（生物化学与分子生物学专业论文）内吗啡肽2类似物的comfa研究.pdf

燃鎏 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导下独立进 行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经发表或未发表的成果、 数据、观点等，均已明确注明出处。除文中已经注明引用的内容外，不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究 ； 成果做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：i 鐾丝重堂日期：z 堡幽 勰描 关予学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知识产权归 属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使用学位论文的规定， 同意学校保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版， 允许论文被查阅和借阅；本人授权兰州大学可以将本学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和 汇编本学位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：差丝壁 导师签名：二碰日 期：鲨：尘丝 赫燃 摘要 内吗啡肽1 ( t y r - p r o - t r p - p h e - n h a ，e m 1 和内吗啡2 ( t y r - p r o - p h e - p h e ，e m - 2 ) 是近年来发现的人体内生的，高选择性，高激 动的譬阿片受体的激动剩。它们具有最小阿片肽结构单元，并且具有强 效的镇痛作用，但又有酶解稳定性不好，不易穿过血脑屏障的缺点，因此 入们多以e m s 为模板来设计新的类似物。但其结构柔性以及并未明确的 构效关系，也大大阻碍了以其结构为模板的瘸觉调节药物的研发。 本论文为了寻找新的具有更高l l 阿片受体结合活性的e m - 2 的类似 物，利用比较分子场分析方法( c o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ， c o m f a ) 方法，选择2 1 个e m - 2 的类似物，进行了三维定量构效关系 ( 3 d 。q s a r ) 研究。为了获得有统计意义的c o m f a 模型，收集了许多不 f 同实验的活性和结构数据，来进行c o m f a 研究。最终所建立的c o m f a 模 型具有较好的预测性( q 2 = o ，6 3 4 ，r 2 _ o 9 7 0 ) 。又选择了六个已知活性的类 似物对于所建立的模型进行了验证，预测活性与实验测定的活性具有一致 性。在该模型的基础上，设计了多个类似扬，并预测了檑应的活性值。本 文为设计和寻找新的高结合活性e m - 2 类似物提供了有指导价值的信息。 关键词：e m s 类似物，q s a r ，c o m f a ，空间构象，药效匿 蔺州夹孚 u l 蹭辫壤嘲l l j f a b s t r a c t e n d o m o r p h i n - 1 ( t y r - p r o t r p p h e - n h 2e m 一1 ) a n de n d o m o r p h i n 一2 ( t y r - p r o p h e - p h e - n h 2 ，e m - 2 ) a r eh i g h l yp o t e n ta n ds e l e c t i v ee n d o g e n o u sl i g a n d st oi x o p i o i dr e c e p t o r a l t h o u g ht h e ya r et h em o s ts m a l lm o d e lp e p t i d e st or e v e a lt h ef u n c t i o no fo p i o i dl i g a n d s ， e m sw e r ef o u n dt ob ee a s i l yd i g e s t e db ye n z y m e sa n dh a r dt op a s st h eb l o o d - b r a i n - b a r r i e r t od e v e l o pp o t e n ta n a l o 誉e sw i t hl e s ss i d ee f f e c t s ，m a n yg r o u ph a v er e p o r t e dd i f f e r e n t m e t h o d st od e v e l o pt h em o r ei d e a la n a l o g so fe m s h o w e v e r , t h e i rs t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i pr e m a i n su n c l e a r ，a n dn os i g n i f i c a n tp r e f e r e n c ef o rs u b t y p eo p i o i dr e c e p t o rh a s b e e na c h i e v e d i no r d e rt of i n dn e we m 一2a n a l o g sw i t hs u p e r i o rp r o p e r t yt h a tt a r g e tt h ei x - r e c e p t o r ， t h r e e - d i m e n s i o n a lq u a n t i t a t i v es t r u c t u r ea n da c t i v i t yr e l a t i o n s h i p ( 3 弘电s 2 埘s t u d i e sw e r e p e r f o r m e do n2 1e m - 2a n a l o g su s i n gc o m p a r a t i v em o l e c u l a rf i e l da n a l y s i s ( c o m f a ) t o o b t a i ns t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n ta n dr o b u s tc o m f am o d e l s , 2 1e m - 2a n a l o g u e sw e r e a s s e m b l e db yp o o l i n gb i o l o g i c a la n ds t r u c t u r a ld a t af r o mi n d e p e n d e n ts t u d i e s 。t h eb e s t p r e d i c t i v em o d e lf o rt h ei x - r e c e p t o rw e r eo b t a i n e dw i t hq 2 - - - 0 6 3 4 ，r 2 = 0 9 7 0 t h em o d e l s w e r ef u r t h e rv a l i d a t e db yat e s ts e tc o n t a i n i n gs i xc o m p o u n d s b a s e do nt h em o d e l ，s e v e r a l c a n d i d a t es t r u c t u r e sw e r ed e s i g n e da n dp r e d i c t e df o rt h w i rb i n d i n gp o t e n c i e s t h i ss t u d y p r o v i d e sh e l p f u li n f o r m a t i o nf o rd e s i g n i n gn e wc a t e g o r yi x - a g o n i s t sf r o me m s k e y w o r d s ：e n d o m o r p h i n - 2a n a l o g ；q s a r ；c o m f a ；c o n f o r m a t i o n ；p h a r m a c o p h o r e 7 蔺州i i l 夹v i 璐婆i i i 一计算机辅助药物设计的发展 1 1 计算机辅助药物设计的重要性 1 二l 刖舌 近年来，应用各种理论计算方法和分子模拟技术，进行计算机辅助药物设计 ( c o m p u t e r - - a i d e dd r u gd e s i g n ，c a d d ) 已成为国际上十分活跃的研究领域f l 嘲。目前 药品专利的保护期为2 0 年，而药物上市前的研究和开发( r & d ) 花费的时间约为1 0 年，而c a d d 的使用大概可以节约2 3 年，不但节约了r & d 的经费，而且能为市场 赢得宝贵时间，这将产生巨大的经济和社会效益，因此c a d d 方法已经被国外许多 制药公司用于了新药的研究和开发，并取得了巨大成果。 1 2 计算机辅助药物设计的途径 理论计算和计算机辅助药物设计可以用来研究受体生物大分子上药物结合部位 的结构和性质、药物一受体复合物的构型和立体化学特征、药物与受体结合的模式和 选择性、药物分子的活性集团和“药效构象”等。为改进现有的生物活性物质的结构、 设计新的药物，提供理论上的先导化合物和思路，大大提高新药研究的效率，逐步形 成形成“理论研究一药物设计一药物合成一药理研究”相结合的新途径 7 1 。 1 2 1 在药物小分子构效关系基础上的药物设计 大多数药物作用的受体大分子三维结构上不清楚。在这种情况下，一般以小分子 的结构和活性为基础，对一系列化合物进行定量构效关系和三维定量构效关系的研 究，得到预测能力较强的q s a r 3 d q s a r 模型，对设计化合物进行预测。3 d q s a r 模型还会给出结构改造的信息，这使新化合物的设计目标更明确。 赫燃 1 2 ，2 以受体的三维结构为基础的药物设计 近年来随着分子生物学和结构生物学的发展，越来越多的受体生物大分子三维结 构被测定。有些有重要药理作用的受体大分子的生物的三维结构虽然目前还没有被测 定，但是他们的一级结构已被阐明，这时可以使用同源蛋白模建的方法建立其三维结 构模型。在这种情况下，我们可以用基于结构的药物设计方法设计新的先导化合物。 一般是先根据受体的三维结构，用分子模拟或理论计算方法研究药物和生物大分子的 作用方式，得到生物大分子特别是其活性部位或结合部位的详细结构性质，如静电作 用、疏水作用和氢键结合等区域的分布。然后用全新药物设计或数据库搜寻的方法， 设计新的化合物。 1 2 3 与组合化学相对应的计算机辅助药物设计 组合化学的建立和发展，也推动了计算机辅助药物设计方法的发展，随之也产生 了计算机模拟组合化学方法。用分子模拟和计算机技术设计合成组合样品库的构造块 ( b u i l d i n gb l o c k ) 、根据分子多样性( m o l e c u l a rd i v e r s i t y ) 评价样品库的质量，或者建 立虚拟组合样品库。高通量筛选所产生的大量信息也必须用计算机来处理。 二内吗啡肽简介 阿片用于镇痛作用有较悠久的历史了。1 8 0 3 年德国药剂师s e r u r n a 从罂栗果汁 中分离出它的主要成分吗啡( m o r p h i n e ) 。1 9 2 5 年确定了吗啡的化学结构。虽然吗啡 成瘾性很强以及有呼吸抑制作用，但是因其镇痛性很好，现在仍是临床上广泛采用的 麻醉药物之【8 】。科学家一直在寻找合适的取代药物，因此导致了内源性阿片肽的发 现。 从1 9 7 3 年阿片受体的发现开始，人们确信人体内应该具有和阿片受体匹配 的内源性物质。1 9 7 4 年，k o s t e r l i t z 实验室的h u g h e s 利用豚鼠回肠( g p i ) 和小 9 赫燃 鼠输精管( m v d ) 模型筛选脑内提取物，找到了两个具有吗啡类似活性的五肽， 即甲硫氨酸脑啡肽( m e t h i o n i u ee n k a p h a l i nl e ，简称甲啡肽) 和亮氨酸脑啡肽 ( 1 e u c i n ee n k a p h a l i n el e ，简称亮啡肽) ，两者合称脑啡肽( e n k a p h a l i n ) 。随后 又有入相继发现了1 3 内啡肽( b e n d o r p h i n e ，9 一e p ) ，强啡肽( d y n o r p h i n ) 。 并且明确了这些阿片肽和他们的g 蛋白偶联受体( 6 ，k 和p 阿片受体) 的关 系。脑啡肽、强啡肽分别对6 和k 受体选择性强，被认为是6 和，c 受体的内源性 配体。但对耻阿片受体一直发现它的专一性强的内源性配体。1 9 9 2 1 9 9 3 年 s ，强移k 阿片受体相继克隆成功，1 9 9 4 和1 9 9 5 年又发现了阿片受体样受体 ( o r l l 受体) 及其专一性配体一孤啡肽( o r p h a n i n f q n o e i e e p t i n ) 。 直到1 9 9 7 年，z a d i n a 9 1 及其同事才从牛脑中发现两种内源性的m o r 选择 性配体。命名为魂玛啡肽一1 ( e n d o m o r p h i n l ，e m l ，t y r p r o t r i o p h e - n h 2 ) 和 内吗啡肽一2 ( e n d o m o r p h i n - 2 ，e m - 2 ，t y r - p r o p h e - p h e - n h 2 ) 。 2 1e m s 的研究进展 z a d i n a 9 及其同事在n a t u r e 上报道，通过替换t y r - w m i f 1 ( t y r p r o t r p g l y - n h 2 ) 的第四位氨基酸及免疫组化筛选肽库的方法，从牛脑 孛发现两种走源性的m o r 选择性配髂。该配体钯学上属于蹬肽，其性能类似 吗啡，因此被命名为内吗啡肽1 ( e n d o m o r p h i n l ，e m - l ，t y r p r o t r p p h e n h 2 ) 襄疼吗哮肽2 ( e n d o m o r p h i n2 ，e m 2 ，t y r p r o ，p h e - p h e n h 2 。离体及体内实 验证明内吗啡肽( e n d o m o r p h i n s ，e m s ) 是迄今为止发现的对i i 阿片受体亲和性 秘选择镁最高的生物获，具有广泛的生理、药理作用，被认药是天然酶秘隧片 受体内源性配体。e m s 与传统阿片肽共有序列t y r - g l y - g l y - p h e - o h 不同，其二位氨 基酸是p r o ，其三位氨基酸是t r p 或p h e ，箕四位氨基酸是p h e - n h 2 焉嚣p h e - o h ，靛 而有别予传统阿片肽。e m s 的四个氨基酸残基组分所蕴含的信息和作用之多引起了广 泛的关注释研究热激。 2 1 。1e m s 的分布 l o 蔺锻么寥 u 姗l l l l r 璐i r l e m s 广泛分布予小鼠、大鼠、猴、豚鼠等实验动物及人的中枢神经系统内，在入 额顶皮层中含量丰富。e m i 在脑部的分布广丽密集，主要分布于孤柬核、臂旁核、隔 区、斜角带、终纹床核、僵核、丘脑腹后内侧核、下丘脑后核、导水管周围灰质( p a g ) 、 蓝斑、伏核、杏仁核及运动性语言中枢等部位。e m 2 在脊髓分布更广泛，主要分布于脊 髓背角的小宜径初级传入神经，脊髓背角浅神经层、背根，髓质| l 阿片受体富集区及脊 髓三叉神经元。e m 2 也出现于脑中富有m o r 的许多区域，包括伏核、丘脑中核、隔 区、下丘脑和杏仁核、蓝斑、导水管周围灰质，但在大脑皮质、纹状体、海马、孤束核 和鹜根神经节上分布很少1 1 0 ，n 】。孝孛经解割学研究结果显示，凌吗啡款参与了痛觉调制、 自律神经系统传导及对压力作出反应等过程。 与其他阿片肽类似，e m s 在哺乳动物的免疫组织也有分布。放射免疫试验和h p l c 分耩表明，大鼠胸腺和脾脏提取液中含有e m - 1 和e m - 2 ，人体脾赃审含有e m - 2 ，因姥 e m 2 也可能参与免疫调节1 2 1 。 2 1 2e m s 的阿片受体结合特征 在小鼠脑匀浆标本中，e m s 高亲和、高选择地结合m o r ，e m l 和e m 2 的k d f 分别为0 。2 5 + 0 ，0 6n m o l l l 稆0 2 5 圭0 。ln m o l l 一熏，b m a x 分别为7 a ：2f m o l m g p r o t e i n - 1 和0 2 5 + 0 1f m o l m gp r o t e i n 一1 ，对i l l 受体的k i 分别为0 6 7 + 0 2n m o l l 一1 和0 4 3 士o 0 5 n m o l l 1 ，对抛受体的k i 分别隽3 2 + 0 5n m o l l 1 和4 妊0 。0 5 n m o l l l ；同时以 中等的亲和力与k 3 阿片受体结合，k i 分别为2 1 士6 3n m o l l 一1 和3 0 士9 9n m o l l l ； 毽不与5 、x l 受体结合，殛均大予5 0 0m n o l l l 翻；对m o r 酶选择性缀高，e m l6 7 拜一 4 0 0 0 、r d r t = 1 5 0 0 0 ，e m 28 l x = 1 3 0 0 0 、w i t = l5 0 0 0 l l j 。在m o r 1 c h o 细胞及 s h 。s y 5 y 缅胞株上，e m s 两样高亲秘性地结合m o r 1 3 , 1 4 l 。 2 。1 3 雕s 祷效关系研究 动物及人体内多种生物透子( 如，季孛经递质等) 作用酶发挥主要依靠其与相应受体 的结合，这种结合实际上是在受空间构象的限制。受体与配体结合的特异性生要是因 麓弼么鎏 i 越砌硼懈玎：y 为相互空间构象上的匹配【1 5 1 。多肽类物质作为体内一大类递质调质在生物体内发挥 重要的作用，多肽的空间构象决定着其与受体结合的选择性、特异性和生物活性。研 究多肽的构象对于研究出高生物活性的药物具有重要的意义【1 6 1 。目前多肽构象分析多 利用n m r ，x f a y ，m o l e c u l a rm o d e l i n g 等手段来研究多肽在不同黏性系数溶液中的 构象( 如：水，脂，水侑机溶剂混合溶液，细胞膜环境模拟溶液) ，借以探讨配体一 受体结合的优势构象。 多肽分子由于其结构相对简单分子闻作用力小，通常在体液状况下为一松散结构， 其与受体结合瞬间的构象一直是我们所要了解却又难以了解的【1 7 l 。它们处于何种构象 面有利于多歉与受体的结合以及如何控制多歉的生物活犍，一般可以通过构象限制来 研究。随着合成技术的发展和更多的多肽砌块的发现，已经有多种方法可以实现多肽 分予构象静限制。另夕 随着计算枧模拟和燃技术的发展越来越多的多款分子模型也 被得到。 多肽在溶液中非常柔软，但是它们在与其受体结合时却能够采取非常特异的 构象，不凰的受体亚型甚至可以识别同一多默分子的不厨构象两弓；发不屈的生物 学效应，当今科技的前尚领域之一就是要最终确证这些受体皿型，从而开发出能 ， 够徽失药物使用麓肽类或菲默类受体的堵抗刹或激动裁，7 解多麓药物的分子构 象与其活性的关系是目前这方面研究的焦点。 2 1 4e m s 的构象 一些霹片短默的构象可戬透过形成单磊雳x - m y 得出。但是冒体构象帮溶液状态的 生物构象相差很远，晶格力对肽的构象有很大影响，并且在固体状态下，阿片肽会形 成不霹嚣簿布。如脑蹲敖。 i s - 2 1 露前提出的阿片肽筋生物活性构象有很多不辅盼鼹点，没有被大家认可的模型。由 于侧链基团在空间排布的精细区别，不同类型的阿片肽在不同的溶液中有多种结构【2 2 1 。 多肽在溶液中的构象研究最常用的手段就是基于n o e 的多维n m r 技术 1 2 胁燃 ( n o e s y ，r o e s y 等) 。然而，大部分短肽的结构非常柔软，极少可指定的n o e s 能用 于构象研究，这使n m r 技术在柔软短肽构象分析中的应用困难重重。和m o r p h i c e p t i n 一样，e m s 相对于大部分结构柔软的阿片肽而言，研究它们在溶液中构象的是非常有 意义的，因为e m s 的第二位是具有结构限制功能的p r o z 。p r o 在肽序列中能形成顺式( c i s ) 和反式( r a n s ) 两种构象，p r 0 2 对e m s 结构的限制可能暗含极其丰富的结构一功能信息。 1 9 9 8 年，p o d l o g a r 等【2 3 】利用1 d j h n m r ，2 d j h n m r 和分子动力学模拟技术研究了 e m 1 的溶液构象。在d m s o 溶液中通过2 d n m r 和n o s e y 来测定t y r l p r 0 2 顺反比 例；通过基于n o e 约束的分子动力学研究得到了e m s 的顺式和反式构象。结果表明， 在d m s o 溶液和水中，e m s 第二位p r o 的c o 键有顺式( 2 5 ) 和反式( 7 5 ) 两种构象。 顺式构象的t y r l 和t 巾3 芳香环相向包裹着p r 0 2 环，采取一压缩三明治构象。其反 式构象相对伸展，t y r l ，t r p 3 ，p 1 1 e 4 都有不同的立体空间指向，可能为生物活性构象 口嘻1 ) 。同时他们通过比较m o r p h i n e ，d t i p p - n h 2 ，t y r - d t i c p h e - p h e - n h 2 ，p l - 1 0 7 ， t y r - p r o p h c d p r o n h 2 的反式构象，确认反式构象是e m l 的优势构象，并且认为由 疏水基团所形成疏水区域是决定e m lm o i 进择性至关重要的因素( f 谚2 ) 。 4b f i g 1 s t r u c t u r e so ft h et r a n s ( a ) a n dc i s ( b ) i s o m e ro fe n d o m o r p h i n - ii nd m s o d 6a s d e t e r m i n e db y2 d - n m ra n dm o l e c u a rm o d e l i n g 【2 3 】 韵州夹婆 u 珊硼吣n t f i g 2 c o m p a r i s o no ft r a n s - e m ie x t e n d e dc o n f o r m a t i o n 、析md - t i p p - n h 2a n dp l - 0 1 7 【2 3 】 l m o r o d e r 等人认为短肽的构象强烈依赖于短肽分子周围所处的溶液环境。他 们用n l 脚究了e m l 在s d s 胶束和反a o t 胶束 2 4 1 ( 可以有效模拟细胞膜环境) 中e m l i 的构象，得出了与p 0 d l o g a r 等人不一致的结果1 2 3 1 ( f i g 5 ) ：他们比较了e m l 在水溶液和 胶束中的构象。水溶液反式构象中，t y r l 和p h e 4 空间上互相靠近。s d s 胶束和a o t 胶束溶液中，e m l 顺反构象比分别为，2 6 ：7 4 和4 5 ：5 5 ，并且，t y r l 的酚环都插入胶束 的脂层，肽链呈深度弯曲。由此可以看出，随着溶液环境的变换( 水- - s d s 胶束- - a o t 胶束) ，芳香环侧链的相互作用由r y t l 和p h e 4 侧链空间上互相靠近，到r r p 3 的 吲哚环与t y r l 的酚羟基环互相靠近，p h e 4 侧链指向完全相反的方向( f i g 3 ) 。各侧链 空间朝向随介质变化的同时伴随着e m l 顺式构象的相对稳定。l m o m d e r 认为顺式 构象中各侧链的空间朝向与m o r p h i c e p t i n 及其他m o r 受体激动剂在溶液 2 5 】以及 晶体结构f 2 睨刁中的朝向一致，这说明顺式构象是e m l 的活性构象。 1 4 麓僻么婆 u 姗b t l 璐r r l r a t r a n s - i s o m e ro f e n d o m o r p h i n 一1i n a q u e o u ss o l u t i o n c l s - p r o t i a n 8 - a n dc i s s t r u c t u r e so f e n d o m o r p h i n - 1i na o t i s o o c t a n e m i c e l l e s f i g 3 ( a ) 。t r a n s i s o m e ro f e n d o m o r p h i n - 1i na q u e o u ss o l u t i o n ；0 3 ) t r a n s - a n dc i s s t r u c t u r e s o fe n d o m o r p h i n - ii na o t i s o o c t a n em i c e l l e s 刚 建立在e m 1 的构象研究基础上，e m - 2 的构象也通过n m r 和分子动力学模拟技 术得以阐明f 2 8 , 2 9 1 ，也嚣不同的溶剂环境得出了不同的观点。2 d 一1 h n m r 和模拟退火 分予动力学研究证实了e m - 2 的顺反式比为l ：2 ，且顺反式构象侧链均相对伸展，碳 架结构在p r 0 2 一p h e 3 处发生扭转，这些结构说明e m - 2 的构象与e m - 1 的构象存在差 异不大( f i g 4 ) 在伸展构象的反式e m - 2 中t y r l ，p r 0 2 和p h e 3 的空间方向与反式e m 1 接近不需要很多能力消耗。各个疏水基翻t y r l ，p h e 3 和p 聍占据相同空间位置，它们 对l l 受体选择性区域都具有同样的重要性。 b a l a z sl e 堍c b 等人【3 0 】根据佃和s a 模拟根据试验数据进行的无限制模拟中得到 大量不同的伸展和弯曲的顺式和反式e m 2 结构。认为e m s 的构象可能涉及到一个伸展 结构，和e m l 和e m 2 的活性构象相关。根据“信息一地址 的概念，信息应该在n 端 片段t y r l - p r 0 2 - p h e 3 两地址部分是e 端尾，p h e 4 - n h 。在反式构象中可以发现n 端反式 y 转角，而在顺式构象中不存在。他们假定e m 2 的活性构象是一个反式t y r l 一p r 0 2 肽 键及一个反式y 转焦在n 端区域。在s a 模拟中获得的构蒙中有丰富的n 端反式y 转 角暗示了假定。进而推论，反式y 转角在n 端片段和受体的结合中是重要的，顺式异 构体将不是活性构象，是因为在顺式异构体的构象中没有发现y 转危。 韵州幺寥 u 姗1 i r t l 盈s l t l r 文啜黼 黟搿毽 f i g 4 s t e r e o s c o p i cv i e w so fm o s ts t a b l ec o n f o r m e r so ft r a n se m 2b e l o n g i n gt o r e s p e c t i v ec o n f o r m a t i o n a lg r o u p s ( a ) r s - t y p eo p e nc o n f o r n l e ri nt f e ，( b ) n 7 - t y p e o p e nc o n f o r m e ri nw a t e r ，( c ) f l - t y p ea n d ( d ) f 2 - t y p ef o l d e dc o n f o r m e r si nd p c m i c e l l e s 【2 硼 虽然，e m s 的生物活性构象可能不是一种顺式或反式构象作为主导的，在不同环 境下它可能会有不同的空间排布。e m s 的顺反构象会随着溶液环境不同而改变，但值 得注意的是，我们并不能根据溶液中顺反式构象比例的多寡来判断生物活性构象。有 些低比例、高能量构象有可能就是生物活性构象，因为高能向低能的构象转变所释放 的能量有利于配体与受体结合。 2 1 5 脚s 的类似物研究进展 目前对e m s 的类似物研究进展很快，肽链上每个肽都进行过替换研究，借此 来研究了各肽在e m s 的结合和生物活性中的重要性。女【 y u s u k es a s a k i 3 l 】等用d m p 取代了t y r l ，虽然缺少了n 端的酚的羟基基团，但是得到的类似物活性降低并不显 著。说明了d m p 可以在一定程度上对t y r 的羟基基团的功能进行一定程度的取代。 a n n a j a n e c k a l 3 2 】等用s a r ( s a r = n m e g l y c i n e ) 进行了对p r 0 2 的替换，结合活性在一定 程度上降低，但是并不显著。 进行最多研究的是对p h e 3 t r p 3 位和p h e 4 的替换，根据研究表明，4 位和生理活性关 燃霎 系密切，以l d m p ( 2 ，6 - d i m e t h y l p h e n y l a l a n i n e ) 替换p h e 3 得到的e m s 类似物 p m p 3 e m 2m o r 亲和力相比e m 2 有所提高，但类似物 d - d m p 3 e m 2m o r 亲和力却 极度减弱f 3 3 l 。以l d m t ( 2 ，6 d i m e t h y l l t y r o s i n e ) t 3 4 1 替换t y r l 得到的类似物 2 , 6 - d i m e t h y l - l - t y r o s i n e p r o p h e - n h - x ( x - - n a p h t h a l e n e ，q u i n o l i n e ，或i s o q u i n o l i n e ) 的 m o r 亲和力也相对提高 2 5 1 ，但是m o r 选择性下降p 舅。然而，以【d d m p 替换p h e 4 得 到的类似物无论是m o r 亲和力z 选择性，还是g p i 活性都有所下降。以【厢。d m p 替换 t y r l 对m o r 亲和力，g p i 活性无显著影1 响1 3 6 1 。 另外对e m s 的n 端或c 端的结构修饰研究表骧，e m l o l ，e m 2 o l 能保持对m o r 的高亲和性，可能是由于o l 能够促进该类似物与m o r 实现多位点结合【3 7 】。e m 2 一 o h ( t y r - p r o - p h e p h e - o h ) 是以羧基结尾的e m s 类似物，其对m o r 的亲和力大大减 弱。n m r 及模拟退火分予动力学研究表日y j t 2 9 3 8 1 ，以羧基替换- n h 2 促使e m s 的结构 柔化，结构交得极其不稳定，容易形成极度 枣展的构象，也容易形成极度弯益压缩的 构象，而e m 2 能比较稳定的保持伸展的构象，这就说明e m 2 o h 的低亲和主要是由 于构象变化引起的。同时，羧基的极性及负箕电荷也可能诱导e m 2 o h 结合到m o r 含g l u 序列的结合区域p s ，进而阻止e m 2 o h 与活性位点结合。 对e m s 的天然序列中附加额外的基匿也是种研究e m s 构效关系的方法。热， 将a d a m a n n t a n e 添加到e m s 的c 末端得到了高亲和的肽模拟物【3 9 l ；将n a p h t h a l e n e ， q u i n o l i n e 或i s o q u i n o l i n e 等疏水基团导入e m s 也得到了高亲和的肽模拟物，但其m o r 选择性有所下降【3 5 1 。 三关于阿片戢受体的砑究进展。 阿片及其衍生物在神经系统中具有很强的镇痛作用，对阿嚣受体的研究已有2 0 多年的历史。2 0 世纪7 0 年代发现了阿片受体的存在并先后发现了脑啡肽、 1 3 一内毽 默和强毽 肽等阿片肽，随蜃发现了孤啡肢。大量的生纯、药理研究表翡。至 少存在4 种不同的阿片受体皿型，即u 、6 、l c 和孤啡肽受体( o p i o i dr e c e p t o rl i k e 董，o r l i ) ，它们呈现不同的药理特性和解剖学分布。这四种亚型阿片受体除了涉及 镇痛作用以外，还与对疼痛刺激的反应如痛觉过敏、依赖性潜力以及对抗情绪变化、 蔺州矢孚 i j i h 姗碾i v 髓s r 联 植物神经和神经内分泌能等相关 4 0 , 4 。这四种阿片受体的的基因均已克隆成功，氨基 酸序列表明它们均属g 蛋白偶联受体，为7 螺旋跨膜受体家族的成员，具有很高的同 源性，功能包括介导腺苷酸环化酶的抑制作用以及一些离子通道的激活和抑制作用 等。目前阿片受体基因敲除、计算机结构模拟分析以及寻找新型阿片受体基因的研究 均在深入进行【4 2 】。 3 1 关于阿片肽结构的研究 自从1 9 7 3 年证实存在阿片受体以来，纯化阿片受体就成为许多科学家追求的目 标。但多年的研究表明，阿片受体的分离、纯化极难。目前还未能阐明阿片受体的三 维结构，这极大的制约了对阿片受体进行结构和功能研究。 近年来，随着计算机科学的发展和分子模拟技术( m o l e c u l a rm o d e li n g ) 的进步， 使得通过分子模拟构建阿片受体的三维结构模型成为可能，可用于研究阿片受体与选 择性激动剂、拮抗剂的相互作用，加深对药物作用机理的认识。 阿片受体构象的计算研究进展，是从视紫质x 射线结构的得到而真正开始的。2 0 0 0 年 发表的高分辨的视紫质的x 射线结构可以被用来作为真正的g p c r 模板来模拟其它 g p c r a 3 4 3 1 。h i m o s b e r g 和c b f o w l e r 就用视紫质的x 晶体结构为模板设计了i l 和6 阿 片受体的三维模型【4 5 】。 3 2 关于e m s 与m o r 结合的分子动力学模拟 关于肽与阿片受体结合构象的报道比较少，更多的是非肽类化合物的相关研究。 h i m o s b e r g 和c b f o w l e r 笔j # 5 ) x c j o m 一6 和j o m - 1 3 做了结合研究。得到了u 和6 阿片受 体的结合关键残基( f i g 5 ) 凿钟幺薯 u 日踊跚堪i v 璐玎y 毒o 赫纛 t 缒婚鹚 嘭 f i g u r e5 。j o m - 6 ( r e d ) i nlr e c e p t o rb i n d i n gs i t e ( t a i e kt i n e s ) j o m - 13 ( t h i nb l u el i n e s ) i nd b i n d i n gs i t e ( t h i nl i n e s ) i sa l s od e p i c t e d 4 5 1 y a s u k o 等人用i n s i g h t 的d i c o v e r y 模块模拟了e m 2 与m o r 的结合 2 9 1 。以前的 受体突变研究表明，a s p l 4 7 ，t y r l 4 8 ，g l u 2 2 9 ，h i s 2 9 7 ，t r p 3 18 和 t y r 3 2 6 残基可能是m o r 与配体相互作用的位点【l1 0 1ll 】。y a s u k o 用分子动力学 模拟将e m 2 锚定到这些结合位点( f i g 9 ) 网。e m s 阳离子氨基鸟酚环主要的作用是与 m o r 形成氢键，它们极有可能与受体h i s 2 9 7 残基的咪唑基发生作用，使t y r l 锚定到 m o r 受体的底部。因为o l u 2 2 9 位于受体结合区域的入口处，所以极有可能与c 端酰 氨发生作用相互作用。由于a s p l 4 7 与h i s 2 9 7 空间上非常接近，所以有可能与e m 2 的n - 末端发生作用。y a s u k o 认为受体更容易与伸展的反式构象结合。主要形成以下几对氢 键：( t y r l ) n h o ( a s p l 4 7 ) ，( t y r l ) o h i m i d a z o l e n ( h i s 2 9 7 ) ，( t y r l ) o h o ( a l a 2 4 0 ) ， ( t y r l ) o h o ( t y r - 1 4 8 ) ，( t y r l ) o h o ( t h r 2 1 8 ) 和( c - a m i d e ) n h o ( g l u 2 2 9 ) t r p 2 9 3 , t r p 3 1 8 残基与e m 2t y r l ，p h e 3 的互相堆积作用使受体一配体结合更加稳定 鬣、1 鞠州幺莹 i j 耋i o u 吼、礤c s i t y f i g 6 s t e r e o s c o p i cv i e wo fp o s s i b l ed o c k i n go fr s t y p eo p e nc o n f o r m e ro fe m 2f b a l la n d s t i c km o d e l ) o nt h ea g o n i s tb i n d i n gs i t eo ft h e1 - o p i o i dr e c e p t o rs t r u c t u r a lm o d e l ( g r e e n r i b b o nm o d e l ) t h ef u n c t i o n a lr e s i d u e so ft h er e c e p t o rf o rt h ei n t e r a c t i o na r es h o w nb ya b a l la n ds t i c km o d e l t h eh y d r o g e nb o n d so re l e c t r o s t a t i ci n t e r a c t i o n sa r er e p r e s e n t e db y d o t t e dl i n e s ”1 四定量构效关系研究 定量构效关系研究，指利用理论计算和统计分析工具来研究系列化合物的结构与 其生物效应之问的定量关系。分为二维定量构效关系( 2 d - - q s a r ) 和三维定量构效 关系( 3 d - - q s a r ) 。 4 1 二维定量构效关系( 2 d q s a r ) 二维定量构效关系的历史可以追溯到1 9 世纪中期，1 8 6 8 年c r u m b r o w n 和f r a s e r 2 0 勰描 发表了方程( 1 1 ) ，这是q s a r 方面的第一个方程，该方程表明，化合物的生理活性 可用化学结构c 的函数表示【4 6 1 。 = f ( c )( 1 1 ) 在随后的一段时间里，有很多科学家提出了另外一些q s a r 关系。r i c h e t 、m e y e r 和o v e r t o n 各自独立发现了亲脂性和生物效应，以及毒性和麻醉活性之间的线性关系。 b r u i c e 、k h a r a s c h 和w i n z l e r 发现在一系列甲状腺激素类似物中，基团对活性贡献很 大，这是第一个f r e e - - w i l s o n d e 类的q s a r 分析。 但是系统的研究物化参数与分子活性定量关系是到了2 0 世纪6 0 年代才真正开始 的。h a n s c h 、f u j i t a 和f r e e 、w i l s o n 分别发现了两种不同的定量途径，前者称为h a n s c h 途径，后者称为f r e e - - w i l s o n d e 途径 7 1 。 4 1 1h a n s c h 途径 h a m c h 途径的最初形式是( 1 2 ) ，即活性与疏水参数i g p 、电性参数。和立体参 数e s 相关： l g l c = a l g p + bo + c e s + + c o n s t a n t ( 1 2 ) x = l g p r _ x l g p h( 1 3 ) 后来h a n s c h 和f 匈妇考虑用两种不同的物化参数以线性加和的方式来定义亲脂性 参数丌，得到一个活性与亲脂性相关的抛物线方程( 1 3 ) ，其中l g p h 为化合物被取 代基x 取代后的油水分配系数，1 9 p h 为原化合物的油水分配系数。 h a n s c h 方程是第一个系统研究活性与物化性质相关的定量关系模型，并且在研究 中运用了新兴的计算机技术，开始了真正的计算机