（生物化学与分子生物学专业论文）伤寒沙门菌qsec特性与功能研究.pdf

独创 生声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已注明引用的内容以外，本论文不包含任何其他个人 或集体已经发表或撰写过的作品成果，也不包含为获得江苏大学或其他教育机构 的学位或证书而使用过的材料。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已 在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名： 夥哲 沙再年歹月膨日 l 学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档，可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致， 允许论文被查阅和借阅，同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入中国 学位论文全文数据库并向社会提供查询，授权中国学术期刊( 光盘版) 电子杂 志社将本论文编入中国优秀博硕士学位论文全文数据库并向社会提供查询。 论文的公布( 包括刊登) 授权江苏大学研究生处办理。 本学位论文属于不保密口。 学位论文作者签名：罗誓 妙1 1 年莎月烨日 指导教师签名： 2 , o l f 年 荔 6 j l 眵 i i 分类号 u d c 密级公珏 编号一! q 2 坌坌q 墨1 2 q ! ! 硕士学位论文 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 c h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o na n a l y s i so f q s e ci ns a l m o n e l l ae n t e r i c as e r o v e r t y p h i 作者姓名：罗哲 指导教师：黄新祥教授 小组成员：徐顺高副教授 生秀梅讲师 张海方讲师 倪斌讲师 申请学位：硕士 学科专业：生物化学与分子生物学 论文提交日期：2 0 11 年4 月2 8 日 论文答辩日期：2 0 11 年6 月1o 日 学位授予单位：江苏大学 学位授予日期：2 0 11 年6 月 答辩委员会主席：许化溪教授 基金资助：国家自然科学基金( 3 0 8 7 0 0 9 5 ) 江苏大学硕士学位论文 摘要 目的： q s e c 是大肠杆菌中一个重要的群体感应调节因子，在信号分子 a i 3 及肾上腺素去甲肾上腺素的作用下可以启动系列基因的表达。 基因组序列分析显示，伤寒沙门菌中存在有q s e b c 同源基因，本研究 拟观察伤寒沙门菌q s e c 同源基因的功能及在是否含有葡萄糖条件下 对基因表达的系统调节作用。 方法： 1 基因缺陷变异株的制备：采用自杀质粒p g m b l 5 1 介导的同源重组 方法，制备伤寒沙门菌q s e b 、q s e c 同源基因的单缺陷及q s e b q s e c 双缺陷变异株。 2 q s e b 、q s e c 基因缺陷回补株的构建：p c r 扩增目的基因，与表达载 体p b a d g l i i 定向连接后，转化到大肠埃希菌d h 5 a 中筛选阳性质 粒，经序列分析鉴定后，转入相应的基因缺陷变异株中。 3 生长曲线的测定：以生长时间为横坐标，细菌o d 6 0 0 值为纵坐标绘 制野生株与缺陷株生长曲线。 4 动力试验分析：分别在是否含有o 5 葡萄糖的l b 半固体培养基中 培养细菌，观察野生株及缺陷株的动力情况。 5 伤寒沙门菌基因表达谱分析：分别在是否含有葡萄糖的条件下培养 野生株与q s e c 基因缺陷变异株至o d 6 0 0 值为1 0 ，收集菌体、提取 总r n a 、反转录成c d n a 并标记荧光( c y 3 或c y 5 ) ，与伤寒沙门 菌全基因组芯片杂交，双通道扫描后根据荧光信号分析各基因转录 表达水平，比较伤寒沙门菌野生株和q s e c 基因缺陷变异株基因表达 谱差异。 伤寒沙门茵q s e c 特性与功能研究 6 实时荧光定量p c r ( q r t p c r ) 分析：选择基因芯片结果中部分差 异表达基因，设计特异性引物，进行反转录和实时定量p c r ，验证 d n a 芯片分析结果。 7 h e l a 细胞侵袭试验：将在含o 5 葡萄糖生长条件下培养至o d 6 0 0 为1 o 左右的细菌，加入培养有h e l a 细胞的2 4 孔板中( m o i = 2 0 ) ， 9 0m i n 后收集一部分细胞，加入裂解液，涂l b 平板过夜培养，计 细菌克隆数，代表细菌粘附细胞水平t o ；另一部分加入庆大霉素杀 死胞外细菌，继续培养9 0m i n ，破胞后涂板过夜培养，计克隆数代 表细菌的侵袭水平t 9 0 ，用t 9 0 t o 的值代表细菌的侵袭力。 结果： 1 经p c r 及序列分析证实q s e b 、q s e c 及q s e b q s e c 基因缺陷变异株 中分别缺失了2 6 4 ，6 9 0 及9 5 4 个碱基，表明成功构建伤寒沙门菌 q s e b 、q s e c 及q s e b q s e c 基因缺陷变异株。 2 p c r 及序列分析结果表明，成功构建p b a d q s e b 及p b a d q s e c 阳 性重组载体，并成功将重组载体导入相应的缺陷株中，制备成q s e b 、 q s e c 各基因缺陷回补株。 3 生长曲线结果表明q s e c 基因缺陷变异株在是否含有葡萄糖条件下 生存能力均与野生株相似。在葡萄糖条件下，野生株与缺陷株的生 长均比不加葡萄糖条件下快。 4 动力试验结果显示，在是否含有葡萄糖情况下，q s e c 基因缺陷变异 株动力均比野生株明显下降，回补q s e c 基因后动力有所恢复；q s e b 缺陷变异株与q s e b q s e c 双缺陷变异株动力与野生株相比均无明显 差异。 5 基因芯片分析结果显示，在普通条件下，伤寒沙门菌q s e c 基因缺 陷变异株相比野生株，有1 3 个基因表达上调，6 个基因表达下调， 主要涉及q s e c 侧翼基因、酶类基因等；在含葡萄糖条件下，q s e c 江苏大学硕士学位论文 基因缺陷变异株中有2 6 个基因表达上调，1 4 个基因表达下调，差 异表达基因包括s p i 1 相关基因，q s e c 侧翼基因，酶类基因等。 6 实时荧光定量p c r 分析基因表达差异结果，一方面进一步支持了基 因芯片分析结果，另一方面还显示q s e b 能促进q s e c 侧翼基因的表 达。 7 在含葡萄糖环境下，q s e c 基因缺陷变异株的侵袭力比野生株下降约 4 倍，而q s e c 回补株与野生株相比无明显差异。 结论： 伤寒沙门菌中q s e c 对其侧翼基因的表达，动力具有调节作用，同 时在葡萄糖条件下，上调s p i 1 侵袭相关基因的表达，促进细菌的侵袭。 关键词：伤寒沙门菌，q s e c ，葡萄糖，基因表达，侵袭 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 i v 江苏大学硕士学位论文 a b s t r a c t u b j e c t i v e ： q s e ci sa ni m p o r t a n tq u o r u ms e n s i n gr e g u l a t o rw h i c hi n i t i a t e st h e e x p r e s s i o no fa s e r i e sg e n e si nt h ep r e s e n c eo fa u t o i n d u c e r3 ( a i - 3 ) e p i n e p h r i n e n o r e p i n e p h r i n ei ne c o l i b ys e q u e n c i n ga n a l y s i s ，w eh a v e f o u n dt h eh o m o l o go ft h ep u t a t i v eq s e b ci ns a l m o n e l l ae n t e r i c as e r o v e r t y p h i 假t y p h i ) i nt h i ss t u d y ，w ew i l li n v e s t i g a t et h ef u n c t i o no fq s e c a n di t si n f l u e n c eo ng e n ee x p r e s s i o no fs t y p h ii nt h ep r e s e n c ea n d a b s e n c eo f g l u c o s e m e t h o d s ： 1 t h ec o n s t r u c t i o no fq s e b ，q s e c , a n dq s e b q s e cd e l e t e dm u t a n t s t h e t a r g e tg e n ed e l e t e dm u t a n to fs t y p h iw a sp r e p a r e db yh o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o nm e d i a t e db ys u i c i d ep l a s m i dp g m b151 2 r e s c u eo fq s e ca n dq s e bi nt h eq s e ca n dq s e bd e l e t e dm u t a n t s r e s p e c t i v e l y ap a i ro fp r i m e r ss p e c i f i ct ou p s t r e a ma n dd o w n s t r e a m r e g i o n so ft h et a r g e tg e n ew a sd e s i g n e d ，t h ea m p l i c o nc o n t a i n i n gt h e p r o m o t e ra n dt e r m i n a t o rr e g i o no ft h et a r g e tg e n ew a sd i r e c t i o n a l l y i n s e r t e di n t ot h ee x p r e s s i o nv e c t o rp b a d g l i i t h et a r g e tg e n ed e l e t e d m u t a n t sw e r et r a n s f o r m e db yt h ep o s i t i v er e c o m b i n a n tp l a s m i da n dt h e e m p t y v e c t o rt og e n e r a t et h ec o m p l e m e n t a r ys t r a i na n dt h ec o n t r o ls t r a i n ， r e s p e c t i v e l y 3 t h eg r o w t hc u r v e sa s s a y g r o w t hc u r v e so ft h ew i l d t y p es t r a i na n d m u t a n t so fs t y p h iw e r ed r a w nb yu s i n gg r o w t ht i m ea st h ea b s c i s s a a n dv a l u eo f0 da st h eo r d i n a t e 4 m o t i l i t ya s s a y t h em o t i l i t yo ft h ew i l d t y p es t r a i na n dm u t a n t so fs t y p h iw a se s t i m a t e db ym e a s u r i n gt h ed i a m e t e ro f t h eb a c t e r i a lz o n eo n s e m i s o l i da g a rp l a t e si nt h ep r e s e n c ea n da b s e n c eo f g l u c o s e 5 a n a l y s i so f t h eg e n ee x p r e s s i o np r o f i l e so fs t y p h i a f t e rg r o w i n gi n l bi nt h ep r e s e n c ea n da b s e n c eo fg l u c o s ef o r5h ，t h ec e l l so f w i l d t y p e v 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 s t r a i na n dq s e cd e l e t e dm u t a n to fs t y p h iw e r ec o l l e c t e d t h et o t a l r n a so ft h e mw e r et h e ne x t r a c t e d c d n a sw e r es y n t h e s i z e db yr e v e r s e t r a n s c r i p t i o na n dl a b e l e dw i t hc y 3 - o rc y 5 一d c t p a tt h es a m et i m e a f t e r h y b r i d i z a t i o n w i t ht h es a l m o n e l l ag e n o m i cm i c r o a r r a y ，t h e g e n e e x p r e s s i o np r o f i l e sd i f f e r e n c ei nb e t w e e nt h ew i l d - t y p es t r a i na n dq s e c d e l e t e dm u t a n to f s t y p h iw e r ea n a l y z e di nt h et w oc o n d i t i o n s 6 q r t p c ra s s a y p r i m e r ss p e c i f i c t os o m es e l e c t e d g e n e s w e r e d e s i g n e da n du s e df o rq u a n t i t a t i v er e a lt i m ep c r ( q r t p c r ) t o v a l i d a t e t h er e s u l t so f m i c r o a r r a ya s s a y 7 b a c t e r i a li n v a s i o na s s a y t h eb a c t e r i aw e r eg r o w nt ol a t e - l o gp h a s e ( o d 6 0 01 o ) i n t h e p r e s e n c e o fg l u c o s ea n da d d e dt o2 4 一w e l l t i s s u e c u l t u r e ( m o i = 2 0 ) a f t e ri n c u b a t i o no f9 0m i n ，s o m eo ft h ec e l l s w a sl y s e da n di n c u b a t e do nl bp l a t ef o rc a l c u l a t i n gb a c t e r i a lc l o n et o i n v e s t i g a t et h el e v e lo fc e l l a s s o c i a t e db a c t e r i a ( t o ) t h eo t h e rc e l l sw e r e i n c u b a t e df o raf u r t h e r9 0m i na f t e rt r e a t i n gw i t hg e n t a m i c i nt ok i l l 。e x t r a c e l l u l a rb a c t e r i a t h ec e l l sw e r et h e nl y s e da n di n c u b a t e do nl b p l a t ef o rc a l c u l a t i n gb a c t e r i a lc l o n et oa s s e s st h ei n v a s i o nl e v e l ( t 9 0 ) t h er a t i oo ft 9 0 t 0w a su s e dt or e p r e s e n tt h ei n v a s i o na b i l i t yo fb a c t e r i a r e s u l t s ： 1 ad e l e t i o no f2 6 4b pa n d6 9 0b pf r o mt h eq s e ba n dq s e cg e n e ， r e s p e c t i v e l y ，w a sc o n f i r m e db yp c r a n ds e q u e n c i n ga n a l y s i ss u g g e s t e d t h a tt h eq s e b ，q s e ca n dq s e b q s e cd e l e t e dm u t a n t sw e r ec o n s t r u c t e d s u c c e s s f u l l y 2 p c ra n ds e q u e n c i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eq s e co rq s e bg e n ew a s c o m p l e m e n t e di n t ot h et a r g e td e l e t e dm u t a n t 3 t h eo v e r a l lg r o w t ho ft h ew i l d t y p es t r a i na n dq s e cd e l e t e dm u t a n to fs t y p h iw a ss i m i l a r ，r e g a r d l e s so ft h ep r e s e n c eo fg l u c o s e t h ei n i t i a l g r o w t hr a t e so ft h eb a c t e r i ai nt h ep r e s e n c eo fg l u c o s ew e r ef a s t e rt h a n t h a tj ni t sa b s e n c e 4 t h e m o t i l i t y o f q s e cd e l e t e d m u t a n tw a s a p p a r e n t l y d e c r e a s e d c o m p a r e dt ot h a to ft h ew i l d t y p es t r a i ni nt h ep r e s e n c ea n da b s e n c eo f v i g l u c o s e ；t h em o t i l i t yo fq s e ba n dq s e b q s e cd e l e t e dm u t a n t sa n dt h e q s e cc o m p l e m e n t a r y s t r a i nw a ss i m i l a rt ot h a to ft h ew i l d - t y p e s t r a i n 5 g e n ee x p r e s s i o np r o f i l e sa n a l y s i sr e v e a l e dt h a t13g e n e sa n d 6g e n e si n t h eq s e cd e l e t e dm u t a n tw e r eu p - a n dd o w n r e g u l a t e d ，r e s p e c t i v e l y ，i n t h ea b s e n c eo fg l u c o s e t h eo b v i o u s l yc h a n g e dg e n e sw e r e1 n v o l v e di n q s e cf l a n k i n gg e n sa n de n z y m ef u n c t i o n a lg e n e s ；i nt h ep r e s e n c eo f g l u c o s e ，2 6g e n e sa n d14g e n e si nt h eq s e c d e l e t e dm u t a n tw e r eu p 。a n d d o w n r e g u l a t e d ，r e s p e c t i v e l y ，i n c l u d i n gq s e cf l a n k i n g g e n e s ，s p i _ 1 a s s o c i a t e dg e n e sa n de n z y m ef u n c t i o n a lg e n e s 6 r e s u l t so fq r t p c rs h o w nt h a t t h e e x p r e s s i o n d i f f e r e n c eo ft h e s e l e c t e dg e n e si nb e t w e e nw i l d t y p es t r a i na n dt h eq s e cd e l e t e dm u t a n t o f t y p h iw a ss i m i l a rw i t ht h er e s u l t sf r o mt h em i c r o a r r a ya s s a y ，a n d a l s or e v e a l e dt h a tt h eq s e cf l a n k i n gg e n e sw e r ep r o m o t e db yq s e b 7 i n v a s i o no fh e l ac e l l sb yq s e cd e l e t e dm u t a n tw a sd e c r e a s e da b o u t f o u r f o l dc o m p a r e dt ot h a to ft h ew i l d t y p es t r a i ni nt h ep r e s e n c eo f g l u c o s e t h e i n v a s i o nd e f e c t c a nb er e s c u e db yc o m p l e m e n t e d e x p r e s s i o no fq s e c i nq s e c d e l e t e dm u t a n t c o n c l u s i o n s q s e cp l a y s a ni m p o r t a n tr o l e i nr e g u l a t i o no fm o t i l i t ya n dt h e e x p r e s s i o no f i t sf l a n k i n gg e n e si ns t y p h i i nt h ep r e s e n c eo fg l u c o s e ，i t u p r e g u l a t e st h es p i 一1 a s s o c i a t e d g e n e sa n dp r o m o t e si n v a s i o no fh e l a c e l l sb ys t y p h i 。 k e yw o r d s ：s a l m o n e l l ae n t e r i c as e r o v a rt y p h i ，q s e c , g l u c o s e ，g e n e e x p r e s s i o n ，i n v a s i o n v l l 伤寒沙门茵q s e c 特性与功能研究 江苏大学硕士学位论文 第一章 1 1 1 2 1 3 1 4 1 5 第二章 2 1 2 2 2 3 2 4 第三章 3 1 目录 绪论1 伤寒沙门菌简介1 细菌的群体感应2 细菌双组份调控系统2 葡萄糖对毒力的作用3 q s e b q s e c 系统的研究现状4 研究的目的与内容、技术路线、材料和方法5 研究目的与内容5 2 1 1 研究目的5 2 1 2 研究内容5 技术路线一5 2 2 1 q s e c 基因缺失对伤寒沙门菌表型的影响5 2 2 2 + q s e c 缺失后对伤寒沙门菌基因表达的影响6 2 2 3 野生株与q s e c 基因缺陷变异株的侵袭力检测6 实验材料7 2 3 1菌株和质粒7 2 3 2 主要试剂7 2 3 3 主要溶液7 2 3 4 主要仪器9 实验方法lo 2 ，4 1 伤寒沙门菌q s e b 、q s e c 单缺陷及双缺陷变异株的制备1 0 2 4 2 筘出、q s e c 基因缺陷回补株的制备1 6 2 4 3 q s e c 对生长的影响1 9 2 4 4 q s e c 对动力的影响1 9 2 4 5 q s e c 对细菌生物膜的影响2 0 2 4 6q s e c 对伤寒沙门菌其他基因表达的调节2 0 2 4 7 q r t p c r 分析2 3 2 4 8 侵袭h e l a 细胞试验2 4 实验结果与讨论2 6 实验结果2 6 3 1 1 q s e b 、q s e c 单缺陷及双缺陷变异株的制备结果2 6 i x 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 3 1 2 q s e b 、q s e c 回补株的制备结果3 0 3 1 3 q s e c 对伤寒沙门菌生长的影响3 2 3 1 4 q s e c 对伤寒沙门菌动力的影响3 3 3 1 5 q s e c 对伤寒沙门菌生物膜的影响3 4 3 1 6 伤寒沙门菌表达谱分析结果3 4 3 1 7 q r t - p c r 分析结果。3 8 3 1 8 侵袭试验结果_ 4 l 3 2 讨论4 2 第四章主要结论及展望 4 7 4 1主要结论4 7 4 2 展望4 7 参考文献4 8 英文缩写索引5 6 致谢5 7 攻读硕士学位期间发表的文章5 8 x 江苏大学硕士学位论文 第一章绪论 1 1伤寒沙门菌简介 沙门菌( s a l m o n e l l a ) 属肠杆菌科( e n t e r o b a c t e r i a c e a e ) ，具有运动性，为革 兰氏阴性细菌，是一种人类严重的肠道致病菌，能引起全身性系统感染u , 2 1 。伤寒 沙门菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c as e r o v a rt y p h i ，& t y p h i ) 在1 8 8 0 年由e b e r t h 首次从 伤寒病人的粪便中观察到，并在1 8 8 4 年由g a f t k y 首次培养成功。t h o m a s 首先将 有持续发热，脾肿大，玫瑰疹，神经系统中毒症状，少数可并发肠出血和肠穿孔 等临床特征的疾病描述为一t y p h o i df e v e r 。伤寒沙门菌常通过污染食物经消化道进 入人体内，克服胃酸、高渗肠液及肠道正常菌群的防御作用，在空肠的远端侵入 肠上皮m 细胞，并能进一步克服人体免疫吞噬细胞的杀伤作用，在局部肠系膜淋 巴组织和吞噬细胞中存活和增殖，再经血液进入肝脾等全身组织，并突破机体免 疫防御，造成严重全身系统性感染一伤寒热( t y p h o i df e v e r ) 【3 ，4 1 。 病原菌的致病过程是一个多因素参与的复杂过程，伤寒沙门菌进入肠道内需 经一系列调节，如增加荚膜( v i ) 抗原表达以克服剧烈胃酸环境影响，进入肠道 后减少荚膜抗原的表达，增加鞭毛抗原与一些位于沙门菌毒力岛( s a l m o n e l l a p a t h o g e n i ci s l a n dl ，s p i 1 ) 的侵袭因子的表达，以协助细菌粘附于肠上皮m 细胞， 侵入肠上皮组织【2 - 8 ，进而使宿主致病。s p i 1 对细菌的侵袭发挥重要作用，其编码 毒力蛋白，效应蛋白及i i i 型分泌系统( t y p ei i is e c r e t i o ns y s t e m ，t t s s ) 。一旦 细菌接触到肠道内上皮细胞，则通过t t s s 将效应蛋白分泌到上皮细胞中，引起细 胞结构发生变化，导致细菌大量侵袭【乳】。伤寒沙门菌是经消化道感染的，有较 强的传染性，历史上曾经对人类造成过巨大的危害。伤寒沙门菌是人们研究最为 广泛和深入的细菌之一，目前随着抗菌素的发展和应用，其危害己大为降低，但 在热带和亚热带地区伤寒热仍是一种常见病，亚洲尤其是东南亚属于高发区，每 年约有1 6 0 0 万人感染伤寒并有6 0 万人死于伤寒，我国南方地区也时有局部暴发 流彳亍【l 3 1 。2 0 0 8 至2 0 0 9 年美国由被污染的花生酱引起了伤寒沙门氏菌感染疫情爆 发，导致了六百多人感染。由此可见，伤寒沙门菌是一种重要的食源性致病菌， 同时由于多种抗菌药物的广泛使用，产生了多种耐药菌株，更增加了伤寒沙门菌 对人类食品安全的危害【1 2 】。 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 1 2 细菌的群体感应 细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变 化，当信号达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中 的变化，这一调控系统被称为细菌的群体感应( q u o r u ms e n s i n g ，q s ) 调节系统 1 3 - 1 5 】。该系统首先由酶催化合成信号分子，信号分子经扩散或转运系统到达胞外， 当累计到一定浓度后，能被位于膜上的感应系统识别，进而引起受体蛋白的构象 或基团变化，最终激活靶基因的表达，该表达产物能使细菌适应外界环境各种变 化【1 5 】。自然界中大多数的细菌都能够在达到一个临界的数量之后，通过细胞之间 的信息交流来感觉、整合和处理环境的综合信息。这种现象最初称为“自动诱导 ( a u t o i n d u c t i o n ) ，现在被广泛地接受为“群体感应 ( q u o r u ms e n s i n g ) ，或者“细 胞与细胞的交流”( c e l lt oc e l lc o m m u n i c a t i o n ) 。到目前为止，科学研究证实，不 管是革兰氏阴性细菌或革兰氏阳性细菌都存在着群体感应现象【1 6 1 。这种由细菌细 胞与细胞之间的信息交流而引发的群体感应，是由被称为自动诱导物或信息素的 特殊的、微小的、可扩散的化学分子所介导。这种化学物质由细菌分泌到环境中 去。不同菌体q s 系统利用不同的信号分子来调控基因的表达。大多数革兰氏阴性 ( g ) 细菌使用酰化高丝氨酸内脂( a c y l h o m o s e r i n el a c t o n e s ，a h l ) 作为信号分 子。革兰氏阳性( g + ) 细菌利用寡肽类( a u t o i n d u c i n gp e p t i d e ，a i p ) 信号感知自 身种群数量，这两种分子一般被认为是种内信号分子，具有种属特异性，不能被 其他细菌所识别【1 7 1 8 】；另外还有一类信号分子是呋喃酰硼酸二酯( f u r a n o s y lb o r a t e d i e s t e r ) ，即i i 型信号分子( a u t o i n d u c e r - 2 ，a i 2 ) ，在g 。与g + 细菌中均存在。 它可感知其它种问细菌数量来调节自身行为【1 9 2 1 】。a i 2 及其合成酶l u x s 保守且广 泛存在于细菌中，人们推测a i 2 可能在细菌种问的通讯中起重要作用【2 2 】。此外， l u x s 被证明在细菌中具备双重功能( 代谢与信号) ，它既是甲基循环中一个重要 的代谢酶，同时又在这一过程中合成了副产物a i 一2 作为信号分子【2 2 , 2 3 】。目前发现 在大肠杆菌与鼠伤寒沙门菌中无a h l 类信号分子，但存在a i 2 及a i 3 类信号分 子 1 9 , 2 0 】，a i 3 类信号分子与肾上腺素结构类似，与a i 2 结构有所不刚1 5 , 2 1 , 2 4 - 2 6 。 据报道，a i 3 与肾上腺素及去甲肾上腺素作用于相同的受体，其中的一个受体就 是q s e b q s e c 双组份系统【2 。7 1 。 1 3 细菌双组份调控系统 “双组份调控系统 ( t w oc o m p o n e n ts i g n a l i n g ，t c s ) 是细菌的一种普遍而 2 江苏大学硕士学位论文 又重要的信号传递系统，也是基因表达的调节系统。t c s 由两种蛋白质成分组成， 其一为组氨酸蛋白激酶( h i s t i d i n ep r o t e i nk i n a s e ，h k ) ，通常位于细胞膜上，其功 能是识别并翻译外界的环境信号；另一为位于胞浆内的反应调节因子( r e s p o n s e r e g u l a t o r ，r r ) ，主要功能是调节某些基因的表达或改变细菌的某种局部运动形 式以响应外界信号，如图1 1 。整个信号传导通路由信号输入、h k 自磷酸化、r r 磷酸化及信号输出等环节构成【2 8 圳】。细胞受到外界刺激如温度、渗透压、酸碱度 等作用，h k 的组氨酸残基发生自磷酸化，进而将磷酸基团传递给r r 蛋白的特定天 冬氨酸残基，使得r r 蛋白激活，启动下游靶基因的表达。t c s 存在于各种细菌中， 细菌通过t c s 感应外界信号，引起基因表达变化以应对各种环境刺激【3 l 】。目前， t c s 的研究越来越多，仅在ec o b 中就已发现了多达5 0 个t c s 调节系统【3 2 1 。伤寒沙 门菌中也存在多种t c s 系统，应对不同的环境刺激信号，如o m p r e n v z ， p h o p p h o q ，p r n r a p m r b 等都是伤寒沙门菌中重要的t c s 系统，参与细菌应对各种 环境刺激，以及发挥毒力 3 3 - 3 8 】。 1 信褂 1 s 蹦o l t l l t a 删 _ _ _ n 调节相关基因 一 一一 瀹 ， 图1 1 双组份调节系统示意图 f i g1 1t h es c h e m a t i cd i a g r a mo f t c s 1 4 葡萄糖对毒力的作用 细菌的生存是一个不断适应外界环境，利用外界环境的过程，葡萄糖是细菌 生长的重要碳源。人体肠道内在进食半小时之后，食物中淀粉分解产生葡萄糖， 形成一个相对高糖环境。肠道菌在侵入肠上皮细胞时必须首先克服并利用肠道中 的葡萄糖，以发挥其侵袭作用。葡萄糖不仅是肠道内的能源物质，同时也是一种 重要的信号分子，如在枯草芽孢杆菌中( b a c i l l u ss u b t i l i s ) ，葡萄糖参与对乌头酸 3 伤寒沙门菌q s e c 特性与功能研究 酶( c i t b ) 基因的抑制作用，从而参与细菌毒力的调节【3 9 4 1 】。在金黄色葡萄球菌中 ( s t a p h ) ，l o c o c c u sa u r e u s ) ，分解代谢控制蛋白c c p a 在葡萄糖作用下调节代谢相 关基因和毒力决定基因的表达【4 2 舶】。 1 5o s e b o s e c 系统的研究现状 q s e b q s e c 是已知的大肠杆菌中的群体感应调节系统，通过感应外界的a i 3 肾上腺素去甲肾上腺素调节细菌的动力及毒力相关基因的表达【2 s , 4 s , 4 6 。q s e c 是位 于细胞膜上的感应蛋白，可以感应外界信号刺激自磷酸化，再将磷酸基团转移给 其调节蛋白q s e b ，激活的q s e b 可与编码鞭毛的f l h d c 基因启动子区结合，调节 砌d c 的表达，从而影响细菌鞭毛的合成t 4 6 4 引。在大肠杆菌中，q s e c 除了通过其 相应的调节蛋白q s e b 发挥作用外，还可激活非对应调节蛋白，如q s e f ，k d p e 来 调节毒力及其他基因的表达【4 6 1 ，如图1 2 。此外，大肠杆菌中q s e c 不仅具有激酶 的作用，同时又可以发挥磷酸酶的作用，在某些条件下可以抑制q s e b 的功能【4 6 ，4 9 1 。 鼠伤寒沙门菌中( s a l m o n e l l ae n t e r i c as e r o v a rt y p h i m u r i u m ，& t y p h i m u r i u m ) ，q s e c 对其侧翼基因的表达具有显著的调节作用【5 0 1 。与大肠杆菌中一样，鼠伤寒沙门菌 中q s e c 也可以调节鞭毛相关基因f l h d c 和毒力相关基因的表达 4 6 , 4 7 , 5 1 】。据文献报 道，在鼠伤寒沙门菌q s e c 基因缺失变异株中，细菌在猪中的聚集作用相比野生株 明显下降，说明鼠伤寒沙门菌中q s e c 还可调节细菌的聚集作用【4 8 ，5 2 1 。尽管鼠伤寒 沙门菌与伤寒沙门菌基因组序列具有很高的同源性，但其对人类的致病机制具有 很大差异【。在伤寒沙门菌中，q s e b q s e c 系统的功能目前尚无报道。 4 图1 2 ：大肠杆菌中q s e c 信号传导模式图【4 6 l f i g1 2m o d e lo ft h eq s e cs i g n a l i n gc a s c a d e si ne c o l i 江苏大学硕士学位论文 第二章研究的目的与内容、技术路线、材料和方法 2 1 研究目的与内容 2 1 1研究目的 q s e b q s e c 系统是大肠杆菌中的群体感应调节系统，在大肠杆菌及鼠伤寒沙门 菌中参与鞭毛和毒力相关基因的调节，本文拟研究在是否含有葡萄糖作用- f q s e c 对伤寒沙门菌基因表达调控的影响。 2 1 2 研究内容 观察伤寒沙门菌q s e c 基因缺失对表型的影响；分析q s e c 缺失对伤寒沙门菌系 统基因表达影响：分析q s e c 基因缺失对伤寒沙门菌侵袭力影响。 2 2