（材料学专业论文）钛氧膜表面纤连蛋白的固定及内皮细胞生长行为研究.pdf

西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 摘要 本文采用非平衡磁控溅射沉积技术，制备了具有金红石结构的t i o 膜， 并在此基础上，通过表面生物化方法之一的固定细胞外基质蛋白中的纤连蛋 白对t i o 膜进行表面改性。先通过盐酸和双氧水活化t i o 膜表面使其产生 活性的羟基基团，再涂覆上一层多聚赖氨酸( p 0 1 y l l y s i n e ，p l l ) 作为中 间过渡层，以促进生物大分子的粘附，最后在表面上固定纤连蛋白 。( f i b r o n e c t i n ，f n ) 。并采用傅立叶变换红外光谱仪( f t i r ) 、x 射线光电子 能谱( x p s ) 、原子力显微镜( a f m ) 、扫描电子显微镜( s e m ) 、接触角测 量等方法对每一步处理后的样品表面特征进行了测试与分析，最后在样品表 面进行了体外人脐静脉血管内皮细胞培养实验。重点研究了t i o 膜表面固定 纤连蛋白的表面改性方法以及对人脐静脉血管内皮细胞粘附及生长行为的影 响，目的在于寻求能促进内皮细胞在t i o 膜表面粘附和生长的表面生物化方 法。 t i o 膜经盐酸和双氧水活化后，f t i r 结果显示表面可产生羟基基团， x p s 中一0 h 对应的o 峰位增强，接触角减小。 在活化的t i 一0 膜表面涂覆p l l 后，f t i r 及x p s 结果表明t i o 膜表面 的羟基可以和p l l 中的羧基基团反应生成酯键，使p l l 化学键合到t i 0 膜 表面。s e m 及a f m 结果显示表面形貌发生改变，有尺寸在1 0 0 n m 左右的微 小颗粒出现，接触角增加。 在涂覆了p l l 的样品及t i o 膜表面固定f n 后，f t i r 及x p s 结果得出 样品表面都有不同程度的吸附f n 。接触角进一步增大。 人脐静脉血管内皮细胞体外培养实验结果表明，t i o 膜具有一定的内皮 细胞亲和性，f n 对内皮细胞的生长有较好的促进作用，且在t i o 膜表面通 过p l l 修饰后固定f n 比直接固定f n 能使细胞更好的粘附和生长。 综合分析结果表明，f n 能促进内皮细胞的粘附和生长，通过表面活化 后涂覆p l l 并固定f n 的方法能使内皮细胞在材料表面更好的粘附和生长。 西南交通大学硕士研究生学位论文第| l 页 此种在t i o 膜表面固定f n 的方法为无机材料表面生物化提供了途径。 关键词：钛氧膜：表面生物化：多聚赖氨酸；纤连蛋白；内皮细胞 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 ii 页 a b s t r a c t i nt h i sp 印e r ，t h et i t a l l i 岫o x i d ef i l m sw i t hr m i l es t m c t u r ew e r es y n t h e s i z e d b yu n b a l a n c e dm a g n e t r o ns p u t t e r i n g a 1 1 dt h e nm o d i 打e d b yo n e s u r f a c e b i o 坤d i f i c a t i o nm e t h o d t h et i t a n i u mo x i d ef i l m sw e r e a c t i v a t e db yh c la n d h 2 0 2t 0p r o d u c eh y d r o x y lg r o u nt h e nc o a t e dw i t hp o l y l i y s i n et op m m o t et h e a d s o r p t i o no fb i o m a c r o m o l e c u l ea i l di m m o b i l i z e dw i t hf i b r o n e c t i n t h es u r f a c e c h a r a c t e r i s t i c so fs a m p i e sw e r e i n v e s t i g a t e du s i n gf o u r i e r 他弧s f e ri n 矗a r e d s p e c t n l m( f t i r ) ，x r a yp h o t o e l e c t r o ns p e c t r o s c o p y( x p s ) ，a t o m f o r c e m i c r o s c o p e ( a f m ) a n ds c 孤n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p e ( s e m ) t h ew e t t a b i l i t yo f t i of i l m sw e r es t u d i e db yac o n t a c ta n g l em e t h o d t h eb i o l o g i ca lb e h a v i o ro f c u l t u r e dh u m a nu m b i l i c a lv e i ne d o t h e l i a lc e l l s ( h u v e c s ) o n t od i f r e n t s a m p l e sw a se v a l u a t e db yt h e 加v m oh u v e c sc u l t u r e de x p e r i m e n t t h i sw o r k f o c u so nt h es u r f a c em o d i f i c a t i o no fi m m o b i l i z a t i o no ff i b r o n e c t i na 1 1 di t s i n f 】u e n c et ot h eb i o l o g i c a lb e h a v i o ro fc u l t u r e dh u v e c so n t ot i t a n i u m o x i d e 6 l m s t h er e s u l t so ff t i ri n d i c a t e dt h a tt h et i t a n i u mo x i d e6 l mc a np r o d u c e h y d r o x y lg r o u p a c t i v a t e d b y h c la i l dh 2 0 2 t h e p e a ko foe l e m e n t c o r r e s p o n d i n gt oh y d r o x y lg r o u pi n c r e a s e di nf e s u l t so fx p s ，t h ec o n t a c ta n g l e w a sl o w e r t h er e s u i t so ff t i ra i i dx p si n d i c a t e dt h a tt h eh y d r o x y lg r o 叩c a t lr c a c t w “hc a r b o x y lo fp 0 1 y l - l y s i n et om a k ei tb o n dc h e m i c a l l yw i t hf i l ms u r f a c e t h e r e s u l t so fs e ma j l da f mi n d i c a t e dt h a tt h es u r f a c em o r p h o l o g yc h a n g e dw i t ht h e a p p e a r a n c eo f1 i t t l e 伊a i n si ns i z eo f 10 0 n ma j l dc o n t a c ta n g l eo ft h es u r f a c e i n c r e a s e d a n e ri m m o b j l i z e dw i t h 丘b r o n e c t i n t h es u r f a c eo ft i t a n i 砌o x i d e 矧mc a n a d s o r bf i r o n e c t i nw h i c hs h o w e di nt h er e s u l t so ff t i ra n dx p s t h ec o n t a c t 西南交通大学硕士研究生学位论文第l v 页 a n g l eb e c a m el a r g e r t h e 加v f f ，dh u v e c sc u l t u r e di n v e s t i g a t i o nj u s t i f i e dm a tt h ee n d o t h e l i a l c e l l sh a v ea 衢n “yw i t ht i of i l m ，6 b r o n e c t i nc a l lp r o m o t em ea d h e s i o na i l d g r o w i ho fe n d o t h e l i a lc e l l s ，t h er e s u l t so f 删v e c sc u l t u r e de x p e r i m e n to f n 一0 f i l mw h i c hm o d i f i e db yp o l y - l - l y s i n ea 1 1 di m m o b i i i z e dw i t hf i b r o n e t c i i sb e t t e r t h a nt h a to ft i 一0f i l mi m m o b i l i z e dd i r e c t l yw i t hf i b r o n c t i n a 1 1m e s er e s u l t si n d i c a t e dt h a tf i b r o n e t i nc a np r o m o t et h ea d h e s i o na n d g r o w t ho fe n d o t 圭l e l i a lc e l i s ，t h em e t h o d 。fc o a t i n gw i t hp l l a n di m m o b i l i z i n g w i t hf i b r o n e c t i nc a i lp r o m o t et h ea d h e s i o na n dg r o w t h0 fe n d o m e l i a lc e l l s t h i s m e t h o d p r o v i d e d as u r f a c eb i o m o d i f i c a t i o n w a y f o r i m p r o v i n g t h e b i o c o m p a t i b i l i t yo ft i of i l m k e y w o r d s ： t 一0f i l m ； u n b a l a l l c e d m a g n e t r o ns p u t t e r i n g ；p o l y - 1 1 y s i n e ； f i b r o n e c t i n ：e n d o 协e l i a lc e l l 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页 第1 章绪论 1 1 生物医用材料 生物医用材料( b i o m e d i c a lm a t e r i a l s )又称生物材料( b i o m a t e r i a l s ) ， 是和生物系统作用，用以诊断、治疗、修复或置换机体中损坏的组织、器官 或增进其功能的材料。它主要用于人工器官、外科修复、理疗康复、诊断、 检查以及治疗疾患等医疗保健领域。 生物医用材料由于直接用于人体或与人体健康密切相关，对其使用有严 格要求。首先要求具有较好的生物相容性，对人体无毒和无过敏反应，对机 体无免疫排异反应。种植体不致引起周围组织产生局部或全身性反应，由于 生物医用材料必须和血液接触，因此它应具有抗凝血和抗血栓性能，不会引 起血液凝固和溶血现象。其次要满足相应的力学性能，这就要求它应有良好 的抗拉强度、压缩强度、弯曲强度、剪切强度及合适的弹性模量和硬度较好 的耐磨损、耐疲劳等性能。再者材料加工成形，价格适当，操作方便，便于 消毒灭菌也是必须考虑的。对于不同用途的材料，其要求各有侧重。 1 2 生物医用材料的表面改性与内皮细胞化 1 2 1 生物医用材料的表面改性 对材料与生物体相互作用机制的大量研究表明：生物医用材料表面的成 分、结构、表面形貌、表面的能量状态、亲疏水性、表面电荷、表面的导电 特征等表面化学、物理及力学特性均会影响材料与生物体之间的相互作用。 通过物理、化学、生物等各种技术手段对材料表面进行改性处理，可大幅度 改善生物医用材料生物相容性。目前这个领域已成为生物材料学科最活跃的 研究领域之一。 生物医用材料表面改性的主要方法有： 1 医用材料的表面修饰，包括种植内皮细胞、涂覆白蛋白涂层、聚氧化 西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页 乙烯表面接枝和磷脂基团表面。 2 等离子体表面改性，包括等离子体表面聚合、等离子体表面处理和等 离子体表面接技等。 3 离子注入表面改性。 4 表面涂层与薄膜合成，包括生物陶瓷涂层、低温液相沉积、气相沉积j 离子束薄膜合成和溶胶凝胶方法等。 5 自组装单分子层。 1 2 2 血液接触材料的内皮细胞化 生物医用材料与血液直接接触时，血液和材料之间将产生一系列生物反 应。这些反应表现为，材料表面出现血浆蛋白吸附，血小板粘附、聚集、变 形，凝血系统、纤容系统被激活，最终形成血栓。通常情况下，材料表面在 与血液接触的数秒内首先被吸附的是血浆蛋白( 白蛋白、t 球蛋白、纤维蛋 白等) ，接着发生血小板粘附、聚集并被激活，同时一系列凝血因子相继被激 活，参与材料表面的血栓形成，血管内形成血栓将引起机体致命性后果。因 此，要求制造人工心脏、人工血管、人工心血管的辅助装置及各种进入或留 置血管内与血液直接接触的导管、功能性支架等医用装置的生物材料，必须 具备优良的血液相容性。 文献f 2 3 】认为，在材料表面种植、培养血管内皮细胞( v a s c u l a re n d o t h e l i a l c e l l ，v e c ) 是提高材料抗凝血性和血液相容性的最理想的途径。当将人工心 脏瓣膜，血管支架等材料植入到人体内时，它们不仅与血液接触并相互作用， 而且还与人体血管内壁的内皮细胞( e n d o t h e l i a lc e l l ，e c ) 直接接触并发生 作用。医学研究表明，血管内皮细胞具有分泌抗凝血物质的功能，并可抑制 内膜增生，是维持血管通畅，防止血栓形成的最主要因素之一。进一步研究 可知，内皮细胞位于血管内壁，呈单层细胞覆盖，是介于血管壁和血液之间 的屏障结构，它不仅能完成血液和组织液的代谢交换，而且能合成和分泌多 种生物活性物质，以保证血管正常的收缩和舒张，起到维持血管张力，调节 血压以及凝血与抗凝平衡等特殊功能，进而保持血液的正常流动和血管的长 西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页 期通畅。此外，内皮细胞与血细胞相似表面带负电荷，由于同种电荷的相互 排斥作用而使内皮细胞具有抗血小板聚集，防止血液凝固和血栓形成的多重 作用。内皮细胞表面能够表达可结合抗凝血酶i i i 因子的糖胺、糖酐 ( g l g c o s a m i n q 9 1 y c a n s ) ，后者能够产生前列环素和组织血浆蛋白原激活物 ( t i s s u ep l a s m i n o g e na c t i v a t o r ) ，这些因素都有利于血管内皮细胞的抗凝活 性。当血管内皮层部分受损时，内皮细胞能够产生一系列前凝血剂 ( p r o c o a g u l a n t ) 如血浆蛋白原( p l a s m i n g e n ) 、激活抑制剂、血栓弹性蛋白 ( t h r o m b o s p o n d i n ) 和胶原等，从而可调节假性内膜过度增生过程的产生和 发展，也可以产生诱导血管松弛或收缩的因子。因此，如果能在人工心脏瓣 膜，血管支架等人工心血管植入器械材料表面种植、培养出内皮细胞单层， 实现与血液接触材料的内皮细胞化，将会从根本上改善材料的血液相容性。 1 3 生物材料与细胞相互作用及表面细胞亲和性改性方法 1 3 1 细胞与材料之问的相互作用 从细胞和分子水平看，细胞与生物材料表面问的相互作用可用细胞膜与 材料表面结合位点阳j 的相互作用来描述，细胞膜受体与材料表面配体的结合 方式主要有配位结合、疏水性结合、静电结合、氢键结合等。 在生理环境中，贴壁细胞与植入材料的相互作用实际上是细胞膜表面受 体与生物材料表面配体i 日j 的相互分子识别，产生生物特异性与非特异性相互 作用。当材料植入体内，细胞膜表面的受体积极寻找与之接触的材料表面所 能提供的信号，以区别所接触材料为自体或异体，识别为异体时，则激活异 物反应，导致胶原纤维将其包裹。 细胞和细胞外基质问粘连不仅使其保持相应形态，还起着细胞间信息传 送和功能调节的重要作用。细胞表面和基质表面分子问特异性相互作用，调 节细胞黏附、增殖、分化和凋亡i 维持细胞生长和凋亡的动态平衡。细胞和 基材的黏附很大程度上由吸附的血清蛋白层决定，血清中2 0 0 种以上的蛋白 质经过竞争吸附过程后形成吸附层，其中有少量的蛋白质( 如纤连蛋白、层连 西南交通大学硕士研究生学位论文第4 页 蛋白及玻连蛋白等) 有助于细胞黏附，但是吸附层中不促进细胞黏附作用的蛋 白质( 如白蛋白) 却占多数，因此消除非特异性吸附非常重要。当植入材料生 物体系统的非特异性吸附作用被完全抑制，同时又具备细胞识别的相应位点， 则会被细胞认为是自体，实现材料和细胞的融合作用，积极诱导组织再生。 细胞在材料上的粘附包括两个过程：贴附过程和粘附过程1 4 l 。贴附过程 非常迅速，是由细胞与材料之间的一些物理、化学作用所引起的。粘附过程 是由材料与一些生物活性分子如细胞外基质蛋白、细胞膜蛋白、细胞骨架蛋 白等相互作用而引起，因此粘附期较长。细胞必须与材料发生适当的粘附， 才能在材料上进行铺展生长，乃至分化、增殖。 实际上细胞与材料之间的作用非常复杂，因此确切的粘附机理目前仍不 十分清楚，目前认识较为一致的是细胞与材料之间是以蛋白质为介导的一种 粘附机理。 1 3 1 1 从生物学的观点分析影响材料纲胞亲和性的因素 细胞对材料的粘附与细胞膜的组成和性能有很大的关系。细胞膜是由蛋 白质、脂类、少量的糖及核酸组成。细胞膜外被覆的是具有分支的亲水性寡 糖链，因而细胞膜具有一定的亲水性，又由于此寡糖链分支末端是带有负电 荷的岩藻糖和唾液酸，故哺乳动物细胞膜一般带负电荷，糖链与细胞识别、 细胞免疫、细胞生长调节及细胞增殖抑制等有关，这也是细胞生长需要支架 材料的原因。一般说来，细胞的代谢状态、细胞与材料的接触时间、细胞的 亲疏水性、细胞的表面电荷、细胞膜分子的侧向运动、细胞膜的柔韧性等可 影响细胞在材料表面的粘附 5 j 。 1 3 1 2 从材料的角度分析影响材料细胞亲和性的因素 1 理化性质 ( 1 ) 材料表面的亲疏水平衡 材料表面的亲疏水平衡是调节蛋白质吸附、影响细胞黏附的一个重要 因素。一般而言，亲水性的材料表面更利于细胞黏附，而疏水性表面对蛋白 西南交通大学硕士研究生学位论文第5 页 质的吸附能力较强。细胞与材料之间的粘附是以蛋白质为介导而发生，细胞 膜上的受体能特异性地识别材料上粘附的蛋白质，因而材料必须具有一定的 疏水性才能吸附蛋白质，而大量研究又表明，亲水性的表面有利于细胞粘附 生长，因为细胞膜具有一定的亲水性，由于过于良好的亲水性的表面又不利 于蛋白质的吸附，因此要使吸附蛋白质层与材料之间有一定的粘附强度，保 证材料表面达到一定的亲水疏水平衡值才最有利于细胞生长【6j 。但对于不 同种类细胞，此平衡值各异。 ( 2 ) 材料的表面能 一般认为，能量较高的表面较能量较低的表面更有助于促进细胞在生物 材料表面的黏附，这主要是由于材料的表面能会影响到血清中的蛋白质在材 料表面的吸附，进而介导细胞的粘连。 ( 3 ) 材料的表面带电电荷 哺乳动物细胞膜表面带有分布不均的负电荷，一般可认为带正电荷的材 料表面与带负电荷的细胞之间的静电作用有利于细胞的粘附，而带负电荷的 材料表面与带负电荷的细胞会由于静电排斥而不利于粘附，而现实情况也不 尽然。有研究【7 1 表明：聚合物表面的电荷能极大地影响蛋白质的吸附与细胞 的迁移形态，表面无论带何种电荷，细胞都能在其上生长，但细胞形貌有很 大的差别，因此可认为材料表面的电荷特性与电荷密度对细胞生长有重要影 响。还有研究表明，血清中的蛋白质在材料表面的正电荷区和负电荷区的吸 附行为差异很大，在正电荷区吸附的玻连蛋白对细胞的粘连具有积极影响。 ( 4 ) 材料表面的化学基团 聚合物材料表面的化学结构是影响细胞的黏附、生长的另一重要因素。 一般认为，砜基、硫醚、醚键等对细胞生长影响不大；刚性结构如芳香聚醚 类不利于细胞黏附；羧基、羟基、磺酸基、胺基、亚胺基及酰胺基【8 】等基团 则可促进细胞的黏附和增强。由于磺酸基能模拟肝素的生理活性而显示出较 好的促进细胞黏附和生长的性质。含氮基团不仅能使材料表面带一定的f 电 荷( 胺的阳离子化) ，调节表面的亲疏水性，而且可以与蛋白质肽链发生功能 西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页 团间的相互作用。 2 拓扑结构 生物材料表面的拓扑结构在材料的生物相容性方面起着重要作用。有学 者认为，小到原子、分子、细胞，大到组织，它们的空间结构构建都遵循着应 力平衡原则。也就是说，细胞通过自身协调胞体内张力和压力的分布和平衡 达到总体力学平衡。因此，材料表面的拓扑结构直接改变表面的应力分布， 从而改变细胞的形态。 研究表明，不同细胞在具有不同粗糙度的材料表面的黏附行为有很大差 异。一般说来，粗糙表面有利于细胞的粘附，因为表面性质对生物膜的形成 有影响，粗糙有利于生物膜的迅速再生长【9 1 。多孔结构也有利于细胞粘附与 生长，因为多孔结构有利于营养物质的渗透，有利于细胞的正常代谢，且孔 结构的大小对于细胞的生长也有影响。生物材料表面的拓扑结构( 表面的粗糙 度、孔洞的大小及分布、沟槽的尺寸和取向等) 对细胞的黏附、销展、增殖、 分化、功能表达有很大影响。 3 表面生物特异性识别 生物材料植入体内后一般会产生非特异性和特异性相互作用，根据组织 工程学对生物材料的基本要求，需要抑制非特异性相互作用而构建特异性识 别位点，以诱发细胞和组织响应。一种策略是通过表面改性，提高生物材料 表面性能，创造惰性表面，如材料表面接枝聚氧化乙烯( p e o ) ；另一种策略 是优化提升生物材料与细胞的特异性相互作用，可在材料表面引入化学信使 ( m e s s a g e ) ，使其和细胞膜表面的相应受体形成配合物，实现分子的特异性 识别。 1 3 2 生物材料表面细胞亲和性改性方法 1 3 。2 1 物理化学方法 l 物理包被法 将溶液中的化学成分通过物理吸附力( 范德华力、静电作用、亲疏水相 西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页 互作用等) 的作用引入生物材料最外层表面。该法简易可行。吸附不牢固、 易脱落，是其一大缺点。 2 接枝改性法 在聚合物表面接枝带有对细胞的黏附和生长具有促进作用的功能基团， 是实施生物材料表面改性的另一途径。大量的研究集中于在材料表面接枝亲 水性单体，以改善材料表面的亲水性，提高其细胞亲和力。生物材料的表面 接枝可通过两种方法实现：通过偶联的方法将一种聚合物接枝到另一聚合 物表面；将带反应性功能团单体通过聚合反应接枝到聚合物表面。接枝物 的制备方法大致可分为力化学法、化学法和辐射法。 ( 1 ) 化学接枝法 偶合接枝是一种简单可行的方法，化学键共价固定生物分子通常以双官 能团偶联剂为中介，偶联剂的一端通过c 0 0 h 、0 h 、一n h 2 等官能团连接 在基体材料表面，另一端有一可变的悬吊基团用于结合单体分子。要求材料 表面及要偶合接枝上去的单体两者都有可能发生偶合的官能团，否则要设法 引入活性官能团。 k l e e 叫等将单体4 2 氨基二聚对二甲苯邻甲酸6 5 0 减压条件下化学蒸气 沉积，1 8 下浓缩在聚偏二氟乙烯( p v d f ) 表面，环己二异氰酸酯( h d i ) 活 化表面氨基，接枝上纤连蛋白( f n ) ，培养成骨细胞，发现细胞的增殖能力大 大提高。 c u i f i l l 等采用氢氧化钠溶液表面水解聚乳酸( p l l a ) ，水溶性碳二亚胺 ( e d c n h s ) 活化表面羧基，共价键合壳聚糖( c s ) 分子，提高了材料表面的 亲和性，在其表面培养牛软骨细胞，发现细胞活性和增殖率均比未改性p l l a 显著提高。 ( 2 ) 辐射接枝法 辐射接枝法是利用高能辐射使聚合物a 产生活性点( 自由基或离子) ，再 由该活性点引发单体b 的接枝聚合。它与通常的化学接枝方法相比具有一系 列的优点：辐射接枝可在较厚的聚合物中均匀进行，又可限制在表面层或 西南交通大学硕士研究生学位论文第8 页 在某些指定的厚度内进行，是一种具有特效性的方法；由于高能电离辐射 能被物质非选择性的吸收，且不受温度和分子结构的限制，可以通过辐射接 枝方法制得具有预期结构的聚合物；由于辐射接枝通常并不需要向体系投 放引发剂之类的添加剂，因此可制得适于某些特殊用途的高纯材料；辐射 接枝法比大多数常用的化学接枝法更容易掌握，有些辐射接枝反应是通常的 化学接枝难以实现的；辐射接枝法更为安全可靠。由于辐射接枝技术独特 的优点，在生物材料的表面改性上已得到广泛的应用。 h o m n a 等i ”叫5 l 研究了甲基丙烯酸卢一羟基酯( h e m a ) 、n v p 等对硅 橡胶的辐射接枝，并对接枝物表面进行了吸附蛋白质的试验。试验表明随 着h e m a 接枝率的增加，血纤维原的吸附量减少。 k e a m y 等1 1 6 l 将丙烯酰胺亚甲基二丙烯酰胺混合物用辐射的方法接枝到 硅橡胶管上，体内实验证明接枝水凝胶管具有更优秀的抗凝血作用。 m i l l e r 等 1 7 】在聚四氟乙烯fp t f e ) 上用v a nd e g r a a f r 型电子加速器辐射， 按枝了巴豆酸( c a c ) 、丙烯酸( a a c ) 等而防止了血栓的形成； s a s a l ( i 等【1 8 j 把h e m a 和疏水性的甲基丙烯酸乙酯( e m a ) 在硅酮上进 行辐射接枝，他们注意到1 0 0 的e m a 接枝物会产生血栓，而2 5 h e m a 7 5 e m a 、7 5 h e m a 2 5 e m a 及1 0 0 h e m a 都获得了良好的效果。 通过辐射接枝能赋予普通高分子材料不具备的生物功能性。在聚合物支 持体上进行所需的辐射接枝后，使蛋白质、激素、酵素、医药等用化学键或 静电的方法引入接枝链已获得很多有用的生物体亲和性材料和医疗材料。 l e i n i n g e r 等m 2 2 1 将乙烯基吡咯等单体接枝到硅酮、p t f e 、p p 及p e 上， 并使作为抗血栓剂的肝素结合在上面，肝素化了的表面显示出了显著的抗凝 血性，而且蛋白质的吸附量减少。 k w o n 【2 3 j 等采用预辐射接枝技术，将甲基丙烯酸环氧丙酯( e p m a ) 接枝到 聚丙烯( p p ) 表面，引入磷酸官能团并且在表面固定肝磷脂，实验表明黏附血 小扳数量减少，血栓形成降低，提高了材料的血液相容性。 高能辐照会改变材料表面微观结构，导致拓扑形貌、湿润性和生物相容 西南交通大学硕士研究生学位论文第9 页 性的变化。m i r z a d e h 【2 4 】等采用c 0 2 和鼬f 受激准分子脉冲激光束照射聚对苯 二甲酸乙二酯( p e t ) 表面，发现表面形貌变化较大，体外培养l 9 2 9 成纤维 细胞，细胞黏附和扩展能力有所提高。 ( 3 ) 光化学接枝法 光化学法利用紫外线或可见光照射产生一系列光化学反应而固定生物分 子，其中紫外线辐照是研究的热点。紫外光的波长范围在2 0 0 4 0 0 n m ，能 量达3 0 0 6 0 0 k j ，m o l ，大多数共价键能均处于这一范围内，故紫外光可激发 生成自由基，在材料表面引发自由基接枝共聚反应。 紫外光接枝是适合表面改性的有效方法，它具有以下优点：紫外光比 高能辐射对材料的穿透力差，故接技聚合可严格地限定在材料的表面或亚表 面进行，改性反应仅发生在表面5 0 1 0 0 m 深度内，不会损坏材料的本体性 能；反应程度易控制。使用光敏剂进行表面活化，则更容易在聚合物表面 引发接枝聚合反应，将特定的官能团引入到聚合物表面。 特异性的细胞外基质如f n ( 矗b r o n e c “n ) 、l n ( 1 a m i n i n ) 、胶原i 、胶原v 等 都可通过光化学接技在材料的表面以提高材料的细胞亲和性。g r e e n 等人将 胶原i v 通过光化学的方法接枝在聚苯乙烯培养皿上，考察了不同细胞在培 养皿上的生长，现改性后的材料非常有利于细胞在材料上的贴附和生长。 z h u 等采用紫外光氧化接枝的方法将亲水性聚甲基丙烯酸( p m a a ) 接 枝到聚己内酯( p c l ) 表面，用水溶性碳= 亚胺( e d c ) 作为偶联剂在接枝膜表面 固定了明胶，经过改性后的p c l 膜表面的亲水性显著提高，内皮细胞在改性 p c l 膜表面上培养9 6 h 后的细胞增殖率和活性均有明显提高。 m a t s u d a 等人【2 6 】在磷酸盐缓冲液中将白蛋白及纤维粘连蛋白分别与n2 羟基丁二酰胺2 4 2 叠氮苯甲酸盐反应制得光活性的蛋白质，覆于聚氨酯及聚 对苯二甲酸乙二醇酯上，通过紫外光照射获得共价键固定蛋白质的高分子材 料。经血小板吸附实验和细胞吸附生长实验证明其具有良好的血液相容性和 组织相容性。 a i b a 等制备了含亚氨酸基团的叠氮类衍生物，利用其亚氨酸基团与壳 西南交通大学硕士研究生学位论文第1 0 页 聚糖的氨基反应制得光活性壳聚糖，通过紫外光照射分别固定于聚氯乙烯等 4 种高分子材料上。实验结果表明，在紫外光照射3m i n 时出现叠氮类基团 的最大吸收峰，并且用衰减全反射傅立叶变换红外光谱法测得所固定的壳聚 糖分子的厚度约为3 0 1 5 0n m 。 3 低温等离子体改性法 等离子体是由中性的原子或分子、激发态的原子或分子、自由基、电子 或负离子、正离子以及辐射光子组成。实验室常采用o 1 1 0 0 p a 气压下的气 体射频放电获得等离子体，由于其中的离子、自由基、中性原子或分子等粒 子的温度接近或略高于室温，故称低温等离子体。低温等离子体对材料表面 改性可分为两类：等离子体聚合和等离子体表面处理。 由于等离子体改性具有改性层被严格限制在材料表面( 通常为几个n m ) ， 对材料本体物理性能影响极小，改性条件容易改变和控制等优点而受到人们 青睐。低温等离子体中存在着电子、离子和自由基，利用它们的物理和化学 作用可使高聚物表面改性。但是，等离子体改性也有其缺点：如等离子体可 能在生物材料表面溅射、刻蚀使材料表面形貌发生变化；表面的化学结构不 专一且易发生结构重组，不能很好地揭示特定基团对细胞相容性的影响。此 外，等离子体改性的表面随时间延长具有退化效应。 s i p e h i a 等人【2 8 】用无水氨气对聚苯乙烯培养皿及聚四氟乙烯膜进行了等 离子体处理，将胺基成功地引入材料表面，从而促进了牛内皮细胞在这两种 材料上的粘附生长。 台湾y j w a i l g 【2 9 j 等人也用无水氨气对不同孔径的尼龙网进行了等离子 体处理，发现能够促进3 t 3 细胞在尼龙上粘附生长。 s t e e l e 等人【3 0 l 系统地研究了含氮基团对材料生物相容性的影响，他们利 用气态酰胺，胺基化合物及氨气的等离子体处理氟化乙烯丙烯共聚物表面， 结果表明所有处理过的表面都支持细胞的粘附生长，并且其中以酰胺单体处 理过的表面情况最好，据此提出酰胺基团的存在及其密度的大小对于细胞在 材料上的粘附生长起着重要的作用，可以促进某些蛋白质在材料上吸附，从 西南交通大学硕士研究生学位论文第11 页 而介导细胞的粘附与生长? d a w 等3 1 】利用等离子体聚合将丙烯酸与1 ，7 辛二烯共聚在铝箔上， 通过调节二者的比例来控制共聚膜中的氧碳比及宫能团组成，考察了类成骨 细胞在该聚合膜上的粘附特性，发现当o c 比为0 1 1 ，表面羧酸浓度为3 时细胞在共聚膜上的粘附最好，且提出细胞的粘附并不简单地随表面自由能 中非扩散性组分即亲水性增加而增加。 e r i c 等人用脉冲等离子体沉积技术将烯丙基胺接枝p l l a 与p c l 的膜 表面，利用接枝上的胺基与预先接枝了r g d 肽段的聚乙二醇链段反应，从 而获得了具有细胞识别位的材料，研究表明经处理后的材料可促进肝细胞在 其表面的粘附。 w a n 2 【3 3 1 等用低温等离子体技术与胶原涂覆的方法对聚乳酸( p d l l a ) 膜 进行了表面改性，有效改善了p d l l a 与3 t 3 成纤维细胞间亲和性，在膜上 粘附细胞的数量及增长速率均明显提高。 d i n g 掣3 4 】先用氩( a r ) 等离子处理聚乳酸( p l l a ) 膜，然后暴露在空气中 使之表面形成过氧化物和氢过氧化物，然后滴加壳聚糖醋酸溶液，共价固定 壳聚糖分子。体外培养l 9 2 9 成纤维细胞，发现细胞增殖能力不错并且改性 基质膜可以控制细胞的形态。 4 离子注入法 离子注入过程是将带电离子以高能射入到固体表面，在与固体内原子核 及核外电子云的相互作用中逐渐能力传递消失，同时在以离子经过的轨迹外 层一定半径范围内会使得固体中原有分子原子产生击发、电离等复杂行为。 离予注入技术被运用在高分子材料的表面改性始于2 0 世纪7 0 年代。离 子注入处理高分子材料可以引起材料表面的结构、化学、电学、光学等性质 的变化，这些变化受注入离子的种类、剂量、能量、束流等条件决定。 离子注入法有其自身的优点：在表面特定深度注入预定计量的高能离 字，可定量控制，仅仅影响材料表层性能，不会破坏材料本体性能：注入的 离子渗入材料表层，与基体原子相混合，不会发生脱落现象。 西南交通大学硕士研究生学位论文第12 页 k i m 等采用硼和氮离子注入法对聚酰亚胺膜表面改性，发现随着离子 剂量的增大，膜表面水接触角下降。 c h e n f 3 6 1 等使用4 0 k e v 碳正离子注入对聚羟基链烷酸酯膜改性，亲水性 得到改善，培养成纤维细胞，发现基体膜的细胞相容性明显提高，细胞黏附 形态的变化估计和表面改性时发生的物理化学过程有关。 5 其他方法 利用聚合物材料中本身的基团反应或通过主链侧基上某些反应活性高的 基团或原子的反应，可使聚合物表面产生小分子功能基团。例如，主链饱和 的聚烯烃材料，如p e 、p p ，主链较稳定，通过表面氧化可在其表面引入功 能基团；用过硫酸盐氧化p p 中空纤维，可在其表面引入羟基【3 7 j ；而对含有 易被水解的酯基的聚合物如p m m a 、p e t 、p l a ，可以在碱溶液中部分水解 使其表面产生羧基【3 8 j 。 1 3 2 2 形态学方法 形态学表面改性技术就是要通过改善植入体的表面微观形貌来获得最好 的植入效果。 很多文献报道了材料表面的拓扑结构对细胞的铺展、取向及迁移的影响。 如为了研究大量存在的单个细胞的个体行为，s i n g h v i 等人f 3 9 】设计了在金表 面构建由十六烷基硫醇自组装而成的具有蛋白吸附能力的微米级“小岛”的方 便的柔性方法。这些小岛的尺度、形态都是可以控制的。鼠肝细胞培养结果 表明，在面积为l o o o o c m 2 的“小岛”上肝细胞的白蛋白分泌速率最大；而在面 积为1 6 0 0 c m 2 的“小岛”上白蛋白分泌速率最为稳定。又如，在钛植入物上， 上皮细胞会明显地沿着1 0 c m 深的沟槽定向排列，而骨细胞则“忽略”深度为 5 c m 的沟槽【4 叭。 培养的细胞在带有构槽的或其他细微结构的表面或在棱角边缘上的生长 情况与在光滑表面上是有差别的。一般情况下，细胞将沿着材料表面的突起 部分或是纤维进行取向和迁移。这一现象称为细胞培养的接触诱导，细胞取 向的程度取决于表面沟槽的深度与宽度。例如成纤维细胞在带有沟槽的表面 西南交通大学硕士研究生学位论文第13 页 特别是沟槽的尺寸为1 8 m 时更易取向【4 i j 。是否取向还与细胞种类有关。 在带有深度为1 t 2 p m 和宽度0 1 9 m 凹槽的二氧化硅表面上培养细胞，只有 成纤维细胞、单核巨细胞在表面伸展，而角质化细胞、中性粒细胞则不展开 【4 2 】。材料表面凹凸不平也会影响细胞的行为。例如p d m s 表面( 聚二甲基硅 氧烷) 均匀地分布4 或2 5 肚m 2 的峰状突起，这将是成纤维细胞最好的生长环 境，而1 0 0 p m 2 的峰或4 、5 、1 0 0 “m 2 的谷状表面的生长情况都不如前。 利用微刻蚀技术用不黏附细胞的p h e m a 把钯的表面分成大小不等的 微区，结果发现5 0 0 肛m 2 大小的微区细胞可被黏附但伸展不好。在大的微区 ( 4 0 0 0 岬2 ) 细胞展开情况很好，与单层培养没有差别【4 3 】。多孔材料表面可以比 普通的材料表面更有利于细胞伪足的攀附，增加细胞层与基质材料之间的作 用力。而且多孔的基底材料有利于水分、无机盐以及其他营养物质和细胞代 谢产物的运输和交换，故更有利于细胞的生长。 此外，经过精确设计、制备的材料表面会对细胞产生特异的选择性吸附 作用，这就是基于分子识别原理的模板印模技术。r a t n e r 等人i 舛】报道了以纤 连蛋白原为模板分子，制备纳米微表面材料的方法。即在云母表面置以蛋白， 再用二糖覆盖其表面，使糖与蛋白形成分子间氢键，再在糖表面覆盖环氧化 合物，并最终形成具有一定力学强度的材料，再除去云母及蛋白。这样，在 材料表面就形成了蛋白质印迹，可以对模板蛋白进行选择性吸附。 1 3 2 3 生物化学方法 因为无论是物理化学方法还是形态学方法，其立足点都是通过改善金属 基体表面的性能来提高材料的生物相容性和对活体细胞的生长诱导性。而生 物化学技术却是将生物大分子蛋白质或酶等化学信使( m e s s a g e ) 物质引入基 体表面，使其和细胞膜表面的相应受体形成配合物，实现分子的特异性识别， 以提升生物材料与细胞的特异性相互作用。 一般生物材料因表面缺乏细胞识别位而影响了细胞的粘附。相容性好的 生物材料表面可通过吸附培养介质中的细胞粘附分子而介导细胞的粘附。为 了提高生物材料的生物相容性，人们往往在材料表面固定一些贴壁因子、生 西南交通大学硕士研究生学位论文第14 页 长因子如f n 、l n 、i 、i i 型胶原、多聚赖氨酸、卵磷脂等，或在材料表面固 定胶原类蛋白，可提高细胞的粘附性。 细胞外基质中的大多数糖蛋白在细胞粘附中起重要作用，称为粘附蛋白 ( a d h c s i v ep r o t e i n ) 。目前明确有重要粘附作用的蛋白有纤维连接蛋白 ( f i b r o n e c t i n ，f n ) ，纤维蛋白原( f i b r i n o g e n ，f g ) ，玻璃体连接蛋白 ( v i t r o n e c t i n ，v n ) ，血管性假血友病因子( v o nw i l l e b r a n df a c t o r ，v w f ) ， 层粘连蛋白( l a m i n i n ，l n ) ，胶原蛋白( c o l l a g e n ，c l ) 等。对他们的来源， 组成成分及基本功能已有一定的了解，现分述如下： 纤维连接蛋白( f n ) 是最具有代表性的粘附蛋白，研究也最深入。它实 质上分为大分子糖蛋白，分子量约4 4 0 ，o o o 道尔顿，主要由各种细胞产生， 如成纤维细胞及内皮细胞等【4 ”。f n 一般以可溶性和不可溶性的形式存在于 血浆，组织及细胞表面，结构上由二条肽链以二硫腱连接而成，其上有三个 功能区域，分别为专一的结合胶原纤维，蛋白聚糖和细胞膜受体的位点，细 胞与其结合的膜受体主要是整合素家族( i n t e g r i nf a m i l y ，i f ) 。 玻璃体连接蛋白( v n ) 是最初在研究补体时发现的一种蛋白质，属于旺 球蛋白，它与f n 一样，存在于组织，细胞及细胞外基质，主要由各种细胞 合成，其中包括内皮细胞。t 0 m a s i m i 【4 6 j 等用单克隆抗体及亲和层析方法研究， 发现v n 有两条带，分子量为7 5 ，0 0 0 和6 5 ，0 0 0 道尔顿，f 常血浆中浓度 为2 5 0 “g m l 。v n 的作用主要是促进内皮细胞与细胞外基质的粘附。 层粘连蛋白( l n ) 是细胞外基质成分之一，实际上是为一分子量约8 0 0 ， 0 0 0 道尔顿的糖蛋白 4 ”。其结构上至少由二条肽链以二硫腱联接而成，它主 要分布于基膜上，血中浓度小于1 o g m l 。研究表明，许多细胞膜能合成l n ， 其中主要是各种成皮细胞。早期研究显示：l n 主要是促进表皮细胞的粘附。 胶原蛋白( c l ) 是基膜的最主要成分之一，广泛存在于机体各种组织器官 当中。结构上为三维螺旋状的三条带，含有3 3 甘氨酸，l o 脯氨酸，1 b 羟脯氨酸及各种含量的羟赖氨酸。目前至少有五种它的同型分子，其分子量 约9 4 ，o o o 道尔顿。每型仅仅是其氨基酸序列稍有差异，许多细胞能合成c l 。 西南交通大学硕士研究生学位论文第15 页 胶原i 源于成纤维细胞，平滑肌及上皮细