（生物化学与分子生物学专业论文）人微小rna转录组分析及细胞定位研究.pdf

廖建友 中山大学博士学位论文 论文题目： 专业： 博士生： 指导教师： 人微小r n a 转录组分析及细胞定位研究 生物化学与分子生物学 廖建友 屈良鹄 摘要 近年来，许多研究发现长度在3 5 n t 以下的微小r n a 在几乎所有已知类型物种 的生命活动中都扮演着重要的调控角色。这些微小r n a 包括m i c r o r n a ( m i r n a ) ， p i r n a ，内源s i r n a 等等，它们以多种方式来调控基因表达，如通过与蛋白编码基 因的m r n a 结合来抑制蛋白翻译，剪切m r n a ，甚至是表观遗传方式调控，从而 影响生物体的生长，发育，分化，代谢，生殖等等许多重要的生命过程。在这些微 小r n a 中被研究的最深入的是m i r n a 。 m i r n a 是一类约2 2 n t 长的微小r n a ，它广泛存在于从线虫到人的所有多细胞 真核生物中。在动物细胞中，一般认为m i r n a 主要通过与靶m r n a3 u t r 区的不 完全互补配对来调控基因表达。尽管如此，还是有许多研究显示一些m i r n a 可以 进入到细胞核并在其中调控基因表达。为了研究有多少m i r n a 能进入细胞核中， 本研究通过对人5 8 f 鼻咽癌细胞系的细胞核1 8 - 3 0 n t 长的r n a 进行s o l e x a 大规模 测序来研究人细胞核微小r n a 转录组。为了比较人细胞核微小r n a 转录组和细胞 质微小r n a 转录组的不同，本研究同时还用s o l e x a 大规模测序对5 8 f 细胞系的细 胞质1 8 3 0 n t 长的r n a 进行测序。本研究的这个工作是国际上首次对人细胞核和 细胞质微小r n a 转录组进行系统地研究。由于通过比较各种微小r n a 在细胞核和 细胞质微小r n a 文库中丰度的高低可以获得它们的亚细胞定位信息，本研究还首 次给出了人细胞中各种微小r n a 的亚细胞分布概况。对细胞中各种微小r n a 的亚 细胞定位分析揭示细胞中各种微小r n a 具有一个复杂的亚细胞分布。 对人5 8 f 细胞核和细胞质微小r n a 转录组的分析发现细胞质中的大部分 m i r n a 都存在于细胞核中，这说明人细胞中的大部分m i r n a 在细胞质中加工成熟 后都会回到细胞核中。为了验证这个现象，本研究又分离了人2 9 3 t 细胞系的细胞 核和细胞质1 4 3 0 n tr n a ，然后用m i r n a 芯片检测2 7 2 种m i r n a 在细胞核和细胞 质1 4 3 0 n tr n a 中的丰度。检测结果显示人2 9 3 t 细胞中的大部分m i r n a 也都会 廖建友中山大学博十学位论文2 0 1 0 进入细胞核中。对各种m i r n a 在细胞核和细胞质中的表达水平分析发现不同 m i r n a 在5 8 f 细胞的细胞核中的富集程度不同。以前的研究发现m i r 2 9 b 的3 末 端六核苷酸“a g u g u u 是一个入核信号，能介导m i r 2 9 b 在细胞核中的富集。与 此发现相一致的是，本研究也发现m i r - 2 9 b 在细胞核内富集，本研究同时还发现有 一些m i r n a 有着和m i r 2 9 b 相似的核富集程度。尽管如此，这些核富集m i r n a 间 并没有一个保守的3 末端序列。为了寻找更多的入核信号，本研究进一步分析了所 有m i r n a 3 末端序列和m i r n a 富集程度间的联系，分析结果显示它们之间没有明 显联系，这说明m i r n a 间并没有一个保守的入核信号能介导它们在细胞核中的富 集。 对人5 8 f 细胞核和细胞质微小r n a 转录组的分析还发现大量的t r n a3 尾巴 被从细胞核运到了细胞质并在细胞质中积累。此外，本研究在正常人类细胞中和其 它物种的细胞中也发现各种t r n a 3 尾巴的积累，这说明t r n a 3 尾巴在细胞中的积 累是一个保守的现象。t r n a3 尾巴是t r n a 在加工成熟过程中产生的一个加工副产 物，它在产生后一度被认为会在细胞核中被降解掉。本研究的发现说明t r n a3 尾 巴可能不是一种无功能的加工副产物，而是一种功能性微小r n a 。 本研究还利用细胞核和细胞质小r n a 的大规模测序数据来预测新的m i r n a 基 因，最终本研究预测出了2 6 个可信度较高的m i r n a 基因，其中包括一个保守的 m i r n a 和一个m i r t r o n 。 本研究鉴定了一个由线粒体轻链复制起始位点编码的微小r n a ，该微小r n a 具有与t r n al 型三维结构中由t1 l r c 环和接收臂堆叠而成的结构域( t i a 小螺旋 结构域) 一样的结构特征，即能它形成一个茎长为1 2 个碱基对的发卡结构，具有 鉴别碱基，它的3 末端含有转录后加上的c c a 。已有许多研究表明与t r n a 小螺旋 结构域结构一样的人工合成的r n a 小螺旋( 称为t r n a 小螺旋) 在体外具有许多 t r n a 的性质，比如能被氨酰化。同样，实验证明本研究发现的这个线粒体轻链复 制起始位点编码的微小r n a 也能被氨酰化。因此，t p l s r n a 是目前为止发现的第 一个内源性t r n a 小螺旋。由于许多研究认为现代t r n a 的祖先的结构可能跟t r n a 小螺旋结构域一样，因此本研究将该微小r n a 命名为类似t r n a 祖先的微小r n a ( t r n ap r o g e n i t o r - l i k es m a l lr n a t p l s r n a ) 。 关键词：微小r n a ，细胞核，m i c r o r n a ，t r n a 3 尾巴，t p l s r n a i i 廖建友中山大学博上学位论文 2 0 l o t i t l e ： m a j o r ： a n a l y s i so ft h et r a n s c r i p t o m ea n ds u b c e l l u l a r d i s t r i b u t i o no fh u m a n t i n yr n a b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y n a m e ：ji a n y o ul i a o s u p e r v i s o r ：l i a n g h uq u a b s t r a c t r e c e n t l y , m a n ys t u d i e sh a v es h o w nt h a tt i n yr n a sw i t hl e n g t h 3 5 一n tp l a y i m p o r t a n tr e g u l a t o r yr o l e si na l m o s ta l lk n o w no r g a n i s m s t h e s et i n yr n a si n c l u d e m i c r o r n a s ( m i r n a s ) ，p i r n a s ，a n de n d o s i r n ae t c t h e yr e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o n i nm a n yw a y s ，s u c ha ss u p p r e s s i n gt h et r a n s l a t i o no fm r n a st h r o u g hc o m b i n a t i o nw i t h t h e m ，m r n ac l e a v a g ea n de v e ne p i g e n e t i cw a y t h r o u g ht h e s ew a y st h e yp a r t i c i p a t ei n t h er e g u l a t i o no fm a n yi m p o r t a n tb i o l o g i c a lp r o c e s s e s ，i n c l u d i n gg r o w t h ，d e v e l o p m e n t ， d i f f e r e n t i a t e ，m e t a b o l i s m a n dr e p r o d u c t i o n a m o n gt h e s et i n y r n a s ，t h em o s t d e t a i l e d s t u d yo n ei sm i r n a m i r n a sa re - 2 2 一n tt i n yr n at h a ta lew i d e l ye x p r e s s e di nt h em e t a z o a n sf r o m w o r mt oh u m a n i na n i m a l s ，t h e yw e r eg e n e r a l l yc o n s i d e r e dt or e g u l a t eg e n ee x p r e s s i o n b yb i n d i n gp a r t i a l l yc o m p l e m e n t a r yt a r g e ts i t e si nt h e3 u n t r a n s l a t e dr e g i o n s ( u t r ) o f t a r g e tm r n a si nt h ec y t o p l a s m h o w e v e r , m a n ys t u d i e sh a v es h o w n t h a ts o m em i r n a s l o c a l i z et oa n df u n c t i o ni nt h en u c l e u s t oi n v e s t i g a t eh o wm a n ym i r n a sl o c a l i z et ot h e n u c l e u s ，w es t u d i e dt h en u c l e a rt i n yr n at r a n s c r i p t o m eo fh u m a nc e l l st h r o u g h d e e p - - s e q u e n c i n go ft h en u c l e a r18 - 3 0 - n tr n a o ft h eh u m a nn a s o p h a r y n g e a lc a r c i n o m a 5 - 8 fc e l ll i n e f u r t h e r m o r e w ea l s od e e p s e q u e n c e dt h ec y t o p l a s m i c18 3 0 n tt i n y r n a so f5 - 8 fc e l ll i n e t oi n v e s t i g a t et h ei d i f f e r e n c eb e t w e e nt h en u c l e a ra n dc y t o p l a s m i c t i n yr n at r a n s c r i p t o m e s o u rw o r k ss y s t e m a t i c a l l ys t u d yt h en u c l e a ra n dc y t o p l a s m i c t i n yr n at r a n s c r i p t o m e s f o rt h ef i r s tt i m e s i n c et h r o u g ht h ec o m p a r a t i o no ft h e a b u n d a n c eo fe a c ht i n yr n ai nt h en u c l e a ra n dc y t o p l a s m i ct i n yr n al i b r a r i e sc o u l d o b t a i ni t ss u b c e l l u l a rl o c a l i z a t i o ni n f o r m a t i o n ，o u rs t u d i e sa l s o p r o v i d et h e f i r s t c o m p r e h e n s i v ev i e wo ft h es u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fd i v e r s et i n yr n a si nc e l l ，a n d i i i 廖建友中山大学博士学位论文2 0 l o r e v e a l e da nu n e x p e c t e d l yc o m p l e xs u b c e l l u l a rd i s t r i b u t i o no fd i v e r s et i n yr n a s o u ra n a l y s i so fn u c l e a ra n dc y t o p l a s m i ct i n yr n at r a n s c r i p t o m e so fh u m a n5 - 8 f c e l ll i n ef o u n dt h a tm o s tm i r n a st h a tp r e s e n t i n gi nt h ec y t o p l a s m i ct i n yr n a l i b r a r y a l s oc o u l db ef o u n di nt h en u c l e a rt i n yr n a l i b r a r y , i n d i c a t i n gt h a tm o s tm i r n a sm i g h t b ei m p o r t e di n t ot h en u c l e u sa f t e rm a t u r i n gi nt h ec y t o p l a s m t ov a l i d a t et h i s ，w ei s o l a t e d t h en u c l e a ra n dc y t o p l a s m i c14 - - 3 0 - n tt i n yr n a s ，a n dd e t e c t e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo f 2 7 2m i r n a si nt h e s et w os a m p l e s t h ed e t e c t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a tm o s tm i r n a si n t h ec y t o p l a s mo f2 9 3 tc e l ll i n ea l s oc o u l db ei m p o r t e di n t ot h en u c l e u s t h ea n a l y s i so f t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fe a c hm i r n ai nt h en u c l e a ra n dc y t o p l a s mf r a c t i o n so f5 8 fc e l l r e v e a l e dt h a td i f f e r e n tm i r n a ss h o w e dd i f f e r e n tn u c l e a re n r i c h m e n te x t e n t p r e v i o u s s t u d yf o u n dt h a tt h e3 e n dh e x a n u c l e o t i d e so fm i r - 2 9 b “a g u g u u w a san u c l e a r i m p o r te l e m e n tw h i c hc o u l dd i r e c tt h en u c l e a re n r i c h m e n to fm i r 一2 9 b c o n s i s t e n tw i t l l t h i sf i n d i n g ，o u rr e s u l ts h o w e dt h a tm i r - 2 9 bw a se n r i c h e di nt h en u c l e u s m o r e o v e r , w e a l s of o u n ds o m em i r n a se n r i c h e di nt h en u c l e u st oas i m i l a re x t e n t 晰t hm i r 2 9 b h o w e v e r , t h e s en u c l e a re n r i c h e dm i r n a sd i dn o th a v ea n yc o n s e r v e d3 e n ds e q u e n c e t of i n dm o r en u c l e a ri m p o r te l e m e n t ，w ea n a l y z e dt h ec o r r e l a t i o nb e t w e e n3 e n d s e q u e n c e so fm i r n a sa n dt h e i rn u c l e a re n r i c he x t e n t o u ra n a l y s i ss h o w e dt h a tt h e r ei s n oo b v i o u sc o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e3 e n ds e q u e n c e so fm i r n a sa n dt h e i rn u c l e a re n r i c h e x t e n t t h e r e f o r ei ta p p e a r st h a tn on u c l e a ri m p o r te l e m e n t sa r ec o n s e r v e di nt h e3 t e r m i n a ls e q u e n c e so fm i r n a s o u ra n a l y s i so fn u c l e a ra n dc y t o p l a s m i ct i n yr n a t r a n s c r i p t o m eo fh u m a n 5 8 fc e l l l i n ea l s of o u n dt h a tal a r g en u m b e ro ft r n a3 t r a i l e r sw e r ee x p o r t e df o r mt h en u c l e u st o t h ec y t o p l a s m w ea l s oo b s e r v e dt h a tv a r i o u st r n a3 t r a i l e r sa l s oa c c u m u l a t e di nt h e n o r m a lh u m a nc e l l sa n dc e l l so fo t h e rv e r t e b r a t e s ，s u g g e s t i n gt h a tt h ea c c u m u l a t i o no f t r n a3 t r a i l e r si nc e l l so fv e r t e b r a t e sw a sac o n s e r v e dp h e n o m e n o n t r n a3 t r a i l e r sa r e m a t u r a t i o nb y p r o d u c to ft r n a sw h i c ha r ec o n s i d e r e dt ob ed e g r a d e di nt h en u c l e u s s o o na f t e rp r o d u c i n g o u rf i n d i n g si n d i c a t et h a tt r n a3 t r a i l e r sm a yb eak i n do f f u n c t i o n a lt i n yr n ai n s t e a do fn o n - f u n c t i o n a lm a t u r a t i o nb y p r o d u c t f u r t h e r m o r e ，w eu s e dn u c l e a ra n dc y t o p l a s m i cs r n ad e e p s e q u e n c i n gd a t at o p r e d i c tn o v e lh u m a nm i r n ag e n e s f i n a l l y , w eo b t a i n e d2 6n o v e l sm i r n ag e n e sw i t h h i g hc o n f i d e n c e ，i n c l u d i n gac o n v e r s e dm i r n aa n dam i r t r o n w ea l s oi d e n t i f i e dan o v e lt i n yr n aw h i c he n c o d e db yt h em i t o c h o n d r i a ll s t r a n d r e p l i c a t i o no r i g i nr e g i o n ( o r il ) w ef o u n dt h a tt h i st i n yr n a h a dt h es i m i l a rs e c o n d a r y i v 廖建友 中山大学博士学位论文2 0 1 0 s t r u c t u r ew i t ht h et r n am i n i h e l i xd o m a i no ft h r e ed i m e n s i o ns t r u c t u r eo ft r n aw h i c h w a sf o r m e db yc o a x i a ls t a c k i n go ft h et1 l ，cs t e mo n t ot h ea c c e p t o rh e l i x ，i e ，i tc o u l d f o r mah a i r p i ns t r u c t u r ew i t h12b pl o n gs t e m ，h a dad i s c r i m i n a t o rb a s e ，a n dc o n t a i n e da p o s t t r a n s c r i p t i o n a la d d e dc c a a ti t s3 e n d m a n ys t u d i e sh a ds h o w nt h a ta r t i f i c i a l s y n t h e s i sr n am i n i h e l i c e sw i t ht h es i m i l a rs t r u c t u r ew i t ht r n am i n i h e l i xd o m a i no f t r n ah a dm a n yt r n ac h a r a c t e r si nv i t r o ，s u c ha st h e yc o u l db ea m i n o a c y l a t e di nv i t r o t h e s er n am i n i h e l i c e sw e r ec a l l e dt r n am i n i h e l i c e s w ef o u n dt h a tt h i sm i t o c h o n d r i a l o r ilr e g i o ne n c o d e dn o v e lt i n yr n aa l s oc o u l db ea m i n o a c y l a t e di nv i t r o t h e r e f o r e t p l - s r n aw a st h ef i r s te n d o g e n o u st r n am i n i h e l i x s i n c em a n ys t u d i e sc o n s i d e r e dt h a t t r n a p r o g e n i t o rm i g h th a dt h es i m i l a rs t r u c t u r ew i t ht r n am i n i h e l i xd o m a i no ft r n a ， w en a m e dt h i sn o v e lt i n yr n at r n ap r o g e n i t o r - l i k es m a l lr n a ( t p l - s r n a ) k e yw o r d s ：t i n yr n a ，n u c l e u s ，m i c r o r n a ，t r n a3 t r a i l e r , t p l - s r n a v 中山大学博士学位论文2 0 1 0 论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人 或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：瓠数 日期：2 0 10 年6 月8 日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其 他方法保存学位论文。保密的学位论文在解密后使用本规定。 学位论文作者签名： 瓠皇支 导师签 日期：2 0 10 年6 月8 日日期：20 10 年6 月8 日 廖建友 中山大学博上学位论文 第一章前言 1 1m i e r o r n a ( m i r n a ) 的研究概况 1 1 1m i r n a 简介 m i r n a 是一类约2 2 n t 长的微小r n a ，它广泛存在于从线虫到人的所有多细胞 真核生物中。m i r n a 在细胞中主要通过引导r n a 介导的沉默复合物( r n a i n d u c e d s i l e n c i n gc o m p l e x 。r i s c ) 结合到与之完全( 植物) 或者不完全( 动物) 匹配的m r n a 上来调控基因的表达【l 】。关于m i r n a 的研究最早可以追溯到1 9 9 3 年。a m b r o s 和 他的同事发现一个能调控线虫时序发育的叫l i n 4 的基因不编码蛋白质，而是只产生 两个小r n a 。一个约为2 2 n t 长，另一个约为6 i n t 长。6 i n t 长的r n a 可以折叠成 一个发卡结构，被认为是2 2 n t 长r n a 的前体。他们进一步发现了l i n 4 可以通过与 l i n 1 43 u t r 区以不完全互补配对的方式来在转录后水平上抑制l i n 1 4 的翻译【2 ，3 】。 由于在线虫以外的其它物种中都没有类似1 i n 4 的基因存在，人们在很长一段时间里 都没有发现除了l i n 4 以外的其它m i r n a 。直到2 0 0 0 年r e i n h a r t 和s l a c k 在线虫中 发现了叫l e t 7 的第二个约2 2 n t 长的微小r n a 的时候这个局面才被打破h 5 】。与l i n 4 不同的是，l e t 7 是一个高度保守的基因，它在从线虫到人的许多物种基因组中都存 在【6 1 。由于l i n 4 基因和l e t 7 基因在很多方面都具有高度的相似性，这让人们感到 可能会有更多的这类分子的存在。确实，在年以后，有三个研究小组在人，线虫 和果蝇中共克隆到了超过1 0 0 个的与l i n 4 和l e t 7 类似的微小r n a 基因 7 - 9 1 。从那 以后，这些起调控作用微小r n a 就进入了人们的视野中并被进行广泛而深入的研 究。 1 1 2m i r n a 的鉴定 对m i r n a 的研究首先是从m i r n a 的鉴定开始的，最早的m i r n a 鉴定工作采 用的是正向遗传学方法，用这种方法鉴定到的m i r n a 除了前面所说的l i n - 4 和l e t 7 外，还包括线虫的l s y 6 【10 1 ，果蝇的两个m i r n a _ a n 诅m 【1 1 】和m i r 1 4 1 2 1 。由于正 向遗传学方法的操作非常复杂，并且不是所有m i r n a 都具有明显的表型，这种方 法应用的并不是很广泛。 廖建友 中山大学博士学位论文 由于m i r n a 是一种r n a s ei i i 的加工产物，它的5 末端含有磷酸，3 末端含有 羟基。根据这个特点，研究人员设计了一种批量克隆m i r n a 的方法，这种方法的 具体过程是首先在m i r n a 的5 末端和3 末端分别加上一段r n a 接头，然后根据 两段接头序列设计引物来做逆转录p c r ，最后将p c r 产物克隆进载体并进行测序。 m i r n a 克隆技术是使用最广泛和最有效的方法之一，m i r n a 研究早期的大部分 m i r n a 都是通过这种方法鉴定的，这种方法经久不衰直到最近还有人在使用【l3 1 。 表1 1 列了部分使用克隆技术来鉴定m i r n a 的文章。由于m i r n a 克隆时所测序列 较少，该技术所鉴定到的m i r n a 总数一般都较少并且只能鉴定那些丰度较高的 m i r n a ，因此使用该技术来鉴定新的m i r n a 还具有很大的局限性。 表1 - 1 m i r n a 的鉴定方法 t a b l e1 - 1 a p p r o a c h e st om i r n a d i s c o v e r y 目前，鉴定m i r n a 最常用的技术是大规模测序技术( 表1 1 ) 。大规模测序技 术也称为第二代测序技术，特点是能在短时间能测定大量序列，目前已经有许多公 司都开发了第二代测序技术并且推出自己的第二代测序系统，常用的测序系统主要 2 廖建友中山人学博上学位论文2 0 l o 包括r o c h e 的4 5 4 ，i l l u m i n a 的s o l e x a ，a b i 的s o l i d 等。目前，在微小r n a 研究 领域最常用的第二代测序系统是s o l e x a 测序系统，因为该测序系统推出较早，并且 测序成本相对其它系统要来的低，测序长度适中，并且一次测序反应数据量【3 7 】。由 于大规模测序所产生的数据量非常大( 一次测序能产生几百甚至上千万条序列，相 比之下常规克隆技术经常一次只测几百条) ，该技术灵敏度非常高，适合用于鉴定 低丰度的m i r n a 。以前的常规克隆技术由于测序量低，它对样本中的m i r n a 检测 率很低，同一个样本经常经过好几次克隆后还能鉴定出新的m i r n a ，而大规模测 序技术通常经过一次测序就能覆盖样本中的大部分m i r n a 。此外，从大规模测序 数据中还可以得到所检测m i r n a 的丰度信息，因此大规模测序不仅可以用来鉴定 新的m i r n a ，还可以用来研究和比较样本间的m i r n a 表达谱【2 7 】，从而为m i r n a 的功能研究提供帮助。 大规模测序技术虽然通过一次测序就可以鉴定到一个样本中的大部分m i r n a ， 但研究发现许多m i r n a 的表达具有组织特异性或者发育时期特异性，对于这些 m i r n a 由于取材上的困难，我们通常很难用实验方法鉴定到它们。为了克服实验 鉴定m i r n a 的这个缺点，研究人员又根据m i r n a 前体序列的二级结构及保守性等 特征开发出了许多m i r n a 预测程序来在全基因组水平上来寻找新的m i r n a 。表1 2 列举了部分m i r n a 预测程序。早期的m i r n a 预测程序一般是通过分析序列的保守 性，结构特征，二级结构热力学稳定性来预测新的m i r n a 3 8 , 3 9 】。到后来出现了基于 支持向量机的从头预测方法m 屯】。最新的新m i r n a 预测程序在以前预测新m i k n a 算法的基础上又加入了大规模测序数据，使得预测的准确性和灵敏度都得到大幅度 的提高【4 3 , 4 4 】。 1 1 3 动物m i r n a 的生物合成 动物m i r n a 基因一般由r n a 聚合酶i i 转录，转录生成一个原初m i r n a ( p r i m a r y m i r n a ，p r i m i r n a ) 4 5 j 。生成的p r i m i r n a 经过d r o s h a 和d g c r 8 ( d i g e o r g e s y n d r o m ec r i t i c a lr e g i o ng e n e8 ) 加工后生成m i r n a 前体( p r e c u r s o rm i r n a ， p r e m i r n a ) 【4 5 4 6 。随后p r e m i r n a 在r a n g t p 和e x p o r t i n5 蛋白的帮助下进入细 胞质中【4 7 , 4 8 】。m i r n a 进入细胞质中后被d i c e r 进一步剪切加工成一个约2 2 n t 长的 r n a 双链，该r n a 双链经过解旋后双链中的一条链被整合进r i s c 中，另外一条 链发生降解【4 9 j 。m i r n a 通过与靶m r n a 的3 u t r 区的不完全互补配对来引导沉默 复合体结合到靶m r n a 上，最终使靶m r n a 翻译抑制或者通过使靶m r n a 脱帽或 脱腺苷酸化来使促进其降解【5 0 , 5 1 】。有证据显示被m i r n a 沉默的m r n a 被运送到了 廖建友中山大学博士学位论文2 0 1 0 m i r s c a n m i r a l i g n m i i 讧i n d e r p r o m i r p r o m i ri i r n a m i c r o m i c r o p r e d m i r d e e p 秀丽隐杆线虫，脊椎动物 现支持动、植物 脊椎动物，果蝇 人和其他脊椎动物 哺乳动物，尾索动物，线 虫 人类 所有动物 网络服务 网络服务 w i n d o w s ，l i n u s 网络服务 l i n u x ，网络服务 l i n u x ，网络服务 i i n u x 3 8 】 5 3 1 【5 4 】 【4 1 】 【5 5 】【5 6 】 4 0 】 【4 2 】 【4 3 】 在果蝇，线虫和哺乳动物中，有一小部分p r e m i r n a 不是通过d r o s h a 途径加 工来的，而是通过m r n a 前体剪接途径生成【5 7 棚】。这些m i r n a 的前体为m r n a 的内含子，它们从m r n a 前体上剪切下来之后就被运输到细胞质中加工成成熟的 m i r n a 。这类以m r n a 内含子为前体的m i r n a 统称为m i r t r o n 。 1 1 4m i r n a 的表达调控 最近的许多研究显示m i r n a 的表达和功能发挥都会受到广泛的调控。细胞对 m i r n a 的调控主要发生在转录，加工和亚细胞定位三个水平上。对m i r n a 的调控 最初发生在转录水平上，一些转录因子会在个体发育或者在细胞对特定环境做出反 应时调控m i r n a 的表达。例如一些免疫细胞中的m i r n a ，比如m i r 1 5 5 、m i r 1 4 6 a ， 会在炎症刺激的情况下上调1 6 0 , 6 1j 。参与m i r n a 加工调控的蛋白因子包括：1 、s m a d 蛋白，研究显示它能通过一个配体依赖( 1 i g a n d d e p e n d e n t ) 的方式来调控m i r 2 1 的力h i 6 2 】。2 、a r s 2 蛋白，它能够促进p r i m i r n a 转录物的加- t - t 6 3 1 。3 、a d a r 蛋 白，它能通过双链m i r n a 茎序列的突变来调控p r i m i r n a 的n i t 矧。4 、肿瘤抑制 因子p 5 3 ，研究证明它在d n a 损伤后与d r o s h a 结合然后促进p r i m i r n a 加工成 4 摩诖应中d j 学博i ：学也论史 t r a n s c r i p t i o n 0 f 丽i 面广一 ：l f j 鼍j ，i ? l i 、l ；| 。 刚。枞芏 l p r o c e 蜘g p r e m i r n a o 一 i 一一一叫一 触。! l m a t u r em i r n a 、 ， 、 二聂n i l o tp r o t e m t a r g e e x p r e s sr o n tl i - - ，：- - - - - r - o m r n a s u b c e l l u l a r i o c a l i z a t i o n 、 d r o s h a d g c r 8 l | n 2 8 k s r p a r s 2 s m a d s i ：) 5 3 a o a r p r i m i r n a t r a n s c r l p t e x p o r t i n5 n u c l e u s c ) c 二二 ( = c y t o p l a s m d i c e r t u t 4 ( 1 e t 7 ) r i s c i m d o r t m8 s t r e s s g r a n u l e o rp - b o d y 廖建友 中山火学博士学位论文 图1 - 1 m i r n a 的生物合成和功能。m i r n a 基冈首先由r n a 聚合酶i i 在细胞核中转录成原初 m i r n a ，然后原初m i r n a 被r n a s ei i id r o s h a 加工成m i r n a 前体。生成的m i r n a 前体在 r a n g t p 和e x p o r t i n 5 的帮助下被运进细胞质中。在细胞质中，m i r n a 前体被r n a s ei i id i c e r 识别剪切成r n a 双链，最后m i r n a 成熟体整合进r i s c 中。结合有m i r n a 的r i s c 介导了 m r n a 的降解或者翻译抑制( 引自o c o n n e l l 等，2 0 1 0 1 6 副) 。 f i g u r e1 - 1 m i r n ab i o g e n e s i sa n df u n c t i o n t h em i r n ag e n ei st r a n s c r i b e db yp o li ii n t oa p r i m i r n ai nt h en u c l e u s t h ep r i m i r n ai sp r o c e s s e di n t op r e m i r n ab yt h er n a s ei i ie n z y m e d r o s h a t h ep r e m i r n ai se x p o r t e dt ot h ec y t o p l a s mw i t ht h eh e l po fr a n - g t pc o f a c t o ra n d e x p o r t i n 5 t h em i r n ad u p l e xi sc l e a v e df r o mt h ep r e - m i r n ab yt h er n a s ei l le n z y m ed i c e ra n d t r b p t h e nt h em a t u r em