酸盐( h c o s ) 为其无机碳源( q ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ，因此人工海水培养液 中一般都添加适量n a h c 0 3 作为补充。事实上，海藻对重碳酸根、硝酸根以及磷 酸根的消耗使培养基的p h 值和碱度不断增高，进一步促进大气中c 0 2r 甸培养基中 大型海藻组织细胞培养系统的研究 扩散( 即所谓的生物泵) 。 一般而言，通气速率对于比生长速率u 的影响不很大，比如批次( b a t c h ) 培 养大型红藻o c h t o d e ss e c u n d i r a m e a 时，通气速率从o 6 3v v i n ( v v m ，即单位时间 ( 分钟) 单位体积培养液( 升 中通入的气体体积( 升) ) 增至2 70w m ，仅 增加了1 5 左右( m a l i a k a le ta t ，2 0 0 1 ) 。通气悬浮培养条件下，藻体细胞团随 培养基而运动，因而通气除了提供无机碳源外，还利于细胞团接受充足的光照、 便于营养物质的传递、气体交换等等；大通气量的缺点在于剪切力的增大易导致 藻体细胞死亡。 2 5 营养物质 海水中有多种微量元素和其他海藻生长必需的物质，氮、磷和铁为海藻生长 的必要元素。目前人们对于铁元素被海藻的利用情况了解很少( 刘静雯等，2 0 0 1 ) ， 氮是参与合成光合色素的重要物质，磷大量代谢进入a t p 和n a d ( p ) h ，因此氮和 磷成为研究较多的限制性营养物质( t o u c h e t t ee ta 1 ，2 0 0 0 ) 。目前对于无机氮磷 的研究主要集中在培养起始时氮磷浓度对于海藻生物量积累、藻体次级代谢产物 生产的影响，培养过程中氮磷的利用率研究等方面。 p o l z i n 在b u b b l e c o l u m n 中连续灌注培养大型红藻o c h t o d e ss e c u n d i r a m e a 的 m i c r o p l a n t l e t 时发现，增加n 0 3 的传递速率从o 0 0 6 3m m o tn l 。1 d 1 至0 7 4m m o l n l 。d ，显著提高了藻体生物量的积累( p o l z i ne ta 1 ，2 0 0 3 ) 。z h i 在b u b b l e - c o l u m n 中批次培养l a m i n a r i as a c c h a r i n a 配子体时发现，当n 0 3 起始浓度大于o 7 4 7 m m o ll 1 ( 小于5 9 7 6m m o ll “) 时，u 基本保持恒定( z h ie ta 1 ，1 9 9 6 ) ；另外， m a l i a k a l 的研究表明，增加n 0 3 的浓度从o 0 5 9m m o ll 。1 至1 1 8m m o ll 一，卤化 单萜的产量反而下降，说明卤化单萜的生物积累适宜在低氮条件下进行( m a l i a k a l e ta l 一2 0 0 1 ) 。 大型海藻组织，细胞培养系统的研究 3 大型海藻组织细胞的光生物反应器培养研究 3 1 光生物反应器类型。 光生物反应器( p h o t o b i o r e a c t o r ) 是培养有光合作用能力的细胞或组织的反 应器系统。目前，培养大型海藻组织或细胞的光生物反应器主要有三类，分别是 搅拌罐式( s t i r r e d t a n k ) ，鼓泡柱或气升式( b u b b l e ，c o l u m no ra i r l i f t ) 和管道式 ( t u b u l a r ) 光生物反应器( 图1 - 1 ) 。s t i r r e d - t a n k 和b u b b l e c o l u m n 光生物反应 器分别借助机械搅动和气流运动实现细胞或组织的悬浮培养，同时利于培养液中 的物质传递和气体交换。b u b b l e c o l u m n 光生物反应器产生的剪切力远比 s t i r r e d t a n k 光生物反应器中搅拌桨产生的剪切力小，所以在培养大型海藻组织 或细胞中使用比较广泛。t u b u l a r 光生物反应器由螺旋管部分( 又称提升管) 和 储液部分( 类似搅拌罐) 组成，t u b u l a r 光生物反应器对光和c 0 2 利用率比前两 者都高，适于工业规模生产，不过目前t u b u l a r 光生物反应器仍主要用于微藻大 量培养( m o l i n ae ta 1 ，2 0 0 1 ) ，用于大型海藻细胞或组织培养的报道还比较少见 ( r o r r e re ta 1 1 9 9 9 ) 。 ( a )( ( c ) 图1 1三种常见的培养大型海藻细胞或组织的光生物反应器 ( a 搅拌式b 鼓泡式c 管道式) f i g 1 - 1 p h o t o b i o r e a c t o r s a s t i r r e d t a n kb b u b b l e c o l u m nc t u b u l a r 大型海藻组织，细施培养系统的研究 3 2 光生物反应器培养方式 根据营养盐供应方式的不同，光生物反应器培养大型海藻组织细胞的方式 分为三种，即批次( b a t c h ) 培养、补料( f e d b a t c h ) 培养和灌注( p e r f u s i o n ) 培养方式。 所谓b a t c h 培养方式，即营养物质在培养初期一次性供应给培养物，在培养 过程中不再添加任何营养物( a l b e r t oe ta 1 。2 0 0 4 ) 。这种培养方式下细胞的生长 会因营养物质的耗尽而渐渐停止，而且因为培养过程中细胞生长的环境始终处在 不断变化中，一方面不利于生物量和代谢物的稳定生产，另一方面也难以建立可 靠的动力学模型。 f e d b a t c h 是在培养过程中向培养系统中添加营养物质的培养方式，目前除了 运用在微生物和陆生植物细胞的培养外，主要在微藻培养中有较广泛的应用。一 般在细胞生长的对数期晚期添加营养物( c h e ne ta 1 ，1 9 9 7 ；z h a n ge ta l ，1 9 9 9 ) ，也 有在细胞进入静止期后再加入的( a l b e r t oe ta 1 ，2 0 0 4 ) 。补加方式主要有一次性 补料、间断性分批补料和连续补料三种方式，其中，间断性分批补料和连续补料 方式研究得较多。至于补加的营养物，因培养方式而异，一般对于自氧培养方式， 补加的就是硝酸盐和磷酸盐( 王军等，2 0 0 3 ) ，对于异氧培养方式( 陆生植物细胞 培养中普遍运用) ，一般补加有机碳和有机氮的混合物( 葡萄糖或乙酸和尿素) ( s h ie ta 1 ，2 0 0 2 ) 。近年来对于f e d b a t c h 培养方式的补加物有了新的定义，可以 不仅指物质，还可以是一种能量，比如c h e n 在培养微藻s p i r u l i n a p l a t e n s i s 时通 过不断提高光强( 补加光强) 来维持藻体细胞的对数生长状态，从而达到高密度 培养的目的( c h e ne ta ，1 9 9 7 ) 。 p e r f u s i o n 培养方式是一个连续培养的过程，但又有别于连续( c o n t i n u o u s ) 培养方式。一般c o n t i n u o u s 培养方式指不断将新鲜培养液输入培养系统中，同 时不断移出体系中的培养液和细胞，最常见的c o n t i n u o u s 培养装置是恒浊器 ( t u r b i d o s t a t ) 和恒化器( c h e m o s t a t 或b a c t o g e n ) ，前者恒定培养物浓度，后者 是恒定培养液流速。p e r f u s i o n 培养方式在运作方式上和后者有点相似，即以恒定 流速将新鲜培养液输送到反应器内，同时以相同速度输出旧的培养液，但并不涉 及细胞在反应器内外的流动。p e r f u s i o n 培养方式目前主要应用在动物细胞培养 中，其主要目的是获得大的细胞密度和及时收获培养液内细胞分泌的重组蛋白和 大型海藻组绷细胞培养系统的研究 单克隆抗体( z e n g e ta 1 ，1 9 9 9 ；s u g i u r ae ta 1 ，1 9 9 8 ；p a r ke ta l ，1 9 9 4 ) 。近来这种培 养方式也开始运用到植物细胞的培养中，目的同样是收获重组蛋白质( s ue ta 1 ， 1 9 9 6 ；s ue ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这种培养方式得以实现的最关键因素是其硬件的设计，即 截留装置( r e t e n t i o nd e v i c e ) ，主要可以分为两类，沉降型和过滤型( v o i s a r de ta 1 ， 2 0 0 3 ) 。由于植物细胞的聚集性，本实验中悬浮培养的配子体细胞其实是一种细 胞团，故采用过滤型的截留装置。 4 生长动力学研究 4 1 光强度生长动力学模型 光强度同海藻生长间存在一定的关系，q i 在s t i r r e dt a n k 中研究了不同入射 光强度( 厶) 下l a m i n a r i as a c c h a r i n a 配子体的比生长速率( u ) ，发现厶和“之 间符合m o n o d 方程( q ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ： u， u = 二2 业 k+i “：比生长速率：。：最大比生长速率；。：入射光强度；e ：半饱和常数。 z h i 在b u b b l e c o l u m n 中也得出了比生长速率和光强之间的关系( z h ie t a l 1 9 9 6 ) ： = 。( 1 一已。) j ：光饱和值的0 6 3 2 倍。 z h i 还进行了合理的公式变换，得到光强度同生物量之间的直接对应关系 x ，= x ，。( 1 一已一) ：最终生物量浓度；一，：最终最大生物量浓度。 通过这一模型，可以预测在特定光强下理论上所能达到的最大生物量，因此 大型海藻组织细胞培养系统的研究 对于工业大规模生产有很大意义。 之后，h u a n g 考虑了培养过程中细胞浓度的增加对光强的削弱，即光衰减现 象，得出平均光强( 厶) 和比生长速率之间的关系( h u a n ge t a l ，2 0 0 2 ) ； 上。1 一e - i r a i t x l k m a x l ：平均光强度；q ：光照面数( 无因次变量) 。 4 2 光周期生长动力学模型 光周期对于海藻的生长速率也存在显著影响，因为细胞体内进行光合作用的 组织在不适宜的光周期下会失活而直接影响光合作用，从而导致生物量的减少。 h u a n g 从理论上推导了光周期同海藻细胞生物量积累的关系( h u a n ge ta 1 ， 2 0 0 2 ) ： 1 1 1 ( 兰) ：业( 一1 ) x o 1 n ( 巾) r ：光周期持续时间( 即2 4 h ) ；f ：光照分数( f = hl i g h t 2 4h ) ；m ：光损伤度( o 鼓气泵一 空气滤器 ( 0 2 t m ) 一) 流量计) 增湿器 气升式培养瓶 出气管。 b m e m b r a n e ( 膜供气培养) ：空气( t 0 0m l m i n ) 一) 鼓气泵) 空气滤 器( 0 2 _ m ) 一) 流量计一) 增湿器一) 膜反应培养瓶一) 出气管。 c s t a t i c ( 静止培养) ：每天定时摇动混合两次，5 s 次。 d s p i n ( 搅拌培养) ：转速1 5 0r p m ，转子长度4 5c m 。 e s h a k e ( 摇床培养) ：转速1 2 0r p m 。 大型海藻组绷细胞培养系统的研究 ab u b b l e 鼓泡式培养 cs t a t i c 静止培养 es h a k e 摇床培养 bm e m b r a n e 膜供气培养 d s p i n 搅拌培养 图2 - 1s u b c u l t r u e 培养系统 f i g 2 - 1 d i f f e r e n ts u b c u l t u r es y s t e m s 9 大型海藻组织细胞培养系统的研究 1 2 2 生物量测定 1 2 2 1 细胞千重测定 均匀量取接种瓶内一定体积( v ) 的藻体细胞，o 6 5um 滤膜抽滤后，转移 至7 0 预烘干2 4 小时的滤纸上，烘干后的滤纸重量为w l ，滤纸和藻体细胞再 经7 0 烘干2 4h 后称重w 2 ，则接种瓶内藻体细胞的细胞干重d c w ( d r yc e l l w e i g h t ) x o - w i 2 - _ w l 。 1 2 2 2 叶绿素含量测定 根据j e f f e r y 方法( j e f f r e ye ta 1 ，1 9 7 5 ) 测定并计算叶绿素的浓度，略有改动。 均匀量取5m l 藻样，4 0 0 0r p m 离心5m i n ，弃上清，加入5m l 去离子水 ( d d h 2 0 ) 重悬，洗涤一次，4 0 0 0r p m 离心5r a i n 后去上清液，用4m l 冰预冷 的9 0 丙酮抽提，4 避光放置2 4h ，测定抽提液6 6 4n l n ，6 4 7n n l ，6 3 0n l t l 的吸光度值( o d 值) ，根据下面公式计算样品中叶绿素a 的浓度( m gl 1 ) ： c c h j 。= ( 1 1 8 5 o d 6 6 4 - - 1 5 4 o d 6 4 7 - - 0 0 8 o d 6 3 0 ) x v 1 v 其中：v 一用来抽提叶绿索的丙酮的体积，v = 4m l 1 - - - 比色皿的宽度，l = 1c m v - 一藻样的体积，v = 5m l 。 1 2 2 3 比生长速率的计算 以生长曲线的对数生长期为准，以叶绿素a 浓度的对数值对培养时间作直 线，其斜率即为比生长速率。 1 2 3 氮浓度( n 0 f ) 的测定 取5m l 藻样离心后，取1m l 上清液，用d d h 2 0 适当稀释，测定2 2 0n n l 处 的o d 值。 1 2 4 磷浓度( p 0 4 3 一) 的测定 取5m l 藻样离- t l , 后，取1m l 上清液，用d d h 2 0 适当稀释，加入1 1 0 体积 的磷酸赫浓度测定液，反应1 5m i n 后，测定8 8 5n l t l 处的o d 值。 大型海藻组绷细胞培养系统的研究 2 结果和讨论 2 1 不同培养方式对配子体细胞生长的影响 根据j e f f e r y 方法( j e f f r e ye ta 1 ，1 9 7 5 ) 测定并计算叶绿素的浓度，由于褐藻中 主要含叶绿素a ( c h la ) ，而且几乎没有叶绿素b ( q ie ta 1 ，1 9 9 5 ) ，所以，本实 验