（生物医学工程专业论文）载药高分子涂层及药物的细胞生物学评价.pdf

i c j西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页摘要冠状动脉粥样硬化性心脏病是心血管疾病死亡的重要原因之一，血管支架植入治疗已经成为一个标准的血管成形术方法，但是血管支架植入后因组织增生和血栓形成引起的再狭窄成为血管支架在临床应用中所面临的主要问题。药物涂层支架的出现使再狭窄率大大降低，在临床上取得了许多突破性进展。目前，各类抑制再狭窄的药物涂层血管支架成为研究的热点，本论文制备了多种含抑制组织增生和抗凝血药物的聚合物涂层薄膜，并采用多种细胞相容性评价方法对载药涂层的抗增生行为进行了较为系统的评价。本论文选用已获得美国f d a 批准应用于临床的可降解高分子材料乙交酯一丙交酯共聚物p l g a ( l g a = 1 5 ：8 5 ) 作为各种药物涂层的高分子载体，制备了载不同种类药物( 姜黄素、雷帕霉素、肝素、姜黄素肝素、姜黄素雷帕霉素、肝素雷帕霉素) 、不同药物浓度，不同混合药物比的药物涂层，将不载药的p l g a 涂层和裸3 1 6 l 不锈钢作为对照样。通过四唑蓝比色法( m t r ) 细胞活性实验对药物浓度进行了筛选；运用检测乳酸脱氢酶( u ) h ) 实验评价了载药涂层薄膜对血管平滑肌细胞是否具有急性毒性反应；利用阿尔玛蓝( a l a m a rb l u e ) 检测方法评价了载药薄膜是否能够抑制血管平滑肌细胞和人脐内皮细胞的增殖，同时有选择的对每组样品中取样进行4 ，6 一联脒一2 - 苯基吲哚( d a p i )染色实验以直观评价薄膜样品表面平滑肌细胞数目。通过m t r 结果分别计算了各种药物的半数生长抑制浓度，其中姜黄素药物半数生长抑制浓度( i c 5 0 ) 为0 5 2 g m 1 ，雷帕霉素半数生长抑制浓度( i c i 卯) 为2 8 8 酬。一姜黄素和雷帕霉素两种药物联用后，对平滑肌细胞的抑制作用较同浓度单用时效果增强，合用指数c i = 0 8 9 ，小于1 ，发挥协同作用。l d h 结果表明，载不同浓度姜黄素、雷帕霉素、肝素的p l g a 薄膜及不同比例的姜黄素、，西南交通大学硕士研究生学位论文第1 i 页肝素、姜黄素雷帕霉素、肝素雷帕霉素混合药物的p l g a 薄膜均未表现出急性毒性反应。与参照样不锈钢相比，a l a m a rb l u e 和d a p i 染色结果表明三种浓度( 1 0 w t ，2 0 w t 和3 0 w t ) 载姜黄素的p l g a 薄膜均表现出对平滑肌细胞的显著性抑制作用；载雷帕霉素的p l g a 薄膜对平滑肌细胞同样具有抑制作用；肝素载药薄膜也表现出了对平滑肌细胞有一定的抑制作用；对于载姜黄素和雷帕霉素混合药物薄膜，当姜黄素雷帕霉素混合比为5 5 时的载药p l g a 薄膜抑制平滑肌细胞增殖的能力最强；对于载姜黄素肝素不同混合比的p “弘薄膜，当姜黄素肝素混合比为7 3 时的抑制效果较强；对于载雷帕霉素肝素不同混合比的p l g a 薄膜，当雷帕霉素肝素混合比为7 3 时的抑制效果较强。人脐静脉内皮细胞与载药p l g a 薄膜和纯p l g a 薄膜共培养3 天，对内皮细胞增生具有不同程度的抑制作用。关键词：药物涂层血管支架；生物相容性；平滑肌细胞；内皮细胞u0西南交通大学硕士研究生学位论文第n l 页a b s t r a c t。c o r o n a r ya r t e r ya t h e r o m a t o u sd i s e a s ei st h em o s ts e r i o u sc a u s eo fm o r t a l i t yo fc a r d i o v a s c u l a rd i s e a s e s t e n ti m p l a n t a t i o nb e c a m eas t a n d a r ds u r g e r yo fc o r o n a r ya n g i o p l a s t y h o w e v e r , i n - s t e n tr e s t e n o s i si n t r o d u c e db yt i s s u eh y p e r p l a s i aa n dt h r o m b o s i si st h em a j o rp r o b l e mi nc l i n i ca p p l i c a t i o n r e c e n t l y ,d r u g - l o a d e ds t e n t sa r eb e c o m i n gt h ef o c u so ft h er e s e a r c h , a n dt h er e s u l t so fr e s e a r c hw i l lb ep r o b a b l yo f f e r e dt h ep i t h i n e s sm e d i c a le v i d e n c et h a tm a k ed r u g - l o a d e ds t e n t sb e c o m ea n dg e ti n v o l v e dt h em a j o rt r e a t m e n to fc a r d i o l o g y s e v e r a lk i n d so fd r u g - l o a d e dp o l y m e rc o a t i n gf l l m sw e r e p r e p a r e di no u rr e s e a r c h ，a n db i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t yw a se v a l u a t e db ym a n yk i n d so fc e l lb i o l o g i c a le v a l u a t i o n p o l y ( 1 a c t i ca c i d - c o g l y c o f i ca c i d ) ( p l g a ) a so n ek i n do fb i o d e g r a d a b l ep o l y m e sa p p r o v e db yf d aw a sc h o s e na st h ed r u gc o a t i n gc a r r i e ri nt h i st h e s i s t h ev a r i o u sp l g as a m p l e sw e r el o a d e db yd i f f e r e n tk i n d so fd r u g s ( c u r c u m i n ，s i r o l i m u s ，h e p a r i n ，c u r c u m i n h e p a r i n ，c u r c u m i n s i r o l i m u sa n ds i r o l i m u s h e p a r i n ) d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n so fd r u g s ，a n dd i f f e r e n tr a t i o so fm i x e dd r u g s p u r ep l g am e m b r a n ea n d b a r e d3 1 6 ls t a i n l e s ss t e e lw e r ep r e p a r e da st h ec o m p a r i s o ns a m p l e s 3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a z o l 2y 02 ，5 一d i p h e n y l t e t r a z o l i u mb r o m i d e ( m t r ) a s s a yw a sp e r f o r m e dt od e c i d et h eo p t i m a lc o n c e n t r a t i o no fd r u g s l a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s e ( l d h ) m e t h o dw a su s e dt oe v a l u a t et h ea c u t et o x i cr e a c t i o no ft h ed r u g l o a d e dp l g at ot h eb l o o dv e s s e ls m o o t hm u s c l ec e l l ( v s m c ) t h ei n h i b i t i o ne f f e c to ft h ed r u g l o a d e dp l g as a m p l e so nv s m cw a se v a l u a t e db yt h ea l a m a rb l u em e t h o da n d4 ，6 一d i a m i d i n e - 2 , - p h e n y l i n d o l ed i h y d r o c h l o r i d e ( d a p i ) t h ei c s o so fd i f f e r e n td r u g sw e r ec a l c u l a t e db yt h em t rr e s u l t t h ei c 5 0o fc u r c u m i ni s0 5 2l - tg m la n dt h ei c 5 0o fs i r o l i m u si s2 8 8n g m 1 t h ei n h i b i t o r ya c t i v i t yo ft h em i x i n go fc u r c u m i na n ds i r o l i m u so nv s m c si ss t r e n g t h e nt h a nt h a to fo n l yo n ek i n do fc u r c u m i no rs i r o l i m u sw i t ht h es a m ec o n c e n t r a t i o n ，w h i c ht h ec ii sc o n c e n t r a t i o n ( 1 0 w t ，2 0 v n a n d3 0 w t ) c a ns t r i k i n gr e s t r a i nt h es m o o t hm u s c l ec e l l sp r o l i f e r a t i o np r o v e db ya l a m a rb l u ea n dd a p ir e s u l t s t h es i r o l i m u s - l o a d e dm e m b r a n ea l s os h o w st h ei n h i b i t i o ne f f e c to nt h ev s m c s t h eh e p a r i n - l o a d e dp l g as a m p l e sh a v es o m ee x t e n ti n h i b i t i n ga c i l i t yo nt h ev s m c s c o m p a r e dw i t ht h ec u r c u m i n s i r o l i m u sp l g af i l m s ，w h e nt h em i x t u r er a t i oo ft h ec u r c u m i n s i r o l i m u si s5 5 ，t h ei n h i b i t i n gc a p a c i t yt h ep l g as a m p l e sw h i c hw e r el o a d e dt w ok i n d so fd r u g si ss t r o n g e rt h a no t h e r s c o m p a r e dw i t ht h ee u r c u m i n h e p a r i np l g af i l m s , w h e nt h em i x t u r er a t i oo ft h ec u r c u m i n h e p a r i ni s7 3 ，t h ei n h i b i t i n gc a p a c i t yt h ep l g as a m p l e sw h i c hw e r el o a d e dt w ok i n d so fd r u g si ss t r o n g e rt h a no t h e r s c o n t r a s tt ot h es i r o l i m u s h e p a r i np l g af i l m s ，w h e nt h em i x t u r er a t i oo ft h es i r o l i m u s h e p a r i ni s7 3 ，t h ei n h i b i t i n gc a p a c i t yt h ep l g as a m p l e sw h i c hw e r el o a d e dt w ok i n d so fd r u g si ss t r o n g e rt h a no t h e r s h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s ( m j v e c ) w e r ec o - - c u l t u r e dw i t ht h ed r u g l o a d e dp l g as a m p l e sa n dp u r ep l g a s a m p l e ，t h er e s u l to f 3d a y ss h o w st h a ta l ls a m p l e sh a v ei n h i b i t o r ya c t i v i t yi nv a r i o u sd e g r e eo nt h ep r o l i f e r a t i o no fh u v e c k e yw o r d s ：d r u g e l u t i n gs t e n t s ，b i o l o g i c a lc o m p a t i b i l i t y , s m o o t hm u s c l ec e l l s ，h u m a nu m b i l i c a lv e i ne n d o t h e l i a lc e l l s西南交通大学硕士研究生学位论文第v 页目录第1 章绪论。：11 1 冠心病的介入治疗与血管支架术。：。11 2 支架内再狭窄j 2 1 2 1 支架内再狭窄的定义j 21 2 2 支架内再狭窄的机理21 3 血管支架表面改性41 3 1 无机材料涂层支架4 1 3 2 放射性血管支架j 4 ，1 3 3 高分子涂层血管支架：oo0 51 3 4 静脉覆盖支架51 4 药物洗脱血管支架j _ - 51 4 1 药物洗脱支架用药物及作用机理：ooooo ooo + oooo ooo o o oo0 61 4 2 载体材料91 4 3 支架1 01 5 本课题的意义。1 0第2 章药物的生物学评价。1 12 1 引言。1 12 2 实验方案：1 12 3 实验设备与方法：1 22 3 1 仪器及试剂：j 1 22 3 2 细胞1 22 3 3 培养液和药物溶液的配制1 22 5 结果讨论：2 3小结：2 5第3 章药物高分子薄膜的体外生物学评价。：2 63 1 引言2 63 2 实验方案2 63 3 实验设备与方法j 2 73 3 1 载药薄膜的制备2 73 3 2 血管平滑肌细胞( v s m c ) 培养。2 93 3 3 内皮细胞( h u v e c ) 的培养2 93 3 4 + l d h ( 乳酸脱氢酶) 实验3 13 3 54 ，6 联脒2 苯基吲哚( d a p i ) 染色实验3 33 3 6 阿尔玛蓝( a l a m a rb l u e ) 实验小3 43 4 结果与讨论i 3 5西南交通大学硕士研究生学位论文第v 豇页3 4 1 载姜黄素p l g a 薄膜的细胞相容性的研究j ：3 53 4 2 载雷帕霉素p l g a 薄膜的细胞相容性的研究3 93 4 3 载肝素的p l g a 薄膜的细胞相容性的研究4 2，3 4 4 载姜黄素雷帕霉素混合药物的p l g a 薄膜的细胞相容性研究4 43 4 5 载姜黄素肝素混合药物的p l g a 薄膜的细胞相容性的研究4 63 4 6 载雷帕霉素肝素混合药物的p l g a 薄膜的细胞相容性研究4 7，3 5 结果讨论。5 0小结：5 2结论叩。：5 3致谢5 3参考文献。5 6攻读硕士学位期间发表的论文及参加的科研项目6 2，西南交通大学硕士研究生学位论文第1 页。第1 章绪论1 1冠心病的介入治疗与血管支架术冠心病全称为“冠状动脉粥样硬化性心脏病 ，又称“缺血性心脏病。是指冠状动脉( 供应心脏自身血液的动脉) 发生严重粥样硬化使冠状血管狭窄或者闭塞，导致心肌缺血或者梗塞的一种心脏病，是目前心血管疾病导致死亡的主要病斟u 。心血管疾病每年夺走1 2 0 0 万人的生命，我国心脏病的发病率和死亡率目前位居第三，其冠心病所占比例最大，并且随着人口的老龄化程度的增加，将变得越来越突出。冠状动脉介入治疗已成为重要的治疗冠状动脉粥样硬化导致的血管狭窄的一种手段。随着介入治疗技术的成熟和治疗器械的改进，冠状动脉介入治疗的适应症不断扩大，手术成功率也不断提高，但是介入治疗并发的血管再狭窄严重影响了治疗效果以及该技术的进一步发展。早期单纯球囊成形术后的再狭窄率大约为3 0 - 5 0 ，采用冠状动脉内支架置入技术后，虽然降低了血管急性闭塞的发生率，但仍然有远期再狭窄，这一缺点严重制约了冠状动脉介入治疗的临床应用，从而也成为冠状动脉介入治疗研究的重点和热点。血管支架( s t e n t ) 是一种网状的管状的用于支撑冠状动脉的医疗器械，其提供了血管内的支撑以实现血管再构从而保持血液流通顺畅，图1 1 为西南交通大学生物材料与表面工程研究所研制的不锈钢支架。血管支架的结构对支架的力学和生物学性能有着很重要的影响。血管支架置入术由于有效地制止了血管弹性回缩和负性重塑，使再狭窄率明显降低。但由于动脉壁损伤，血栓形成及炎性反应，刺激各种生长因子和细胞因子产生，通过血管平滑肌细胞受体使平滑肌细胞分裂，导致平滑肌细胞增殖，使新生内膜过度增殖，导致再狭窄，支架置入术后再狭窄发生率仍达2 0 3 0 左右【2 】。西南交通大学硕士研究生学位论文第2 页图1 - 1 冠状动脉支架1 2 支架内再狭窄1 2 1 支架内再狭窄( i s r ) 的定义血管支架的植入使狭窄的病变血管扩张从而使血管管腔尺寸扩大，支架的再狭窄可以定义为血管经支架扩张后管腔尺寸的变d d 3 。m e h r a n 等 4 1 将i s r 定义为量化冠状动脉造影测量的支架植入( 至少4 个月前) 血管段超出5 0 的直径狭窄。依据再狭窄的长度和支架长度的关系，可将其分为4 类：( 1 ) 局灶性：i s r 小于或等于1 0 m m ，局限于支架内；( 2 ) 弥漫性：i s r 大于1 0 m m ，局限于支架内；( 3 ) 增殖性：i s r 大于1 0 m m ，扩展到支架外；( 4 ) 闭塞性：支架内完全闭塞，按心肌梗死溶栓治疗，临床实验血流评定为0 级。1 2 2 血管支架内再狭窄的机理血管成形术后再狭窄的机制已进行了广泛研究，但直到最近，新生内膜增殖才被认为是再狭窄的主要机匍 t 5 1 。内皮剥脱，气压伤和血管过度扩张是球囊血管成形术和( 或) 支架植人术后的原发损伤，引发了损伤后的治愈反应，而导致了再狭窄的形成。再狭窄经历了血栓形成、炎症、增殖与基质沉积和血管重西南交通大学硕士研究生学位论文第3 页构四个阶段【6 l 。首先，支架植入使血管内皮细胞的完整性受到破坏，导致内皮下基质暴露于血液中，后者引发血小板的凝聚、粘附继而形成富含血小板的血栓。支架植人后3 日内可见到局部纤维蛋白的沉积和血栓形成并与血管壁的损伤深度和范围成正比。血管损伤后，炎症反应随之发生，刺激各种生长因子和细胞因子产生，这些细胞释放生长因子和细胞因子诱导平滑肌细胞的迁移和增殖，并转化平滑肌细胞分泌细胞外基质导致了新生内膜的形成川。血管重构可以认为是血管管腔尺寸的相对变化。血管重构包括负面重构( n e g a t i v e c o n s t r i c t i v er e m o d e l i n g ) 和正面重构( p o s i t i v e e x p a n s i v er e m o d e l i n g )两个方面，支架内再狭窄是由负面重构引起的。负面重构有可能是由细胞外基质的性能变化所引起，支架植入导致细胞外基质合成与降解的变化，导致了更多的胶原合成以及减少了金属蛋白酶原( m e t a l l o p r o t e i n a s e ) 的活性。图1 2 为支架内再狭窄的机理示意 i 8 1 。s m c ：s m o o t hm u s c l ec e l l ，平滑肌细胞图1 - 2 血管支架再狭窄的机理图示金属支架的表面电位比较高，可能导致吸附荷负电的生物物质，如血小板以及纤维蛋白原分子j 引起血栓的形成。研究表明，血栓的最初形成是由于血浆蛋白的电荷向金属转移引起的【9 1 ，因此从血栓形成的观点看来，理想的无机涂层的表面应该具有半导体的性质以便补偿电荷的转移。常见的无机涂层有类金刚石薄膜( d l c ) ，钽支架以及骶o 薄膜涂层的血管支架。但是无机涂层存在比较脆的特点，在支架撑开时比较容易从支架脱落形成局部腐蚀点，因此仅仅用于比较薄的涂层。1 3 2 放射性血管支架过去1 0 年的研究表明，放射治疗可以有效地破坏细胞周期上调蛋白，从而减慢或者终止细胞增生，减少再狭窄的发生，美国f i ) a 已经批准了r 射线和p 射线放射支架的临床应用。已有多个中心开始进行3 2 p 不锈钢支架临床试验，从目前的临床结果来看，3 2 p 放射性支架能明显降低支架内血管再狭窄，但在支架边缘仍有再狭窄的发生【1 0 l 。放射支架容易产生支架边缘再狭窄使增生反弹形成动脉瘤，因此对放射性支架的应用一直持比较谨慎的态度。而且由于制备和使用含有放射性物质血管支架必须实行对放射线的防护，使操作手续十分复杂，同时由于还存在必须防止含有放射性物质的排泄物对环境造成污染的问题，因此血栓的形成以及组织增生，高分子涂层比较柔软也可以尽量减少对血管壁的损伤。但v a n d e r 等人的研究表明在金属支架上涂覆聚乳酸的猪动脉内实验表明引起了大量的内膜增生【1 1 】。1 3 4 静脉覆盖支架利用自体静脉覆盖支架，可以减少支架血栓的形成和局部组织反应。a t h e n s等【1 2 】的研究结果表明，利用这种方法制作的支架植入血管内，8 9 的人在两年内没有发生再狭窄；t o u t o u z a sk 等人【1 3 】的研究结果也显示，这种方法制作的支架植入猪动脉管内可以有效减少新生内膜的形成。1 4 药物洗脱血管支架药物洗脱血管支架( d r u ge l u t i n gs t e n t ，d e s ) ，又称为药物释放血管支架，是通过包被于金属血管支架表面的高分子材料携带药物，在支架置入血管内部病变部位后，药物自高分子涂层中通过洗脱方式有控制的释放至心血管壁组织而发挥生物效应【1 4 1 。近年来，以强生公司的c y p h e r 支架和b o s t o ns c i e n t i f i c 公司的t a x u s 支架为代表的药物洗脱冠状动脉支架的临床应用被誉为冠心病介入治疗领域中的第三个里程碑【1 5 】，使支架内再狭窄率下降至1 0 以下，成为介入冠心病学发展最快的领域之一。，药物洗脱支架既可防止支架置入后早期血管壁弹性回缩和远期负性重构所西南交通大学硕士研究生学位论文第6 页致再狭窄，又有降低术后平滑肌细胞增殖，新生内膜过度增生而导致的再狭窄。药物洗脱支架需要支架、载体高分子材料以及药物三者的有效结合【1 6 1 。理想的血管支架应该在圆周上具有均匀分布的强度以及足够的刚性；足够的灵活性以便支架可以到达冠状动脉内的任何位置；具有良好的可视性以及在保证最小损伤下的支架的撑开能力；能够有效减少急性血栓形成和发炎反应；载体高分子材料应具有良好的生物相容性，对承载药物释放的可控制性并对药物性能无影响、不会改变支架的操纵性能等。涂层药物需有明确的作用机制、药动学和药代学等。目前用于支架的药物主要包括( 1 ) 抗凝血药物，如肝素、水蛭素以及g p i i b i l i a 受体拮抗剂等；均e l dc h r i s t e n s e n 等人【1 7 】详细研究了肝素涂覆支架对支架表面血小板、凝血性质以及补体系统的影响，表明肝素涂覆的血管支架的抗凝血能力大大提高。但是肝素涂层支架对预防平滑肌细胞增殖的收效不大。( 2 ) 抗增生药物，主要有雷帕霉素和紫杉醇等。c y p h e r 支架和t a x u s 支架分别选用了雷帕霉素和紫杉醇作为洗脱药物，是目前临床应用最广泛的两类商用支架。( 3 ) 抗炎药物和促进内皮生长药物，如地塞米松和血管内皮细胞生长因子( v e g f ) 。随着对洗脱支架药物研究的不断深入，一些中药提纯物逐渐引起人们的关注。这些中药提纯物，不但有抗炎和抗氧化作用，而且还具有抗组织增生和抗凝血性能，将这些药物应用于血管支架药物涂层有望取得良好的临床效果。1 4 1 药物洗脱支架用药物及作用机理7( 1 ) 雷帕霉素( s i r o l i m u s )雷帕霉素是3 1 元环组成的三烯大环内酯类化合物( 图1 4 ) ，含有特殊的a 、1 3 - - 酮乙哌啶酸酰胺分子掩盖的半缩酮，分子式为c 5 1 h 7 9 n 0 1 3 ，分子质量为9 9 1 u ，为白色的固体结晶，熔点为1 8 3 , - - - 1 8 5 。c ，亲脂性，微溶于水，几乎不溶于乙醚，西南交通大学硕士研究生学位论文第7 页但溶于甲醇j 乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂【l 9 】。它在血浆中，低p h 、3 7 c 时，降解特别快，其在血浆中的半衰期为l 5 h 。雷帕霉素通过抑制周期蛋白( c y c l i n )及周期蛋白依赖性激酶( c d k ) 调节细胞周期，最终诱导细胞分裂停滞于增殖周期g 1 期f 捌。通过阻止细胞周期g 1 5 的转化，抑制生长因子，选择性地抑制平滑肌细胞的增生和迁移作用，并有效的预防血管损伤后内膜过度增生，防治支架置入后再狭窄【2 l 】。体外实验【捌显示雷帕霉素能抑制大白鼠及人的平滑肌细胞生长，降低血管损伤模型的血管内膜厚度。全身给药也可明显减轻猪冠状动脉成形术后的内膜增殖。一图1 - 3 雷帕霉素的结构( 2 ) 姜黄素( c u r c u m i n )姜黄素( c u r c u m i n 是从姜科属植物姜黄根茎中提取的一种酚性色素【2 3 1 ，其结构式如图1 3 所示俐。由于其色泽稳定且毒性很低，目前己广泛应用于食品添加剂和染料中。在姜黄素的药用价值方面，众多的动物实验表明，它还具有广泛的药理作用，如抗炎、抗肿瘤、抗氧化、抗病毒等药理作用【2 5 1 。早在1 9 7 8年，薛春生等【2 6 1 就报道姜黄素可显著降低高血脂症大鼠的血浆总胆固醇、b 一脂蛋白、甘油三酯的含量，对血小板聚集功能也有明显的抑制作用。石晶等【2 7 】的( 3 ) 肝素( h e p a r i n )。肝素始发现于1 9 1 6 年，它是由超过1 2 0 种不同相对分子量组分组成的混合物，为硫酸化糖胺聚糖【2 8 1 。作为高度硫酸化的蛋白多糖，肝素基本结构是带有磺酸基团和乙酰化基团的四糖体，结构中含有糖醛酸残基和葡萄糖胺残基，肝素结构式如图1 5 所示【2 9 】。肝素作为一种天然的抗凝血物质，在体内和体外均能延长凝血时问，对凝血过程的许多环节都有影响。现认为肝素主要通过激活抗凝血酶( 舢) 而发挥抗凝血作用。a t m 是凝血酶和凝血因子x l l a 、x i a 、 x a 、xa 等丝氨酸蛋白酶的抑制剂，肝素与灯结合后，可加速a t m 与凝血酶的结合，抑制凝血酶的活性，起到抗凝血作用。近年研究证实，肝素除了公认的抗凝血、抗血栓作用，还具有抗炎、免疫调节、调节多肽生长因子、抑制细胞增殖、抗肿瘤转移等多种生物学活性和药理作用f 3 0 1 。大多数的药物要通过高分子材料作为载体涂覆在支架表面，高分子涂层作为药物的载体决定了药物释放行为，通过改变高分子材料的种类以及性质可以控制药物释放的行为。由于现在临床采用的药物洗脱支架多采用不可降解的高分子材料( c y p h e r 支架采用的载体是乙烯一醋酸乙烯共聚物p e 、厂a 和聚甲基丙烯酸丁酯p b m a6 7 3 3 比例的混合物，t a x u s 支架采用的是苯乙烯一异丁烯一苯乙烯共聚物) ，而这类材料在体内的长期植入不可避免的会发生老化和涂层剥落，而这种老化过程是非人为控制的，随着植入时间的增加，给受术者带来潜在的危险，因此将医用可控降解的聚合物作为药物涂层的载体材料，正在成为一个新的发展方向( 2 0 0 5 年巴黎心血管再造国际会议报告，该会议还指出，应当进一步发展可降解药物载体的血管支架) 。可降解生物医用高分子材料除了能很好的控制药物释放速率外，也可以控制降解速率，其力学性能的丧失是可预测的，且最终降解产物对人体无害。b i o s e n s o mi n t e m a t i o n d 公司开发的b i o m m r i x 冠状动脉支架，就是选择可降解高分子材料聚乳酸作为雷帕霉素药物的载体涂层材料。本课题选择了三类具有抗增生或抗凝血药效的药物雷帕霉素、姜黄素和肝素作为洗脱支架用药物研究对象，通过四唑蓝比色法( m r t ) 分别测定了大鼠血管平滑肌细胞对不同浓度的三种单一药物以及雷帕霉素姜黄素、姜黄素肝素、雷帕霉素肝素三种混合药物的敏感性，为确定药物涂层的载药量提供了实验依据；在此基础上，选用美国f d a 批准临床应用的可降解高分子材料乙交酯一丙交酯共聚物( p l l 弘) 作为药物涂层载体，采用l d h 方法评价了载雷帕霉素、姜黄素、肝素、雷帕霉素姜黄素以及姜黄素肝素混合药物的p l g a 薄膜对平滑肌细胞的急性毒性作用，通过a l a m a rb l u c 方法研究了载姜黄素、雷帕霉素、肝素、雷帕霉素姜黄素以及姜黄素肝素、雷帕霉素肝素混合药物的p l g a薄膜对平滑肌细胞和人脐内皮细胞增殖的影响，为后续的实际应用提供生物学依据。管支架的抗凝血能力大大提高，但是肝素涂层支架对预防平滑肌细胞增殖的效果不明显。经过药理研究表明，姜黄素作为中药姜黄的主要有效成分，具有抗组织增生【3 2 1 ，抗氧化【3 3 】，抗炎【3 4 1 以及抗凝血、降血脂【3 5 】等多种作用。本章中采用四唑蓝比色法( m 兀) ，研究了不同浓度的雷帕霉素乙醇溶液、姜黄素乙醇溶液、肝素乙醇溶液以及它们的混合药物溶液对大鼠血管平滑肌细。胞增殖的影响，为确定含药薄膜的载药量提供实验依据。2 2 实验方案m i t 实验原理：m t i 分析法以活细胞代谢物还原剂3 ( 4 ，5 二甲基2 噻唑) 2 ，5 - - - 苯基溴化四唑( 3 一( 4 ，5 - d i m e t h y l t h i a h i a z o 一2 一y 1 ) 一2 ，5 d i p h e n y l t e t r a z o l i u m b r o m i d e ，m t t )为基础。m t i 是一种能接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素c 的作用下四唑环开裂，生成蓝色的结晶( f o r m a z a n ) ，f o r m a z a n 结晶的生成量仅与活细胞数目成正比( 死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将m r r 还原) 。f o n n a z a n 结晶可在含5 0 的n ，n - - - i t i 基甲酰胺和2 0 的十二甲基磺酸钠( p h4 7 ) 的m 兀镕解液中溶解，利用酶标仪测定4 9 0n m处的光密度o d 值，以反映出活细胞数目，也可以用d m s o ( 二甲基亚枫) 来溶解【3 6 1 。m ，兀怯具有特异性强、灵敏度高、快速而准确、且重复性好等特点。注射器、9 6 孔板等。谷氨酸、氨基酸、d u l b e c c o s m o d i f i e de a g l em e d i u m ( d m e m ) 培养基粉末、胎牛血清、0 5 3 m m o l l 胰蛋白酶( 0 0 5 e d t a ) 均为g i b c o 公司产品。雷帕霉素，纯度大于9 9 ，由福建科瑞药业有限公司提供；姜黄素，纯度大于9 8 ，由上海友思生物科技有限公司提供；乙酸乙酯，分析醇，n a h c 0 3 、二甲基亚砜由成都金山试剂厂提供；2 3 2 细胞大鼠血管平滑肌细胞由浙江大学提供。、2 3 3 培养液和药物溶液的配制1 ) d m e m 培养基液的配制配置d m e m 培养基液所需的试剂及用量见表2 - 1 。用9 0 0 m l 二次蒸馏水将该表中的各种试剂溶解，可通入c 0 2 加速溶解，或用磁力搅拌器搅拌一定时间；然后用滤膜( o 2 2 1 u n ) 过滤除菌，分装( 9 0 m l 或1 8 0 m l 每瓶) ，- 2 0 。c 可保存数月，4 可保存1 2 周。，用d m e m 培养全液溶解m t t 粉末，配成浓度为0 5 m g m l 的m t t 培养液。4 ) 磷酸盐缓冲液( p b s ，p h - - 7 4 ) 的配制表2 - 2 配制磷酸盐缓冲液所需的试剂及用量试剂名用量试剂名用量k h 2 p 0 42 4 9 ln a c l8 0 9 ln a 症i p 0 4，1 4 4 9 lh c l 或n a o h 调p hk c i2 9 i ,5 ) 药物溶液的配制将姜黄素、雷帕霉素、肝素分别溶解在无水乙醇中配制成浓度分别为0 4 m g m l 、1 6 , u g m l 、1 6m g m l 的溶液。存储在- 2 0 ( 2 冰箱中备用，评价实验时根据需要在各培养基中稀释到所需浓度。2 3 4 平滑肌细胞培养大鼠平滑肌细胞的培养：平滑肌细胞为取自大鼠颈动脉血管的原代细胞，在无菌条件下操作。当细胞长成单层时，用0 5 3 m m o l l 胰蛋白酶、0 0 5 e d t a西南交通大学硕士研究生学位论文第1 4 页消化，以含1 0 胎牛血清d m e m 培养液传代。实验采用铷8 代血管平滑肌细胞( v s m c s ) 。细胞鉴定采用肌动蛋白( q - a c t i o n ) 免疫组化染色。1 )平滑肌细胞形态观察未贴壁前细胞在光学显微镜下呈长形或椭圆形，胞质密度高，不透明，胞核多为卵圆形，有多个核仁。加入培养液后2 4 h 左右细胞开始贴壁生长。贴壁生长的细胞胞质透明，彼此融合在一起，细胞呈长梭形、放射性生长，成束的细胞平行排列，部分区域细胞多层重叠，部分区域呈单层，高低起伏，呈现平滑肌细胞特征性的“峰”、“谷 状生长。图2 - 1 为细胞传代后1 - 5 天倒置光学显微镜观察下观察到细胞的生长情况。图中的细胞形状呈长形，有的呈椭圆形，第五天时已形成细胞单层，铺满的平滑肌细胞基本呈放射性生长。第一天第三天、第二天第四天，西南交通大学硕士研究生学位论文第1 5 页第五天图2 - 1 细胞传代后1 - 5 天倒置光学显微镜观察下细胞的生长情况( 2 0 0 )细胞传代细胞在培养瓶培养几天，当发现细胞长满培养瓶后，须将细胞进行消化、传代，传代步骤如下：( 1 ) 吸取1 9 m l 磷酸盐缓冲溶液( p b s ) ( 需用小滤膜过滤去除细菌等) ；( 2 ) 弃去旧培养基；( 3 ) 用5 m lp b s 荡洗培养瓶，弃去p b s ，并重复一次；( 4 ) 在剩余的9 m lp b s 中加入l m l 胰蛋白酶( t r y p s i n ) + 7 , - - 胺四乙酸( e d t a )消化液，过滤后加入培养瓶中。如果细胞贴壁不牢，只需一次加入2 m l 消化液；如果细胞贴壁牢固，第一次可入3 - 5 m l 消化液，水平晃动几秒后弃去，再加入2 m l 消化液，晃动并轻弹培养瓶底，同时在倒置显微镜下观察细胞形态，当细胞被完全消化下来时，加入1 0 m l 细胞培养液，并将细胞液移至离心管；( 5 ) 以转速1 2 0 0 r e v m i n 将细胞液离心5 m i n 。弃去上清液，晃动离心管使细胞分散( 确认细胞分散均匀) ，加入培养基1 0 m l ，用两个培养瓶分装细胞液；( 6 ) 标记后半旋开瓶盖放入孵化箱进行培养。3 ) 换液传代后，细胞生长每三天就换二次培养液弃去旧培养基，加入新鲜培养基。西南交通大学硕士研究生学位论文第1 6 页5 m l ，以补充细胞生长所需的养分。换液前，应在显微镜下观察细胞的生长状态，特别注意细胞是否被污染，如果是被污染，应弃去污染的细胞；4 ) 细胞计数细胞计数是为了了解和控制每次实验时细胞液的细胞密度。在细胞液密度大致相同的情况下培养细胞，才能更好地比较和评价不同样品表面的细胞生长特性。常用的细胞计数有血球计数板计数法和电子细胞计数仪计数法，本研究采用前一种计数法。操作方法是：取少量悬浮均匀的细胞液滴入计数板上盖玻片的一侧，然后在显微镜下，用1 0 0 倍物镜观察计数板四角大方格中的细胞数。细胞压中线时，只计左侧和上方者，不计右侧和下方者。最后将计算结果代入下式，得到细胞密度：。细胞数毫升原液= ( 4 大格细胞数之和4 ) 1 0 4 。本研究中，培养的细胞浓度控制在1 1 0 5 佃2 1 0 5 个m l 之间。2 3 5m t t 测定取对数生长期细胞，p b s 缓冲液洗涤2 次，0 5 3 m m o l l 胰蛋白酶、0 0 5 e d t a 消化，离心，吸弃上清液，用d m e m 培养液配成l x l o s m l 细胞悬液，9 6 孔培养板培养，每孔加入细胞悬液1 0 0 a 。培养2 4 h 后，分别加入相应浓度的药物，每一浓度重复6 次，共分为药物组、溶剂组、纯细胞对照组。把培养板放置3 7 ，f ( c o z ) = 5 培养箱中孵育，于7 2 h 后进行检测。吸弃上清液，加m t t 培养液0 5 m g m l ，微震荡混匀，放回73 7 ( 2 、5 c 0 2 培养箱中继续孵育2 h ，然后加二甲基亚砜2 0 0 a i 7 孔，终止反应，微震荡5 m i n ，放置于酶标仪中，在吸收波长为5 7 0 n m 的条件下测定细胞浓度( c ) 值，通过公式( 2 1 ) 计算实验组的抑制率。以浓度对数为x ，抑制百分数为y ，做线性回归线，从而求出直线方程。当y = 5 0 时求出x ，反对数求浓度即i c 5 0 的值。抑制率= ( 对照组c 值一药物组c 值) x t 照组c 值1 0 0 ( 2 1 )西南交通大学硕士研究生学位论文第1 7 页2 3 6 混合药物合用指数( c1 ) 计算【3 7 】混合药物合用指数c i = d 1 d x i + d 2 d x 2 + a d i d 2 ( d x ix d x 2 ) ，d 1 、d 2 分为联合用药达到某一效应时药物1 和药物2 的浓度，d x l 、d x 2 为单独用药达到某，一效应时药物1 和药物2 的浓度，a = l 为两种相互非排斥药物，a - - 0 为两种相互排斥药物。c i i 拮抗。2 3 7 统计学处理采用s p s s l 2 0 软件：组间比较采用单因素方差分析( f 检验和t 检验) 2 4 结果与讨论2 4 1 不同浓度姜黄素乙醇溶液对常规培养v s m c 增殖的影响表2 - 3 不同浓度姜黄素乙醇溶液对平滑肌细胞增殖的影响药物组平均抑制率溶剂组平均抑制率( 乙醇)姜黄素0 1 5 印咖l1 6 3 4 1 5 6 1 8 8 9 姜黄素0 3 1 2 g m l3 3 5 6 3 1 2 4 0 6 1 姜黄素0 6 2 5 肛g m 1 7 2 3 6 2 5 ，4 5 3 0 姜黄素1 2 5 1 比g m l 宰7 4 6 8 1 2 5 4 6 8 6 姜黄素2 5 肛g m l 幸7 9 0 2 2 5 5 0 4 9 姜黄素舡g m l 8 6 4 9 5 0 5 1 1 8 姜黄素l o 比g m l 9 8 6 8 1 0 0 5 6 8 4 宰为与溶剂组相比p o 0 5表2 3 表示不同浓度姜黄素乙醇溶液对平滑肌细胞增殖的影响经统计，当不同浓度的姜黄素乙醇溶液与平滑肌细胞共培养3 d 后，对平滑肌细胞具有不同的抑制作用。当浓度在1 0 m g m l 时，对平滑肌细胞的抑制率的达到9 8 6 8 。在浓度0 6 2 5 t g m l l o 肛g m l 范围内，与溶剂组相比，具有显著性差异，排除了、- 1 0也5n o0 51 0i o g ( c o n c e n t r a u o n ( u g m 1 ) )图2 - 2 不同浓度姜黄素对数与其相应的抑制率进行直线回归2 4 2 不同浓度雷帕霉素乙醇溶液对常规培养v s m c 增殖的影响表2 - 4 不同浓度雷帕霉素乙醇溶液对平滑肌细胞增殖的影响药物组平均抑制率溶剂组平均抑制率( 乙醇)雷帕霉素0 6 2 5 n g n d2 3 1 5 6 1 8 8 9 雷帕霉素1 2 5 n g n d3 4 3 1 2 4 0 6 1 雷帕霉素2 5 n g m l3 9 6 2 5 4 5 3 0 雷帕霉素5 n g 血事5 9 1 2 5 4 6 8 6 雷帕霉素z o n g m l 串6 9 2 5 5 0 4 9 雷帕霉素2 0 n g m l 事8 4 5 0 5 1 1 8 雷帕霉素4 0 n g n ：l l 9 2 1 0 0 5 6 8 4 堆为与溶剂组相比p o 0 5，得姜黄呈剂西南交通大学硕士研究生学位论文第1 9 页7如表2 4 所示，经统计，当不同浓度的雷帕霉素乙醇溶液与平滑肌细胞共培养