（海洋生物学专业论文）嗜热微生物的基因组分析.pdf

嗜热微生物的基因组分析 摘要 自然界中绝大多数生物的生存温度都在2 0 。c 一5 0o c 之间，但是也有很多生物 可以在2 0o c 以下的低温和5 0o c 以上的高温环境中生长。其中能在高于5 0o c 的环境下生长的为嗜热微生物。一直以来，嗜热微生物的嗜热机理都是人们关注 的焦点。但是由于其生存环境的特殊性，人们很难对其进行实验研究。随着生物 信息学的发展，越来越多的嗜热微生物的全序列被测定，这些数据的激增为研究 微生物的嗜热机理提供了难得的机遇。 生物信息学的方法来研究嗜热机理主要是在基因和蛋白水平方面。之前本实 验室的一个研究发现，在几种海洋微生物中，高表达基因的含量与其最适生长温 度o g t 之间存在着正相关性。这启发了我们，基因表达水平也许在原核生物的 热适应当中起到了一定的贡献。本文选取了3 3 种具有不同o g t 的原核微生物为 数据集，从基因表达水平入手来分析热适应的机理。但是由于基因功能对结果的 影响比较大，并且目前实验注释的基因功能不够完善，所选的基因组中有很多未 知功能基因。因此我们的第一步工作是用理论的方法对文中所用的微生物基因组 进行功能的注释，让未知功能基因的比例减小以提高我们所做结果的准确性。为 了便于叙述，我们仅以生长温度最高的两种嗜热微生物p y r o c o c c u sa b y s m 和 p y r o c o c c u sf u r i o s u s 来进行介绍。注释的工作是在已识别出的有注释的基因组基 础上进行的。本文首先对各基因进行非编码o r f s 的判别，而后用g s f i n d e r 计 算其起始位点，得到数据后和相应的n c b i 、p r o t i s a 的数据进行比较，用陪审 团算法得到新的数据，这两个步骤都是在基于z 曲线理论的程序上完成的。对假 定基因功能预测是基于序列相似原理的，用b l a s t 结合c o g 确定其功能。最终， 各有超过2 0 0 个的未知功能基因被确定了功能。 确定了基因功能以后，我们接着用e ( 曲和c a i 两种理论方法预测了3 3 个物 种的基因表达水平，发现在更大的数据集上依然存在着高表达基因的比例与 o g t 之间的正相关性。为了进一步探讨这个现象的原因，我们定义了一个以氨 基酸组成为基础的、衡量蛋白质热稳定性的全面指标c i t ，发现高表达基因编码 的蛋白的c i t 值更高，热稳定性也更好。除此之外，我们也研究了高表达基因在 核酸水平上的热适应性。由于在之前的研究中，a g 和a p g 含量被认为是衡量 d n a 稳定性的一个指标，而我们研究发现，高表达基因的a g 以及a p g 含量也 要显著的高于非高表达基因。因此可以说，在蛋白和d n a 水平上，高表达基因 都更加的热稳定。这些发现不但表明了基因表达水平在热适应中所起的贡献，而 且也为进化过程中天然蛋白热稳定性的翻译选择压力提供了证据。 除此之外，本论文还研究了蛋白质三级结构的拓扑特征在热适应方面的一些 贡献。通过考察1 2 7 个蛋白的结构拓扑参数和其自身熔解温度之间的关系来衡量 三级结构的拓扑特征在热适应中所起的作用。但是由于目前已测定的有确切熔解 温度和三级结构的蛋白序列非常的缺乏，并不具备大批量的统计研究条件，因此 并没有发现确定性的结果。相信随着数据集的增大，可能会有确定的结果。本论 文也为进一步的探讨做了一定的铺垫。 关键词：嗜热微生物；热适应；基因功能注释；基因表达水平；高表达基因； i i g e n o m e a n a l y s i so ft h e r m o p h i l i cm i c r o o r g a n i s m s a b s t r a c t a l t h o u g hm o s ts p e c i e sg r o wa tn o r m a lt e m p e r a t u r er a n g i n gf r o m2 0o ct o5 0 。c ， s o m em i c r o o r g a n i s m sh a v eb e e nf o u n da b l et ot h r i v ef a rb e y o n dt h i sr a n g e t h o s et h e g r o w t ht e m p e r a t u r e so fw h i c ha r eb e y o n d5 0o ca r et h e r m o p h i l e s t h em e c h a n i s mo f t h et h e r m o p h i l i ca d a p t a t i o no ft h et h e r m o p h i l e sh a sb e e nav e r yi n t e r e s t i n gt o p i ct o w h i c hm a n yw o r k sh a v e b e e nd e v o t e d d u et ot h ee x e c r a b l ec o n d i t i o nt h e t h e r m o p h i l e sl i v ei n ，i t i sd i f f i c u l tr e s e a r c h i n gi tb ym e a n so ft h ee x p e r i m e n t a l m e t h o d s t h a n k st ot h ed e v e l o p m e n to ft h eg e n o m i c sa n db i o i n f o r m a t i c s ，m o r ea n d m o r ec o m p l e t eg e n o m e so ft h et h e r m o p h i l e sh a v eb e e ns e q u e n c e da n dt h ei n c r e a s e d d a t am a d ei te a s i e rt or e s e a r c ht h et h e r m o p h i l e s r e s e a r c hi nt h et h e r m o p h i l i ca d a p t a t i o no ft h et h e r m o p h i l e sm a i n l yf o c u s e do nt h e g e n ea n dp r o t e i nl e v e l s o u rf o r m e rw o r kh a sr e v e a l e dt h a tt h e r ee x i s t sas t r o n g p o s i t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ep e r c e n t a g eo fp r e d i c t e dh i g h l ye x p r e s s e d ( p h x ) g e n e sa n d t h e o p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r e s ( o g t s ) o fs e v e r a ld e e p - s e a m i c r o o r g a n i s m s t h i se n l i g h t e n su sa b o u t t h ec o n t r i b u t i o nf r o mg e n ee x p r e s s i o nl e v e l t ot h e r m o p h i l i ca d a p t a t i o n 3 3p r o k a r y o t e sw i t hd i f f e r e n to g t sa r ec h o s e ni np r e s e n t w o r ka n dt h e ya r ea n a l y z e di nt h ea s p e c to fg e n ee x p r e s s i o nl e v e l h o w e v e r , t h eg e n e f u n c t i o nm a yb ei n f l u e n t i a lt ot h er e s u l t s ，a n da n n o t a t i o no ft h e s ep r o k a r y o t e si n p u b l i cd a t a b a s e si sn o ts a t i s f a c t o r yr e s u l t i n gi nt h em a s so ft h eu n k n o w nf u n c t i o n g e n e s c o n s e q u e n t l y ，t h ef i r s ts t e pi np r e s e n tw o r k i st h er e a n n o t a t i o no fg e n o m e s t o d e s c r i b ee a s i l y , t w oh y p e r t h e r m o p h i l e s ，t ：劲r o c o c c u so b y s s ia n di ：v r o c o c c u s f u r i o s u sa r et a k e nf o re x a m p l e s f i r s t ，n o n c o d i n go r f sa r er e c o g n i z e da n dt h e n t r a n s l a t i o ni n i t i a t i o ns i t e s ( t l s s ) o fa l lt h ea n n o t a t e dg e n e sh a v e b e e nr e l o c a t e d ，b o t l l o fw h i c ha r eb a s e do nt h ez c u r v et h e o r y a tl a s t , f u n c t i o n so ft h er e f i n e d h y p o t h e t i c a lg e n e s a r ep r e d i c t e db yu s i n gs e q u e n c ea l i g n m e n tt o o l ss u c ha sb l a s t a n dc o g s ，a n dm o r et h a n2 0 0o r i g i n a l l ya n n o t a t e d h y p o t h e t i c a lg e n e s i ne i t h e ro f t h et w oh y p e r t h e r m o p h i l e sh a v eb e e na s s i g n e dw i t hf u n c t i o n s t h e n ，b ya n a l y z i n gt h ep r e d i c t e dg e n ee x p r e s s i o nl e v e l so f 3 3p r o k a r y o t e sb ye ( 曲 a n dc a i ，au n i v e r s a lp o s i t i v ec o r r e l a t i o nw a sf o u n db e t w e e nt h ep e r c e n t a g eo f p r e d i c t e dh i g h l ye x p r e s s e dg e n e sa n dt h eo r g a n i s m s o p t i m a lg r o w t ht e m p e r a t u r e a t t e m p t i n gt ot r a c et h ei m p r i n to ft h ep h e n o m e n a ，ac o m p r e h e n s i v ei n d i c a t o rf o rt h e t h e r m o s t a b i l i t yo fp r o t e i nb a s e do l la m i n oa c i d sc o m p o s i t i o n ，c i t ，i sd e f i n e d t h e i l l p r o t e i n sc o d e db yt h eh i g h l ye x p r e s sg e n e sh a v eh i g h e rc i tv a l u e s ，m e a n i n gt h a tt h e y a r em o r et h e r m o s t a b l e b e s i d e s ，a sa gc o n t e n ta n da p gc o n t e n th a v eb e e nr e g a r d e d a sa ni n d i c a t o ro ft h ed n a s t a b i l i t y ，t h i si n d i c a t o ro ft h eh i g h l ye x p r e s s e dg e n e sa r e a l s oc a l c u l a t e d , 、撕mt h ef i n d i n gt h a tt h ea ga n da p gc o n t e n to ft h eh i g h l ye x p r e s s e d g e n e sa r es i g n i f i c a n th i g h e rt h a nt h a to fl o w l ye x p r e s s e dg e n e s s o ，t h e s er e s u l t s i n d i c a t et h a th i g h l ye x p r e s s e dg e n e sa r es t a t i s t i c a l l ym o r et h e r m o s t a b l et h a nl o w l y e x p r e s s e dg e n e so nb o t hp r o t e i na n dd n a l e v e l s t h e s ef i n d i n g ss h o wt h ep o s s i b i l i t y o ft h es i g n i f i c a n tc o n t r i b u t i o no fg e n ee x p r e s s i o nl e v e lt ot h ep r o k a r y o t i ct h e r m a l a d a p t a t i o na n dp r o v i d ee v i d e n c ef o rt h et r a n s l a t i o n a ls e l e c t i o np r e s s u r eo nt h e t h e r m o s t a b i l i t yo fn a t u r a lp r o t e i n sd u r i n ge v o l u t i o n m o r e o v e r , c o n t r i b u t i o no ft o p o l o g yo fp r o t e i nt e r t i a r y s t r u c t u r ei nt h e t h e r m o s t a b i l i t yi sa l s or e f e r r e dt o n i n ep a r a m e t e r sc o l l e c t e df r o ml i t e r a t u r eo f12 7 p r o t e i n so fw h i c ht h ep d bs t r u c t u r e sa n dm e l t i n gt e m p e r a t u r e sh a v eb e e nd e t e r m i n e d a r ec a l c u l a t e d h o w e v e r , b e c a u s eo ft h el a c ko ft h ep r o t e i nd a t a , i ti sh a r d l yt of i n da d e f i n i t er e s u l t d e s p i t e ，t h i sw o r kc o u l db er e g a r d e da sab a s i sf o rt h ea d v a n c e d r e s e a r c hi nt h i st o p i c k e yw o r d s ：t h e r m o p h i l e s ；t h e r m o p h i l i ea d a p t a t i o n ；r e - a n n o t a t i o n ；g e n e e x p r e s s i o nl e v d ；p h xg e n e s i v 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得堕 塑逡查墓丝壶蔓签型虚明的! 奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的 材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说 明并表示谢意。 学位论文作者签名：王雩 签字日期：如。件月7 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所 将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众提供信 息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：王寄 签字日期：o 罗年6 月夕日 导师擗孩 乙 签字日期：年月日 嗜热微生物的基因组分析 引言 1 1 嗜热微生物概述 地球上的环境是多种多样的，生物在不同的物理化学环境下生存，包括不同 的温度、压力、盐度和p h 值。这其中，温度对细胞的生化和生理性质有着非常 重要的影响。绝大多数生物的生存温度都在2 0o c 一5 0o c 之间，但是也有很多生 物可以在2 0o c 以下的低温和5 0o c 以上的高温环境中生长。低于2 0o c 以下生 长环境的微生物称为嗜冷微生物；而5 0o c 以上的则称为嗜热微生物。其中嗜热 微生物的嗜热机理一直都是人们关注的焦点。 原核微生物在某个特定的温度下，生长速度最快，这个温度被称为最适生长 温度( o p t i c a lg r o w t ht e m p e r a t u r e ，o g t ) 。具体来说，按照最适生长温度的不同嗜 热微生物又可以详细分为两类：生长温度在5 0o c 7 5o c 之间的称为嗜热微生物 ( t h e r m o p h i l e s ) ；7 5o c 以上的称为超嗜热微生物( h y p e r t h e r m o p h i l e s ) 。目前已知 的最高生长温度为火球菌p y r o c o c c u sf u r i o s u s l1 3o c 。在温度接近1 0 0o c 的情况 下，通常核酸和蛋白都会变性，并且质膜的流动性会增加到一个致死的水平( l y n n a n dm a n c i n e l l i ，2 0 0 1 ) ，在这种状况下，嗜热微生物还能保持其生物活性，并能正 常生长，确实是很值得研究的。目前已知原核生物的2 3 个属中都有超嗜热微生 物的成员。火叶菌属p y r o l o b u s 、热网茵属p y r o d i c t i u m 、热棒菌属p y r o b a c u l u m 、 超高温甲烷菌属m e t h a n o p y r u s 、火球菌属p y r o c o c c u s 、硫化叶菌属s u l f o l o b u s 和 古球菌属a r c h a e o g l o b u s 这几个属中都是超嗜热微生物。其中绝大多数都属于古 生菌，仅有少数的超嗜热微生物属于细菌( s t e t t e r , 1 9 9 9 ；h u b e re ta l ，2 0 0 0 ) 。 1 9 9 5 年，第一个微生物基因组，流感嗜血菌h a e m o p h i l u si n f l u e n z a e 测序完成 ( f l e i s c h m a r me ta l ，1 9 9 5 ) 。接下来完成全序列基因组测序的微生物即为超嗜热微 生物詹氏甲烷球菌m e t h a n o c o e c u s j a n n a s c h i i ( b u l te ta l ，1 9 9 6 ) 。从此，每年都有几 种嗜热微生物的基因组测序完成。其中已完成基因组测序的超嗜热细菌有海栖热 袍菌t h e r m o t o g am a r i t i m e ( n e l s o ne ta l ，1 9 9 9 ) ，风产液菌a q u i f e xa e o l i c u s ( d e c k e r te t a l ，19 9 8 ) 和t h e r m o a n a e r o b a c t e rt e n c o n g e n s i s ( b a oe ta l ，2 0 0 2 ) 等。 截止2 0 0 8 年1 2 月，已有7 7 0 余种原核微生物被测序，其中嗜热微生物有1 0 0 多种。部分嗜热微生物的基本信息见表1 1 。 嗜热微生物的基因组分析 表1 1 己测序的部分嗜热微生物基本信息 种歪一 测序时问基因组长度( m b )o g t ( 。c )g c 含量( 詹氏甲烷球菌( m e t h a n o c a l d o c o c c u s j a n n a s c h i i ) 19 9 6 1 6 68 0 31 3 闪烁古球菌( a r c h a e o g l o b u s f u l g i d u s ) 1 9 9 72 1 88 34 8 6 热自养甲烷杆菌a h 1 9 9 7 1 7 56 5 4 9 5 霍氏火球菌0 t 3 ( e y r o c o c c u sh o r i k o s h f f o t 3 ) 1 9 9 81 7 39 84 1 9 敏捷气热菌( a e r o p y r u m p e r n i xk i ) 1 9 9 9 1 踟9 5 5 6 3 风产液菌( a q u i f e x a e o l i c u s v f 5 ) b 1 9 9 9l ，8 08 54 3 3 海栖热袍菌( t h e r m o t o g am a r i t i m am s b s ) o 1 9 9 9 1 8 68 0 4 6 2 激烈火球菌( p y r o c o c c u s f u r o s u s ) 1 9 9 9 1 9 1 1 0 04 0 8 深海火球菌( p y r o c o c c u sa b y s s ig e 5 ) 2 0 0 0 1 7 59 5 4 4 7 硫化叶菌( s u t f o l o b u st o k o d a i i7 ) 2 0 0 0 2 6 9 8 03 2 8 硫磺矿硫化叶菌( s u t f o l o b u ss o l f a t a r i c u sp 2 ) 2 0 0 l 2 9 98 5 3 5 8 嗜酸热源体( t h e r m o p l a s m a v o l c a n i u mg s s i ) 2 0 0 1 1 5 8 6 03 9 9 坎氏甲烷嗜高热菌( m e t h a n o p y r u sk a n d l e r i a v l 9 ) 2 0 0 l1 6 91 0 36 1 2 需氧热棒菌( p y r o b a c u l u ma e r o p h i l u ms 饥i m 2 ) 2 0 0 2 2 2 2 1 0 05 1 4 嗜苦古菌( p i c r o p h i l u st o r r i d u sd s m9 7 9 0 ) 2 0 0 41 5 56 03 6 0 芝田硫化叶菌( s u t f o l o b u sa c i d o c a l d a r i u sd s m6 3 9 ) 2 0 0 5 2 2 3 7 53 6 7 c a l d i v i r g am a q u i l i n g e n s i s1 ( 2 - 1 6 2 0 0 72 1 08 54 3 1 m e t a l l o s p h a e r as e d u l ad s m5 3 4 8 2 0 0 72 2 07 04 6 2 注：o g t ，最适生长温度；6 细菌，其余为古细菌。 1 2 研究嗜热微生物的意义 生命起源是一个极其复杂而又难以研究的问题，其难点之一就是原始地球的 环境无法被还原。经过与太阳系其它行星大气成分的对比，人们推测，原始地球 的大气成分中不含有游离态的氧，而是主要由氢气( h 2 ) 、甲烷( c h 4 ) 、氨( n h 3 ) 等组成，并且认为原始的地球是高温的环境。1 9 5 3 年，由美国芝加哥大学研究 生米勒在其导师尤利指导下完成了著名的米勒实验，模拟原始地球的大气环境， 在容器底部放有持续沸腾的海水，并持续的火花放电进行电击，一周以后，在底 部的聚集物中检测到了有组成生命体蛋白质的氨基酸形成。该实验证明了在原始 大气的条件下可以形成有机物并进一步产生生命，并从侧面印证了对原始地球环 境预测的可靠性。后来的研究者们通过对古生菌和细菌1 6 sr r n a 序列的对比构 建了进化树，认为超嗜热的古生菌与最后共同祖先( l a s tc o m m o na n c e s t ，l c a ) 最为接近( p a c e ，1 9 9 1 ；s t e t t e r , 1 9 9 4 ) 。因而很多研究者都认为，生命最初是从高温 环境中进化的，当时地球的温度比现在要高，所有的原生细菌均生活于9 0o c 以 2 嗜热微生物的基因组分析 上的环境中( f o n e 玎e ，1 9 9 6 ) 。但是，并不是所有的科学家都认同这个观点。恰 恰相反，有些人持截然不同的观点，认为生命是起源于冷环境中的。他们认为说 生命起源于热环境并没有足够的证据。而生命体的生物化学活动在高温( 接近 1 0 0o c ) 下会减弱而不是增强为生命起源于冷环境提供了化学证据。他们认为超 嗜热物种之所能够出现是由于它们比起一般的常温物种来能更好的适应高温，原 因是由于产生了更多的热激蛋白( m i l l e ra n dl a z c a n o ，1 9 9 5 ) 。但是这些观点至今 都还没有定论。研究嗜热微生物的嗜热机制无疑在解决生命起源和生物进化方面 有着重大的意义，能够为我们解开这些难题。除此之外，除了在理论上有贡献以 外，研究嗜热微生物还有很大的实际应用价值。随着酶工程的发展，越来越多的 嗜高温酶被应用于生产。研究引起原始嗜热酶改变的因素，比较同源的嗜高温酶、 嗜常温酶以及嗜低温酶的结构特点，自然对设计新的嗜高温酶有重要的启发作 用。 1 3 嗜热微生物的嗜热机理的研究进展 尽管嗜热微生物有宽广的温度生长范围，但它们与正常微生物一样采用基本 的基因组结构和编码习惯。但由于它们生存环境的特殊性，许多通常使用的遗传 学工具和分析方法是不能用来研究这些嗜热微生物的。而生物信息学的兴起和发 展，为研究嗜热微生物提供了有效的分析方法。近年来，对嗜热微生物的研究不 断的进行，已经在多个方面取得了进展。 1 3 1 细胞结构层次上的研究 1 3 1 1 嗜热原核微生物的细胞壁结构 我们知道，细菌可以分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。对于一般的细菌来 说，革兰氏阳性菌的细胞壁主要成分为肽聚糖和胞壁酸，而革兰氏阴性菌的细胞 壁主要成分为脂多糖。而对嗜热细菌来说，大多数革兰氏阳性菌的细胞壁是由 n 乙酰氨基葡萄糖和n 乙酰胞壁酸通过b 1 ，4 糖苷键连接而成的聚糖链，与短 肽链和间肽链构成三维网状结构。如嗜热脂肪芽孢杆菌b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i u s 、酸热芽孢杆菌a l i c y c l o b a c i l l u sa c i d o c a r d a r i u s 、嗜热糖菌属 s a c c h a r o c o c c u st h e r m o p h i l u s 等。革兰氏阴性嗜热细菌的细胞壁和细胞外膜分为 典型和非典型两类。典型的细胞包被是由质膜肽聚糖细胞外膜构成的细胞包 嗜热微生物的基因组分析 被。非典型的肽聚糖型细胞壁有两种不同结构，一种的细胞壁与其他革兰氏阴性 菌相似，对青霉素敏感，但细胞壁不含l y s 等，外层由分子量为7 5 0 0 0 u 、含p r o ， g l u ，g l y ，a l a 较多的蛋白质单位组成( 曹军卫等，2 0 0 4 ) 。另一种有胞壁酸和l 型和d 型氨基酸，单倍具有类似鞘的外层结构包围着，这种类似鞘的外层结构 由六角形排列的外膜蛋白组成，海栖热袍菌( t m a r i t i m a ) 的细胞包被即属于此 类型( h u b e re ta 1 ，1 9 8 6 ) 。这些与一般中温细菌的细胞壁结构的差异，有可能更 好地隔离细胞与外界的高温环境，使得细胞可以正常生长和进行生理活动。 古细菌与细菌的细胞壁结构又有显著的不同，比如在古细菌的细胞壁中不含 胞壁酸。一些革兰氏阳性古菌的细胞壁由假肽聚糖组成，含有很多复杂的多糖。 而革兰氏阴性古菌则缺乏外壁层和复杂的肽聚糖网状结构，通常含有蛋白质的表 层或糖蛋白亚基单位。另外，在古菌的细胞壁外，普遍存在着由糖蛋白亚单位构 成的s 层( 杨苏声等，2 0 0 4 ) 。 1 3 1 2 嗜热原核生物的细胞膜 随着环境温度的升高，嗜热微生物中细胞质膜的化学成分中不仅类脂总含量 增加，而且细胞中的高熔点饱和脂肪酸含量也增加了。即长链饱和脂肪酸增加， 不饱和脂肪酸减少。而饱和脂肪酸的熔点和热稳定性都大于不饱和脂肪酸。此外， 饱和脂肪酸能形成更多的疏水键，总而进一步增加膜的稳定性。嗜热菌脂质的脂 肪酸组成以c 1 7 的异构脂肪酸为主，由顺反异构脂肪酸组成。而中温菌的异构脂 肪酸都是以c 1 5 脂肪酸为主。很显然，c 1 7 脂肪酸的熔点要比c 1 5 高。在嗜热菌中 没有一般细菌脂质中所存在的不饱和脂肪酸，且在某些高度嗜热菌的脂质组成 中，还含有独特的糖脂质。另外，嗜热菌脂质脂肪酸成分也会随着外界环境的改 变而变化，脂质的理化性质也会随着外界温度的变化发生相应的变化，以使生物 能适应环境的变化( 曹军卫等，2 0 0 4 ) 。 研究还发现，一些超嗜热的古细菌的突出特征是细胞质膜中含有聚异戊二烯 甘油醚类脂，也被称为古生菌脂肪。很多古生菌脂肪都是以醚键相连的双醚和四 醚。这些包含高双醚和四醚的膜通常都是单分子层而不是常见的双分子层。这样 的单分子层结构它们使得在极端的条件下，如极端高温、极端p h 值下保持极强 的稳定性和质子的不通透性，极大的增强了其耐热性( 弗雷泽等，2 0 0 6 ) 。在受 热条件下，古细菌双醚和四醚脂肪的含量被上调，从而影响到了质子的通透性， 4 嗜热微生物的基因组分析 而这种机制在细菌中并不存在，人们认为这可能是古细菌比细菌有更高的耐高温 能力的原因( a l b e r t se ta l ，2 0 0 0 ) 。质膜在1 0 0 0 c 以上还能保持完整性的机理在生 化研究上已经逐渐清楚，古细菌质膜中的环戊烷的数目随着温度的升高而增加， 而环戊烷的环状结构使得膜相互作用的能量降低，膜结构更加的紧密，并在高温 时仍能维持质子的不通透性和刚性的结构以及保持细胞内外稳定和陡峭的质子 梯度。这种作用机制被称为环温度补偿机制( g a b r i e la n dc h o n g ，2 0 0 0 ) 。 1 3 1 3 嗜热古细菌的运输系统糖类的运输 在常温的细菌中，一般有三种主要的糖类运输方式：次级运输，利用质子或 者钠离子的浓度梯度进行的跨膜运输；依赖于磷酸烯醇丙酮酸酯的磷酸转移酶系 统( p t s ) ，通过消耗磷酸烯醇丙酮酸酯的能量来完成运输：以及a b c ( a t p - b i n d i n gc a s s e t t e ) 传输因子，消耗a t p 能量进行运输。 通过对超嗜热古细菌的生物化学研究以及基因组序列的分析表明，古菌中不 存在p t s 系统，这种现象在一些嗜热的细菌中如zm a r i t i m e 和aa e o l i c u s 中也存 在。尽管古细菌里发现有很多次级运输，但是目前还并没有发现有次级运输作用 参与糖类的运输。这些次级运输作用更多的是用来运输无机物的。也就是说，在 超嗜热的古细菌和一些嗜热细菌中，a b c 传输因子成为了糖类运输的唯一途径。 a b c 传输因子主要分为两大类：糖类运输因子( c u t ) 和寡肽运输因子( o p p ) 。 这两类运输因子不仅在运输的底物上有差别，在其复合物的结构上也有所不同 ( s c h n e i d e r , 2 0 0 1 ) 。c u t 主要是参与运输甘油磷酸酯，单糖和寡糖，它又可以分 为两类：c u t l 主要是参与甘油磷酸酯和寡糖的运输，由一个细胞外的结合蛋白、 两个膜蛋白形成的传送通道和一个a t p 结合亚单元组成；c u t 2 主要参与单糖的 运输，所不同的是它只有一个膜蛋白区域，并与两个a t p 酶结合形成二聚体。在 古细菌中，这两类c u t 因子都存在。o p p 传输因子主要参与运输二肽和寡肽、镍、 血红素以及发生了替代的糖类。该类因子由一个细胞外结合蛋白、两个膜结构域 和两个a t p 酶结构域组成。在古细菌中，o p p 传输因子大量存在( k o n i n ge ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。 对无损伤的细胞进行的研究表明，相对于中温菌来说，超嗜热物种中在糖类 运输时，传输因子与底物具有极强的亲和性，这是超嗜热古生菌的吸收系统的一 个显著特征，而糖类运输在环境温度接近生长温度时最活跃。这对于高温环境中 嗜热微生物的基因组分析 的微生物尤为重要。因为超嗜热的微生物，尤其是古细菌，都生活在很极端的环 境中，本身能够利用的有机物含量都很低，再加上高温对糖类特别是单糖，有极 强的破环能力，因此吸收系统必须极其有效的捕获单糖，从而才能保证有机体有 足够的能量进行各项生命活动( k o n i n ge ta l ，2 0 0 2 ) 。 1 3 2 嗜热微生物的代谢系统 最初发现的超嗜热微生物大都是生活在严格厌氧的环境中的，它们都属于严 格的厌氧异养型生物，但是后来发现的嗜热微生物也有一些是生活在有氧环境中 的，而它们本身也属于需氧异养型生物。除此之外，还有些特殊的微生物，介于 厌氧和需氧之间，属于兼性厌氧。 尽管自养方式并不是超嗜热微生物主要的代谢方式，但是部分超嗜热微生物 也可以吸收c 0 2 进入细胞内作为碳源加以利用。研究发现它们都是靠还原性柠 檬酸循环来固定二氧化碳( b e he ta 1 ，1 9 9 3 ) 。通过氧化性柠檬酸循环的逆过程， 利用两个c 0 2 分子合成乙酰辅酶a ；通过乙酰辅酶a 羧化酶和磷酸烯醇丙酮酸 酯羧化酶，二个额外的c 0 2 分子可以形成丙酮酸酯和草酰乙酸酯。这样碳就被 吸收同化，作为自己的碳源加以利用。 异养的情况要稍微复杂一些，由于几乎所有的超嗜热物种都可以利用蛋白质 底物来作为它们唯一的碳源和氮源，因此它们中的一些很有可能在细胞内外保持 很高的蛋白酶活性。例如激烈火球菌据报道含有十三个不同的多肽，都具有水解 酶的活性( c o n n a r i se ta 1 ，1 9 9 1 ) 。根据推测，细胞外的酶类产生小肽，然后小肽 再被运输至细胞内加以利用。不过这种运输看起来并不是针对酶类特有的，其它 生长所需的物质也可以通过这个途径被运输进细胞( k e l l ya n da d a m s ，1 9 9 4 ) 。一 些异养型的古生菌可以利用复杂的糖类如淀粉和糖原来作为其碳的初始来源。对 这些糖类的水解由细胞外具有淀粉酶和支链淀粉酶活性的淀粉酶所触发。 氢代谢是超嗜热微生物的代谢研究中研究的比较多的一个方面。嗜热的原核 生物编码的氢化酶有的在膜上，有的在细胞质中。膜上固定的氢化酶含有1 0 到 1 4 个亚基，它们能将胞内的质子转换成氢气并释放到胞外( k e l l ya n da d a m s ， 1 9 9 4 ) 。 超嗜热微生物的中间代谢的一个特征是经常在反应中以a d p 替代a t p 。例如 在火球菌中虽然找不到依赖a t p 的磷酸果糖激酶和葡萄糖激酶，但是在糖酵解 6 嗜热微生物的基因组分析 ( e m p ) 途径中，用生化分析却可以找到依赖a d p 的酶( k e n g e na n dd eb o k 1 9 9 4 ) 。但是这并不是表明超嗜热微生物是为了维持热稳定性才在e m p 途径中用 a d p 来取代a t p 的。有些中温的甲烷菌中也发现了依赖a d p 的激酶( v e r h e e sa n d t u i n i n g a , 2 0 0 i ) ，并且一些超嗜热微生物中也有正常的b 族依赖a t p 的磷酸果糖 激酶。但是超嗜热微生物在正常代谢流程中产生过量的a d p 可能说明超嗜热微 生物中有产生a d p 的新步骤，这将有助于发现一些具有不寻常代谢功能的新基 因( 弗雷泽等，2 0 0 6 ) 。 1 3 3 基因水平上嗜热机制的研究 1 3 3 1 嗜热微生物d n a 中的g c 含量及特性 超嗜热微生物令人感到有趣的一个方面就是它们能够在远远超过它们d n a 和r n a 的变性温度下进行生长。我们知道，由于g c 问有3 个氢键，比a t 间 要多，高的g c 含量可以升高d n a 的熔点温度，增加d n a 双链的稳定性，因 此高的g c 含量被认为与微生物的嗜热有很大的关系。人们都期望在嗜热微生物 中有着更高的g c 含量来印证这一说法。关于这方面的研究也是层出不穷。然而 结果却令人失望，嗜热微生物的g c 含量在2 0 7 0 之间变动，范围相当广阔。 g a l t i e r 和l o b r y 于1 9 9 7 年首先研究了嗜热微生物的g c 含量和o g t 之间的关 系，指出两者之间并无显著关系( g a l t i e ra n dl o b r y ，1 9 9 7 ) ，基因并非像人们想象 的那样简单的通过高的g c 含量来增强它对热的适应性。随后，m u s t o 等人将各种 微生物以科为单位，分别研究其g c 含量与o g t 的关系。他们认为分别在每个 科中比较时，物种的g c 含量与生长温度o g t 之间有显著的正相关性( m u s t oe ta l ， 2 0 0 4 ) 。但是对这个结果，目前还存在很大的争议( m a r a s h ia n dg h a l a n b o r , 2 0 0 4 ； b a s a ke ta l ，2 0 0 5 ；w a n ge ta l ，2 0 0 6 ) ，人们都认为他所用的数据较少，偶然因素较 大，并不能充分说明问题。 除此之外，s h a k h n o v i c h 等人又研究了a g 含量与o g t 之间的关系。他们发 现邻位a g 含量与o g t 之间存在显著的正相关，并认为邻位的a g 存在一种堆 积效应，正是这种效应的存在，使得基因能在高温下保持稳定一l 生( z e l d o v i c he ta l ， 2 0 0 7 ) 。最近发现中温古细菌中使用终止密码子u a g 和特殊的u a g t r n a 编码 第2 2 种氨基酸，吡咯赖氨酸( p y r r o l y s i n e ) 。虽然还没有证据显示它在嗜热古细 菌中的存在，但对已知的基因组重新研究可能会发现更多的u a g 密码子与吡咯 7 嗜热徽生物的基固组分析 赖氨酸的关系0 b b a a n d s o l l ，2 0 0 2 ；s f i 血v a s a a e t a l ，2 0 0 2 ) 。 基因的密码子组成也在一定程度上受到高温的影响。由于同义密码子的简并 性，第一第二位的核苷酸往往是决定性的第三位核苷酸的改变对编码的氨基酸 影响并不大。对几种嗜热古细菌的基因序列研究袁明，密码子的前2 位核苷酸组 成随着温度的升高呈现一定的变化趋势浦2 位密码子的组合共有2 大类4 种， 分别为嘌岭僳呤( y y ) 、嘧啶膘呤( r y ) 、嘧啶嘧啶( r r ) 、嘌呤鹰啶( y r ) ， 图中的红色和蓝色方块分别表示r r 和y y ，绿色和黄色分别表示r y 和y r 我 们可以看到，在对基因组序列进行太规模的统计时，随着物种o o t 温度的升高。 y y 和r r 的数量明显增多，如图1 - 1 所示( k a w a s h i m ae t