（动物学专业论文）基于线粒体dna探究辽东湾斑海豹的遗传多样性.pdf

附件一： 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。 对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方 式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：乞杠日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同 意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子 版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：色堡导师签名 山东大学硕士学位论文 中文摘要 斑海豹p h o c al a r g h a 主要分布于北冰洋的波弗特海、楚科奇海及 北太平洋的白令海、鄂霍次克海、日本海和中国沿海，具有重要经济、 科研、医学和观赏价值，是已知鳍脚类动物中惟一能在我国进行繁殖 的种类，其繁殖区位于辽东湾结冰区，是世界上8 个斑海豹繁殖区中 最南端的一个。在我国捕猎斑海豹已有近千年的历史，过量捕猎导致 了种群数量的严重下降。目前，渤海海域围堤、养殖、石油开采、港 口建设等日益展开，海域生态环境受到了极大的影响，特别是近几年 在黄渤海海域兴起的“渔家乐”，其重要项目之一就是观赏斑海豹。此 外，全国各地动物园、水族馆、海底世界、极地世界为满足参观者及 不断补充动物的需求，每年均要活捕一定数量的斑海豹进行人工饲养。 以上这些因素都对斑海豹的栖息与繁殖构成了很大影响，导致其自然 种群数量急剧下降，目前估计仅1 0 0 0 头左右。斑海豹已于2 0 0 7 年由 原来的i i 级升格为我国i 级重点保护动物。 鉴于辽东湾斑海豹种群数量急剧减少的现状，首先要了解该濒危 种群的遗传多样性，即保护遗传学的重要研究内容，因为它是物种能 够繁衍生息的基础。然而，迄今国内外尚未见利用分子生物学手段对 辽东湾斑海豹进行保护遗传学研究。因此，本文以辽东湾2 0 头斑海豹 样本为研究对象，对其线粒体d n a 控制区序列进行分析，查明其在遗 传水平上是否已经濒l 临灭绝，种群的持续发展能力如何。同时，斑海 豹是越海区迁徙的海兽，但是目前对于辽东湾斑海豹的迁徙路线尚不 清楚，以前有人推测每年冬季是从日本海域迁徙到辽东湾进行繁殖， 本研究通过与已发表的日本北海道海域斑海豹相应序列进行分子水平 比较，分析它们之间的地理种群关系及其进化历史中种群变化情况， 为辽东湾斑海豹的保护工作提供科学依据。主要研究结果如下： 1 ) 从2 0 头辽东湾斑海豹样本中检测到l o 个变异位点，定义了9 个 单倍型。用b i o e d i t ，c l u s t a l x ，d n a s p 等软件分析后得出其单倍型多样性 ( h ) 和核苷酸多样性( 露) 分别为o 8 5 7 9 + - 0 0 6 1l 和 山东大学硕士学位论文 o 0 0 3 3 6 1 + 0 0 0 2 2 2 7 ，表明当前辽东湾斑海豹种群的遗传多样性水平很 低，为防止遗传多样性的进一步丧失，应遏制海洋环境恶化的趋势及 严厉打击猖撅的偷猎活动； 2 ) 对所有已发表和本实验中的样本包括日本( 5 7 个) ，阿拉斯加 ( 1 个) 和中国辽东湾( 共1 5 个：本实验9 个；韩家波等( 未发表) g e n b a n k 上6 个) 的单倍型所构建的n j 和m p 系统发育树表明，惟一 的阿拉斯加斑海豹单倍型与处于基位的日本单倍型聚类在一起，所有 的辽东湾斑海豹单倍型都是由处于基位的日本单倍型衍化而来，显示 出辽东湾斑海豹较短的种群发展史，而仅考虑辽东湾样本时，系统发 育树表明单倍型l d 9 和l d 2 是辽东湾种群中相对原始的祖先型； 3 ) a m o v a 分析显示，辽东湾斑海豹种群与日本北海道海域附近的 斑海豹种群已产生了显著的遗传分化，分化程度为6 8 6 2 5 3 3 ( f s t = 0 2 5 3 ，o s t = 0 0 6 7 ，p = 0 ) ，所以，两种群之间没有基因交流。同时， 也推翻了前人推测每年辽东湾斑海豹是从日本海迁徙来繁殖的观点。 以上结论可以看出，其种群的生存状况已岌岌可危。推测辽东湾 斑海豹种群遗传多样性水平较低的可能原因是由于猎捕导致种群数量 的严重减少，与其他繁殖区没有或很少有基因交流，采样数量较少和 采样的偏差，或是种群的历史变动因素，如瓶颈效应，遗传漂变，奠 基者效应等。因此，为查明辽东湾斑海豹种群这种遗传多样性现象形 成的原因，未来应在不同的繁殖区采样并增加样本的采集数量，同时 采用核d n a 标记，可以更完整地表现种群的遗传结构与生态特性，使 研究成果更为可靠，提出更有效的保护措施。 关键词：斑海豹，保护遗传学，遗传多样性，线粒体d n a ，保护建议 6 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t g e n e t i cv a r i a b i l i t yi sa ni m p o r t a n tc o m p o n e n ti nt h ea b i l i t yo ft h e s p e c i e st oa d a p tt h ee n v i r o n m e n t a lc h a n g e l i t t l ei s k n o w na b o u tt h e g e n e t i cs t a t u so fs p o t t e ds e a l i nc h i n a ，t h eo n l yp i n n i p e dt h a tb r e e d si n l i a o d o n gb a y i n f o r m a t i o no ng e n e t i cd i v e r s i t y i s u r g e n t l yn e e d e d ， c o n s i d e r e dt oh a v ead e c l i n i n gp o p u l a t i o na n dt h ee s t i m a t e ds i z eo f s p o t t e ds e a li nl i a o d o n gb a yi sa b o u t10 0 0i n d i v i d u a l s m i t o c h o n d r i a l d n a ( m t d n a ) c o n t r o lr e g i o ns e q u e n c ed a t aa r eu s e dt oi n v e s t i g a t et h e c u r r e n ts t a t u so fg e n e t i cd i v e r s i t yi nt h i ss p e c i e s s e q u e n c ed a t aa r e o b t a i n e df r o m2 0i n d i v i d u a l s ，d e s c r i b i n g9h a p l o t y p e s t h eh a p l o t y p e s h a v ev e r yl o wl e v e l so fv a r i e t i e sa n dt h eh a p l o t y p ea n dn u c l e o t i d e d i v e r s i t yi so 8 5 7 9 + - o 0 6 11a n do 0 0 3 3 6 1 + ，一o 0 0 2 2 2 7 r e s p e c t i ，e l y m o r e o v e r ，w ec o m p a r et h er e s u l t sw i t ht h ep r e v i o u s l yp u b l i s h e dd a t a f r o ms e a l sc o l l e c t e df r o mj a p a na l o n gt h ec o a s to fh o k k a i d oa n dd i s c u s s t h e i rg e n e t i cd i f f e r e n t i a t i o n a m o v ar e s u l t sp r o v i d es i g n i f i c a n tl e v e lo f g e n e t i cs u b d i v i s i o nb e t w e e np o p u l a t i o n si nl i a o d o n gb a ya n dj a p a n ， s h o w i n gt h a tt h e yh a v el i t t l eo rn og e n e t i cf l o w o v e r a l l ，t h eg e n e t i cd a t a r e p o r t e dh e r ec o n s i d e r a b l ys t r e n g t h e nt h en e e df o rc o n s e r v a t i o ne f f o r t s f o c u s e do nt h es p o t t e ds e a li nc h i n a i n c r e a s e ds a m p l es i z ei nl i a o d o n g b a ya n da d d i t i o n a ls a m p l i n gf r o m o t h e rb r e e d i n ga r e a sf o rf u r t h e r r e s e a r c ha r en e e d e dt o c l a r i f yt h eg e n e t i cr e l a t i o n s h i pa m o n gt h e m f u r t h e r m o r e ，c o n f i r m a t i o no ft h ep e r c e i v e dp a t t e r no fg e n e t i cd i v e r s i t y a n dp o p u l a t i o ns t r u c t u r eu s i n gan u c l e a rm a r k e ri sr e c o m m e n d e dt o v a l i d a t ec o n s e r v a t i o nm o n i t o r i n ga n dm a n a g e m e n t k e yw o r d s ：s p o t t e ds e a lp h o c al a r g h a ，c o n s e r v a t i o ng e n e t i c s ，g e n e t i c d i v e r s i t y ，m t d n a ，c o n s e r v a t i o nm e a s u r e s 7 山东大学硕士学位论文 1 1 引言 第一章综述 自然界中数以百万种的植物、动物、微生物、各个物种所拥有的 基因和由各种生物与环境相互作用所形成的生态系统，以及它们的生 态过程，共同组成了各种形式的生物资源，被称为一生物多样性。它 们是地球上人类赖以生存的基础，然而，近百来年，世界人口数量由 1 9 世纪初的1 0 亿到目前已经超过6 0 亿，人类为了维持生存，过度采 伐，滥捕乱猎，对生物资源进行无止境的索取，使得全球各类生态系 统遭到严重破坏，很多生物失去栖息地。由此引发了一系列恶果，如 土地荒漠化和沙化、全球气候变暖、环境污染、水土流失和生物多样 性严重丧失等，不仅使人类面临粮食短缺、资源匾乏、生存环境恶化 和持续发展受阻等困境，也使许多野生生物因受到不同程度的胁迫而 仅残存于片断化的生境中。由于种群隔离，基因交流中断以及严重的 近亲繁殖，许多物种已处于严重濒危的境地。目前世界上许多物种都 面临着灭绝的危险，据估计现有物种的灭绝速率是化石记录上的4 - 5 倍【i ，2 1 。在这些严酷的事实面前，人们终于认识到，自然界中物种的多 样性和进化潜力是其自身生存和发展的基础，保护物种以及保护物种 所蕴藏的遗传多样性就是保护生物多样性，就是保护人类赖以生存的 资源，就是保护人类自己1 3 , 4 。 如何在现有的不断恶化的、破碎化的生境中最大程度、最有效的 保护生物资源，保护生物多样性呢? 一门新兴学科一保护生物学 ( c o n s e r v a t i o nb i o l o g y ) ，在这一迫切需求下，在现有各学科基础上产生 并发展为一门不断壮大的热门学科【4 l 。保护生物学具有理论科学和应 用管理科学的双重特征，由基础生物学、应用生物学和社会科学交叉 融合而成。它的目标是评估人类对生物多样性的影响，提出防止物种 灭绝的具体措施f ”。生物多样性包括三个主要层次，即遗传多样性， 物种多样性和生态系统多样性。遗传多样性是生物体内决定性状的遗 9 山东大学硕士学位论文 传因子及其组合的多样性。由于人类活动的影响，环境正在全球尺度 上发生变化，很多物种将不得不适应这一变化或承受更大的灭绝考验， 而这些物种所具有的遗传多样性对其生存起着决定性的作用。一个物 种如果没有遗传多样性，就无法适应其生存环境的变化，也就不能进 化。因此，任何物种只有具备定的遗传多样性才能抵御自然界中的 各种生存压力，否则，灭绝将是不可避免的【4 一】。所以，遗传多样性是 物种多样性和生态系统多样性的基础【6 】。 基于这一认识，在保护生物学的研究与实践中，人们逐步将遗传 学的原理和方法运用于生物多样性的研究和保护中，使保护生物学成 为现代生命科学中一个十分活跃的分支学科6 ，7 1 。7 0 年代以后，由于分 子遗传学、群体遗传学和生态学等学科的迅猛发展，保护遗传学 ( c o n s e r v a t i o ng e n e t i c s ) 开始以一门新兴学科的姿态出现1 6 8 l 。1 9 7 8 年第一届国际保护生物学大会的召开，标志了该学科的确立。1 9 8 1 年 由f r a n k e l 和s o u l e 9 j 编著的c o n s e r v a t i o na n de v o l u t i o n 以及19 8 3 年由 s c h o n e w a t d c o x 等i1 0 】人编纂的g e n e t i c sa n dc o n s e r v a t i o n ) ) ，对过去 l o 年中保护遗传学领域的进展进行了较为全面的介绍和论述，标志着 保护遗传学理论框架的形成。2 0 0 0 年，在国际著名的学术出版社k l u w e r a c a d e m i cp u b l i s h e r s 的组织和推动下，一份名为c o n s e r v a t i o n g e n e t i c s ) ) 的国际性专业期刊在荷兰刨刊，标志着这门学科己逐步成熟 并受到国际社会的广泛关注。 1 。1 1 保护遗传学的概念、目的和研究方向 根据w o o d r u f f 的定义，保护遗传学即是运用遗传学的原理和研究 手段，以生物多样性尤其是遗传多样性的研究和保护为核心的一门新 兴学科【l l ，1 2 】。实际上，保护遗传学是一门多学科综合的学科，它融合 了群体遗传学、生态学、分子生物学、数学和系统与进化等许多领域 的研究内容，兼有基础科学与应用科学的性质。保护遗传学是在基于 制定濒危物种合理的保护策略的过程中应运而生的，它首要解决的问 题是查明被研究物种当前的遗传学状况( 即遗传多样性水平，群体分 1 0 山东大学硕士学位论文 化程度等) ，特别是濒危物种和具有重要进化及生态学意义的物种的 遗传关系。在此基础上，确定保护单元，并据此决定对其实施何种保 护策略，维护其生物多样性。尽管不同学者有不同的观点【6 8 ，13 1 ，但正 如a v i s e 和h a m r i c k 在保护生物学一书中所指出的，其核心内容不 外乎以下五个方面，即研究群体内遗传变异的水平及其意义：群体内 个体问的亲缘关系；群体遗传结构和种群间的进化关系；种间的界限 和杂交；以及物种或更高级别类群间的系统发育关系 6 1 。此外，物种 的进化历史、适应潜力和濒危机制、交配系统及其进化机制、外来入 侵的遗传后果、圈养种群遗传衰退、濒危物种的法医鉴定( 包括与贸 易有关的品种和品系鉴定) 等都属于保护遗传学研究的范畴【| 1 3 i s l 。 1 1 2 保护遗传学主要研究的内容 保护遗传学的主要研究目标是保护物种遗传多样性( g e n e t i c d i v e r s i t y ) 和保持物种进化潜力( e v o l u t i o n a r yp r o c e s s e s ) 。其研究内容 主要包括种群遗传结构( p o p u l a t i o ng e n e t i cs t r u c t u r e ) 、近亲繁殖 ( i n b r e e d i n g ) 、遗传变异( g e n e t i cv a r i a t i o n ) 、基因流( g e n ef l o w ) 、 杂交( h y b r i d i z a t i o n ) 、迁移( m i g r a t i o n ) 、亲系关系( k i n s h i p ) 、有效种群 大小( e f f e c t i v ep o p u l m i o ns i z e ) 、种群的噩分化( p o p u l a t i o ns u b d i v i s i o n ) 以及进化显著单元( e v o l u t i o n a r ys i g n i f i c a n tu n i t ，e s u ) 的确定等方面 t 1 9 1 。其中，有关种群遗传结构和进化显著单元的研究将直接影响遗传 多样性的保护和进化潜力的保持以及保护管理对策的制定和实施。 1 1 2 1 遗传多样性和种群遗传结构 物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单位，生态系统多 样性离不开物种的多样性，也就离不开不同物种所具有的遗传多样性。 而世界上每一个物种都具有其独特的基因库和遗传组织形式，物种的 多样性也就显示了基因( 遗传) 的多样性 2 0 , 2 1 。生物在发展和繁衍后 代的过程中，其遗传信息d n a 能准确地复制并传递给后代，以保持遗 传性状的相对稳定。然而，在d n a 复制、传递和表达过程中由于受生 物自身内部的因素( 酶的活性、体液酸碱度) 、外界环境因素( 物理或 山东大学硕士学位论文 化学因素) 的影响，可能引起单个碱基或碱基片段的变化，如碱基的 缺失、插入、倒位、易位等，从而导致不同程度的遗传变异。随着遗 传变异的不断积累，遗传多样性不断得到丰富，遗传多样性变异越丰 富，群体对环境变化的适应能力越强，进化潜力越大1 2 0 。因此，遗传 多样性是生态系统多样性和物种多样性的基础。广义地讲，遗传多样 性就是生物所携带遗传信息的总和，是指种内或种间表现在分子、细 胞和个体三个水平的遗传变异度 2 0 , 2 2 ，但一般所指的遗传多样性是种 内不同群体和个体间的遗传多态性程度弘”。 研究生物遗传多样性对于合理而有效的利用生物资源以及保护生 物遗传资源具有十分重要的现实意义，也是保护遗传学研究的核心之 一，其实质就是保护基因的多样性。通过了解种内遗传变异的大小， 时空分布及其与环境条件的相互关系，才能采取科学有效的措施保护 人类赖以生存的遗传资源，才能挽救濒于灭绝和受到威胁的物种。 通常，遗传多样性最直接的表达形式就是遗传变异性的高低。然 而，对任何一个物种来说，个体的生命很短暂，由个体构成的种群或 种群系统( 种、亚种) 才在时间上连绵不断，才是进化的基本单位 2 4 , 2 5 l 。 这些种群或种群系统在自然界有其特定的分布格局，所以，遗传多样 性不仅包括遗传变异高低，也包括遗传变异分布格局，即种群的遗传 结构1 2 6 1 。种群遗传结构的研究主要评估濒危物种种群问和种群内的遗 传变异水平、分布及其产生的遗传多样性水平，目前已成为保护遗传 学中一个最主要的研究内容 2 7 , 2 s 。通过评估遗传结构的变异，保护工 作者能够估计种群水平上的近亲繁殖程度、有效居群大小、亲系鉴定、 种群间迁移和基因交流程度、检测种群间杂交和基因渗透等情况。这 些参数对制定合适的保护策略起十分重要的作用 2 9 3 1 】。 1 1 2 2 物种基本保护单元的确定 物种内基本保护单元的确定是优化和实施保护策略的基础。r y d e r 首次提出了“进化显著单元”，用以代表根据不同技术所确定的、具有 明显适应性变异的一组群体( 其中也包括种群) ，由于这样的群体在 进化上具有独特性，需要予以优先保护【”l 。随着对物种的保护研究不 断深入，这个概念也得到了很大的发展。目前被广泛接受的定义是 1 2 山东大学硕士学位论文 m o r i t z 提出来的“进化显著单元”的遗传学标准：如果有a 和b 两个类群， 若它们在线粒体d n a 水平上互为单系群( r e c i p r o c a l l ym o n o p h y l e t i c ) ， 并且在核基因座位上的基因频率已有显著分化，则认为a 和b 两个类群 分属不同的e s u s ，在保护和遗传管理中应分别对待。同时他又指出， 有些种群虽然等位基因频率存在显著的差异，但是在系统进化上线粒 体d n a 并不互为单系群，这些种群是由很低的基因流维持的、功能上 独立的单元，也具有重要的保护意义。为了区分，m o r i t z 用管理单元 ( m a n a g e m e n tu n i t ，简称为m u ) 来表示，m u 是一个比e s u 更小的保 护单元，它的含义是：不管两个类群的核或线粒体等位基因有没有发 生系统分化，只要它们在核d n a 位点上等位基因频率或线粒体d n a 位 点上单倍型频率存在显著差异，则认为这两个类群分属于不同的m u s 。 e s u 和m u 在保护管理上均具有重要的意义，但两者侧重点不一样，前 者侧重于策略性的长期管理，后者则侧重于短期管理。e s u 整合了等 位基因的系统发育信息，特别是线粒体d n a 的系统发育信息，所以e s u 考虑的是种群的历史遗传结构，线粒体d n a 确定的是系统发育和长期 保护的需要；而m u 强调种群的当前结构、等位基因频率和短期管理需 要。目前，e s u 普遍接受为生物保护中的基本单元，为生物多样性的 科学保护提供了一种量化的指标。当没有充足的财力、物力对所有的 e s u s 进行保护时，实践上常常确定进化显著区域( e v o l u t i o n a r i l y s i g n i f i c a n ta r e a ，e s a ) ，即许多物种或群体均显示系统地理学 ( p h y l o g e o g r a p h y ) 结构的区域加以保护而非单个物种或群体 3 3 1 0 1 1 3 保护遗传学的重要性 对于我国这样一个物种资源丰富而生物多样性又面i 临严重威胁的 国家，加快保护遗传学的研究十分必要。由于技术和经费等方面的限 制，加上人们往往看重研究的实用性，迄今在选择研究对象时往往格 外关注那些与人类密切相关的类群。大量野生动植物仍得不到足够的 重视，更缺乏基本的研究。例如，在庞大的海洋哺乳类动物资源中， 就种类和数量来说，鳍脚类( p i n n i p e d i a ) 仅次于鲸类( c o t a c e a ) ，包 山东大学硕士学位论文 括海豹，海狮( 有的称为海狗) 和海象。它们均具有很高的经济价值， 比如毛皮海狮与海狗的绒毛短而密。质地柔软，是制高档皮氅的上乘 佳品，以此制成的毛氅在国际市场上称“千金裘”，价格昂贵。其他鳍 脚类动物的皮革，一般都可制皮大衣，皮夹克，也可做皮箱，帐幕、 皮帽、手套等。另外，海豹的肉可以吃；海豹油以前用来点灯，后来 成为重要的工业、医药原料；海狮油可以治疗伤风、哮喘、皮肤病， 也可做护肤剂；海象牙可做牙雕，肠衣可做琴弦；雄性海豹、海狗的 生殖器是一种海洋药物，叫做“海狗肾”或“海狗鞭”，具有生精壮阳、 健脑补肾的功能。因此，在巨大经济利益的驱使下，人类肆意偷猎并 捕杀着它们；更为严重的是，随着海洋资源开发利用的不断深入和经 济的不断发展，海洋环境污染和海洋生态破坏日益加剧，使得鳝脚类 的生存环境受到极大威胁。这种全球范围内的生境破坏加速和人为捕 杀是导致大量鳍脚种类变为稀有、濒危以致灭绝的主要原因。当人们 已经意识到问题的严重性并着手制定各种政策和法规时，却发现我们 对这些物种的了解和认识仍相当贫乏。迄今可检索到的有关鳍脚类保 护遗传学研究的文献与该类群的多样性和重要性远不相称。大多数保 护活动都是在缺乏基本的生物学研究的情况下进行的。f a l k 和 h o l s i n g c r 曾指出“我们不可能保护好我们所不了解的”【34 1 。因此，全面 开展保护生物学研究包括遗传学研究是解决生物多样性危机、挽救成 千上万物种的根本出路，也是进行合理的资源开发和利用的前提。 1 2 保护遗传学中线粒体d n a 分子标记技术 近3 0 年来分子生物学的迅猛发展，为从分子水平上研究保护遗传 学建立了一系列新技术和新方法，从而也为海洋生命现象的研究提供 了向更深层次发展的机会和途径，其中应用最广泛的是d n a 分子标记 技术【”】。d n a 分子标记( d n am o l e c u l a rm a r k e r ) 一般指在d n a 水平 上的遗传标记，具有数量大( 可1 0 s _ 1 0 1 0 个) ，大多数呈中性突变，遗传 较为稳定，符合孟德尔遗传规律，不受生理期和环境的影响并在群体 中具有高度多态性和较高的杂合度等特点p ”。根据所处细胞中的位置， 1 4 山东大学硕士学位论文 d n a 标记分为核d n a 标记和线粒体d n a 标记两类【3 7 l ；根据多态水平的 高低和发展历史，d n a 分子标记可分为三类：第一类是限制性片段长 度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) ：第二 类是以p c r 为基础的分子标记，包括随机扩增多态性( r a n d o m a m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 及其衍生的标记、扩增片段长度 多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、小卫星 d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) 和微卫星d n a ( m i c r o s a t e l l i t ed n a 或者 称为简单序列重复，s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ，简写为s s r s ) 等；第三 类是单核苷酸多态性分子标( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m s ，s n p ) 。 在不同保护水平和研究内容上，各种方法在其应用范围和解决问题的 能力上则有所不同，因此，研究者应根据研究内容的需要来选择不同 的分子标记1 33 1 。 1 2 1 动物线粒体d n a 简介 线粒体d n a ( m i t o c h o n d r i ad n a ，m t d n a ) 作为高等动物惟一的 核外遗传物质，目前已被广泛应用于动物起源进化、亲缘关系、遗传 变异等方面的研究。它主要存在于除成熟的红细胞以外的所有细胞中， 在细胞内的分布一般是均匀的，形状因细胞类型不同有很大差异，可 呈圆柱状、环状、哑铃状、线状等，但多数为圆柱状。大小因细胞种 类不同而有差异，一般直径为o 5 - 1 0 p m ，长为o 5 3 o “m 。线粒体在 每个细胞中含有1 0 0 0 1 0 0 0 0 个拷贝，数目因细胞种类不同，如肝细胞 内有1 0 0 0 1 6 0 0 个线粒体。尽管m t d n a 仅占整个真核生物总d n a 的 l 以下，但在物种不同层次的遗传分化研究方面具有独到优势，也研 究的最为深入广泛，尤其是随着限制性内切酶、d n a 序列分析、聚合 酶链式反应( p o l y m e r i s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) 等分子生物技术的建立 与发展，m t d n a 已经成为动物保护遗传学、分子系统学和地理系统学 研究中强有力的工具【39 1 。 1 2 1 1 动物线粒体基因组的基本结构 线粒体d n a 是一种密闭环状双链d n a ，在动物界中其结构大致相 山东大学硕士学位论文 同。根据碱性氯化铯密度梯度离心中，双链密度不同分为重链( h 链) 和轻链( l 链) 。大多数动物m t d n a 由3 7 个基因和一段长度可变的非编 码序列组成，包括2 个r r n a 基因( 1 6 s r r n a 和1 2 s r r n a ) ，2 2 个t r n a ( t a 、t r 、t n 、t d 、t c 、t q 、t e 、t o 、t h 、t i 、t l l 、t l 2 、t k 、 t m 、t f 、t p 、t s l 、t s 2 、t t 、t w 、t y 、t v ) 和1 3 个蛋白质基因( 分 别为细胞色素c 氧化酶贬基i 、m ( c o l 、c 0 2 和c 0 3 ) ，细胞色素b ( c y t b ) ，a t p 合成酶驱基6 和8 ( a t p a s e 6 和a t p a s e 8 ) ，n a d h 脱氢酶亚 基( n d l 、n d 2 、n d 3 、n d 4 、n d 4 l 、n d 5 、n d 6 ) 。蛋白质基 因n d 6 和其中的8 个t r n a 基因由l - 链编码，其余的基因均由h 一链编码。 除编码区外，动物m t d n a 还有两段长度可变的非编码区，一段是m t d n a 复制及转录的起点，即l 链复制起始区：另一段是控制区( c o n t r o l r e g i o n ) ，又称为d 环区( d i s p l a c e m e n t - l o o pr e g i o n ，简称为d - l o o p ) ， 位于t r n a p r o 和t r n a p h e 之间，是整个线粒体基因组序列和长度变异 最大的区域，长度约8 0 0 1 4 0 0 b p ，它含有重链复制起始和重链和轻链 转录的启动子。 1 2 1 2 动物线粒体基因组的特点 ( 1 ) m t d n a 的基因结构比较简单、稳定、分子量小 m t d n a 基因的排列紧凑，除与m t d n a 复制和转录有关的一小段区 域外，其他序列无内含子和转座子，也没有基因问隔序列。2 个r r n a 基因紧紧相邻，2 2 个t r n a 基因位于r r n a 和1 3 个蛋白质基因之间。上述 结构与核基因组形成鲜明对比，因此，认为m t d n a 是高度经济有效的。 m t d n a 基因分子量小，分子大小为1 5 2 0 k b ，绝大多数动物介于1 6 1 8 k b 之间( 哺乳动物的线粒体d n a 长度只有1 6 k b 左右) 。m t d n a 广泛存在于 动物各组织中，拷贝数高，易于分离和纯化 4 0 , 4 1 1 ，且重复性好4 2 1 。 ( 2 ) 动物m t d n a 的母系遗传 动物线粒体的遗传传递属于一种无性传递方式一母系遗传 ( m a t e r n a li n h e r i t a n c e ) ，即仅通过卵子细胞质传给下一代，使得予代 的m t d n a 与雌性亲体一致，所以，又称为核外遗传。m t d n a 在世代遗 传中不发生重组，能保持其祖先特征并记录了曾经发生的进化事件： 不受雄性杂交改良的影响1 4 3 1 。这种遗传方式便于进行群体分析，一个 1 6 山东大学硕士学位论文 个体即能代表一个母系集团，随机抽取几个个体就可以了解一个群体 的遗传结构。当然，并不排除极低机率有精子d n a 进入卵子而发生父 系渗入引起个体内m t d n a 异质性和产生双亲遗传现象的可能性，但这 种概率极低。线粒体有自己的遗传系统，它自身的基因组能进行d n a 的复制，转录和翻译，可以编码自己的r r n a 、t r n a 以及少量的蛋白质。 但是，线粒体基因的表达受两种调控：一是线粒体基因组自身的调控 系统；另一种是核基因组的指导和调控，这种调控反映在转录、r n a 加工和翻译等三个水平上。所以，m t d n a 的功能在很大程度上仍受核 基因组基因的控制。 ( 3 ) 动物m t d n a 的密码特性 m t d n a 的遗传密码、反密码予和密码识别机制与核基因的编码规 律有所不同，分析动物和酵母m t d n a 的密码子发现，u g a 是色氨酸的 密码子，而不是核基因终止密码子；a u a 和a u u 是甲硫氨酸的密码子。 而不是通常异亮氨酸的密码予；a g a 和a g g 在动物m t d n a 中是终止密 码子而不是通常精氨酸的密码子。 ( 4 ) m t d n a 的进化特征 m t d n a 没有与之结合的核蛋白，裸露于代谢产生的诱变剂中：其 次m t d n a 的复制酶缺乏3 ，至5 ，外切校对功能 4 4 1 和修复机制4 ”，碱基不 配对的频率很高，在复制中经常发生错误，约每1 0 0 0 个核苷酸中就掺 入l 2 个随机分布的核苷酸。因此，m t d n a 一级结构的突变速率很高， 每百万年2 4 b p 左右，使其进化速率远高于核d n a ，大约是单拷贝核 d n a 进化速度的5 - 1 0 倍；同时m t d n a 相对于核d n a 面临的选择压力 小，突变容易固定，因而具有累加效应。于是，m t d n a 由于碱基替换 和核苷酸片段的添加和缺失在种间和种内不同群体间存在广泛的多 态，两个无关个体的m t d n a 碱基平均相差3 ，这些差异大多为中性的， 不改变氨基酸排列，多态性集中在d 环，其他区域则高度保守。核苷酸 序列的分歧程度反映了物种亲缘关系的远近，因而m t d n a 是进行近缘 种间和种内群体问分化关系研究的良好遗传标记1 4 3 , 4 6 1 。保护遗传学中 进化显著性单元的确定，就极大地依赖于不同动物群体线粒体d n a 单 倍型的系统发育关系1 4 7 | 。 1 7 山东大学硕士学位论文 ( 5 ) m t d n a 无组织特异性 在脊椎动物中m t d n a 无组织特异性，不同组织m t d n a 仅是拷 贝数不同，个体内m t d n a 高度均，有利于取材和分析 4 0 1 。 ( 6 ) m t d n a 的核营酸组成不均一 m t d n a 分子是由平均组成很不均一的片段构成的，a 、t 、g 、c 四种碱基组成偏离了随机平均组成，g + c 的摩尔分数为2 l 4 3 ( 3 7 5 0 ) 。在哺乳动物中线粒体d n a 这种组成特性被称为碱基组成 偏向性( b a s e c o m p o s i t i o n b i a s ) 或核苷酸偏向性( n u c l e o t i d e b i a s ) 。 1 2 1 3 动物线粒体d n a 各基因的进化特点 ( 1 ) r r n a 基因 动物m t d n a 仅有两个r r n a 基因，分别为小亚基1 2 s r r n a 基因和大 亚基1 6 s r r n a 基因，每个线粒体内只有一份拷贝，无基因间隔。从总 体上看r r n a 基因进化最慢，以替换为主，有时可发生片段的插入或缺 失。相比而言，1 2 s r r n a 基因进化速率比核同簇体快1 9 倍，1 6 s r r n a 基 因比核同簇体快4 倍，而且，1 6 s r r n a 基因进化要比1 2 s r r n a 基因快 【4 8 1 。在研究分类问题上，1 2 s r r n a j e 常保守，可以解决高阶元的分类 地位，1 6 s r d n a 通常用来解决中间阶元的分类地位。 ( 2 ) t r n a 基因 线粒体的t r n a 基因的结构和功能约束力与相应的核t r n a 基因相 比较弱，因而，其进化速率较快。在线粒体基因中，t r n a 也是以替换 为主，有时也发生l 2 b p 的插入和缺失。t r n a 基因的一个主要特点是 它比其他线粒体基因更易发生转位。 ( 3 ) 编码蛋白质的基因 蛋白质基因与上述r n a 基因的最大差别是三联体密码子，尤其是 密码子第一、二位的强约束力，这种约束力强烈影响着d n a 的替换形 式。此外，m r n a 的二级结构也可能影响替换形式。在蛋白质水平上进 化速率主要受蛋白质的二、三和四级结构因素的影响。所有这些d n a 和蛋白质水平的影响因素已非常复杂的相互作用方式决定着编码蛋白 质基因的替换形式。在研究分类问题上，相对于1 2 s r d n a 和1 6 s r d n a ， 线粒体蛋白编码基因进化较快，是解决科、属和种等较低分类阶元的 1 8 山东大学硕士学位论文 有力标记【49 1 。 ( 4 ) 非编码区 动物m t d n a 有少量的非编码区，主要是控制区，另有一些非编码 的短片段零星分布于一些类群中。控制区是高度可变区，替换和片段 的插入或者缺失经常发生。控制区的另一特点是经常发生长度变异， 长度变异主要由重复序列或模块的有无及重复数目多少决定。线粒体 d n a 控制区的进化速率是其他区段的5 倍，是种群遗传多样性研究中十 分有效的分子标记之一，可以用于物种遗传管理、濒危物种保护、种 群结构和进化历史等方面的研究5 0 】。通过测定一定数量个体m t d n a 变 异程度较高的控制区序列，可以揭示种群的遗传变异及多样性程度， 为种群管理单元的划分提供依据。但是，线粒体控制区在个体之间， 特别是在濒危动物的许多个体之间，很少发生碱基取代变异。这就意 味着线粒体控制区是检测大尺度变异的，对于近期变异，不能获得足 够的遗传信息【”】。因此，线粒体控制区虽然在e s u 的确定和遗传多样 性的检测等方面不失为一种可选择的分子标记，但是，它不能用来鉴 定个体和检测遗传结构的近期变化过程。 1 2 1 4 动物线粒体d n a 研究的局限性 尽管动物线粒体d n a 有上述优点，但是也有它的局限性： ( 1 ) 线粒体d n a 序列的异质性 线粒体d n a 序列的异质性即同一细胞、组织或器官中线粒体序列 不同。如果种内个体中线粒体d n a 表现出异质性，将使线粒体d n a 的 分析方法复杂化。虽然在一些动物中发现了这种异质性，但一般认为， 异质性的范围和程度不是很大，在目前的检测条件下不影响线粒体 d n a 的分析。 ( 2 ) 多重替换 多重替换掩盖系统进化信息造成位点性质状态的错误处理和遗传 距离的低估。这一问题主要影响快速进化的序列和远缘种类的分析， 虽然可通过加权和距离校正部分克服，但仍影响系统进化的分析结果 1 5 2 。 ( 3 ) 祖先多态性 1 9 山东大学硕士学位论文 当不同序列之间的差异起源于共同祖先序列中存在的多态性变异 时，利用这些序列估算的遗传距离就比实际的大，从而由基因树推论 的物种树分支长度与实际长度不一致。这一问题主要对新近分歧的序 列或在种内表现出高度多态性的序列有不利影响，尤其对于新近形成 的物种的分析影响较大。 ( 4 ) 核内线粒体基因拷贝的可能影响 近年来的研究发现一些动物核基因组中含有类m t d n a 的片段，这 些类m t d n a 片段是通过某些方式整合到核基因组中的，整合的片段长 度不等，主要包括编码蛋白质的基因和r r n a 基因，而且常以多拷贝形 式存在。目前，虽然还没有核基因干扰m t d n a 分析的证据，但应考虑 到这种干扰的可能性。 ( 5 ) 样本序列长度问题 很难确定研究类群之间系统进化关系的最低分辨率所需要的最少 位点数。线粒体不同基因序列由于进化速率不同，其系统发育信号不 一，解决系统进化问题所需最少位点也就不同。进化比较快的片段如 d 1 0 0 p 对于新近分歧的类群有较强的信号，可用较短的序列；对于系 统树基本分支来说信号很弱，需要较长的序列。对于大部分序列数据， 其系统进化推论的稳定性和可靠性随序列数据的增加而加强。 ( 6 ) 非恒定分子钟。 ( 7 ) 非选择中性。 ( 8 ) 两性遗传。 综上所述，m t d n a 以其分子量小，结构简单，进化速度快，严格 的母系遗传和几乎不发生重组等特征成为分子群体遗传学和分子系统 学研究的重要标记 5 3 , 5 4 l 。更值得一提的是，m t d n a 基因组内不同区域 的进化速度不同，适合不同水平的进化研究。一般说来，研究“种”以 上的系统进化关系时选择比较保守的d n a 基因序列比较适宜，其中以 c y tb 基因、c y tc 基因、1 6 8r r n a 基因和1 2 sr r n a 基因序列等目前用 得较多。而研究“种”以下阶元的遗传分化和系统进化关系则需选择进 化比较快的区域，d 1 0 0 p 区运用最为广泛，有时用c y tb 基因5 。 山东大学硕士学位论文 1 2 2m t d n a 的检测方法 m t d n a 序列差异既可间接通过限制酶切位点的分析，又可直接对 线粒体基因组测序进行度量。 限制酶切位点分析通过限制性内切酶识别m t d n a 中特定的碱基